Nghiên cứu khả năng kháng oxy hóa của cao chiết nấm Cordyceps sp.

ĐẠI HỌC QUỐC GIA THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN




HUỲNH THƯ








NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG KHÁNG OXY HOÁ CỦA
CAO CHIẾT NẤM Cordyceps sp.





Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm (hướng Hoá Sinh)
Mã số chuyên ngành: 604230



LUẬN VĂN THẠC SĨ: Hoá Sinh

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:
TS. Ngô Đại Nghiệp





Tp. Hồ Chí Minh, năm 2012

iii
LỜI CẢM ƠN
Xin chân thành gởi lời cảm ơn đến tất cả những người thân yêu đã luôn bên
cạnh động viên, giúp đỡ tôi trong suốt thời gian thực hiện luận văn này.
- Em vô cùng biết ơn sự tận tâm dạy bảo và hướng dẫn nhiệt tình của thầy
Đinh Minh Hiệp và thầy Ngô Đại Nghiệp. Chúc hai thầy luôn vui khoẻ và ngày
càng thành công hơn trên con đường khoa học.
- Em cũng vô cùng biết ơn các thầy cô đã truyền
đạt kiến thức, dẫn dắt em
trên con đường học vấn.
- Xin gởi lời cảm ơn chân thành đến Trần Văn Khuê, Trình Mai Duy Lưu,
Trần Đăng Khoa và toàn bộ cán bộ Bộ môn Sinh Hóa đã tạo mọi điều kiện cho tôi
thực hiện luận văn này.
- Cảm ơn bạn Mỹ Nương và Hoàng Quyên đã đồng hành cùng tôi trong thời
gian thực hiện đề tài này.
- Chị cảm
ơn tất cả các em phòng Hợp chất có hoạt tính sinh học đã giúp chị
thực hiện luận văn này. Chị chúc tất cả các em sẽ thành công trong cuộc sống.
- Cảm ơn tất cả bạn bè lớp SH20 đã luôn chia sẻ buồn vui với mình trong hai
năm học vừa qua.
- Cảm ơn gia đình và người thân luôn bên cạnh thương yêu con.

Huỳnh Thư

30









MỞ ĐẦU



2
Ngày nay, các nhân tố bất lợi như ô nhiễm môi trường, tia tử ngoại, thức ăn
độc hại, sức ép công việc và gia đình ngày càng tăng cao, điều này làm gia tăng
đáng kể số lượng gốc tự do hoạt động gây ảnh hưởng trực tiếp đến sức khoẻ con
người. Đây chính là nguyên nhân phá hủy nhiều hệ thống sinh học, gây đứt gãy
DNA, phá vỡ màng tế bào, biến tính protein; làm phát sinh nhiều bệnh nghiêm
tr
ọng liên quan đến thóai hóa gan, thận, thần kinh, tim mạch,…Việc sử dụng các
chất kháng oxy hóa đã được đề xuất và ứng dụng từ lâu. Tuy nhiên, các nghiên cứu
gần đây cho thấy các chất kháng oxy hóa tổng hợp tuy có hoạt tính kháng oxy hóa
rất cao nhưng lại có nguy cơ gây hại đến cơ thể con người. Điều này đòi hỏi các nhà
khoa học phải nghiên cứu các hoạt chất kháng oxy có nguồn gốc tự nhiên nhằm giải
quyết v
ấn đề trên.

Trong nghiên cứu này, nhóm nghiên cứu nhắm đến đối tượng nấm
Cordyceps vì đây là một loại nấm quý sở hữu rất nhiều hoạt tính sinh học. Các
nghiên cứu đã chứng minh được Cordyceps chứa nhiều hoạt chất như cordycepin,
adenosin, hydroxyethyl-adenosin, các nucleosid, ergosterol, polysaccharid, các
nguyên tố đa và vi lượng cùng nhiều hoạt chất khác. Các nghiên cứu lâm sàng cũng
đã cho thấy Cordyceps có khả năng lớn trong việc điều trị nhi
ều bệnh cũng như tác
dụng bồi bổ cơ thể.
Các nghiên cứu về hoạt tính kháng oxy hóa ở Cordyceps đã được thực hiện
rất nhiều không chỉ ở châu Á mà trên toàn thế giới, kết quả cho thấy Cordyceps có
khả năng kháng oxy hóa rất cao, nhưng các nghiên cứu này chủ yếu được thực hiện
trên hai loài C. sinensis và C. militaris. Tại Việt Nam, đây vẫn là hướng nghiên cứu
mới và hầ
u như chưa có một nghiên cứu nào về hoạt tính kháng oxy hóa trên
Cordyceps được công bố. Mặt khác, nhận thấy ở Việt Nam, một vài vùng có địa
hình và khí hậu hoàn toàn phù hợp với điều kiện sinh trưởng của Cordyceps. Chính
vì lý do đó, nhóm nghiên cứu quyết định thực hiện đề tài: “Nghiên cứu khả năng
kháng oxy hóa của cao chiết nấm Cordyceps sp.” trên đối tượng là các chủng
Cordyceps được phân lập chính tại Việt Nam nhằ
m khảo sát các hoạt tính sinh học
của các chủng giống được chọn, trong đó tập trung khảo sát hoạt tính kháng oxy
hóa; tạo cơ sở cho việc khai thác ứng dụng và mở rộng phạm vi nghiên cứu,
hướng tới phát triển một số dạng sản phẩm phục vụ sức khỏe cộng đồng.

3
Mục đích: Đánh giá hoạt tính kháng oxy hóa in vitro của các phân đoạn cao
chiết từ sinh khối nấm Cordyceps sp. thu nhận tại Việt Nam.
Ý nghĩa: Cung cấp các số liệu thực nghiệm về hoạt tính kháng oxy hóa trên mô
hình in vitro, từ đó lựa chọn các phân đoạn cao chiết có hoạt tính kháng oxy hóa cao
để nghiên cứu kháng oxy hóa trên mô hình in vivo và tạo tiền đề cho các nghiên cứu

ứng dụng sâu hơn.



v

MỤC LỤC Trang
Trang phụ bìa ii
Lời cảm ơn iii
Lời cam đoan iv
Mục lục v
Danh mục chữ viết tắt ix
Danh mục bảng x
Danh mục hình, đồ thị và biểu đồ xi
MỞ ĐẦU 1
Chương 1 - TỔNG QUAN 4
1.1. Sự oxy hóa 5
1.1.1. Các khái niệm đầu tiên về sự oxy hóa 5
1.1.2. Các đặc trưng của phản ứng chuỗi 6
1.1.2.1. Độ bền hóa trị tự do 6
1.1.2.2. Điề
u kiện của chu kỳ chuyển đổi điện tử 6
1.1.2.3. Sự cạnh tranh của phản ứng chuỗi và phản ứng phân tử 6
1.2. Sự kháng oxy hóa 7
1.2.1. Khái niệm 7
1.2.2. Phân loại chất kháng oxy hóa 7
1.2.3. Cơ chế ức chế quá trình oxy hóa chuỗi 8
1.3. Tác hại của sự oxy hóa 9
1.3.1. Khái niệm stress oxy hóa 9
1.3.2. Các gốc tự do gây hại cho cơ thể 9

1.3.2.1. Khái niệm 9
1.3.2.2. Các dạng gốc tự do chứa oxy 9
1.3.3. Tác động lên DNA 10
1.3.4. Tác động lên protein 12
1.3.5. Tác động lên lipid 13

vi
1.4. Giới thiệu về Cordyceps 14
1.4.1. Phân loại khoa học 14
1.4.2. Lịch sử nghiên cứu 14
1.4.3. Phân bố 15
1.4.4. Đặc điểm 15
1.4.5. Hiệu quả sử dụng 15
1.4.6. Các hoạt chất chính 16
1.4.6.1. Cordycepin 16
1.4.6.2. Acid cordyceptic 17
1.4.6.3. Polysaccharid 18
1.4.6.4. Ergosterol 19
1.4.6.5. Nucleotide 19
1.4.6.5. Protein và acid amin 20
1.5. Tình hình nghiên cứu trên Cordyceps 20
1.5.1. Các nghiên cứu ngoài nước 20
1.5.2. Các nghiên cứu trong nước 23
Chương 2 – VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 25
2.1. Vật liệu 26
2.1.1. Đối tượng nghiên cứu 26
2.1.1.1. Sinh khối Cordyceps 26
2.1.1.2. Dòng tế bào 28
2.1.2. Hóa chất 28
2.1.3.Thiế

t bị - Dụng cụ 28
2.2. Quy trình chiết cao 30
2.3. Phương pháp xác định hoạt tính bắt gốc tự do DPPH 32
2.3.1. Nguyên tắc 32
2.3.2. Thực hiện 32
2.4. Phương pháp xác định năng lực khử 33
2.4.1. Nguyên tắc 33

vii
2.4.2. Thực hiện 34
2.5. Phương pháp xác định hàm lượng polyphenolic 35
2.5.1. Nguyên tắc 35
2.5.2. Thực hiện 35
2.6. Phương pháp xác định hàm lượng polysaccharid 36
2.6.1. Nguyên tắc 36
2.6.2. Thực hiện 36
2.7. Phương pháp xác định khả năng gây độc tố tế bào 37
2.7.1. Nguyên tắc 37
2.7.2. Thực hiện 37
2.8. Phương pháp xác định khả năng bảo vệ tế bào 38
2.8.1. Nguyên tắc 38
2.8.2. Thực hiện 38
2.9. Phương pháp xác định ảnh hưởng của sự oxy hóa trên DNA 39
2.9.1. Nguyên tắc 39
2.9.2. Phươ
ng pháp ly trích DNA 39
2.9.3. Phương pháp xác định sự hư hại DNA do tác nhân oxy hóa 40
2.9.4. Phương pháp xác định khả năng bảo vệ DNA của mẫu 41
Chương 3 - KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN 42
3.1. Khảo sát khối lượng cao chiết 43

3.2. Hàm lượng chất có trong cao chiết 44
3.2.1. Hàm lượng polyphenol 44
3.2.2. Hàm lượng polysaccharid 46
3.3. Khả năng kháng oxy hóa bằng phương pháp hóa học của các phân
đoạn cao chiết từ Cordyceps
47
3.3.1. Khả năng bắt gốc DPPH tự do 47
3.3.2. Năng lự
c khử 49
3.3.3. Nhận xét chung 51
3.4. Khảo sát ảnh hưởng của cao chiết trên tế bào Hep G2 54

viii
3.4.1. Khảo sát khả năng gây độc tế bào 54
3.4.2. Khả năng bảo vệ tế bào 55
3.4.3. Khả năng bảo vệ DNA 58
Chương 4 – KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 61
4.1. Kết luận 62
4.2. Đề nghị 62
DANH MỤC CÔNG TRÌNH CỦA TÁC GIẢ 63
TÀI LIỆU THAM KHẢO 64
PHỤ LỤC


4

CHƯƠNG I
TỔNG QUAN TÀI LIỆU

5
1.1. Sự oxy hóa
1.1.1. Các khái niệm đầu tiên về sự oxy hóa
Vào giữa thế kỷ 19, lần đầu tiên các nhà khoa học đã tình cờ phát hiện ra
hiện tượng phản ứng giữa kim loại và hợp chất hữu cơ, tạo tiền đề cho các nghiên
cứu oxy hóa về sau. Năm 1844, Shonbein khám phá ra sự hình thành ozon qua quá
trình oxy hóa chậm của phosphin, diethyl ether và ethyl alcohol [54].
Năm 1897, Bach và Engler đã phát triển nguyên lý peroxy hóa của quá trình
oxy hóa dựa trên các thí nghiệm về quá trình oxy hóa các hợp chất hữu cơ b
ằng oxy
phân tử và chứng minh sự hình thành peroxid như là sản phẩm cơ bản của quá trình
oxy hóa [12].
Năm 1959, Jorissen nghiên cứu về hiện tượng cảm ứng hóa học, ông khám
phá rằng indigo không bị oxy hóa bởi oxy phân tử nhưng bị oxy hóa khi có sự hiện
diện của triethylphosphin hoặc benzaldehyd oxy hóa, sau đó chứng minh rằng các
sản phẩm oxy hóa của benzaldehyd – benzoic peracid - không oxy hóa indigo trong
các điều kiện thí nghiệm [60]. Điều này cho thấy rằng một chất trung gian có hoạt
tính đã hình thành trong suốt quá trình oxy hóa benzaldehyd nhưng không phải là
benzoic peracid.
Cơ chế tương tự quá trình oxy hóa dây chuyền các hydrocarbon nhóm olefin
được mô tả bởi Bolland và Gee vào năm 1946 sau khi nghiên cứu chi tiết về động

học của sự oxy hóa các hợp chất không no [14]. Năm 1956, Miller và Mayo đã
nghiên cứu được quá trình oxy hóa styren và oxy phân tử tạo ra các polymer peroxy
hóa [42]. Năm 1957, Rust đã mô tả sự tạo thành dihydroperoxid trong nghiên cứu
của ông ta về sự oxy hóa các hydrocarbon béo mạch nhánh [49].
Năm 1935, Semenov đã đưa ra nguyên lý về hiện tượng tự
phản ứng nhanh
của cơ chế oxy hóa hydrocarbon [52]. Hiện tượng này giống như phản ứng chuỗi
phân nhánh (H
2
+ O
2
) được nghiên cứu bởi Hinshelwood và Williamson (1934) [29]
hoặc quá trình đốt cháy hơi phosphin được nghiên cứu bởi Semenov (1935) [52].
Sau đó, suốt các nghiên cứu động học về sự đa dạng của các phản ứng hydroperoxy
hóa, sự phát sinh các gốc tự do đã được khám phá.

6
1.1.2. Các đặc trưng của phản ứng chuỗi
1.1.2.1. Độ bền hóa trị tự do
Hóa trị tự do bền khi điện tử hoặc nguyên tử phản ứng với một phân tử, phản
ứng tạo ra một điện tử hoặc nguyên tử khác. Và hóa trị tự do không thể bền khi một
điện tử phản ứng với một điện tử
khác. Đây là kết quả của quá trình bảo toàn số
lượng electron trong phản ứng hóa học [25].
1.1.2.2. Điều kiện của chu kỳ chuyển đổi điện tử
Sự phát sinh gốc tự do không đủ khả năng cho phản ứng chuỗi xảy ra mà cần
có thêm sự tác động của oxy. Một phản ứng chuỗi có thể được duy trì trong một hệ
thống khi các điện tử nằm trong chu k
ỳ chuỗi được bảo toàn hóa trị tự do [25].

Hình 1.1. Quá trình phát sinh phản ứng oxy hóa chuỗi do sự tác động của oxy [25]
Khi gốc tự do xuất hiện trong một hệ thống, hai dạng phản ứng khác nhau có
thể xảy ra: phản ứng có sự bảo toàn hóa trị tự do và phản ứng không có sự bảo toàn
hóa trị tự do. Một phản ứng chuỗi có thể xảy ra nếu tỷ lệ phát triển cao hơn tỷ lệ kết
thúc chuỗi [20] [21].
1.1.2.3. Sự c
ạnh tranh của phản ứng chuỗi và phản ứng phân tử
Các nguyên tử và điện tử tự do có khả năng phản ứng hóa học cao, điều này
được thấy rõ ràng từ việc so sánh hằng số tốc độ. Khả năng phản ứng hóa học cao
của điện tử và nguyên tử tự do là một trong nguyên nhân làm cho phản ứng chuỗi
điện tử xảy ra nhanh hơn nhiều so vớ
i quá trình chuyển hóa phân tử trực tiếp.
Trong phản ứng phân tách, nguyên tử và một vài điện tử có thuận lợi hơn
hẳn so với phân tử. Khi hai dạng phản ứng hình thành trạng thái chuyển vị, những
nhóm sắp xếp gần với trung tâm phản ứng sẽ bị bỏ qua làm tăng năng lượng hoạt
động, vì trong trạng thái chuyển tiếp, năng lượng bỏ qua của các đoạn phân tử sẽ

cao hơn [25].

7
1.2. Sự kháng oxy hóa
1.2.1. Khái niệm
Các chất kháng oxy hóa là các hợp chất có khả năng làm chậm, ngăn cản
hoặc đảo ngược quá trình oxy hóa. Các chất này là những chất khử mạnh và có hoạt
tính với oxy cao hơn các đại phân tử sinh học mà nó bảo vệ [3].
Các chất kháng oxy hóa được cung cấp bởi hai nguồn bên trong và bên ngoài
cơ thể:
- Bên trong: protein (ferritin, transferrin, albumin), các enzym chống oxy hóa
(superoxid dismutase, glutathion peroxydase, catalase)
- Các hợp chất bên ngoài là các hợp chất có khả nă

ng bắt lấy điện tử tự do như
các hợp chất phenol, polysaccharid, vitamin C, vitamin E, carotenoid…
1.2.2. Phân loại chất kháng oxy hóa
Chất kháng oxy hóa có thể bị phân thành bảy nhóm sau [25]:
- Chất kháng oxy hóa phá vỡ chuỗi phản ứng bằng cách phản ứng với gốc
peroxyl: là các hợp chất khử với liên kết O-H và N-H tương đối yếu, sẵn sàng phản
ứng với gốc peroxyl tạo thành các gốc trung gian có hoạt tính thấp.
- Chất kháng oxy hóa phá vỡ chu
ỗi phản ứng bằng cách phản ứng với gốc
alkyl: là các hợp chất sẵn sàng nhận gốc alkyl, hoạt động hiệu quả tại nồng độ oxy
phân tử thấp và trong các polymer đồng nhất.
- Chất kháng oxy hóa có khả năng phân ly hydroperoxid: là các hợp chất phản
ứng với hydroperoxid ngăn không hình thành gốc tự do.
- Chất kháng oxy hóa khử hoạt tính kim loại: các hợp chất kim loại chuyển vị
phân ly hydroperoxid đồng thời t
ạo ra gốc tự do, do đó làm tăng tốc độ oxy hóa. Sự
tăng cường oxy hóa có thể được làm chậm bằng cách thêm vào hợp chất có khả
năng tương tác với ion kim loại để hình thành phức hợp nhằm bất hoạt
hydroperoxid.
- Chất kháng oxy hóa kết thúc chuỗi chu kỳ: số lượng phản ứng kết thúc chuỗi
dựa trên sự cân đối giữa tỷ lệ các phản ứng phục hồi và h
ấp thu của chất ức chế.
- Các chất ức chế tác động cộng hợp: chất kháng oxy hóa ức chế quá trình oxy
hóa thông qua nhiều phản ứng khác nhau. Một phân tử ức chế có thể có hơn hai
nhóm chức năng, mỗi nhóm đều có các phản ứng đặc trưng của nó.

8
- Các chất kháng oxy hóa hoạt động hợp lực: hoạt động hợp lực xảy ra khi hai
chất ức chế tăng cường lẫn nhau hiệu quả của chúng. Nếu hiệu quả ức chế của hai
chất ức chế được tăng cường tuyệt đối, đó là hiện tượng ức chế cộng hợp. Tuy

nhiên, nếu hiệu quả ức chế của hỗ
n hợp chất ức chế thấp hơn so với việc cộng hiệu
quả các chất ức chế riêng với nhau gọi là nguyên tắc đối lập giữa các chất ức chế.
1.2.3. Cơ chế ức chế quá trình oxy hóa chuỗi
Quá trình oxy hóa các hợp chất hữu cơ bao gồm các bước sau:
Chất khởi động → r
●

r
●
+ RH → rH + R
●

R
●
+ O
2
→ RO
2
●

RO
2
●
+ RH → ROOH + R
●

ROOH + RH → RO
●
+ H

2
O + R
●

2R
●
→ RR
R
●
+ RO
2
●
→ ROOR
RO
2
●
+ RO
2
●
→ ROOR + O
2

Dựa trên các điều kiện và khả năng phản ứng của quá trình oxy hóa, chất ức
chế (InH) và gốc tạo thành (In
●
) có thể tham gia vào các phản ứng khác nhau nhằm
ức chế quá trình oxy hóa. Quá trình ức chế sự oxy hóa được chia thành 13 cơ chế
đặc trưng được xác định bởi một tập hợp nhỏ các bước cơ bản và các thông số động
học. Các cơ chế này xác định các trường hợp oxy hóa chuỗi được khởi động khi tốc
độ khởi động v

i
=hằng số, tỷ lệ tự khởi động k
3
[ROOH]<<v
i
, và nồng độ oxy phân
tử hoà tan đủ cho sự chuyển đổi hiệu quả các gốc alkyl thành gốc peroxid. [25]
- Cơ chế 1: Phản ứng với các điện tử khởi động
- Cơ chế 2: Ức chế quá trình oxy hóa đơn
- Cơ chế 3: Ức chế quá trình oxy hóa chuỗi
- Cơ chế 4: Ức chế quá trình oxy hóa chuỗi khi In
●
phát triển trong chuỗi bằng
cách phản ứng với RH
- Cơ chế 5: Ức chế quá trình oxy hóa chuỗi khi In
●
phát triển trong chuỗi bằng
cách phản ứng với hydroperoxid.
- Cơ chế 6: Phản ứng với hydroperoxid
- Cơ chế 7: Phản ứng với oxy phân tử

9
- Cơ chế 8: Phân ly quinolid peroxid
- Cơ chế 9: Phân ly gốc phenol
- Cơ chế 10: Phản ứng với RO
2
●
và gốc In
●
phản ứng với oxy phân tử

- Cơ chế 11: Bắt gốc alkyl
- Cơ chế 12: Phản ứng với R
●
và có điện tử phản ứng với RH
- Cơ chế 13: Phản ứng với R
●
và có điện tử phản ứng với ROOH
1.3. Tác hại của sự oxy hóa
1.3.1. Khái niệm stress oxy hóa
Stress oxy hóa là hiện tượng xuất hiện trong cơ thể sinh vật khi có sự mất
cân bằng giữa việc sản xuất các gốc tự do và hoạt động của các chất chống oxy hóa
gây tác động xấu đến cơ thể sinh vật.[3]
1.3.2. Các gốc tự do gây hại cho cơ thể
1.3.2.1. Khái niệ
m
Gốc tự do là các phân tử hay nguyên tử có lớp ngoài cùng chỉ chứa điện tử
độc thân. Vì chỉ có một điện tử đơn lẻ nên gốc tự do luôn ở trạng thái bất ổn và tìm
cách chiếm lấy điện tử của các nguyên tử khác. Các gốc tự do hoạt động chứa oxy
là các dẫn xuất dạng khử của oxy phân tử. [3]
- Khi nồng độ thấp, các gốc t
ự do là các tín hiệu làm nhiệm vụ điều hoà quá
trình chết theo chu trình của tế bào (apoptosis), kích hoạt các yếu tố phiên mã cho
các gen tham gia vào quá trình miễn dịch, kháng viêm, điều hoà các gen mã hóa cho
các enzym chống oxy hóa.
- Khi nồng độ cao, các gốc tự do gây ra sự phá hủy các đại phân tử sinh học
dẫn đến nhiều bệnh nghiêm trọng.
1.3.2.2. Các dạng gốc tự do chứa oxy
- Superoxid (O
2
●

): Đây là gốc tự do có vai trò quan trọng nhất, hình thành khi
oxy nhận một điện tử. Hoạt tính phá hủy của superoxid không bắt nguồn từ phản
ứng phân tách nguyên tử hydrogen mà từ quá trình khử một electron, dẫn đến việc
hình thành các gốc tự do khác. Shibanuma và cs (1988) đã chứng minh superoxid
làm tăng pH nội bào trong tế bào bạch cầu người [53] và giải phóng sắt từ ferritin
[13][56]. Kulisz và cs (2002) đã nghiên cứu sự tương tác của superoxid và

10
hydrogen peroxid trong quá trình hoạt hóa sự phosphoryl hóa p38MAP kinase trong
suốt quá trình giảm oxy huyết trong tế bào cơ tim [34].
- Hydroxyl (HO
●
): Sự hình thành gốc hydroxy dựa trên phản ứng Fenton phụ
thuộc superoxid. Đây là gốc tự do có khả năng hoạt động rất mạnh liên quan gây ra
sự peroxy hóa lipid, phá hủy protein và DNA [25].
O
2
●
+ Fe
3+
→ O
2
+ Fe
2+
Fe
2+
+ H
2
O
2

→ Fe
3+
+ HO
●
+ HO
-

- Perhydroxyl (HOO
●
): Nồng độ gốc perhydroxyl thấp hơn nhiều lần so với
superoxid (khoảng 100 lần tại pH 7,8) nhưng luôn hiện diện trong dung dịch ở trạng
thái cân bằng so với superoxid.
O
2
●
+ H
+
↔ HOO
●
pK
a
(HOO
●
) = 4,8
Gốc perhydroxyl được nghiên cứu có thể là chất khởi động cho sự peroxy
hóa lipid, đồng thời là gốc có thể bắt nguyên tử hydrogen từ NADH và phức hợp
glyceraldehyd-3-phosphat dehydrogenase-NADH (GAPDH-NADH) [25].
HOO
●
+ NADH → H

2
O
2
+ NAD
●

HOO
●
+ GAPDH-NADH → H
2
O
2
+ GAPDH-NAD
●

- Một số gốc tự do quan trọng khác như peroxid (ROO
●
), alkoxyl (RO
●
),
lipoperoxid (LOO
●
).
1.3.3. Tác động lên DNA
- Hydroxyl là gốc tự do có khả năng phá hủy DNA mạnh nhất, thường là qua
con đường biến đổi các base hay phân cắt chuỗi DNA. Các gốc hydroxyl dễ dàng
lấy đi một nguyên tử hydrogen từ một nửa đường deoxyribose của DNA, tạo thành
các sợi DNA đơn (single DNA strand – SSB) [15]. SSB vô hại và có thể được sửa
chữa bởi các enzym bởi vì cấu trúc DNA được bảo toàn từ chuỗi còn lại. Nhưng
nếu sợi đ

ôi DNA (double-stranded break – DSB) bị bẽ gãy thì sẽ gây ra hiện tượng
chết tế bào, DSB có thể là kết quả của quá trình tấn công bởi nhiều gốc hydroxyl
[61]. Luôn có sự cạnh tranh giữa việc thêm gốc hydroxyl vào các base DNA và quá
trình lấy hydrogen từ phân tử đường của DNA, tuy nhiên việc thêm vào nối đôi của
các polyribonucleotid sợi đơn thích hợp hơn nhiều so với phản ứng lấy đi hydrogen
[51]. Dù vậy, việc lấy đi hydrogen trở nên tích cực hơn cho các nucleic acid sợi
đôi.
Mặc dù quá trình lấy đi hydrogen có thể xảy ra ở tất cả các nguyên tử carbon của

11
phân tử đường, nhưng việc lấy khỏi C-4’ có thể là quan trọng nhất [15]. Có thể thấy
một trong các con đường có thể gây rối loạn DNA trong điều kiện hiếu khí là hình
thành DNA-3’-phosphoglycolat, propenal base, và DNA-5’-phosphat.

Hình 1.2. Các sản phẩm DNA base do các gốc tự do gây ra [41]
- Phản ứng Fenton không chỉ đặc trưng cho sự sản sinh các gốc hydroxyl mà
còn cho các phức hợp ferryl và perferryl tương tự hydroxyl. Đồng thời, việc phá
hủy DNA có thể do hầu hết các dạng oxy hoạt động. Vì thế, mặc dù hiệu ứng phân
ly điện tử tạo gốc hydroxyl và các gốc khác được sản sinh bởi phản ứng Fenton khá
giống nhau, nhưng có thể có vài khác biệt, ví dụ, do s
ự tham gia trực tiếp của các
ion sắt trong sản phẩm tạo thành [28]. Gốc hydroxyl được đo như là phức hợp
DMPO-OH tấn công DNA tạo thành dạng aldehyd. Park và Floyd chỉ ra rằng gốc
hydroxyl tạo ra bởi hệ thống thiol/Fe
3+
/oxy phân tử gây đứt gãy DNA và tạo thành
8-hydroxy-2’-deoxyguanosine (8-OhdG) [45][46]. Aruoma và cs cho rằng sự phá
hủy DNA base bởi hệ thống peroxy hóa Fe
3+
/hydrogen gây ra bởi gốc hydroxyl

[11]. Nunoshiba và cs (1999) đã chứng minh được sự phá hủy DNA trong điều kiện
in vivo [44]. Việc gia tăng sản xuất các gốc hydroxyl trong các tổn thương DNA bị
oxy hóa như 7,8-dihydro-8-oxoguanin và 1,2-dihydro-2-oxoadenin có thể được tìm
thấy trong các tế bào E.coli nuôi cấy hiếu khí loại bỏ SOD và chất kìm hãm hấp thu

12
sắt. Itoh và cs (1964) chứng minh rằng các Fe
2+
và Fe
3+
tăng phá hủy mtDNA trên
tế bào gan chuột [30]. Sự thay thế cấu trúc ngón tay kẽm bằng sắt gây phá hủy DNA
ở điều kiện in vitro và cả in vivo [18].
- Bản thân superoxid không tương tác với DNA nhưng có khả năng khử Fe
3+

thành Fe
2+
xúc tác phản ứng Fenton, khởi đầu cho sự phá hủy DNA. Mặt khác, gốc
perhydroxyl có thể lấy đi nguyên tử 5’-hydrogen từ vòng deoxyribose, và cơ chế
này có thể chuyên biệt cho phản ứng của HOO
●
[22].
Bảng 1.1. Các bệnh liên quan đến sự oxy hóa DNA [41]
Cơ quan Bệnh
Máu Bạch cầu cấp; Rối loạn đường huyết; Thiếu máu
Hệ thống thần
kinh – não bộ
Parkinson; Alzheimer; Đa xơ cứng gây tê liệt dần; Teo cơ; Mất
điều hoà

Phụ khoa Các loại ung thư thuộc phụ khoa; Ung thư cổ tử cung; Ung thư vú
Gan
Nhiễm virus viêm gan C (HCV); Xơ gan mãn tính; Ung thư tế
bào biểu mô thận
Phổi Xơ hóa nang; Ung thư tế bào biểu mô; Ung thư phổi
Da Viêm da phân bào; Vẩy nến da; Ung thư da
Dạ dày Nhiễm Helicobacter pylori; Ung thư dạ dày
Một số bệnh
khác
Lão hóa; Đái tháo đường; Hội chứng Down; Viêm thấp khớp; Rối
loạn tim mạch; Ung thư trực tràng; Ung thư tế bào biểu mô thận

1.3.4. Tác động lên protein
Sự oxy hóa protein diễn ra do sự biến đổi các protein gây ra trực tiếp bởi các
gốc tự do hoặc gián tiếp do các sản phẩm thứ cấp của stress oxy hóa. Các tác nhân
dẫn đến oxy hóa protein bao gồm hydrogen peroxid, HOCl, các hợp chất sinh học
ngoại lai, các kim loại, oxy, các gốc tự do, các enzym oxy hóa khử, bức xạ γ, Có
rất nhiều cơ chế gây ra sự oxy hóa protein cũng như toàn bộ chuỗi acid amin đều có
thể bị oxy hóa, do đó gây ra một s
ố lượng rất lớn các protein bị biến đổi. Hai acid
amin dễ bị tác động nhất là cystein và methionin do cả hai chứa nguyên tử sulfur
linh hoạt, hầu như tất cả các tác nhân oxy hóa đều có thể oxy hóa hai acid amin này.
Trong khi ở các acid amin khác, sự oxy hóa cần các điều kiện nghiêm ngặt hơn.

13
Cách oxy hóa hiệu quả nhất là tấn công thông qua xúc tác kim loại ở các vị trí
chuyên biệt, trong đó các dạng khử của kim loại chuyển vị liên kết với protein sẽ
khử H
2
O

2
thành dạng trung gian hoạt động. [23]
Bảng 1.2. Các bệnh liên quan đến sự oxy hóa protein
Protein bị oxy hóa Bệnh
Carbonyl; Glutamine synthetase Lão hóa; Alzheimer; Thiếu máu cục bộ
IgG Viêm thấp khớp
Protein não Thiếu máu cục bộ
Protein thủy tinh thể Đục thủy tinh thể
Protein cơ Teo cơ
Elastase; Chất ức chế α-1-proteinase Khí thủng
Một số protein chưa biết
Lão hóa; Parkinson; Xơ vữa động mạch;
Viêm phổi mãn tính

1.3.5. Tác động lên lipid
Các gốc tự do, đặc biệt là superoxid tấn công các phân tử lipid tạo ra các gốc
lipid bị oxy hóa khởi đầu cho phản ứng chuỗi oxy hóa lipid theo cơ chế sau:
- Khởi đầu
L
1
H → L
1
●

- Kéo dài
L
1
●
+ O
2

↔ L
1
OO
●

L
1
OO
●
+ L
2
H → L
1
OOH + L
2
●

L
2
OO
●
+ L
3
H → L
2
OOH + L
3
●
…
….

L
n-1
OO
●
+ L
n
H → L
n-1
OOH + L
n
●

- Kết thúc
L
n
●
L
n
●
→ Các sản phẩm kết hợpL
n
O
●
+ L
n
O
●

L
n

OO
●
L
n
OO
●
LO
●

LOO
●

→ Các sản phẩm phân ly

14
Sự oxy hóa lipid bị gây ra bởi nhiều tác nhânvà sự cân bằng giữa các tác
nhân này bao gồm một hệ thống dựa trên dung môi, nồng độ và thành phần acid
béo, nhiệt độ, áp suất oxy, đặc biệt là các nguồn hydrogen. [25]
Bảng 1.3. . Các bệnh liên quan đến sự oxy hóa lipid [24][47]
Cơ quan Bệnh
Thần kinh
Azheimer; Parkinson; Teo cơ; Đa xơ cứng; Tâm thần phân liệt; Tổn
thương dây thần kinh cột sống; Thoái hóa hệ thần kinh; Động kinh
Tim mạch Xơ vữa động mạch; Nhồi máu cơ tim
Thận Phù hạch bạch huyết mãn tính; Viêm thận mãn tính
Gan
Gan nhiễm mỡ; Xơ gan; Ung thư gan; Kháng insulin ngoại vi;
Nhiễm virus viêm gan C
Một số cơ
quan khác

Viêm; Tiểu đường; Ung thư; Lão hóa

1.4. Giới thiệu về Cordyceps
1.4.1. Phân loại khoa học
Theo hệ thống phân loại của NCBI, chi Cordyceps thuộc giới Nấm, ngành
Ascomycota, lớp Sordariomycetes, bộ Hypocreales, họ Cordycipitaceae.
1.4.2. Lịch sử nghiên cứu
Tên Cordyceps được lấy từ tên Latin, từ “cord” mang nghĩa “club” và từ
“ceps” mang nghĩa “head”. Những hiểu biết đầu tiên và phổ biến hiện nay về
Cordyceps là về C. sinensis, hay còn được gọi là Đông Trùng Hạ Thảo [67]. Đây là
phương thu
ốc bổ dưỡng có từ lâu đời. Loài nấm C. sinensis được ghi nhận lần đầu
tiên trong văn hóa y học cổ truyền của Trung Quốc là trong bản “Trích yếu về y
dược” của Wang Ang vào năm 1694. Năm 1757, C. sinensis có tên “Bei Cao Cong
Xin” được đặt bởi Yiluo Wu. Năm 1765, Xueming Zhao gọi là “Ben Cao Gang Mu
Shi Yi” [72]. Năm 1878, một nhà nghiên cứu người Ý đã đặt tên cho loài Đông
Trùng Hạ Thảo được tìm thấy ở Trung Quốc là C. sinensis, và danh pháp này được
sử dụng đế
n ngày nay. Hiện nay, các nhà khoa học đã phân lập được thêm nhiều
loài Cordyceps mới, kết quả nghiên cứu cho thấy các loài này sở hữu các hoạt tính
dược học không thua kém gì so với C. sinensis. Cùng với sự phát triển của công

15
nghệ lên men, Cordyceps đã được nuôi cấy thành công trong các môi trường nhân
tạo, đồng thời các nghiên cứu còn cho thấy Cordyceps nuôi cấy nhân tạo vẫn giữ
được các hoạt tính và các hoạt chất sinh học quý, đánh dấu một bước phát triển mới
trong việc sản xuất đối tượng tiềm năng này.
1.4.3. Phân bố
Cordyceps phân bố ở các vùng núi cao 3500 – 5000m so với mặt nước biển,
thường được tìm thấy nhiều ở

Tây Tạng, Thanh Hải, Tây - Phúc Kiến, Tây Nam
tỉnh Cam Túc và Tây Bắc tỉnh Vân Nam và các vùng núi cao thuộc Ấn Độ, Nepal,
Bhutan. Hiện nay, khoảng hơn 500 loài đã được tìm thấy, trong đó có khoảng 90
loài được phát hiện ở Trung Quốc [72].
1.4.4. Đặc điểm
Cordyceps là loài chuyên sống ký sinh trên một loại ấu trùng bướm đặc biệt
có tên Hepialus armoricanus [72]. Tuy nhiên thao các công bố hiện nay thì
Cordyceps còn được phát hiện sống ký sinh trên nhiều loài côn trùng khác và ấu
trùng của chúng. Thường ấu trùng bị nhiễm nấm vào mùa hè, n
ấm sinh trưởng và
phát triển một cách tự nhiên trên vật chủ vào mùa thu và giết chết vật chủ. Qua mùa
đông, nấm sẽ giết chết hoàn toàn cơ thể vật chủ, hình thành cấu trúc bào tử sinh sản,
gọi là stroma, phát triển lên mặt đất vào mùa hè sau đó [67].
1.5.4. Hiệu quả sử dụng
Từ hàng ngàn năm trước, Cordyceps đã được xem như một phương thuốc bổ
dưỡng có giá trị cao hàng đầu trong các loại dược li
ệu truyền thống. Vì đặc tính quý
hiếm cũng như tác dụng hữu hiệu trong điều trị bệnh và tăng cường sinh lực nên
Cordyceps được xem là loại thực phẩm quý chuyên dành cho hoàng tộc. Hiện nay,
các sản phẩm về Cordyceps đã được thương mại hóa rất nhiều trên toàn thế giới.
Tại Việt Nam, nguồn sản phẩm này trên thị trường chủ yếu nhờ vào nhập khẩu.

Theo Đông y và các nghiên cứu khoa học, Cordyceps thường được dùng với các
mục đích sau [60]:
- Chức năng gan: Kích thích sự biến dưỡng năng lượng; Hoạt hóa chức năng
tế bào Kupffer; Giảm xơ gan
- Chức năng thận: Giảm độc tố thận gây ra bởi aminoglycosid; Giảm hiện
tượng huyết niệu và protein trong nước tiểu

16

- Hệ thống steroid và nội tiết: Kích thích sản xuất corticosteroid; Kích thích
sản xuất corticosteron
- Chức năng tim mạch: Ức chế sự tập kết tiểu huyết cầu; Giảm chứng loạn
nhịp tim gây ra bởi ouabain, aconitin và BaCl
2

- Hoạt tính kháng ung thư: Sterol và các glucosid của chúng; Các chất biến
dưỡng có trọng lượng phân tử thấp hơn cordycepin; Các nucleosid bị biến đổi; Tăng
cường miễn dịch và sản xuất cytokin
- Điều hoà miễn dịch: Tăng cường và ức chế miễn dịch
- Hạ đường huyết
- Tạo hồng cầu và máu
1.4.6. Các hoạt chất chính
1.4.6.1. Cordycepin
Cordycepin có cấu trúc 3’-deoxyadenosin là một purin alkaloid có dạng của
nucleosid adenosin bị mất một oxy ở vị trí 3’ phần đường ribose. Cordycepin được
phân lập lần đầu vào năm 1950 từ C. militaris. Bằng phân tích phổ NMR (nuclear
magnetic resonance) và IR (infrared), cordycepin được xem như là một hợp chất có
hoạt tính sinh học được ly trích từ quả thể và sợi nấm C. sinensis. Cordycepin có
công thức C
10
H
13
N
5
O
3
và có phân tử lượng 251, điểm nóng chảy tại 230-231
0
C, độ

hấp thu cực đại tại 259nm. Có thể hoà tan trong dung dịch đệm muối, methanol hay
ethanol, nhưng không hoà tan trong benzen, ether hay chloroform, do vậy nhiều
nghiên cứu đã sử dụng dung dịch muối khử trùng và đệm phosphat làm dung môi.
[72]
Vì cordycepin có cấu trúc tương tự adenosin nên RNA polymerase không thể
phân biệt. Khi tham gia tổng hợp nên phân tử RNA, cordycepin ngăn chặn quá trình
kéo dài thêm các RNA và tạo ra các phân tử RNA kết thúc sớm. Do đó, cordycepin
được xem như chất kháng ung thư hiệu quả [30]. Năm 2003, Sun và cs đã chứng
minh hàm lượng cordycepin vớ
i hoạt tính kháng khối u ở C. kyushuensis cao hơn C.
sinensis và C. militaris, ở Cordyceps nuôi cấy cao hơn tự nhiên, và trong sợi nấm
cao hơn ấu trùng chủ [55]. Tác giả cũng khẳng định rằng đây là hợp chất có tiềm
năng dược học cao. Năm 2007, Noriko Yoshikawa và cs chứng minh cordycepin có
hoạt tính kháng ung thư hiệu quả thông qua việc ức chế quá trình methyl hóa acid

17
nucleic và polyadenin hóa [66]. Đồng dạng của cordycepin là 2’, 5’- oligoadenin có
tác dụng kháng virus thông qua việc ức chế reverse transcriptase. Tác giả cũng
chứng minh rằng tiền chất của cordycepin là adenosin cũng có hoạt tính kháng ung
thư.

Hình 1.3. Cấu trúc cordycepin và tiền chất [71]

1.4.6.2. Acid cordyceptic
Acid cordycepic, một isomer của acid quinic, được nghiên cứu đầu tiên ở C.
sinensis năm 1957. Cấu trúc tinh thể của acid cordyceptic được xác định là D-
mannitol bởi Sprecher và Sprinson. Mannitol là hợp chất sinh học chính có nhiều
hoạt tính quan trọng như kháng gốc tự do, lợi tiểu, trị ho. Chất này tồn tại trong tự
nhiên chủ yếu ở rễ, thân và lá cây; được tìm thấy nhiều trong nấm ăn, cà rốt và rêu.
Hàm lượng acid cordyceptic trong Cordyceps khoảng 7-29%. Mannitol có c

ấu tạo
gồm một alcohol và một đường, hoặc một polyol; tương tự như xylitol hay sorbitol.
Tuy nhiên, mannitol có xu hướng loại bỏ ion hydrogen trong nước làm dung dịch
trở nên acid. Công thức hóa học của mannitol là C
6
H
14
O
6
, trọng lượng phân tử 182,
nhiệt độ nóng chảy 166
0
C, tỷ trọng 1,489 (20
0
C) và nhiệt độ sôi 290-295
0
C (467
kPa). Mannitol có nhiều đặc tính quan trọng đã được sử dụng trong y học và thực
phẩm, hàm lượng mannitol có trong quả thể nấm Cordyceps vào khoảng 29-85
mg/g, sợi nấm có hàm lượng acid cordyceptic cao hơn so với trong quả thể. [72]

18

Hình 1.4. Cấu trúc acid cordyceptic
1.4.6.3. Polysaccharid
Cordyceps chứa một lượng lớn polysaccharid, khoảng 3-8% khối lượng, đây
là một trong những hợp chất sinh học chính. Từ năm 1977, nhiều nghiên cứu khoa
học tại Trung Quốc và Nhật Bản đã chứng minh được những ích lợi từ
polysaccharid trong việc kháng ung thư, kháng oxy hóa, kháng viêm cũng như tác
động điều hòa miễn dịch.

Các hợp chất polysaccharid ở Cordyceps là một galactomannan nhiều nhánh.
Các hợp chấ
t này bao gồm D – mannose và D – galactose với tỷ lệ 3:5, thường
chứa một tỷ lệ nhỏ protein. Nó là một cấu trúc phân nhánh gồm các liên kết (1 – 6)
và (1 – 2) liên kết các gốc α – D – mannopyranosyl ở mạch chính, có các liên kết đa
dạng giữa các monosaccharid kế cận tạo thành các cấu trúc xoắn và vòng nhỏ. Tuy
nhiên, một mannoglucan với trọng lượng phân tử xấp xỉ 7700 g/mol được phân tách
gần đây chỉ chứa các đơn vị mannose và glactose với tỷ lệ 1:9. Các phân tích cho
thấy nó có m
ột khung sườn α – D – glucan với các liên kết (1 – 4) và (1 – 3); và các
mạch nhánh của α – D – (1 – 6) – mannopyranose (Manp) được gắn vào khung
sườn qua vị trí O – 6 của gốc α – (1 – 3) – glucopyranosyl (Glcp). Nghiên cứu này
cũng cho thấy dược tính của polysaccharid là từ các đặc tính của nó như trọng
lượng phân tử, ví dụ như các polyglucan có trọng lượng phân tử lớn hơn (10 – 1000
kDa) có xu hướng tan trong nước tốt hơn và vì thế có hoạt tính kháng khối u hiệu

19
quả hơn. Tuy nhiên, hoạt tính kháng ung thư là do sự tăng cường miễn dịch cho cơ
thể hơn là hiệu ứng gây chết tế bào trực tiếp. [60]
1.4.6.4. Ergosterol
Ergosterol là tiền chất quan trọng cho vitamin D. Hàm lượng ergosterol ở C.
militaris nuôi cấy rất cao, chỉ đứng sau C. sinensis tự nhiên phân lập ở Tây Tạng. Li
và cs chứng minh hàm lượng ergosterol trong sợi nấm Cordyceps vào khoảng 1,44
mg/g, thấp hơn trong quả thể là 10,68 mg/g [69]. Các ergosterol và các chất đồng
d
ạng của nó có hoạt tính kháng virus, điều hoà tim mạch, điều trị bệnh thận do giảm
immunoglobin A [72].

Hình 1.5. Cấu trúc ergosterol [20]
1.4.6.5. Nucleotid

Nucleotid là chất có nhiều trong Cordyceps, có tác dụng kháng khối u, phóng
thích các tín hiệu dẫn truyền thần kinh, chống co giật… Trong đó, hàm lượng
guanosin thường cao nhất. Hàm lượng nucleotid trong Cordyceps nuôi cấy cao hơn
hẳn Cordyceps tự nhiên, điều này có thể liên quan đến hoạt động biến dưỡng nhanh
trong quá trình nuôi cấy. Hàm lượng các nucleotid trong tự nhiên thấp có thể do sự
thoái biến các nucleotid trong quá trình ủ đông [69]. Khí hậu ấm và ẩm ướt là điều
kiện làm tăng nucleotid trong Cordyceps. Năm 2003, Sun và cs nghiên cứu thấy có
ít nhất 8 loại nucleosid hoặc nitrogen base có trong C. kyushuensis [55]. Năm 2010,
Xie Jian Wei và cs đã tách và xác định được các loại thymin, adenosin, adenin và
cordycepin có trong C. sinensis, nghiên cứu cho thấy hàm lượng các nucleotid khác
nhau tùy theo vị trí phân lập [64].