Nghiên cứu chuyển gen kháng thuốc diệt cỏ vào lan dendrobium cv. Burana white bằng vi khuẩn agrobacterium tumefaciens

ĐẠI HỌC QUỐC GIA THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN


HUỲNH NGUYÊN PHÁT



NGHIÊN CỨU CHUYỂN GEN KHÁNG THUỐC DIỆT CỎ
VÀO LAN DENDROBIUM CV. BURANA WHITE BẰNG VI
KHUẨN AGROBACTERIUM TUMEFACIENS




Chuyên ngành: DI TRUYỀN
Mã số: 60 42 70



LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH – 2012

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC
TS. NGUYỄN HỮU HỔ

LỜI CẢM ƠN


Trong quá trình thực hiện đề tài, tôi đã nhận được rất nhiều sự quan tâm, giúp đỡ,
chia sẻ từ các Thầy, các Cô, bạn bè và gia đình. Đó là nguồn động lực vô cùng to
lớn và quý giá đã giúp tôi vượt qua những khó khăn để hoàn thành tốt luận văn
này. Tôi xin chân thành tỏ bày lòng biết ơn sâu sắc đến:
TS. Nguyễn Hữu Hổ đã tận tình hướng dẫn, chia sẻ những kiến thức cũng
như những kinh nghiệm quý giá giúp tôi hoàn thành luận văn này.
Các Quý Thầy, Quý Cô Khoa Sinh học, trường Đại Học Khoa Học Tự
Nhiên, Thành phố Hồ Chí Minh đã giảng dạy và truyền đạt những kinh
nghiệm đã trải qua trong quá trình giảng dạy cũng như trong quá trình thực
nghiệm.
Các anh, các chị, các em công tác tại Bộ môn Công Nghệ Sinh Học Thực
Vật và Chuyển Hóa Sinh Học, trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Thành
phố Hồ Chí Minh đã tạo mọi điều kiện thuận lợi cho tôi hoàn thành luận
văn này.
Các bạn và các em sinh viên đã nhiệt tình giúp đỡ tôi hoàn thành tốt luận
văn.

Ba mẹ, anh chị em và vợ tôi đã luôn luôn đồng hành, ủng hộ và nâng đỡ tôi
về mặt vật chất cũng như tinh thần.


TP. Hồ Chí Minh, tháng 9 năm 2012

Huỳnh Nguyên Phát







1

MỞ ĐẦU

Họ Phong Lan là một họ lớn của thực vật có hoa, gồm hơn 800 giống và 30.000
loài, đặc biệt là hoa rất đẹp. Có rất nhiều loài Phong Lan đã được thương mại hóa
trên thế giới, trong số đó có Dendrobium. Dendrobium là một trong những giống
lan thương mại quan trọng được trồng phổ biến dùng như hoa cắt cành lẫn cây
trồng chậu bởi hoa đẹp, dễ trồng và thích ứng với phổ khí hậu rộng.
Việc áp dụng các kỹ thuật di truyền vào thực vật mở ra cơ hội có thể đưa các
tính trạng mới mong muốn vào Phong Lan. Kết quả đã tạo ra rất nhiều giống lan
mới không chỉ có giá trị kinh tế mà còn góp phần làm tăng thêm tính đa dạng cho
Phong lan. Tuy có nhiều phương pháp chuyển gen khác nhau vào thực vật, nhưng
hai phương pháp chuyển gen thường được sử dụng nhiều nhất, đó là phương pháp
chuyển gen trực tiếp bằng súng bắn gen và phương pháp chuyển gen gián tiếp
thông qua vi khuẩn Agrobacterium. Mỗi phương pháp đều có ưu điểm và nhược

điểm khác nhau, nhưng việc sử dụng vi khuẩn Agrobacterium làm công cụ chuyển
gen sẽ giúp gen mục tiêu gắn chèn vào bộ gen thực vật chủ bền vững hơn.
Tuy nhiên, việc chuyển bất cứ gen ngoại lai nào vào bất cứ đối tượng nào
không phải lúc nào cũng thành công tốt đẹp. Điều này còn tùy vào đặc tính của
từng họ, từng loài, từng loại mô, loại kháng sinh sử dụng để diệt khuẩn Do đó,
việc chuyển gen ngoại lai vào đối tượng thực vật, đặc biệt là Phong Lan, thì điều
trước hết cần phải thực hiện là xây dựng quy trình chuyển gen ổn định, đồng thời
tối ưu một số nhân tố khác để nâng cao hiệu suất chuyển gen.
Hiện nay, có rất nhiều gen thường được sử dụng trong chuyển gen, chẳng hạn
như gen phát sáng xanh lá cây gfp (từ sứa Aequorea victoria), gen phát sáng đỏ Ds-
Red (từ bọt biển Discosoma sp.), gen luc (từ đom đóm Photinus pyralis) trong số
đó có cả gen kháng thuốc diệt cỏ (gen bar). Và đã có rất nhiều công trình nghiên
cứu trên thế giới sử dụng gen bar như là gen mục tiêu trên một số đối tượng như
2

Saccharum sp. (Manickavasagam và cộng sự, 2004), Pinus radiata (Charity J.A.
và cộng sự, 2005), Zea mays (Vega J., 2008) Tuy nhiên, công trình áp dụng
chuyển nạp gen bar cho đối tượng Phong Lan là rất ít, và chỉ thấy có một bài báo
đã sử dụng gen bar làm gen mục tiêu để khảo sát trên ba giống Lan (Brassia,
Cattleya, và Doritaenopsis) (Knapp J.E., Kausch A.P. và Chandlee J.M., 2000).
Kết quả cho thấy gen bar này biểu hiện rất tốt và có thể sử dụng vừa như gen mục
tiêu vừa như gen chọn lọc.
Trên cơ sở phân tích đó, luận văn sẽ tập trung chủ yếu vào việc sử dụng vi
khuẩn Agrobacterium tumefaciens để chuyển gen bar vào Phong lan Dendrobium
CV. BURANA WHITE, nhằm bước đầu xây dựng quy trình chuyển nạp gen bar,
để từ đó góp phần tìm hiểu thêm gen này sẽ biểu hiện như thế nào trên giống lan
Dendrobium CV. BURANA WHITE cũng như có thể áp dụng chuyển gen trên các
giống lan khác, và đồng thời làm tiền đề cho việc chuyển nạp gen khác có giá trị
thương mại vào Phong lan nói chung và Dendrobium nói riêng.

MỤC LỤC


Trang phụ bìa
MỤC LỤC
DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT
DANH MỤC HÌNH
DANH MỤC BẢNG
DANH MỤC BIỂU ĐỒ

MỞ ĐẦU 1
1. TỔNG QUAN 3
1.1 Sơ lược về họ Lan 3
1.2 Sơ lược về Phong Lan Dendrobium 3
1.2.1 Vị trí phân loại 3
1.2.2 Nguồn gốc và sự phân bố 4
1.2.3 Đặc điểm hình thái Dendrobium 4
1.3 Các phương pháp nhân giống 6
1.3.1 Phương pháp tách chiết 6
1.3.2 Phương pháp gieo hạt 6
1.3.3 Phương pháp lai tạo 7
1.3.4 Phương pháp nuôi cấy mô 7
1.3.5 Phương pháp cắt lát mỏng (Thin Cross Section) 7
1.3.6 Phương pháp vi nhân giống quang tự dưỡng 7
1.4 PLB (Protocorm-Like Body) 8
1.4.1 Thuật ngữ 8
1.4.2 Các nguồn nguyên liệu tạo PLB 8
1.5 Cách trồng và chăm sóc lan Dendrobium 8
1.5.1 Điều kiện sống của Dendrobium 8
1.5.2 Cách trồng lan Dendrobium 10
1.5.3 Cách chăm sóc lan Dendrobium 10
1.6 Giá trị của Phong Lan 11
1.6.1 Giá trị dược liệu 11
1.6.2 Giá trị kinh tế 12
1.7 Tình hình sản xuất hoa lan ở nước ta và trên thế giới 12
1.8 Các phương pháp chuyển gen 14
1.8.1 Phương pháp chuyển gen gián tiếp thông qua vi khuẩn Agrobacterium
tumefaciens 14
1.8.2 Một số phương pháp chuyển gen khác vào thực vật 22
1.9 Các yếu tố ảnh hưởng đến hiệu quả chuyển nạp gen 25

1.9.1 Xử lý mẫu 25
1.9.2 Thời gian đồng nuôi cấy và mật độ A. tumefaciens 25
1.9.3 Làm khô mẫu cấy 26
1.9.4 Xử lý với chất chống hoại tử 26
1.9.5 Nhiệt độ 27
1.9.6 Chất hoạt động bề mặt 27
1.9.7 Môi trường ủ và môi trường đồng nuôi cấy 27
1.9.8 Kháng sinh 28
1.9.9 Marker chọn lọc 30
1.10 Ứng dụng plasmid Ti trong công nghệ chuyển gen ở thực vật 30
1.11 So sánh phương pháp bắn gen với phương pháp chuyển gen bằng vi khuẩn
A. tumefaciens 32
1.12 Cấu trúc của gen chuyển nạp 32
1.12.1 Promoter và terminator 32
1.12.2 Gen chọn lọc (selectable gene) 33
1.12.3 Gen chỉ thị (reporter gene) 34
1.13 Một số phương pháp phát hiện gen chuyển 35
1.13.1 Phương pháp thử GUS 35
1.13.2 Phương pháp thử khả năng kháng kháng sinh hay thuốc diệt cỏ (PPT)
của cây tái sinh trong in vitro 35
1.13.3 Kỹ thuật PCR (Polymerase Chain Reaction) 35
1.14 Tình hình nghiên cứu thực vật chuyển gen 37
1.14.1 Tình hình nghiên cứu chuyển gen lan Dendrobium trên thế giới 37
1.14.2 Tình hình nghiên cứu chuyển gen thực vật ở Việt Nam 39
2. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP 41
2.1 Vật liệu thí nghiệm 41
2.1.1 Đối tượng thí nghiệm 41
2.1.2 Môi trường nuôi cấy 41
2.1.3 Chủng vi khuẩn A. tumefaciens 41
2.1.4 Thiết bị và hóa chất thực hiện chuyển nạp gen bằng A. tumefaciens 42

2.2 Phương pháp thực hiện 44
2.2.1 Khảo sát ảnh hưởng của PPT đến khả năng sống của PLB Dendrobium
CV. BURANA WHITE 45
2.2.2 Khảo sát ảnh hưởng của kháng sinh cefotaxim và meropenem lên khả
năng sống của PLB Dendrobium CV. BURANA WHITE và sự tái nhiễm
khuẩn qua đồng nuôi cấy 45
2.2.3 Thử nghiệm quy trình biến nạp gen vào lan Dendrobium CV. BURANA
WHITE bằng vi khuẩn A. tumefaciens 46
2.2.4 Tái sinh các mẫu PLB giả định chuyển gen bằng A. tumefaciens trên
môi trường chọn lọc có bổ sung PPT 48
2.2.5 Kiểm tra sự hiện diện của gen bar trong PLB tái sinh trên môi trường
chọn lọc bằng kỹ thuật PCR 49
2.2.6 Khảo sát khả năng kháng chịu với PPT của PLB Dendrobium CV.
BURANA WHITE chuyển gen 53
3. KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN 54
3.1 Khảo sát ảnh hưởng của PPT đến khả năng sống của PLB Dendrobium CV.
BURANA WHITE 54
3.2 Khảo sát ảnh hưởng của kháng sinh cefotaxim và meropenem lên khả năng
sống của PLB Dendrobium CV. BURANA WHITE và sự tái nhiễm khuẩn qua
đồng nuôi cấy 57
3.3 Thử nghiệm quy trình biến nạp gen vào lan Dendrobium CV. BURANA
WHITE bằng vi khuẩn A. tumefaciens 61
3.4 Tái sinh các mẫu PLB chuyển gen bằng A. tumefaciens trên môi trường chọn
lọc có bổ sung PPT 67
3.5 Kiểm tra sự hiện diện của gen bar trong PLB tái sinh trên môi trường chọn
lọc bằng kỹ thuật PCR 70
3.5.1 Tách chiết DNA 70
3.5.2 Kiểm tra sự hiện diện của gen bar trong PLB tái sinh trên môi trường
chọn lọc bằng kỹ thuật PCR 72
3.6 Khảo sát khả năng kháng chịu với PPT của PLB Dendrobium CV.

BURANA WHITE chuyển gen 74
4. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 78
4.1 Kết luận 78
4.2 Đề nghị 79
TÀI LIỆU THAM KHẢO 80
DANH MỤC CÔNG TRÌNH 90
PHỤ LỤC 91








Chương 1









TỔNG QUAN
3

1. TỔNG QUAN
1.1 Sơ lƣợc về họ Lan

Phong Lan thuộc ngành Thực vật hạt kín, lớp Một lá mầm, bộ Lan Orchidales,
họ Lan Orchidaceae. Đây là họ lớn thứ hai trong ngành Hạt kín với khoảng 800 chi
và 30.000 loài, phân bố khắp nơi trên Trái Đất, nhưng phong phú nhất là ở trong
các rừng ẩm nhiệt đới Đông Nam Á và Châu Mỹ. Ở nước ta, có hơn 130 chi, 800
loài. Hầu hết đều có hoa đẹp và dùng làm cảnh [6].
Ở Châu Âu, cây lan được nhà Thực vật học Theophratus mô tả từ khoảng năm
300 trước Công Nguyên và đặt tên theo tiếng Hy Lạp là Orchid (có nghĩa là “Ngọc
hành”). Mãi đến năm 1836, Lindley J. sử dụng từ này để đặt tên cho họ Phong Lan
là Orchidaceae [8].
Ở Việt Nam, lần đầu tiên vào năm 1789, nhà truyền giáo Bồ Đào Nha Joanis
Loureio đã khảo sát và mô tả cây lan. Sau đó, trong bộ “Thực vật chí Đông
Dương” (Lecomte H.; 1932-1934) đã mô tả 101 giống, gồm 750 loài lan ở ba nước
Đông Dương. Gần đây, trong bộ sách “Cây cỏ Việt Nam” (Phạm Hoàng Hộ, 1993)
đã mô tả tới 653 loài lan [8].
1.2 Sơ lƣợc về Phong Lan Dendrobium
1.2.1 Vị trí phân loại
Giới: Plantae (Giới Thực vật)
Ngành: Magnoliophyta (Ngành Ngọc lan)
Lớp: Liliopsida (Lớp Một lá mầm)
Bộ: Orchidales (Bộ Lan)
Họ: Orchidaceae (Họ Phong lan)
Chi: Dendrobium
Loài: Dendrobium CV. BURANA WHITE Hình 1.1 Hoa Dendrobium CV.
BURANA WHITE
4

1.2.2 Nguồn gốc và sự phân bố [4]
Tên Dendrobium có nguồn gốc từ chữ Hy Lạp: “Dendro” có nghĩa là gỗ, “bios”
có nghĩa là sống. Vì vậy, Dendrobium hầu hết là phụ sinh và sống bám trên cây gỗ.
Ở Việt Nam, người ta còn gọi là Hoàng lan hoặc Đăng lan.

Giống Dendrobium có khoảng trên 1600 loài và đã được lai tạo thêm nhiều
giống mới với hình thái và cấu tạo hết sức phức tạp, đa dạng. Dendrobium được
tìm thấy ở Đông Bán Cầu, trải dài từ Australia, xuyên suốt Nam Thái Bình Dương,
Philippines, Ấn Độ, và xuất hiện một ít ở Nhật Bản và nhiều nhất ở Đông Nam Á.
Ở Việt Nam, Dendrobium có đến 100 loài, xếp trong 14 tông và được phân biệt
bằng thân (giả hành), lá và hoa.
1.2.3 Đặc điểm hình thái Dendrobium [4]
Dendrobium là lan đa thân, có hoa bên nách, nhiều nhánh, sống lâu năm, tăng
trưởng không liên tục, có thời gian nghỉ sau mùa tăng trưởng và thường sống trên
những cây gỗ lớn với bộ rễ khí sinh. Do phân bố rộng nên hình thái rất đa dạng.
Nhìn chung, các giống Dendrobium đều có cơ quan sinh dưỡng là thân, giả hành,
lá và rễ; cơ quan sinh sản là hoa, hạt, trái (quả).
 Thân
Dendrobium thuộc nhóm đa thân, nhánh nằm ngang, bò dài trên giá hoặc nằm
sâu trong đất, gọi là thân rễ. Kích thước thân dao động từ 0.1-0.2m đến 3-4m,
mang rễ và lá. Phát hoa mọc trên thân ở các nách lá, song song với lá và thẳng góc
với rễ. Thân nhẵn hay có nhiều vảy (do thoái hóa) và một phần thẳng đứng mang lá.
Các lá này bao nhau hợp thành thân giả (giả hành).
 Giả hành
Giả hành là những đoạn phình to, bên trong là các mô mềm chứa dịch nhầy làm
giảm sự mất nước và dự trữ chất dinh dưỡng. Ngoài ra, giả hành còn chứa diệp lục
tố nên có khả năng quang hợp. Giả hành có hình dạng và kích thước rất đa dạng:
nhỏ hoặc lớn, hình cầu, thuôn dài hay hình trụ xếp chồng lên nhau, tạo thành thân
5

giả. Trên thân giả, có nhiều mắt ngủ nên có thể nhân giống nhanh bằng phương
pháp tách chiết. Một số loài ở xứ lạnh chỉ có nhiệm vụ dự trữ chất dinh dưỡng nên
giả hành không có màu xanh.
 Lá
Lá mọc xen, hình giáo thuôn dài thành bẹ ôm lấy thân, màu xanh bóng, đậm và

nhẵn. Hình dạng và cấu trúc lá rất đa dạng: hình kim, trụ có rãnh hay phiến mỏng,
có màu xanh bóng, đậm hay nhạt tùy vào vị trí sống của cây. Những lá sát dưới gốc
đôi khi không phát triển nên trở thành vảy. Các loài thuộc giống Dendrobium vùng
nhiệt đới nói riêng và họ Orchidaceae nói chung đôi khi trút lá vào mùa khô hạn,
sau đó đâm chồi mới khi gặp trời mưa.
 Rễ
Đa dạng về hình thái và cấu trúc (rễ mập, thân rễ bò dài hay ngắn) nên
Dendrobium phù hợp với nhiều điều kiện sống khác nhau. Cây có hệ rễ khí sinh, có
một lớp mô hút ẩm dày bao quanh gồm những tế bào chứa đầy không khí nên rễ
ánh lên màu xám bạc. Rễ có chức năng hấp thu nước mưa hay nước lơ lững trong
không khí (sương, hơi nước) và giúp cây bám chặt vào giá thể để không bị gió
cuốn đi. Hơn nữa, rễ còn có thể chứa diệp lục tố nên có khả năng quang hợp. Một
số loài sống hoại, có vòi để hút dinh dưỡng từ xác thực vật.
 Hoa
Ra hoa ở nách lá. Chồi hoa mọc từ các mắt ngủ ở gần ngọn hoặc trên ngọn, gọi
là keikei. Có loài trước khi ra hoa sẽ có hiện tượng rụng hết lá. Thời gian ra hoa là
đầu mùa mưa hay đầu Tết. Hoa có thể là hoa đơn hoặc hoa kép. Thường thì trung
bình khoảng 1-2 tháng, hoa mới tan. Thời gian nở hoa có khi suốt năm. Cấu trúc
hoa gồm ba cánh đài và ba cánh tràng.
 Quả
Thuộc loại quả nang. Khi chín, các nang bung ra, đính lại với nhau ở đính và ở
gốc. Ở một số loài, khi chín, quả không nứt ra nên hạt chỉ ra khỏi vỏ khi quả bị
mục nát.
6

 Hạt
Một quả lan chứa từ 10.000-100.000 hạt, có khi đến 3 triệu hạt, có kích thước
rất nhỏ (trước đây còn gọi là họ Vi tử), phôi hạt chưa phân hóa. Sau 12-18 tháng,
hạt chín và phát tán nhờ gió. Khi gặp nấm cộng sinh tương thích trong điều kiện
phù hợp, hạt sẽ nảy mầm.

1.3 Các phƣơng pháp nhân giống
1.3.1 Phƣơng pháp tách chiết
Thời điểm tách chiết tốt nhất đa số các loài lan là vào đầu mùa tăng trưởng.
Những vùng có khí hậu bốn mùa (xuân, hạ, thu, đông) rõ rệt thì thời điểm tách
chiết là vào đầu mùa xuân (như ở miền Bắc). Những vùng có khí hậu bốn mùa
không rõ rệt và có hai mùa là mùa khô và mùa mưa, thì thời điểm tách chiết là vào
đầu mùa mưa. Nếu kiểm soát được nhiệt độ trong vườn ươm hay trong nhà kính thì
có thể tách chiết quanh năm. Thường tách ba giả hành thành một đơn vị trồng [4].
1.3.2 Phƣơng pháp gieo hạt
 Phương pháp gieo hạt nhờ nấm cộng sinh
Hạt lan rất nhỏ, không có chất dinh dưỡng dự trữ để tự nảy mầm nên không thể
gieo như cách thông thường, mà hạt phải cộng sinh với nấm chuyên biệt để cung
cấp chất dinh dưỡng (chủ yếu là đường). Khi đó, hạt mới có thể nảy mầm [4].
 Phương pháp gieo hạt không cần nấm cộng sinh
Phương pháp này được thực hiện trong điều kiện vô trùng của phòng thí
nghiệm: hạt sau khi được rửa sạch và được khử trùng sẽ được gieo trên môi trường
gieo hạt giàu khoáng và dinh dưỡng. Khi lan con được 4 lá và rễ dài thì đem ra
trồng. Phương pháp này đơn giản, ít tốn kém và tỷ lệ nảy mầm cao [7].
 Phương pháp gieo hạt xanh
Hai phương pháp trên không thể áp dụng cho những loài từ sự lai bất thường
giữa hai loài xa nhau vì thời gian hạt chín lâu (6 tháng đến 1 năm). Vì trái lan còn
xanh, vỏ trái chưa bung ra nên hạt bên trong chưa bị nhiễm bệnh và chỉ cần khử
trùng một lần, sau đó cấy lên môi trường gieo hạt [4].
7

1.3.3 Phƣơng pháp lai tạo
Chọn các cây bố mẹ cùng loài. Sau đó, dùng tăm tre vô trùng ấn vào nhị đực và
đưa sang quệt vào bề mặt nuốm nhụy cái. Tiếp đó, đem cây mẹ để riêng, không
tưới nước, bảo quản thật tốt, không để côn trùng bay vào thụ phấn. Sau khi thụ
phấn thành công, cần bón phân chứa nhiều phospho và đem ra ngoài để trồng [7].

1.3.4 Phƣơng pháp nuôi cấy mô
Phương pháp tách chiết thu được kết quả ít, còn gieo hạt cũng được khá nhiều
nhưng cây con lai tạo có một số thì giống cha, một số thì giống mẹ, một số thì vừa
giống cha vừa giống mẹ, nhiều khi ra hoa không đạt. Do đó, để có một lượng lớn
cây con trong một thời gian ngắn và đồng nhất về tính trạng thì cần phải nuôi cấy
mô với các phương pháp như nuôi cấy đỉnh sinh trưởng, mô sẹo, tế bào đơn, hạt
phấn đơn bội Vật liệu cho nuôi cấy mô có thể là bất kỳ cơ quan nào của cây như
đỉnh sinh trưởng, rễ, lá, hạt
1.3.5 Phƣơng pháp cắt lát mỏng (Thin Cross Section)
Phương pháp này do Nihar Najak và cộng sự (2001) thực hiện trên loài
Cymbidium aloifolium (L.) SW và Dendrobium nobile Lindl Phương pháp này
thường được áp dụng để nhân nhanh các protocorm hay PLB (Protocorm-like
body). Protocorm hay PLB được cắt thành những lát có độ dày khoảng 0,5mm và
đặt trên môi trường nuôi cấy có bổ sung chất điều hòa tăng trưởng thực vật thích
hợp. Sau một khoảng thời gian, các protocorm hay PLB này sẽ tái sinh thành
những cụm protocorm hay PLB mới [4][7].
1.3.6 Phƣơng pháp vi nhân giống quang tự dƣỡng
Phương pháp này nhằm tạo điều kiện cho cây con phát triển tốt khi đưa ra vườn
ươm. Chủ yếu chú trọng đến các tác nhân vật lý của môi trường nuôi cấy như nồng
độ CO
2
, sự khuyếch tán khí hòa tan, cường độ ánh sáng, nhiệt độ, độ ẩm và giá thể.
Phương pháp này gồm hai giai đoạn: mẫu mô thực vật được đem vào ống nghiệm
và nuôi cấy dị dưỡng hay quang dị dưỡng (giai đoạn 1). Sau khi cơ quan có diệp
lục tố (lá) hình thành, thì mẫu cấy được chuyển sang điều kiện nuôi cấy quang tự
dưỡng (giai đoạn 2). Phương pháp này có nhiều ưu điểm là nâng cao tốc độ tăng
8

trưởng và phát triển của cây in vitro, cây phát triển đồng đều, tỷ lệ đột biến thấp,
không đòi hỏi hoàn toàn vô trùng và chi phí thấp [4]

1.4 PLB (Protocorm-Like Body)
1.4.1 Thuật ngữ
 Thuật ngữ Protocorm
Protocorm là thuật ngữ được đặt ra đầu tiên bởi nhà quản lý Melchoior Treub
của vườn bách thảo Bogor, Indonesia (hiện nay là vườn Kebun Raya). Ông dùng từ
này để chỉ ra một giai đoạn phát triển của rêu (Treub, 1890). Sau đó, Noel Bernard
(1899-1910) dùng protocorm cho các cây họ Lan. Hiện nay, protocorm dùng để mô
tả những cấu trúc hình cầu nhỏ hình thành từ hạt lan, có vài lông hút đơn bào và
mô phân sinh ở đỉnh. Các thể có cấu trúc tương tự hình thành từ các mẫu cấy in
vitro không được gọi là protocorm. Các tế bào bề mặt protocorm duy trì tiềm năng
của các tế bào phôi, từ đây chúng phát khởi tạo nhiều điểm sinh trưởng bất định
[4][75][81]
 Thuật ngữ PLB
PLB (Protocorm-Like Body) là thuật ngữ dùng để chỉ các thể có cấu trúc tương
tự protocorm, được hình thành từ mô nuôi cấy hoặc mô sẹo in vitro. Thuật ngữ này
được ông Georges Morel sử dụng đầu tiên khi nuôi cấy chồi đỉnh. PLB là một thể
có tổ chức, có thể tái sinh nhiều PLB mới và có thể tái sinh thành chồi. Hiện nay,
PLB là nguồn nguyên liệu để nhân nhanh lan và thường dùng trong chuyển gen [4].
1.4.2 Các nguồn nguyên liệu tạo PLB
Mô lá (in vitro), nốt phát hoa, chồi (in vitro), rễ, chóp rễ, phát hoa
1.5 Cách trồng và chăm sóc lan Dendrobium
1.5.1 Điều kiện sống của Dendrobium [4][8]
 Nhiệt độ
Nhiệt độ thích hợp từ 25-30
0
C, một số thì khoảng 18-22
0
C [8]. Dendrobium ưa
vùng khí hậu nhiệt đới và cận nhiệt đới, chênh lệch nhiệt độ giữa ngày và đêm
9

khoảng 6-9
0
C. Nhiệt độ thích hợp cho sự phát triển của Dendrobium là 27-32
0
C
(ban ngày) và 16-18
0
C (đêm). Nhiệt độ dưới 10
0
C có thể làm rụng lá.
 Ánh sáng
Tốt nhất là 50-70% độ chiếu sáng. Thiếu ánh sáng, cây yếu ớt, đứng không
vững, hoa ít. Ánh sáng quá nhiều, lá bị vàng hoặc cháy khô, để lại giả hành trơ trụi,
có thể ra hoa nhưng hoa ít và nhỏ [8]. Ánh sáng thấp làm thân cây mảnh khảnh, lá
mỏng, hoa nhỏ hoặc không có hoa. Ánh sáng quá cao, dễ làm cây bị cháy.
 Nước
Giúp duy trì ẩm độ trong giai đoạn tăng trưởng. Nên giữ nước khô ráo giữa các
lần tưới nước sau giai đoạn tăng trưởng. Lan đang mọc, cần tưới nhiều nước. Khi
ngưng tăng trưởng, nên bớt nước lại. Những lan trồng ngoài tự nhiên, bình thường
tưới hai lần một ngày. Vào mùa hè, cây thiếu nước nên tưới nước thường xuyên.
 Độ ẩm
Ẩm độ thích hợp là 50-70%. Nếu quá ẩm thì gốc và rễ thường bị thối. Nếu
trồng trong nhà kính, nên dùng máy tạo độ ẩm khi điều kiện quá hanh khô.
 Bón phân
Lan Dendrobium cũng cần dinh dưỡng tương đối cao. Ngoài bón phân hữu cơ,
cần bổ sung phân NPK và vi lượng [8]. Thời gian tưới phân tốt nhất trong ngày là
sáng sớm hay chiều tối, không nên tưới vào buổi trưa. Tuy nhiên, tùy theo mùa mà
có thể dịch chuyển lịch tưới cho phù hợp. Trung bình chỉ nên tưới mỗi tuần một lần
và phải tưới từ nồng độ thấp đến nồng độ cao.

 Giá thể
Dendrobium là loài phụ sinh, sống trên nhiều loại giá thể như xơ dừa, dớn, than
củi, vỏ cây khô, có thể sử dụng cả mút xốp làm giá thể. Giá thể phải xốp, thoáng
khí và không giữ nước quá lâu.
 Thay chậu
Lan Dendrobium trồng cỡ 2 năm thì giả hành phát triển, mọc lan ra ngoài nên
cần phải thay chậu và cần tách chiết ra để nhân giống.
10

 Sâu bệnh
Việc bón phân hữa cơ hay dùng giá thể xơ dừa (sẽ mục nát sau một thời gian
nào đó) là nguyên nhân chủ yếu tạo điều kiện cho gián, rệp, côn trùng cắn phá,
nấm và virus… gây hại cho cây lan. Do đó, cần phải theo dõi thường xuyên để
phòng trừ mầm bệnh một cách nhanh chóng và hiệu quả.
1.5.2 Cách trồng lan Dendrobium
 Trồng cây con từ tách chiết
Các lan con từ việc tách chiết được trồng trong chậu nhựa hoặc đất nung, bên
trong có thể là than củi, xơ dừa hoặc xốp. Cũng có thể trồng thành luống bằng vỏ
dừa già. Buộc cây lan vào một cái nẹp, gốc lan giáp với xơ dừa. Tưới nước đủ ẩm
hàng ngày nhưng đừng để đọng nước. Sau 2-3 năm, xơ dừa mục thì thay, sau đó
trồng lại [8].
 Trồng cây con nuôi cấy mô
Dùng kẹp móc nhẹ nhàng các lan con trong chai nuôi cấy mô, đem rửa sạch
thạch (agar). Sau đó, lấy xơ dừa đã cắt nhỏ, bó nhẹ chung quanh rễ lan con và ràng
lại bằng một sợi dây thun nhỏ. Có thể tưới phun kích thích tố ra rễ, nước dừa pha
loãng, hoặc Vitamin B1 trước khi trồng. Chú ý là để bộ rễ thật thông thoáng và
tưới nước thường xuyên ba lần mỗi ngày [7].
1.5.3 Cách chăm sóc lan Dendrobium
Dendrobium xuất xứ từ Đông Nam Á nên rất phù hợp với khí hậu Việt Nam.
Dendrobium rất dễ trồng, chịu nắng 70%, chịu ẩm, tưới nước ngày hai lần. Những

ngày nắng nhiều thì tưới ba lần. Nếu thiếu nước, giả hành sẽ teo lại, rụng lá.
Khi cây ra rễ mạnh, tưới phân NPK (30-10-10) mỗi tuần một lần. Đến khi cây
trưởng thành, chuyển qua phân NPK (10-30-10) để kích thích ra hoa. Khi vừa hé
phát hoa, tưới qua phân NPK (10-10-30) để cho hoa đẹp, lâu tàn. Khi cắt hoa thì
quay trở lại phân NPK (30-10-10) để cây ra chồi và phát triển nhanh. Tuy nhiên,
cần thường xuyên vệ sinh giàn lan, nhổ cỏ, diệt côn trùng (sên, ốc, dế, bướm) để
tránh lây lan mầm bệnh. Hàng tháng nên phun thuốc sát trùng, thuốc rầy một lần để
phòng tránh nấm mốc, sâu bệnh gây hại [7].
11

1.6 Giá trị của Phong Lan
1.6.1 Giá trị dƣợc liệu
Ngoài giá trị thẩm mỹ, lan còn được sử dụng trong lĩnh vực dược liệu để trị một
số bệnh. Chẳng hạn như Lan Phi Điệp (Dendrobium anosmum Lindl.) (hình 1.2)
[76] (dùng thân cây) có thể trị bệnh suy nhược cơ thể hay thần kinh, đau họng, tiểu
đường, yếu sinh lý [74][75], Lan Củ Khóm (Dendrobium crumenatum Sw.) (hình
1.3) (dùng thân và lá) cũng có thể trị đau họng, lợi tiểu, khử lọc [79]

Hình 1.2 Lan Phi Điệp Dendrobium anosmum Lindl.

Hình 1.3 Lan củ khóm Dendrobium crumenatum Sw.
Một số chất như dendromoliside, picrotoxane, glucoside… được chiết từ thân
của lan Dendrobium moniliforme (hình 1.4) có khả năng làm tăng số lượng tế bào
B và ức chế tăng sinh tế bào T trong in vitro [71].

Hình 1.4 Lan Dendrobium moniliforme Hình 1.5 Lan Dendrobium salaccense
12

Một bộ tộc ở Indonesia dùng lan Dendrobium salaccense (hình 1.5) nấu với
cơm như người Việt Nam ở đồng bằng sông Cửu Long dùng lá dứa để nấu. Ngoài

ra, lá và giả hành còn được dùng làm trà để uống…[4]
1.6.2 Giá trị kinh tế
Ngày nay, đời sống của con người ngày một nâng cao thì nhu cầu trưng bày hoa
nói chung và hoa lan nói riêng, làm cảnh quan để thưởng ngoạn là nhu cầu tất yếu.
Sự hiện diện của hoa lan thể hiện sự sang trọng và quý phái.
Hàng năm, tỷ lệ ngành sản xuất hoa lan trên thế giới là 10%, đạt khoảng 40 tỷ
(2006), đến nay (2012) đã đạt 102 tỷ USD [82]. Trong năm 2000, kim ngạch xuất
nhập khẩu lan cắt cành và cây lan trên thế giới đạt 150 triệu USD, trong đó lan cắt
cành đạt 128 triệu USD. Vì lợi nhuận đem lại khá cao nên nhiều nước đã xem
ngành trồng phong lan là một trong những ngành kinh tế quan trọng, góp phần phát
triển kinh tế. Hiện nay, các quốc gia ở Đông Nam Á đã phát triển rất mạnh nghề
trồng hoa nói chung và hoa lan nói riêng, trong đó có cả Việt Nam [4].
1.7 Tình hình sản xuất hoa lan ở nƣớc ta và trên thế giới
Trên thế giới, hoa cắt cành nói chung và hoa lan nói riêng là một trong những
ngành đem lại nhiều tỷ đô-la (USD) và vô cùng năng động. Ở Mỹ, giá trị lan trồng
chậu ước tính đạt từ 47 triệu USD (1996) đến 121 triệu USD (2003). Ở Hà Lan,
trong năm 2002-2003, ước tính giá trị lan trồng chậu Phalaenopsis khoảng 87 triệu
bảng Anh (Michel Paul, 2004). Theo số liệu thống kê từ FlowerTECH (2004), đến
năm 2014, sản lượng hoa lan trồng chậu đạt khoảng 305 triệu USD.

Hình 1.6 Sản lượng lan trồng chậu đến năm 2014
13

Ở Đông Nam Á, Thái Lan đã vươn lên trở thành nước không chỉ xuất khẩu lan
cắt cành mà còn xuất khẩu giống nhiều nhất trên thế giới. Năm 1990, Thái Lan
xuất khẩu khoảng 15.5 triệu cành, đến năm 1995 là 26.5 triệu cành. Đến năm 2009
xuất khẩu đạt 104 triệu USD. Thái Lan cũng dành khoảng 3718 ha (chiếm 30.6%)
để trồng lan (2009). Khoảng 60-70% sản lượng lan cắt cành của Thái Lan được
xuất khẩu sang khoảng 38 nước trên thế giới, trong đó có Việt Nam [77].
Chính phủ Malaysia cũng đã thấy được tiềm năng trong ngành hoa lan nên đã

quy hoạch khoảng 300 ha và giao cho Hiệp hội hoa lan để sản xuất với mục đích
xuất khẩu. Đài Loan cũng rất quan tâm đến việc sản xuất hoa lan để xuất khẩu bởi
vì hàng năm ngành trồng hoa đem lại khoảng 9 tỷ Đài tệ. Còn ở Singapore, nhiều
vườn lan không chỉ phục vụ cho du khách mà còn xuất khẩu sang các nước Châu
Âu, Mỹ, Nhật… Các vườn lan ở các quốc gia này trồng theo quy trình công nghiệp
rất hiện đại từ khâu trồng đến khâu thu hoạch cũng như phân phối và đóng gói.
Riêng ở Việt Nam, lan rất đa dạng, đều có mặt hầu hết cả nước và từ lâu đã
trồng làm cảnh trong nhà. Diện tích trồng hoa ở Việt Nam khoảng 2500 ha nhưng
lan chỉ chiếm khoảng 5-6%. Hiện nay, ở Thành phố Hồ Chí Minh, diện tích trồng
lan khoảng 210 ha, hướng đến 2015 là 400 ha, tập trung chủ yếu ở Quận Thủ Đức,
Quận 2, Quận 9, Bình Chánh, Hóc Môn, Củ Chi… Tuy nhiên, giống lan chủ yếu là
Mokara và Dendrobium [78]. Theo số liệu của Hội Hoa lan thành phố Hồ Chí
Minh, trung bình mỗi tuần Thành phố Hồ Chí Minh nhập hơn 20.000 cành lan từ
Thái Lan, 15.000 cành từ Đài Loan và giá dao động từ 5.000-7.000 đồng/cành.
Như vậy có thể nói rằng ngành trồng lan tại Thành phố Hồ Chí Minh đang rất
cần những nhà đầu tư mạnh dạn mở rộng diện tích sản xuất và áp dụng những kỹ
thuật hiện đại để tăng sản lượng hoa cung ứng trong nước và có thể xuất khẩu.
Ngoài ra, Ủy Ban Nhân Dân Thành Phố Hồ Chí Minh cũng đã ban hành Quyết
định số 3330/QĐ-UBND ngày 04/07/2011 để thực hiện Chương trình phát triển
hoa, cây kiểng trên địa bàn Thành Phố Hồ Chí Minh, trong đó cây lan được ưu tiên
lựa chọn. Sở Khoa học và Công nghệ Thành Phố Hồ Chí Minh đã giao cho Trung
tâm Công nghệ Sinh học Thành Phố Hồ Chí Minh thực hiện nhằm chuyển giao cho
các hộ nông dân.
14

1.8 Các phƣơng pháp chuyển gen
1.8.1 Phƣơng pháp chuyển gen gián tiếp thông qua vi khuẩn Agrobacterium
tumefaciens
 Sơ lược về vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens
A. tumefaciens là vi khuẩn gram âm, hình gậy, đơn bào, không sinh bào tử, gây

bệnh khối u ở thân cây. Khối u này chứa một số chất mới như nopalin và octopin,
gọi chung là opine, mà ở cây bình thường không có. Đặc biệt hơn là khối u không
ngừng tăng trưởng ngay cả khi diệt hết các vi khuẩn trong cây bị nhiễm [11].
Bộ gen của A. tumefaciens chứa một nhiễm sắc thể và một plasmid lớn có kích
thước khoảng 200kb, gọi là plasmid Ti (Tumor-inducing). Chính plasmid này là tác
nhân gây bệnh khối u ở thân cây.

Hình 1.7 Bộ gen của vi khuẩn A. tumefaciens
Khi xâm nhiễm vào cây, A. tumefaciens chuyển đoạn T-DNA nằm trên plasmid
Ti vào bộ gen thực vật. Sau khi sát nhập vào bộ gen thực vật, các gen trên T-DNA
sẽ tiến hành phiên mã và dịch mã để tạo nên các protein đặc biệt mà cây bình
thường không có, đó là các opine. Kết quả hình thành nên các khối u trên thân cây.
Vi khuẩn A. tumefaciens dễ dàng xâm nhập vào cây Hai lá mầm, nhưng lại khó
khăn với cây Một lá mầm, ngoại trừ vài loài của Asparagus [2].

Hình 1.8 Khối u do A. tumefaciens tạo ra
Nhiễm sắc thể
Plasmid
15

 Phân loại [61]
Ngành: Proteobacteria
Lớp: Alpha Proteobacteria
Bộ: Rhizobiales
Họ: Rhizobiaceae
Loài: Agrobacterium tumefaciens Hình 1.9 A. tumefaciens đang
gắn vào tế bào thực vật
Dựa vào đặc tính gây bệnh, Agrobacterium được phân loại như sau:
 Các chủng gây khối u sủi thân (crown gall) được gọi là
Agrobacterium tumefaciens

 Các chủng cảm ứng khối u (cane gall) trên các loại dâu đất, cây mâm
xôi (Rubus idaeus) được gọi là Agrobacterium rubi
 Các chủng cảm ứng rễ tơ (hairy root) được gọi là Agrobacterium
rhizogenes
 Các chủng không gây bệnh được gọi là Agrobacterium radiobacter
Dựa vào các đặc tính sinh lý và sinh hóa: có 3 kiểu sinh học (biotype):
 Biotype I: Agrobacterium tumefaciens và Agrobacterium radiobacter
 Biotype II: Agrobacterium rhizogenes
 Biotype III: Agrobacterium vitis
 Đặc điểm di truyền [2][24]
Bộ gen Agrobacterium gồm hai phần: phần plasmid Ti và phần nhiễm sắc thể.
Plasmid Ti là DNA dạng vòng, kích thước khoảng 200kb, có khả năng tự sao chép
độc lập trong tế bào vi khuẩn, gồm hai thành phần chính: T-DNA và vùng gen vir
(vùng độc tính). Ngoài ra, còn có vùng sao chép plasmid, vùng chuyển nạp plasmid
và vùng bị hóa opine (hình 1.10). Plasmid Ti được phân loại theo opine nên có
plasmid Ti kiểu octopine, plasmid Ti kiểu nopaline… Có hai nhóm opine chính:
một là họ octopine là dẫn xuất của carboxyl ethyl của arginine, hai là nopaline là
dẫn xuất của dicarboxylpropyl của arginine. Ngoài ra, còn có agropine là dẫn xuất
16

của “bicyclic sugar” của glutamic acid và succcinamopine là dẫn xuất của
dicarboxylpropyl của asparagine (hình 1.11).

Hình 1.10 Cấu tạo của plasmid Ti
Vùng T-DNA là một đoạn DNA có kích thước khoảng 25kb, gồm hai loại gen:
gen oncogen (gen phát sinh khối u) mã hóa cho các enzym liên quan đến sự tổng
hợp auxin, cytokinin và đảm trách việc hình thành khối u. Gen thứ hai mã hóa cho
việc tổng hợp các opine. Vi khuẩn sử dụng các hợp chất này như nguồn carbon và
nitơ để sinh sản. Đoạn T-DNA trong plasmid Ti được giới hạn bởi bờ trái (Left
Border - LB) và bờ phải (Right Border - RB). Các bờ này là những trình tự lặp lại

cùng chiều có kích thước khoảng 25 nucleotide, có vai trò như là tín hiệu cis trong
bộ máy vận chuyển T-DNA vào tế bào thực vật.

Nopaline Octopine Agropine
Hình 1.11 Một số loại opine
17

Vùng gen vir là vùng gen độc tính, dài khoảng 30-40 kb, là một regulon gồm 6
operon cần thiết cho sự vận chuyển T-DNA (virA, virB, virD, virG) và làm tăng
hiệu quả chuyển gen (virC và virE). Các gen này mã hóa cho các enzym tương
ứng có chức năng cắt đứt bờ trái và bờ phải để giải phóng T-DNA, đồng thời còn
có chức năng bao bọc T-DNA, vận chuyển và gắn T-DNA vào bộ gen tế bào thực
vật. Hai gen virA và virG hợp lại thành một hệ thống điều hòa hai thành phần để
điều hòa hoạt động của các gen vir khác. Các gen vir thường được kích thích bởi
các hợp chất phenolic được tiết ra từ vết thương của cây. Các hợp chất này vừa có
tính kháng khuẩn vừa là chất dẫn dụ vi khuẩn.
Ngoài vùng T-DNA và vùng gen vir, trên plasmid Ti còn có vùng khởi đầu sao
chép giúp cho vi khuẩn tự sao chép độc lập trong tế bào, vùng gen đồng hóa opine
giúp cho vi khuẩn tiêu hóa các opine được tạo ra trong các khối u.
Ngoài các yếu tố di truyền từ plasmid Ti, còn có các yếu tố di truyền khác từ
nhiễm sắc thể của vi khuẩn, có vai trò quan trọng trong việc giúp A. tumefaciens
bám vào tế bào thực vật và dòng hóa vi khuẩn [22], đó là: locus chvA và chvB
(tổng hợp và bài tiết β-1,2 glucan), locus chvE (gia tăng đường cảm ứng gen vir và
gia tăng tính hướng hóa của vi khuẩn), locus cel: (tổng hợp sợi cellulose), locus
pscA (exoC) (tổng hợp c-glucan và acid succinoglycan) và locus att (liên quan đến
các protein bề mặt tế bào).
 Quá trình xâm nhiễm của A. tumefaciens [22]
Bản chất tự nhiên của vi khuẩn A.tumefaciens là xâm nhập vào những vị trí tổn
thương trên cây Hai lá mầm và gây ra khối u tại những vị trí tổn thương đó. Khi bị
xâm nhiễm, tế bào thực vật tiết ra các chất độc có bản chất phenolic (như

acetosyringone, hydroxyl acetosyringone…) không chỉ để làm lành vết thương, dẫn
dụ vi khuẩn, mà còn gián tiếp hoạt hóa vùng gen vir của plasmid Ti.
Quá trình T-DNA của A. tumefaciens gắn vào bộ gen thực vật được bắt đầu
bằng sự nhận diện các tín hiệu từ thực vật thông qua hệ thống điều hòa hai thành
phần VirA/VirG nằm trên màng tế bào vi khuẩn. Hệ thống này ngay sau đó sẽ hoạt
18

hóa các gen vir cần cho quá trình giải phóng T-DNA khỏi plasmid Ti, vận chuyển
T-DNA, nhập vào nhân tế bào thực vật và sau cùng là gắn vào bộ gen thực vật. Các
gen trên T-DNA sẽ được biểu hiện qua quá trình phiên mã và dịch mã.

Hình 1.12 Mô hình xâm nhiễm của vi khuẩn A. tumefaciens
 Cơ chế phân tử của quá trình A. tumefaciens xâm nhiễm [22] [18]
Đầu tiên, vi khuẩn A. tumefaciens bám vào tế bào thực vật thông qua các
receptor chuyên biệt có trên bề mặt tế bào thực vật (hình 1.13). Người ta đã xác
định được một số receptor tham gia, đó là protein giống Vitronectin, CSLA9
(Cellulose synthase-like protein) và các protein tương tác với VirB2 (VirB2
iteractors - BTIs) bao gồm BTI1, BTI2, BTI3 và AtRAB8. Các receptor BTI này
liên kết với T-pilus của vi khuẩn. Tuy nhiên, chức năng chính xác của các receptor
này chưa được biết rõ.
Khi mô thực vật bị tổn thương, tế bào thực vật tiết ra các hợp chất phenolic,
monosacharid để bảo vệ. Tuy nhiên, chính các hợp chất này lại dẫn dụ vi khuẩn và
đồng thời kích hoạt hệ thống điều hòa hai thành phần VirA/VirG trên màng tế bào
vi khuẩn bởi quá trình phosphoryl hóa. Hệ thống này sau đó hoạt hóa các gen vir
để cuối cùng mã hóa cho hàng loạt các protein Vir (VirA, VirB, VirC, VirD, VirE,
VirF).