NGHIÊN CỨU TẠO PHÁT SINH PHÔI SOMA TỪ PHÔI NON MỘT SỐ DÒNG THÔNG NHỰA Pinus merkusii Jungh. et de Vriese

ĐẠI HỌC QUỐC GIA THÀNH PHỐ HỒCHÍ MINH
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
o0o



BÙI QUANG KIỆT


NGHIÊN CỨU TẠO PHÁT SINH PHÔI SOMA TỪ PHÔI
NON MỘT SỐ DÒNG THÔNG NHỰA Pinus merkusii

Jungh. et de Vriese


CHUYÊN NGÀNH: SINH LÝ THỰC VẬT
MÃ SỐ: 60 42 302



LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC


NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: TS. VƯƠNG ĐÌNH TUẤN




THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH-2010
LỜI CẢM ƠN

Xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến:
TS Vương Đình Tuấn - đã tận tình hướng dẫn, động viên và đóng góp nhiều ý
kiến quý báu.
Cảm ơn các cô chú, anh chị ở Viện nghiên cứu khoa học lâm nghiệp Nam Bộ, đã
quan tâm, giúp đỡ và hỗ trợ trong thời gian tiến hành đề tài tốt nghiệp.
Xin chân thành cảm ơn:
− Ban giám hiệu ĐH Khoa học Tự Nhiên Tp Hồ Chí Minh
− Phòng đào tạo sau đạ
i học
− Ban chủ nhiệm khoa Sinh học
− Bộ môn Sinh lý thực vật
đã tạo giảng dạy, truyền đạt nhiều kiến thức quý báu và tạo điều kiên thuận lợi
trong quá trình thực hiện đề tài .
Chân thành cảm ơn cha mẹ, anh chị em và bạn bè đã động viên hỗ trợ về tinh thần
cũng như vật chất trong quá trinh sinh sống và học tập.
Cảm ơn các anh chị, các b
ạn học viên Cao học K15, K16, K17, K18 đã đồng hành
trong quá trình học tâp, cũng như chia sẽ nhiều tài liệu, kiến thức quý giá.
Tất cả là nguồn động viên, tiếp thêm nghị lực để tôi hoàn thành tốt chương trình
học cũng như hoàn thành khóa luận tốt nghiệp này, là niềm khích lệ để tôi bước
tiếp những bước thành công trong tương lai.
Một lần nữa, xin chân thành cảm ơn.
TP Hồ Chí Minh 12/2010


Bùi Quang Kiệt
1


HV.Bùi Quang Kiệt Luận Văn Thạc Sĩ

MỞ ĐẦU

Thông nhựa hay còn gọi là thông hai lá có tên khoa học là Pinus merkusii
Jungh. et de Vriese, là một trong số ít những loài thông nhiệt đới trên thế giới. Thông
nhựa phân bố nhiều ở vùng Đông Nam Á, trong đó có Việt Nam.
Thông nhựa chủ yếu được trồng để lấy nhựa phục vụ một số ngành công nghiệp
như sơn, sản xuất nhựa đường. Nhựa thông được tinh chế để thu tinh dầu thông, phần
còn lại là Colophan được xà phòng hóa để làm xà phòng, làm keo trong sản xuấ
t giấy
và một số ứng dụng trong công nghiệp điện, làm chất đốt v.v… Ngoài ra, gỗ thông còn
được dùng trong xây dựng, đóng đồ gia dụng. Thông nhựa có thể sống ở những vùng
đồi trọc, đất đai khô cằn, nghèo dinh dưỡng nên được trồng để cải tạo môi trường và
chống xói mòn đất.
Ở Việt nam, thông nhựa được trồng nhiều ở một số tỉnh như Quảng Ninh,
Quảng Bình, Nghệ
An, Hà Tĩnh và Lâm Đồng…Tuy nhiên, trong mấy năm gần đây (từ
2005-2007) rừng thông nhựa bị tấn công bởi nhiều loài sâu bệnh, đặc biệt là sâu róm,
gây thiệt hại rất lớn về kinh tế. Vì vậy, việc tuyển chọn, lai tạo để tìm ra giống thông
nhựa có khả năng chống chịu cao với sâu bệnh, nhất là sâu róm đang là yêu cầu cấp
thiết của sản xuất.
Hiện nay, việc nghiên cứu tạ
o chọn giống thông nhựa kháng sâu bệnh được tiến
hành chủ yếu là phương pháp truyền thống nên tốn rất nhiều thời gian để đưa một
giống mới vào sản xuất.
Với sự phát triển mạnh mẽ của công nghệ sinh học, đặc biệt là công nghệ sinh
học thực vật đã đạt được những thành tựu quan trọng trong việc cải tạo giống cây
trồng. Cụ
thể, ở Canada người ta đã tạo được giống thông có khả năng chống chịu cao
với sâu ăn lá bằng cách bắn gen Bt vào loài Pinus strobus (Lachance và ctv 2007). Tuy
nhiên, để áp dụng kỹ thuật chuyển gene, một bước không thể thiếu được đó là xây

2


HV.Bùi Quang Kiệt Luận Văn Thạc Sĩ
dựng hệ thống tái sinh in vitro vật liệu dự kiến chuyển gene. Các tài liệu đã công bố
trên thế giới cho thấy ở chi thông, phần lớn kết quả chuyển gene thành công đều được
tiến hành trên vật liệu là thể tiền phôi soma.
Vì thế, để đạt được mục tiêu là tạo được giống thông nhựa kháng sâu róm bằng kỹ
thuật chuyển gen, việc nghiên cứu hệ
thống tái sinh in vitro thông qua con đường tạo
phôi soma là hết sức cần thiết.
Tuy nhiên, hiện nay ở Việt Nam, chưa có bất cứ một công trình nào được công bố về
hướng nghiên cứu này, vì thế, đề tài : “ Nghiên cứu tạo phát sinh phôi soma từ phôi
non một số dòng thông nhựa Pinus merkusii Jungh. et de Vriese ” được đề xuất
nhằm tạo được nguồn vật liệu cho ứng dụng kỹ thuật chuyển gene Bt để tạo cây thông
nhựa kháng sâu róm trong tươ
ng lai. Mặt khác, kỹ thuật tạo phôi soma còn là một kỹ
thuật nhân giống mới nhằm tạo ra hàng loạt cây con với số lượng lớn và có thể áp dụng
trên quy mô công nghiệp.
Mục tiêu đề tài: xây dựng được kỹ thuật tạo phát sinh phôi soma hiệu quả
nhằm cung cấp nguồn vật liệu cho các nghiên cứu chuyển gene và nhân giống vô tính
thông nhựa.

i

i

MỤC LỤC
Trang

 Trang tựa
 Lời cảm ơn .
 Mục lục i
 Danh mục chữ viết tắt v
 Danh mục bảng vi
 Danh mục hình vi
 Danh mục ảnh vii

Mở đầu 1
Chương 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3
1.1 Giới thiệu về chi Pinus 3
1.1.1 Phân loại Pinus merkusii 3
1.1.2 Phân bố 4
1.1.3 Đặc đi
ểm sinh học 4
1.1.4 Giá trị kinh tế 5
1.1.5 Con đường sinh sản ở thông nhựa 6
1.2 Phôi soma và quá trình hình thành phôi soma 7
1.2.1 Sơ lược về phôi soma. 7
1.2.2 Sự phát sinh phôi soma 8

1.2.3 Sơ lược quá trình nghiên cứu phôi soma 10
1.3 Tiềm năng phát sinh phôi soma 10
1.4 Các giai đoạn phát triển của phôi 11
1.4.1 Sự phát sinh phôi hữu tính 11
ii

ii

1.4.1.1 Điều hòa sự phát triển của phôi 11
1.4.1.2 Thiết lập chương trình phát sinh phôi 11
1.4.2 Các giai đoạn của sự phát sinh phôi 12
1.4.2.1 Các bước tạo phôi vô tính 13
1.4.2.1.1 Nuôi cấy tạo phôi 13
1.4.2.1.2 Nuôi cấy tăng sinh phôi 15
1.4.2.1.3 Giai đoạn tiền trưởng thành của phôi 15
1.4.2.1.4 Sự phát triển của phôi 15
1.4.2.2 Xây dựng bản đồ phát triển của phôi ở thực vật hạt trần 16
1.5 Một số giả thuyết trong quá trình phát sinh phôi soma 18
1.6 Một số yế
u tố ảnh hưởng đến quá trình phát sinh phôi soma 19
1.6.1 Nhân tố tác động đến quá trình cảm ứng 19
1.6.2 Nhân tố tác động đến sự gia tăng số lượng phôi 21
1.6.2.1 Chất điều hòa sinh trưởng thực vật và nitơ khử 22
1.6.2.2 Kiểu di truyền thực vật 22
1.6.3 Nhân tố ảnh hưởng đến sự biệt hóa mô 22
1.7 Ứng dụng của quá trình tạo phôi soma 23

Chương 2: Vật liệu và phương pháp nghiên cứu 25
2.1 Đối t
ượng nghiên cứu 25

2.2 Nội dung nghiên cứu 25
2.3 Vật liệu nghiên cứu 27
2.4 Phương pháp nghiên cứu 27
2.4.1 Thu quả non và xử lý vô trùng 27
2.4.2 Phương pháp cảm ứng tạo khối tiền phôi 27
2.4.3 Nghiên cứu sự tăng sinh của khối tiền 28
2.4.4 Nghiên cứu sự trưởng thành của phôi 28
iii

iii

2.4.5 Phương pháp quan sát hình thái phôi 28
2.4.6 Phương pháp sinh trắc nghiệm đo lượng hocmon nội sinh 28
2.4.7 Phương pháp đo cường độ hô hấp 30
2.5 Môi trường nuôi cấy 30
2.5.1 Môi trường cảm ứng 30
2.5.2 Môi trường duy trì và tăng sinh khối 31
2.5.3 Môi trường trưởng thành 31
2.6 Bố trí thí nghiệm 31
2.7 Các chỉ tiêu theo dõi và xử lý số liệu 31

Chương 3: Kết quả và thảo luận 34
3.1 Khảo sát ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy đến quá trình cảm ứ
ng tạo khối tiền
phôi 38
3.2 Cấu trúc hình thái trong quá trình cảm ứng tạo thể phát sinh phôi 38
3.3 Ảnh hưởng của nước dừa đến các biến đổi hình thái và giai đoạn nhân nhanh . 39
3.4 Thí nghiệm ảnh hưởng của Glutamin đến các biến đổi hình thái và giai đoạn nhân
nhanh khối sinh phôi 3
3.5 Thí nghiệm Ảnh hưởng của đường maltose và sucrose lên sự tăng sinh khối của

PEM 47
3.6 Quan sát cấu trúc hình thái của khối phát sinh phôi trong quá trình phát triển 49
3.7 Ảnh hưởng của n
ồng độ ABA đến cấu trúc hình thái và tỷ lệ tạo phôi thành thục
hóa 50
3.8 Các giai đoạn của quá trình phát sinh phôi soma 51
3.9 Kết quả đo cường độ hô hấp 54
3.10 Sự thay đổi hoạt tính chất điều hòa tăng trưởng thực vật trong quá trình nuôi cấy
55

iv

iv


Chương 4:
KẾT LUẬN - KIẾN NGHỊ 57
TÀI LIỆU THAM KHẢO………………………………………………………59
PHỤ LỤC

3


HV.Bùi Quang Kiệt Luận Văn Thạc Sĩ



CHƯƠNG 1
TỔNG QUAN TÀI LIỆU

4


HV.Bùi Quang Kiệt Luận Văn Thạc Sĩ
CHƯƠNG 1
TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Giới thiệu về chi Pinus:
Theo phân loại của Stefanovic và ctv.,1998, bộ Coniferales gồm 7 họ: Pinaceae,
Cupressaceae sensu lato, Araucariaceae,
Podocarpaceae, Cephalotaxaceae,
Taxaceae và Sciadopityaceae. Pinaceae là
họ lớn nhất trong 7 họ, bao gồm 11 chi, tất
cả đều lưỡng tính, chứa 215 loài, hơn một
nửa các loài này thuộc chi Pinus.
Chi Pinus chia làm 2 chi nhỏ: Strobus
(haploxylon) và Pinus (diploxylon).
Pinaceae được xem là họ phân bố ở bắc
bán cầu mặc dù có những ngoại lệ như: Pinus
caribaea và
Pinus merkusii phân bố vùng nhiệt
đới. [13]
1.1.1 Phân loại Pinus merkusii:
• Giới: Plantae
• Ngành: Pinophyta
• Lớp: Pinopsida
• Bộ: Pinales
• Họ: Pinaceae
• Giống: Pinus

• Loài: P.merkusii Jungh. et de Vriese[31]

Hình 1.1: Quả và hạt P.merkusii
(www.educorolla6.blogspot.com)
Hình 1.2: Vùng phân bố P. merkusii
(
www.conifers.or
g
)

5


HV.Bùi Quang Kiệt Luận Văn Thạc Sĩ
1.1.2 Phân bố:
Pinus merkusii là một trong rất ít loài thông nhiệt đới trên thế giới có thể chịu được
khí hậu nóng ẩm, đất đai khô cằn và khí hậu gần biển. Trên thế giới, cây phân bố
nhiều ở khu vực Đông Nam Á như Thái Lan, Lào, Myamar, Việt Nam, Philipine,
Campuchia…Ở Việt Nam thông nhựa phân bố nhiều ở các tỉnh miền trung và một số ở
các tỉnh đông bắc bộ: Thanh Hóa, Quảng Ninh, Hà Tĩnh, Nghệ An, Quảng Bình,
Quả
ng Trị, Lâm Đồng (Đà Lạt)… [2], [31]
1.1.3 Đặc điểm sinh học:
Pinus merkusii là cây gỗ lớn, cao trung bình 20 - 25 m, đường kính 60 - 70 cm có
khi tới 1m, thân cây thẳng và tròn, gốc không có
bạnh vè, vỏ dày màu nâu đỏ nhạt, nứt dọc sâu, tán
lá rộng hình tháp góc phân cành từ 25 - 80
o
, cành
cứng và giòn, hai lá kim mọc ra từ một bẹ, bẹ dài

1-1,5 cm, màu nâu nhạt (Lâm Công Định, 1977)
[1]
Pinus merkusii là loài cây lưỡng tính, nón đực mọc
ra ở các nách bẹ lá, có chiều dài từ 2 - 3 cm, màu
vàng nhạt, khi chín có màu vàng đậm.
Là cây thụ phấn nhờ gió nên nón đực chủ yếu tập
trung ở những cành nằm phía dưới tầng tán lá, còn
nón cái ngược lại chủ yếu ở phần trên tán lá. Nón
cái được mọc ra ở các đầu cành, thường có
2-4 nón, nón gồm nhiều vảy xếp hình xoắ
n
ốc, bên trong vảy có chứa noãn. Noãn cái
chưa được thụ phấn có màu xanh nhạt, vảy giữa mở, nhưng sau khi được thụ phấn thì
vảy quả đóng lại và quả chuyển sang màu xanh đậm. Khi quả chín có màu vàng xậm,
chiều dài quả 10-12 cm, đường kính quả 3-4 cm. [2], [31].
Hình 1.3: Đặc điểm hình thái P.merkusii
()
6


HV.Bùi Quang Kiệt Luận Văn Thạc Sĩ
Hạt thông nhựa hình trái xoan dài 3-4 cm và có cánh, cánh hạt dài 1-1,5 cm. Khi hạt
chín vảy quả mở ra để hạt bay ra theo gió. Thời gian để khi hạt chín đến bay ra khỏi
quả thường không quá một tháng. Chu kỳ sai quả của thông nhựa là 2-3 năm (Lâm
Công Định, 1977) . Thông nhựa là cây ưa sáng hoàn toàn, có khả năng tái sinh hạt rất
mạnh nhưng không có khả năng tái sinh chồi, cây dưới 5 tuổi có thể chịu bóng râm
nhẹ. Tùy từng điề
u kiện sống và loại thông, có giai đoạn cây sinh trưởng rất chậm, cây
5-6 tuổi chiều cao thường không quá 2m, nhưng từ 10-25 tuổi cây sinh trưởng nhanh
nhất, sau đó lại giảm dần. Rễ cọc ăn sâu và rộng, có khả năng liền rễ trong cùng một

cây và khác cây (Lâm Công Định, 1977; Lê Đình Khả và Hồ Viết Sắc, 1980).
1.1.4 Giá trị kinh tế:
Pinus merkusii là cây có giá trị công nghiệp toàn diện, cung cấp nhựa và gỗ. Gỗ
có vân đẹp, mùi thơm, sợ
i dài, có nhiều đặc tính cơ lý tốt, gỗ bền, chống chịu được mối
mọt, không chỉ được dùng làm đồ mộc, xây dựng, nguyên liệu giấy mà nó còn được
làm cả tà vẹt và đóng đồ thủ công mỹ nghệ (Lâm Công Định,1977). Nhựa thông được
ứng dụng rộng rãi cho nhiều ngành công nghiệp. Thành phần nhựa thông chứa 19-
24,1% dầu terpentin; 73,2-77,5% colophan, còn lại là nước và chất tạp (Lâm Công
Định, 1977). Colophan là sản phẩm được dùng trong nhiều ngành công nghiệp xây
dựng và sản xuất sơn, cho công nghiệp kỹ thuật điện và công nghiệp luyện kim. Còn
dầu terpentin được dùng trong các ngành công nghiệp sản xuất sơn và công nghiệp xây
dựng, chế biến các sản phẩm tẩy rửa và hoá chất (Lê Đình Khả và ctv, 1995; Hà Huy
Thịnh, 1999). Thông nhựa còn là cây được trồng để chống xói mòn, phủ xanh đất trống
đồi trọc vì có khả năng chịu hạn và sống trong điều kiện thổ nhưỡng khô cằn, khắc
nghiệt. Vì thế thông nhựa được phát triển còn nhằm mục đích cải tạo môi trường ở
những vùng đất khô cằn, nghèo dinh dưỡng. [1][31][32]

7


HV.Bùi Quang Kiệt Luận Văn Thạc Sĩ
1.1.5 Con đường sinh sản ở thông nhựa
Chu kì sống của thông nhựa là chu kì
sống của thực vật lưỡng đơn bội có 5 đặc
tính chung:
(1) Tính dị bào tử hay (hay bào tử chuyên
biệt cho tính đực và tính cái)
(2) Thể giao tử đực và cái đa bào
(3) Sự duy trì thể giao tử cái bên trong bào

tử trưởng thành
(4) Thụ tinh qua ống phấn
(5) Phát tán của phôi trưởng thành. [13]
Sự thụ phấn và thụ tinh ở thông nhựa.
Thể bào tử cho ra 2 loại bào tử
. Túi bào tử cái giảm phân tạo ra các đại bào tử . Túi bào
tử đực giảm phân tạo các tiểu bào tử đơn bội, sau đó nảy mầm để tạo ra thể giao tử đực
gọi chung là hạt phấn. Sự thụ phấn là việc chuyển hạt phấn (thể giao tử đực), đến vùng
lân cận của thể giao tử cái. Ban đầu, các giao tử đực không chín mà rơi ở giữa các vảy
bắc của nón và đáp trực tiếp lên noãn (nơi chứa các giao tử cái cũng chưa chín). Thể
giao tử đực nội bào tử tạo một ống phấn để đưa tinh tử đến gặp trứng và thực hiện quá
trình thụ tinh.
Sau khi thụ tinh, phôi được hình thành qua các giai đoạn:
• Tế bào hợp tử phân đôi cho tế bào gốc và tế bào ngọn. Tế bào ngọn chủ yếu hình
thành phôi, phân cắt dọc (thẳng góc với vách ng
ăn đầu tiên) thành bốn tế bào. Các
tế bào này đến lượt chúng phân cắt ngang, hình thành một khối cầu 8 tế bào, đó là
giai đoạn tiền phôi.
• Tiếp theo, mô phân sinh rễ mầm, mầm của điểm sinh dưỡng thân mầm và trụ dưới
lá mầm hình thành, phôi được phân hoá lớn lên nhanh hơn dây treo. Tất cả các cơ
Hình 1.4: Chu kì sống thực vật lưỡng
đơn bội [3]
8


HV.Bùi Quang Kiệt Luận Văn Thạc Sĩ
quan mầm trước đây trải qua sự tăng trưởng để phát triển thành cây ở giai đoạn lá
mầm.
• Dây treo có vai trò tạm thời, đẩy phôi vào sâu trong phôi tâm và phôi nhũ, lấy chất
dinh dưỡng để vận chuyển vào phôi.

1.2 Phôi soma và quá trình phát sinh phôi soma
1.2.1 Sơ lược về phôi soma
Phôi soma, phôi dinh dưỡng, phôi vô tính hay phôi thể hệ đều là cùng một khái
niệm để mô tả một cấu trúc l
ưỡng cực bất định bao gồm cực chồi và cực rễ, mà dưới
những điều kiện thích hợp thì có thể phát triển thành một cơ thể có chức năng hoàn
chỉnh. Phôi soma chứa chất dinh dưỡng tương tự phôi hữu tính, có mầm chóp rễ và
chồi đỉnh nên có thể nảy mầm trực tiếp thành cây không qua giai đoạn phát sinh chồi,
rễ [6]
Hình 1.5: Các giai đoạn phát triển của phôi thực vật hạt kín và hạt trần
9


HV.Bùi Quang Kiệt Luận Văn Thạc Sĩ
1.2.2 Sự phát sinh phôi soma
Phát sinh phôi soma là một quá trình trong đó các tế bào soma dưới các điều
kiện cảm ứng sẽ phát sinh các tế bào phôi thông qua một loạt các thay đổi về hình thái
và sinh hóa. Sự phát sinh phôi soma khác với sự phát sinh phôi hợp tử là có thể kiểm
soát các điều kiện nuôi cấy khác nhau.
Phát sinh phôi soma có các thuận lợi chính so với quá trình phát sinh phôi hữu tính là
kiểm soát được quá trình phát sinh phôi, điều khiển được môi trường nuôi phôi, dễ
dàng thu đượ
c một số lượng lớn phôi.
Không giống với những cơ thể sinh vật khác, ở thực vật, tính toàn thế của tế bào không
chỉ có ở các tế bào của phôi hợp tử mà các tế bào soma cũng có mang tính toàn thế. Sự
linh hoạt của chương trình biệt hóa giúp cho các tế bào đã biệt hóa vẫn hoàn toàn có
thể trở về giai đoạn sinh phôi dưới những điều kiện nhất định. Sự lặp l
ại toàn bộ
chương trình phát sinh cơ thể thông qua việc khởi đầu sự tạo phôi đòi hỏi sự tái chương

trình hóa sự biểu hiện của những gen cần thiết. Sau khi đã hoàn toàn thoát khỏi chức
năng trước đó của các tế bào đã biệt hóa, các tế bào soma mang tính toàn thế dưới tác
động cảm ứng phân chia của tế bào sẽ có trạng thái biến dưỡng tương tự như tế bào
trứng đ
ã thụ tinh (Dénes và cộng sự, 1995).
Các tế bào soma của mô thực vật có khả năng trải qua quá trình phản biệt hóa để tạo
một khối các tế bào vô tổ chức, hay còn gọi là mô sẹo, cũng như là có khả năng tạo ra
các tế bào biệt hóa, có nghĩa là tạo các cơ quan bình thường về mặt hình thái và sinh lý
từ các tế bào soma.




Từ tế bào trứng đã
được thụ tinh
Từ các tế bào túi
phôi chưa thụ tinh
Từ các tế bào soma Từ các tiểu bào tử Từ các giao tử độc lập
hay được dung hợp
Phát sinh phôi in planta Phát sinh phôi in vitro
H
ợp
t
ử
Vô tính
Soma
Giao t
ử

Sự sinh phôi hạt

phấn
Thụ tinh in vitro
Sơ đồ1.1: Nhữn
g
con đườn
g
kiểm soát s
ự

p
hát triển
p
hôi ở th
ự
c v
ậ
t b
ậ
c cao
[
7
]

10


HV.Bùi Quang Kiệt Luận Văn Thạc Sĩ
Việc cảm ứng phát sinh phôi in vitro từ mô tế bào soma là một tiến trình phát triển thay
thế xảy ra khi phản ứng với việc thêm nồng độ cao của auxin hoặc các chất có chức
năng tương tự auxin như 2,4-D vào môi trường nuôi cấy. Khả năng đặc biệt này của

các tế bào soma (có thể trải qua quá trình biệt hóa tế bào thành phôi soma) cho phép
thiết lập một hệ thống mô hình có giá trị để
phục vụ nghiên cứu cơ bản về sự phát sinh
phôi vì tiến trình phát triển của quá trình phát sinh phôi soma có nhiều điểm tương
đồng với tiến trình phát triển của quá trình phát sinh phôi hợp tử (Zimmernman, 1993).
Tiềm năng phát sinh phôi của tế bào đòi hỏi phải có sự hiện diện của auxin trong môi
trường nuôi cấy khi tế bào hình thành các khối tiền phôi (PEM – ProEmbryogenic
Mass). Nếu loại auxin ra khỏi môi trường nuôi cấy, các khối tiền phôi này sẽ trải qua
quá trình biệt hóa và sau đ
ó hình thành cây con. Người ta cho rằng khi có sự hiện diện
của auxin, các khối tiền phôi sẽ tổng hợp tất cả các gene cần thiết để biệt hóa. Như vậy,
có thể nói các điểm nhấn phát triển của các giai đoạn dường như được điều hòa ở mức
phiên mã, và quá trình phát sinh phôi thể hệ phải thông qua con đường truyền tín hiệu
trung gian mà auxin đóng vai trò là một điểm nhấn chuyển đổi [7]
Các
đặc tính cơ bản của các tế bào có khả năng sinh phôi: Tế bào có kích thước
nhỏ, đẳng kính, có hoạt động biến dưỡng rất mạnh mẽ, cường độ tổng hợp acid
ribonucleic cao, thể tích không bào giảm, thể tích tế bào chất tăng, nhân và hạch nhân
rất to và đậm màu. Đặc biệt là các tế bào này có một số lượng lớn các ribosome, ty thể,
hạt tinh bột và có mạng lưới nội chất nhỏ (Ammirato, 1987; Emons, 1994; Thorpe,
1988).
M
ặc dù quá trình phát sinh phôi soma in vitro đã và đang được áp dụng rộng rãi trên
nhiều đối tượng thực vật ở các phòng thí nghiệm nuôi cấy mô, nhưng cơ chế sinh học
của quá trình này thì hầu như vẫn chưa được hiểu rõ. Những điều kiện đặc biệt để kích
thích sự phát sinh phôi thì chỉ được thiết lập một cách máy móc theo kinh nghiệm vì
người ta vẫn chưa biết tại sao những kiểu gen hoặc mẫu cấy như vậy lại có tiềm năng
11

HV.Bùi Quang Kiệt Luận Văn Thạc Sĩ
phát sinh phôi, tại sao và làm thế nào để đạt được khả năng đó, cũng như đâu là điểm
nhấn kích hoạt quá trình phát triển của phôi [7][28]
1.2.3 Sơ lược quá trình nghiên cứu tạo phôi soma:
Mặc dù sự tạo phôi vô tính bất định (apomictic adventive embryogeny) xuất
hiện ở một số loài thực vật hạt kín trong tự nhiên, các thí nghiệm cảm ứng hiện tượng
này cũng được ti
ến hành trong nuôi cấy tế bào thực vật in vitro và được mô tả bằng
thuật ngữ “somatic embryogenesis” . Phát sinh phôi soma là một quá trình hình thành
phôi vô tính in vitro (Krishnaraj và Vasil, 1995). Những mô tả đầu tiên về sự hình
thành phôi vô tính trong nuôi cấy tế bào được Steward và cộng sự (1958) và Reinert
(1959) đưa ra khi nuôi cấy tế bào Cà rốt. Cho đến nay quá trình hình thành phôi vô tính
đã được tiến hành thành công trên những cây một lá mầm thuộc các họ sau: Alliaceae,
Araceae, Asparagaceae, Dioscoreaceae, Gramineae, Henerocallidaeae, Iridaceae,
Liliaceae, Musaceae, Orchidaeae, Zingiberaceae [6]

1.3 Tiềm năng phát sinh phôi soma
Khả năng phát sinh phôi soma được biểu hiện tr
ước hết là ở mức kiểu gen
(Kielly và Bowley, 1992; Moltrasio và cộng sự, 2004). Điều này có thể được chứng
minh dễ dàng bằng cách chuyển khả năng phát sinh phôi từ kiểu gen có khả năng phát
sinh phôi sang kiểu gen ngăn cản sự phát sinh phôi thông qua quá trình lai giống hữu
tính (Bowley và cộng sự, 1993; Kielly và Bowley, 1992; Moltrasio và cộng sự, 2004).
Mặc dù các điều kiện kích thích sự phát sinh phôi đã được thiết lập cho nhiều loài,
nhưng vẫn còn một số lượng lớn các loài ch
ưa thể tạo phôi soma. Thậm chí ngay trong
cùng một loài, có kiểu gen dễ tạo phôi nhưng cũng có kiểu gen ngăn cản sự tạo phôi.
Tuy nhiên, cần phải nhấn mạnh rằng trong nhiều trường hợp, sự ngăn cản tạo phôi có
thể được giải quyết bằng cách tối ưu hóa các điều kiện sinh trưởng của cây hoặc bằng
cách chọn lựa mẫu cấy thích hợp (Krishna Raj và Vasil, 1995). Vì vậy, việc xác định

các đặc tính di truyền có thể chỉ được sử dụng để xác định thời điểm và vị trí biểu hiện
12


HV.Bùi Quang Kiệt Luận Văn Thạc Sĩ
khả năng sinh phôi. Do đó, khả năng phát sinh phôi chủ yếu được xác định thông qua
chương trình phát triển của thực vật cũng như những dấu hiệu của môi trường.[6]

1.4 Các giai đoạn phát triển của phôi. [4], [26]
1.4.1 Các giai đoạn của sự phát sinh phôi hữu tính:
Sự phát triển của phôi có thể chia thành 2 bước chính sau đây ( Dodeman và ctv,
1997):
(i) Sự phát sinh phôi sensu stricto: ở thực vật h
ạt trần có thể chia thành 3 giai đọan
(Singh, 1978):
− Tiền phôi: tất cả giai đọan trước khi có sự kéo dài của dây treo
− Phôi sớm: tất cả giai đọan sau khi có sự kéo dài của dây treo và cho tới trước khi
hình thành đỉnh sinh trưởng rễ.
− Phôi muộn: sự phát triển mô học mạnh mẽ, bao gồm sự thiết lập đỉnh sinh trưởng rễ
và chồi
(ii) Sự trưởng thành của phôi tiếp sau đó là sự nảy mầm.[5] [28]
1.4.1.1 Điều hòa sự phát triển của phôi:
Suốt quá trình phát triển của phôi, một số lượng gene khổng lồ cần được biểu
hiện để đảm bảo xuất phát từ một hợp tử, một tế bào phát triển tạo nên một cấu trúc đa
bào. Có hơn 3.10
4
gen khác nhau biểu hiện ở phôi và cây con (Thomas,1993). Người ta
thấy rằng có khoảng 3500 gen khác nhau cần thiết để hoàn tất quá trình phát triển
phôi. Trong số đó có khoảng 40 gen quyết định trực tiếp đến sự hình thành toàn bộ các
yếu tố cấu thành phôi Arabidopsis thaliana (Mayer và ctv, 1991). [6]

1.4.1.2 Thiết lập chương trình phát sinh phôi:
Có 2 cơ chế dẫn đến sự đa dạng trong các chương trình phát sinh phôi: sự phân
chia không cân xứng của các tế bào phân cực và sự quyết định chương trình sinh phôi
phụ
thuộc vào vị trí mặt phẳng phân chia tế bào (Laux, Jurgens, 1997).
13


HV.Bùi Quang Kiệt Luận Văn Thạc Sĩ
Mặt phẳng phân chia đóng vai trò quan trọng trong suốt quá trình hình thành phôi bởi
khi phân chia tế bào bao gồm phân chia tế bào chất và các phân tử điều hòa. Kết quả
của việc phân chia bất đối xứng là các tế bào con sinh ra được thừa hưởng những thành
phần quyết định khác nhau từ tế bào chất, do đó mang những chương trình phát triển
khác nhau. Một số yếu tố cần cho quá trình phiên mã được mã hóa bởi gen SHORT-
ROOT (SHR) c
ần cho sự phân chia bất đối xứng chịu trách nhiệm trong việc hình
thành mô nền. Do vậy, yếu tố này được cho là có tham gia vào con đường truyền tín
hiệu bằng khuếch tán vòng (Helariutta và ctv.,2000). Giai đoạn phát triển tiếp theo của
tế bào được quyết định bởi các sự kiện được thiết lập từ trước, sau đó được truyền sang
các thế hệ tế bào tiếp theo. Tuy nhiên, trừ giai đoạn đầu hình thành biểu bì, sự phát
triển mô phôi được quyết định bởi vị trí của tế bào hơn là việc truyền đạt thông tin
cứng nhắc như trên (Dawe, Freeling, 1991). Nói một cách chung nhất, sự thiết lập
chương trình tế bào trong sự phát triển phôi liên quan đến họat động của các protein
điều hòa, kết quả của sự biểu hiện các gen tại vị trí đó (Lindsey, Topping, 1993).
Mặc dù có sự liên lạc giữa các tế bào nhưng cơ chế phân tử của nó vẫn chưa được hiểu
rõ, tuy nhiên, theo Mayer và Jurgens (1998) thì sự trao đổi thông tin đó nhờ hai cơ chế:
tín hiệu được truyền qua bề mặt tế bào thông qua receptor của serine threonine kinase
có các vùng lặp lại giàu leucin và cơ chế trao đổi phân tử tín hiệu thông qua cầu liên
bào (Mayer, Jurgens, 1998).
Phân tích về dòng vô tính chỉ ra rằng các tế bào mầm được chuyên biệt bởi tín hiệu về

vị trí và ảnh hưởng của các tế bào ở vị trí cao nhất của đỉnh sinh trưởng chồ
i. Nghĩa là
chỉ có thế hệ sau của các tế bào mầm ở vị trí này mới có tính toàn thể, còn những tế
bào rời bỏ vị trí này sẽ trở nên biệt hóa (Mayer và ctv.,1998; Bowman, Eshed,
2000).[6]
1.4.2 Các giai đoạn của sự phát sinh phôi vô tính:
Sự phát sinh phôi vô tính được định nghĩa là một quá trình trong đó cấu trúc lưỡng cực
giống phôi hữu tính phát triển từ một tế bào dinh dưỡng và không có liên kết mao
14


HV.Bùi Quang Kiệt Luận Văn Thạc Sĩ
mạch với tế bào gốc ban đầu. Sự phát sinh phôi vô tính xảy ra tương tự như một số giai
đoạn tương tự như phôi hữu tính. Phôi vô tính có thể biệt hóa trực tiếp từ mẫu cấy
không cần đi qua trung gian giai đoạn tạo mô sẹo hoặc gián tiếp thông qua giai đoạn
tạo mô sẹo (callus) (Williams, Maheswaran, 1986).
Phát sinh phôi vô tính là một quá trình gồm nhiều bước, khởi đầ
u bằng việc hình thành
khối tiền phôi (PEM), theo sau đó là sự hình thành phôi vô tính, phôi trưởng thành,
phôi ở giai đoạn miên trạng và cuối cùng là giai đoạn tái sinh cây.
Sự tái sinh thực vật thông qua con đường phát sinh phôi vô tính gồm năm giai đoạn:
− Nuôi cấy tạo phôi bằng cách chọn lựa mẫu cấy sơ cấp cho vào môi trường bổ sung
chất điều hòa sinh trưởng (chủ yếu là auxin)
− Tăng sinh của quá trình nuôi cấy phôi trên môi trường rắn hoặc l
ỏng có bổ sung các
chất điều hòa sinh trưởng tương tự như trên
− Giai đoạn trước khi trưởng thành của phôi trong môi trường không có chất điều hòa
sinh trưởng, để ngăn sự tăng sinh và kích thích sự tạo phôi và phát triển sớm
− Giai đoạn phôi trưởng thành bằng cách nuôi cấy phôi trong môi trường bổ sung
ABA và/hoặc giảm áp lực thẩm thấu.

− Sự phát triển của cây trên môi trường không có chất đ
iều hòa tăng trưởng.[5][6]
1.4.2.1 Các bước tạo phôi vô tính:
1.4.2.1.1 Nuôi cấy tạo phôi:
Các tế bào dinh dưỡng thực vật có chứa đầy đủ các thông tin di truyền cần thiết
để tạo nên một cơ thể thực vật có chức năng hoàn chỉnh. Việc cảm ứng quá trình phát
sinh phôi trước hết phải tác động để kết thúc sự biểu hiện gen hiện tại và thay nó bằng
chương trình biểu hiện gen phát sinh phôi. Một cơ chế
có thể ngừng biểu hiện gen là
methyl hóa DNA, có thể tiến hành bằng auxin (LoSchiavo và ctv, 1989).
Người ta cho rằng các chất điều hòa sinh trưởng và stress đóng vai trò trung tâm trong
điều hòa truyền tín hiệu, dẫn đến tái thiết lập chương trình biểu hiện gen. Điều này dẫn
đến kết quả là cảm ứng một loạt các phản ứng phân chia tế bào, dẫn đến tăng trưởng
15


HV.Bùi Quang Kiệt Luận Văn Thạc Sĩ
khối mô sẹo (callus) không tổ chức hoặc tăng trưởng có cực, từ đó đưa đến phát sinh
phôi (Dudits và ctv,1995). Việc khởi động con đường phát sinh phôi chỉ giới hạn ở một
vài loại tế bào nhất định của mô sơ cấp hoặc các tế bào có khả năng họat hóa các gen
liên quan đến phát sinh phôi.
Hai cơ chế quan trọng trong phát sinh các tế bào phôi in vitro là : sự phân chia tế bào
bất đối xứng và sự kéo dài tế bào (de Jong và ctv, 1993b; Emons, 1994). Phân chia tế
bào b
ất đối xứng được thúc đẩy bởi các chất điều hòa sinh trưởng thay đổi cực tế bào
bằng các can thiệp vào sự chênh lệch pH (gradient pH) hoặc điện trường xung quanh tế
bào (Smith, Krikorian, 1990). Khả năng kiểm soát sự phát triển tế bào chịu ảnh hưởng
bởi polysaccharides vách tế bào và các enzyme thủy giải (de Jong và ctv, 1993a;
Emons, 1994; Fry,1995) [4]

Khả năng hình thành phôi vô tính được quyết định bởi gen. Có những khác biệt đ
áng
kể về kiểu gen cho những tính trạng này. Có những loài thực vật biểu hiện tiềm năng
phát sinh phôi không chịu ảnh hưởng loại mẫu cấy như ở loài Daucus carota và
Medicago sativa, trong khi những loài khác phải sử dụng mô phôi hoặc các mô còn rất
Hình 1.6: Sự phân chia tế bào trong quá trình phát sinh phôi thực vật hạt kín (a) và hạt trần (b)
16


HV.Bùi Quang Kiệt Luận Văn Thạc Sĩ
trẻ hoặc mô còn non. Kiểu đáp ứng phát sinh phôi của các mô nuôi cấy chịu tác động
của ngoại cảnh và bị ảnh hưởng bởi giai đoạn phát triển của thực vật , bản chất của
mẫu cấy… (Litz, Gray, 1995).
Nhu cầu auxin hoặc các chất điều hòa sinh trưởng thực vật khác cần cho việc khởi
động sự phát sinh phôi phần lớn chịu
ảnh hưởng của mô cấy tại thời điểm đó. Thông
thường khởi sự phát sinh phôi (embryogenic cell) được tạo thành ở môi trường có chứa
auxin [4]
1.4.2.1.2 Nuôi cấy tăng sinh phôi:
Một khi tạo được các tế bào tiền phôi, chúng tiếp tục tăng sinh, tạo thành cụm
tiền phôi (PEM). Auxin rất cần cho việc tăng sinh khối tiền phôi (PEM) nhưng lại ức

chế khối tiền phôi (PEM) phát triển thành phôi vô tính (de Vries và ctv.,1988; Nomura,
Komamine 1985; Filonova và ctv.,2000a). Mức độ hấp thụ auxin tùy thuộc theo loài.
Môi trường để duy trì và tăng sinh khối tiền phôi (PEM) tương tự như trong môi
trường cảm ứng nó. Có thể nuôi cấy trên môi trường bán rắn, tuy nhiên, nuôi cấy huyền
phù cho tốc độ tăng sinh cao và các tế bào phát triển đồng đều hơn. Ở một số loài, phôi
có thể cấy chuyền sau thời gian dài trên môi trường có chất điều hòa sinh trưởng mà
vẫn mang đầy đủ tiềm năng phát triển thành phôi. Tuy nhiên, sai biệt về gen tăng lên
v
ới việc kéo dài thời gian cấy chuyền, làm suy giảm khả năng phát triển của phôi [6]
1.4.2.1.3 Giai đoạn tiền trưởng thành của phôi:
Sự chuyển tiếp từ khối tiền phôi (PEM) sang phôi có vai trò rất quan trọng, là
một sự kết nối giữa sự tăng sinh của khối tiền phôi (PEM) và sự phát triển có tổ chức
của phôi. Không nên xử lý cho phôi vô tính trưởng thành trước khi nó đạt đến một giai
đoạn phát triển thích hợp.
1.4.2.1.4 S
ự phát triển của phôi:
Suốt giai đọan trưởng thành, phôi vô tính trải qua các biến đổi về hình thái và
sinh hóa. Các bộ phận dự trữ như lá mầm, tăng trưởng mạnh mẽ cùng với việc tích lũy
các vật chất dự trữ . Các phôi vô tính tích lũy sản phẩm dự trữ có đặc điểm tương tự
17


HV.Bùi Quang Kiệt Luận Văn Thạc Sĩ
như phôi hữu tính. Sản phẩm dự trữ cũng hướng đến một số bào quan dưới mức tế bào
(Merkele và ctv., 1995). Tuy nhiên, lượng các chất dự trữ cũng như thời điểm tích lũy
các chất dự trữ có sự khác biệt giữa phôi vô tính và hữu tính (Merkele và ctv.,1995;
Yeung, 1995). Sự tổng hợp và tích lũy các chất dự trữ và protein có nhiều trong giai
đoạn phôi muộn (late embrogenesis abundant). Ở m
ột số loài, môi trường nuôi phôi
cần được bổ sung ABA để kích thích sự trưởng thành. Abscisis (ABA) còn có tác dụng

làm giảm quá trình phát sinh phôi thứ cấp hoặc ức chế sự nảy mầm sớm. Tuy nhiên,
tiếp xúc với ABA nhiều có thể ảnh hưởng xấu tới thực vật sau này (Bozhkov và ctv,
1998). Nhiều nhân tố như ethylene, stress nước, pH và quang kỳ cũng được cho là ảnh
hưởng đến sự trưởng thành của phôi. Sự trưởng thành của phôi hữu tính thường tr
ải
qua giai đoạn làm khô phôi để làm giảm quá trình trao đổi chất và đi vào trạng thái
miên trạng. Sau giai đoạn này, việc hydrate hóa hạt sẽ làm chúng đáp ứng và nảy mầm
ngay tức thời. Đối với phôi vô tính có thể không tuân thủ các giai đoạn như phôi hữu
tính mà chúng có khả năng nảy mầm ngay, tuy nhiên, các cây này tỉ lệ sống thấp. Có
thể làm phôi đi vào trạng thái miên trạng bằng cách khử nước. Một số yếu tố tác
động
đến chất lượng của phôi như là áp suất thẩm thấu (muối vô cơ, acid amin, đường,
polyethylen glycol…), stress nước v.v.… Polyethylen glycol (PEG) hay được sử dụng
vì đây là hợp chất cao phân tử. Các phân tử PEG không thể đi xuyên qua vách tế bào
trong khi nước thì lại đi ra khỏi tế bào, dẫn đến giảm lực trương tế bào . Mặc dù, việc
thêm PEG vào môi trường có tác dụng kích thích trưởng thành, tuy nhiên, nhiều nghiên
cứu cho thấy PEG tác động xấu lên sự nảy mầm c
ủa phôi và tăng trưởng của rễ. Đối
với loài Picea abies, PEG ảnh hưởng đến hình thái phôi và sự phát triển mô phân sinh.
1.4.2.2 Xây dựng bản đồ phát triển của phôi ở thực vật hạt trần
Filonova và ctv.,2000 đã dùng kỹ thuật time-lapse để nghiên cứu con đường
phát triển của phôi ở Pinus. Abies. Theo đó, từ vài cụm tế bào khối tiền phôi (PEM) I
ban đầu, là những tế bào nhỏ, cứng có tế bào chất đậm đặc bên c
ạnh các tế bào có
không bào lớn. Khi nuôi cấy trong môi trường dinh dưỡng thích hợp có bổ sung auxin
18


HV.Bùi Quang Kiệt Luận Văn Thạc Sĩ
và cytokinin, cụm tế bào khối tiền phôi (PEM) I sẽ phát triển thành nhiều tế bào có

không bào lớn và tiến tới giai đoạn kế tiếp khối tiền phôi (PEM) II

Sơ đồ 1.2: Mô tả con đường phát triển của sự phát sinh phôi vô tính P.abies[16]

Bằng thử nghiệm đánh dấu đọan đứt (dUTP mediated deoxynucleotidyl
transferase), người ta có thể phát hiện ở một trong các tế bào giàu không bào của cụm
khối tiền phôi (PEM) II vài tín hiệu đầu tiên của sự thoái hóa nhân trong suốt con
đường phát sinh phôi vô tính (Filonova và ctv, 2000b). Kích thước của khối tiền phôi
(PEM) II tăng dần lên do chúng phân chia tế bào. Cả tế bào giàu tế bào chất và tế bào
nhiều không bào trong khi vẫn giữ
được tính phân cực của chúng. Sau đó, tính phân
cực mất dần di do sự gia tăng hoạt động tăng sinh. Quá trình này tiếp tục cho đến khi
cấu trúc khối tiền phôi (PEM) III được hình thành, theo sau là sự biệt hóa các phôi của
khối tiền phôi (PEM) III. Một điều ngẫu nhiên xảy ra cùng với sự tạo phôi, khối tiền
phôi (PEM) III thoái hóa dần (chương trình tự chết của tế bào).
Loại bỏ các chất điều hòa sinh trưởng ra khỏi môi trường nuôi c
ấy làm gia tăng đáng
kể sự phát sinh phôi và giảm sự chết tế bào theo chương trình của khối tiền phôi (PEM)
(Filonova và ctv., 2000b). Trong phân tích kiểm soát thời gian ở các tế bào, người ta
thấy rằng phôi bắt đầu phát triển trong môi trường không bổ sung chất điều hòa sinh
trưởng.
19


HV.Bùi Quang Kiệt Luận Văn Thạc Sĩ
Để phôi phát triển và trưởng thành, việc nuôi cấy được bổ sung ABA Đáp ứng với
ABA, cụm phôi có màu đục, đi kèm là sự loại bỏ dây treo thông qua chương trình chết
tế bào (Filonova và ctv.,2000b). Sau đó, phôi bắt đầu kéo dài. Sự kiểm soát khi phôi
trưởng thành toàn diện giống như phôi hữu tính.[15]

1.5 Một số giả thuyết trong quá trình phát sinh phôi soma
Ở các loài thực vật bậc cao, việc không thể phát sinh phôi hợp tử ở mộ
t số loài
được cho là có liên quan đến sự sinh sản tiếp hợp vô tính - sinh sản vô phối (apomixis)
(gồm hơn 400 loài cây thuộc ít nhất 40 họ khác nhau; Bicknell và Koltunow, 2004).
Trong quá trình sinh sản vô phối, sự hình thành hạt vô tính bắt đầu từ những mô mẹ
của noãn, không trải qua quá trình giảm phân và thụ tinh, dẫn đến sự phát triển của
phôi (Bicknell và Koltunow, 2004).
Hiện tượng sinh sản vô phối đã bộc lộ hai khía cạnh quan trọng của quá trình phát sinh
phôi ở thực vật:
(1) những nhân tố
kích hoạt sự thụ tinh có thể được thay thế bằng các cơ chế nội sinh.
(2) ở một số loài thực vật bậc cao, ngoài tế bào trứng được thụ tinh thì các loại tế bào
khác cũng có thể duy trì và giữ lại khả năng phát triển phôi.
Mặc dù quá trình sinh sản vô phối chỉ hạn chế đối với các tế bào phát sinh đỉnh hoặc
noãn, nhưng cũng có một số lượng lớn tế bào soma thực vật có thể trải qua quá trình
phát triển phôi dưới những điều kiện thích hợp. Tất cả các tế bào soma ở thực vật đều
có chứa toàn bộ thông tin di truyền cần thiết cho việc hình thành nên một cơ thể thực
vật hoàn thiện với đầy đủ các chức năng cần thiết. Trong suốt quá trình phát triển, sự
biểu hiện gen ở thực vật được kiểm soát chặt chẽ theo không gian và thờ
i gian để cho
phép sự biệt hóa của rất nhiều cơ quan trong cơ thể.
Sự cảm ứng hình thành phôi vô tính phải làm kết thúc sự biểu hiện của một gen trong
mô thực vật tại thời điểm đó, và thay thế nó bằng chương trình biểu hiện của gen sinh