Đề cương công nghệ sinh học

ĐỀ CƯƠNG CÔNG NGHỆ SINH HỌC
PHẦN I. CÁC KỸ THUẬT NỀN CỦA CNSH HIỆN ĐẠI
Câu 1. Khái niệm về Enzym giới hạn? Cách đặt tên, kiểu cắt, tần suất cắt? Ứng
dụng của Enzym giới hạn trong công nghệ gen?
Trả lời
1. Khái niệm Enzym giới hạn (Restriction enzym) – RE
- Là enzym chỉ cắt ADN tại những trình tự đặc hiệu (vị trí nhất định) do chúng chỉ
nhận biết được 1 trình tự đặc trưng và cắt trình tự đó tại 1 điểm cố định
- Các RE có vị trí cắt rất đặc hiệu nhưng lại không đặc hiệu về loài nghĩa là chúng
có khả năng cắt bất kỳ loại ADN nào tách chiết từ các nguồn khác nhau.
2. Cách đặt tên (cho RE loại II: loại phổ biến nhất hiện nay)
Tên gọi của các RE được quốc tế quy định:
- Chữ đầu viết hoa là chữ đầu tiên trong tên chi vi khuẩn mà từ đó RE được phát
hiện
- Tiếp theo là 2 chữ đầu của tên loài không viết hoa
- Sau đó là một chữ viết hoa chỉ tên chủng
- Cuối cùng là chữ số La Mã chỉ thứ tự RE được phát hiện
3. Kiểu cắt (cho RE loại II)
Có 2 kiểu:
 Cắt tạo ra đầu bằng:
+ Cắt cả 2 mạch ADN ở cùng 1 vị trí
+ Các đoạn cắt theo kiểu này không có khả năng tự kết hợp lại mà phải dùng
Enzym nối hoặc adaptor đặc dụng cho từng loại enzym
 Cắt tạo đầu so le:
+ Cắt 2 mạch ADN ở vị trí lệch nhau
+ Tạo ra các đoạn ADN có các đầu so le có trình tự nu hoàn toàn bổ sung
cho nhau nên có thể tự nối với nhau, các đầu so le gọi là đầu dính.
4. Tần suất cắt (cho RE loại II)
Giả thiết sự sắp xếp của các bazo là ngẫu nhiên thì xác suất để 1 đoạn trình tự
được nhận biết là 1/4
n

(n là số nu của chuỗi được nhận biết)
 Như vậy chuỗi trình tự càng ngắn bao nhiêu thì xác suất nó tình cờ xuất hiện
trong 1 đoạn ADN càng lớn bấy nhiêu
Vd: Đoạn cần nhận biết có 4 nu thì cứ 4
4
= 256 cặp bazo sẽ gặp lại đoạn đó 1 lần
5. Ứng dụng (cho RE loại II)
Điều quan trọng của các RE kiểu II là tác động của nó không bị sai lệch. Khi
một mẫu ADN được xử lý bằng một trong những RE này thì toàn bộ các điểm nhận
biết đều bị cắt. Như vậy có thể xây dựng các bản đồ giới hạn của ADN cho các RE khi
cho ADN bị cắt bởi từng RE riêng lẻ cũng như tổ hợp của các RE này.
Bằng cách này có thể thiết lập được các bản đồ giới hạn cho các phân tử ADN
khác nhau.
Câu 2. Vector nhân dòng là gì? Nêu tiêu chuẩn của 1 vector nhân dòng? Trình bày
cấu trúc di truyền và nguyên tắc chọn lọc của vector plasmid sử dụng trong công
nghệ gen?
Trả lời
1. Khái niệm vector nhân dòng
Sau khi tách chiết ADN, cắt chúng bởi các E. giới hạn thì công đoạn quan trọng
tiếp theo là nhân bản các đoạn ADN đã cắt thành nhiều bản đồng nhất và sắp xếp
chúng thành từng dòng riêng. Quá trình này gọi là tách dòng gen hoặc nhân dòng
gen.
Trong thực tế các đoạn ADN lạ không thể tự duy trì và nhân bản trong tế bào chủ
nếu như nó được chuyển vào TB mới chỉ ở dạng 1 đoạn ADN đơn. Các đoạn ADN
muốn tái bản trong TB chủ mới cần phải được gắn vào 1 vector nhân dòng.
Vector nhân dòng thực chất là 1 phân tử ADN có gốc tái bản và có thể nhân
lên trong TB chủ đã chọn .
2. Tiêu chuẩn của 1 vector nhân dòng
- ADN của vector nhân dòng lý tưởng là chỉ có một điểm nhận biết một RE
nào đó. Nếu địa điểm này >1 thì sẽ gây rối loạn cho sự nhân dòng sau này.

- Tất cả vector nhân dòng phải có một hay nhiều chỉ thị di truyền chọn lọc như
tính kháng sinh, tính xúc tác cho các phản ứng tạo màu => Nhận biết, chọn lọc
được những tế bào đã nhận được vecto nhân dòng.
- Các vector nhân dòng phải có ít nhất một điểm tái bản, để đảm bảo chúng có
thể tự nhân lên trong tế bào chủ mới.
3. Cấu trúc di truyền
- Là các phân tử ADN nhỏ, mạch vòng, nằm ngoài NST của TB vi khuẩn và có
khả năng tự nhân bản do có chứa 1 trình tự như 1 gốc tái bản ADN
- Thường chứa 1 số gen có tính đặc thù rất cao
+ Một số mang thông tin về giới tính và có thể chuyển từ TB này → TB
khác qua tiếp hợp
+ Một số mang đặc tính chống chịu với kháng sinh
+ Một số có gen đặc hiệu có khả năng sử dụng các chất trao đổi bất thường
+ Một số không mang gen mã hóa bất kỳ chức năng nào
- Kích thước plasmid dao động từ 1→vài trăm kb
4. nguyên tắc chọn lọc của vector plasmid
Câu 3. Nhân dòng gen (Cloning gen) là gì ? Trình bày kỹ thuật nhân dòng gen bằng
vector plasmid?
Trả lời
1. Khái niệm nhân dòng gen
Sau khi tách chiết ADN, cắt chúng bởi các E. giới hạn thì công đoạn quan trọng
tiếp theo là nhân bản các đoạn ADN đã cắt thành nhiều bản đồng nhất và sắp xếp
chúng thành từng dòng riêng. Quá trình này gọi là tách dòng gen hoặc nhân dòng gen.
2. Trình bày kỹ thuật nhân dòng gen bằng vector plasmid
 Bước 1. Chuẩn bị Plasmid
• Chọn plasmid : thường dùng pUC có các đặc tính sau :
+ Chứa đoạn gen kháng kháng sinh (ampicillin)
+ Chứa đoạn gen chịu trách nhiệm sinh màu (gen này mã hóa cho
β galactosidase, enzym này + X - gal sẽ cho màu xanh)
• Cắt pUC = RE cùng loại đã cắt ADN

 Bước 2. Gắn ADN đã cắt vào plasmid
• Trộn các đoạn ADN + plasmid theo tỷ lệ thích hợp
• Ủ hỗn hợp trên : 10 – 15
0
C trong 6h với E. ligase
 Bước 3. Chuyển nạp các plasmid đã gắn ADN vào TB E.coli
• Xử lý vỏ ngoài vi khuẩn = CaCl
2
nhằm tăng hoạt tính tiếp nhận plasmid
• Tạo hỗn hợp VK + plasmid đã gắn ADN trong điều kiện lạnh
• Đưa hỗn hợp trên vào 40
0
C trong 90s: sự phân chia TB xảy ra, plasmid sẽ
tự tiếp xúc với các TB VK
• Ngay lập tức đưa hỗn hợp vào lạnh, sốc lạnh sẽ khiên cho plasmid đi vào
và cố định trong TB VK
• Chuyển hỗn hợp này vào đĩa petri (đĩa petri có chứa môi trường nuôi cấy
VK + bổ sung chất kháng sinh + cơ chất cho phản ứng tạo màu) ủ 1 đêm ở
37
0
C.
 Bước 4. Chọn lọc khuẩn lạc VK có chứa ADN đã chuyển
Nguyên tắc chọn khuẩn lạc VK có chứa ADN đã chuyển
• VK có chứa plasmid đã chuyển nạp thì mới tồn tại được trên môi trường và
sinh khuẩn lạc
• Mặt khác, vùng gen chịu trách nhiệm sinh màu là vùng bị cắt để gắn ADN
ngoại vào
 Khuẩn lạc có màu xanh là khuẩn lạc có chứa plasmid nhưng không gắn ADN lạ
 Khuẩn lạc có màu trắng là khuẩn lạc có chứa đoạn ADN lạ được ghép vào. Do
đó cần tách lấy khuẩn lạc màu trắng và lưu giữ chúng riêng rẽ.

Câu 4. Trình bày phương pháp lai Southern Blot?
Trả lời
1. Khái niệm
- Được Edwin Southern đề xuất năm 1975
- Cho phép xác định sự có mặt của những trình tự nu/ 1 đoạn ADN trong một
hỗn hợp các đoạn ADN khác nhau dựa trên sự bắt cặp của mẫu dò (ADN mẫu dò) đã
được đánh dấu P
32
với đoạn ADN có chứa trình tự bổ sung với mẫu đó
2. Các bước trong Southern Blot: bao gồm 7 bước
 Bước 1: Chiết tách ADN, cắt ADN => thu được hỗn hợp các đoạn cắt AND
khác nhau
 Bước 2: Điện di hỗn hợp/ gel agarose (nồng độ 0,8% + đẹm TBE) ở hiệu
điện thế 1,5V/cm chiều dài gel
 Bước 3: Làm biến tính (tách thành sợi đơn) các băng ADN trên gel điện di
= cách xử lý gel điện di 20ph trong NaOH 0,4M
 Bước 4: Đặt gel lên hệ thống giá chuyển → in các ADN đã biến tính lên tấm
lọc (màng lai). Tấm lọc này sẽ giữ chặt các đoạn ADN được chuyển lên. Quá trình này
được thực hiện với dung dịch dẫn chuyển là NaOH 0,4M
 Bước 5 : Lai các đoạn AND trên màng lai với dung dịch mẫu dò đã được
đánh dấu (P
32
hoặc chất gây phản ứng màu), thực hiện ở buồng lai (65 - 68
0
C trong 6 –
12h)
 Bước 6: Sau kết thúc phản ứng lai, đem rửa màng lai để loại bỏ các mẫu dò
không tham gia phản ứng lai
 Bước 7: Phát hiện vị trí lai nhờ kỹ thuật phóng xạ tự ghi. Nơi xảy ra phản
ứng sẽ mang hoạt tính phóng xạ. Khi đặt phim lên tấm lọc, nơi có phản ứng lai sẽ phát

xạ vào phim, tráng phim thu được các vết đen tại nơi phát xạ chính là địa điểm lai.
Câu 5. Trình bày kỹ thuật RFLP và ứng dụng?
Trả lời
1. Kỹ thuật RFLP
Khi cắt ADN nhân bằng các RE sẽ sản sinh ra hàng triệu đoạn cắt xếp liên tục
cạnh nhau theo kích thước khi điện di. Nếu như đưa các đoạn này lên điện di rồi
nhuộm màu và xem xét dưới ánh sáng tử ngoại, con người không thể quan sát thấy sự
phân cách giữa các đoạn cắt.
Để giải quyết vấn đề này, người ta không thể so sánh sự sai khác của toàn bộ
đoạn cắt mà chỉ so sánh sự sai khác về một trình tự nu bất kỳ nào đó trên các
băng điện di.
Một đoạn ADN nào đó lấy từ thư viện mẫu đã nhân dòng sẽ được sử dụng làm
mẫu dò để phát hiện ra trình tự nu tương ứng trên các băng điện di
Tiến hành phản ứng Southern Blot (trình bày phản ứng này đã nói ở câu 4)
So sánh sự hiện diện của các vị trí lai sẽ phát hiện được tính đa hình của các
đoạn cắt.
2. Ứng dụng
• Phát hiện được sự có mặt của gen cần tìm trong hệ gen sinh vật nghiên cứu
• Phát hiện được sự đa dạng ADN của các cá thể khác nhau
• Phát hiện các đột biến
• Phát hiện các thể lai soma qua dung hợp TB trần
• Lập bản đồ giới hạn của một gen
•
Câu 6. Phương pháp xác định trình tự nu của ADN? Cho ví dụ minh họa?
Trả lời
1. Phương pháp Maxam Gilbert
Dựa trên phân giải hóa học: Sử dụng hóa chất để phân hủy ADN tại vị trí các
bazơ nitơ khác nhau → các đoạn có chiều dài khác nhau 1 nu.
Các bước tiến hành:
 Bước 1: Chuyển đoạn ADN về dạng sợi đơn

 Bước 2: Đánh dấu phóng xạ P
32
tại đầu 5’
 Bước 3: Chia các sợi đơn thành 4 mẫu riêng rẽ và xử lý với hóa chất đặc hiệu để
phá hủy 1 hoặc 2 trong 4 loại bazơ (tức là thay đổi trật tự gốc phosphat)
 Bước 4: Xử lý tiếp các mẫu này với piperillin để bẻ gãy ADN tại các bazơ đã bị
phá hủy
 Bước 5: Điện di riêng rẽ 4 mẫu này. Khi đó sự phân bố các đoạn này trên điện di
đồ tương ứng với kích thước của chúng có chiều dài hơn kém nhau 1 nu.
 Bước 6: Đưa gel hiện hình rồi đọc các băng hình trên phim để xác định trình tự
sợi đơn ADN
Đọc tiếp mạch bổ sung còn lại
2. Phương pháp Sanger (phương pháp enzym)
Dựa vào hoạt động của enzym ADN polymerase (xúc tác để gắn các đoạn
ADN chỉ chênh lệch nhau 1 nu)
- Trong phương pháp này, người ta sử dụng các nhân tố kết thúc đặc hiệu quá
trình kéo dài ADN khi tổng hợp. Nhân tố này là các 2,3 didesoxynucleotit
triphosphat (ddNTP)
+ Các phân tử này có thể kết hợp vào chuỗi ADN đang tổng hợp bình
thường nhưng không kết hợp được với phân tử desoxynucleotit
triphosphat (dNTP) tiếp theo
+ Khi trộn lẫn lượng nhỏ ddNTP với 4 loại dNTP rồi tiến hành tổng hợp
nhờ enzym ADN polymerase → cho một loạt các đoạn ADN được kết
thúc 1 cách đặc hiệu bởi gốc ddNTP
- Tiến hành thí nghiệm tương tự cho 4 phản ứng tổng hợp ADN tách rời, mỗi
phản ứng bổ sung 1 loại ddNTP khác nhau → các đoạn ADN kết thúc bằng
gốc ddNTP và hơn kém nhau 1 nu
- Chạy điện di các đoạn này rồi hiện hình chúng → Ta có thể xác định trình tự
chuỗi ADN.
3. Giải trình tự gen bằng phương pháp tự động

- Nguyên tắc chung của máy là giải trình gen tự động là dựa theo cơ sở của
phương pháp Sanger
- Quá trình tổng hợp được thực hiện nhờ máy PRC có các hóa chất tiêu chuẩn và
phần mềm xử lý số liệu
- Máy đọc trình tự trên cả 2 mạch đơn nên kết quả rất chính xác.
Câu 7. Trình bày kỹ thuật PCR và ứng dụng?
Trả lời
Nêu được các ý sau :
 Kỹ thuật PCR : Khái niệm, nguyên tắc, chu trình (sơ đồ), yêu cầu cần
thiết, yếu tố ảnh hưởng
 Ứng dụng
1. Kỹ thuật PCR
 Khái niệm
Bản chất của kỹ thuật PCR (phản ứng chuỗi polymerase) là kỹ thuật tổng hợp
nhân tạo các đoạn ADN với tốc độ nhanh chưa từng thấy và có độ chính xác cao được
thực hiện trong máy chu trình nhiệt (máy PCR).
 Nguyên tắc của PCR
Dựa trên sự xúc tác của enzym ADN polymerase để có thể nhân bản ADN nhờ
đoạn mồi (primer) tương hợp với đầu 3’ và 5’
 Chu trình PCR
Một chu kỳ của PRC gồm 3 giai đoạn:
• Giãn xoắn
• Gắn mồi
• Kéo dài mạch bổ sung
Các giai đoạn của PCR được thể hiện rõ qua sơ đồ sau:
Sơ đồ chu trình PCR
Biến tính để tách chuỗi mới
tổng hợp thành các sợi đơn
Tổng hợp các sợi ADN mới
(65 – 75

0
C, 2 - 5ph
Gắn mồi vào các sợi đơn
(30 - 65
0
C, 30s)
Biến tính mẫu ADN thành các sợi
đơn (94
0
C trong 5ph)
Một chu trình gồm khoảng 30 – 35 chu kỳ là đủ, nếu kéo dài thêm chu kỳ không
những số sản phẩm tăng không đáng kể mà tăng thêm cả sự sai sót.
 Các yêu cầu cần thiết của PCR
- 2 mồi phải có trình tự bổ sung với 2 đầu của đoạn ADN cần nhân dòng (mối
xuôi và mồi ngược)
- Khoảng cách giữa 2 mồi này không quá 1kb để tránh hiện tượng bắt cặp giữa
các mồi.
- Các mồi có kích thước ít khác nhau
 Các yếu tố ảnh hưởng đến phản ứng PCR
- Độ tính sạch của ADN khuôn
- Sự hoạt động của RE
- Nồng độ các loại nu
- Nồng độ của các dung dịch đệm
2. Ứng dụng của kỹ thuật PCR
- Giúp tách nhanh và chính xác từng gen hoặc từng đoạn ADN riêng biệt
- Là kỹ thuật nền cho nhiều phương pháp nghiên cứu sinh học phân tử quan
trọng
- Chẩn đoán nhanh, nhạy, chính xác các bệnh di truyền
- Giúp xác định giới tính của động vật và người ở giai đoạn phôi thai sớm
- Khôi phục các gen của các loài sinh vật cổ xưa

- Giúp xác định nguồn gốc hài cốt liệt sĩ vô danh, thủ phạm hình sự
Câu 8. Kỹ thuật RAPD: nguyên lý và ứng dụng?
Trả lời
1. Nguyên lý
- Phương pháp RAPD thực chất là quá trình nhân bản các đoạn ADN bằng
kỹ thuật PCR có sử dụng các mồi được thiết kế ngẫu nhiên. Các mồi này sẽ
bắt cặp một cách ngẫu nhiên vào ADN ở bất kỳ vị trí nào mà tại đó có trình tự
bổ sung với nó.
- Theo lý thuyết 1 mồi ngẫu nhiên gồm 10 nu thì xác suất bắt gặp 1 trình tự bổ
sung với nó trong mạch ADN (được cấu tạo từ 4 nu) là 1/4
10
= 1/ 1.048.576
- Giả sử một bộ gen đơn bội của lúa có kích thước 550.000 Kb = 550.000.000
bp, vậy khả năng mồi ngẫu nhiên (gồm 10 nu) có thể có 550.000.000/
1.048.576 = 524 vị trí bắt cặp.
- Do mồi gắn với ADN ở 2 điểm khác nhau trên các sợi đơn đối diện của ADN
khuôn nên sẽ có 262 đoạn ADN khác nhau được nhân. Như thế số băng điện di
sản phẩm PCR rất phong phú.
2. Ứng dụng
Phát hiện tính đa dạng đáng tin (sự mất đoạn NST, sự thay đổi, thêm bớt nu, xen
đoạn,..đều làm thay đổi kích thước đoạn nhân bản)
Câu 9. Kỹ thuật tạo thư viện mẫu cADN ?
Trả lời
Khái niệm cADN: là các phân tử ADN được tổng hợp từ khuôn ARN thông qua
quá trình sao chép ngược. cADN được thu thập và lưu giữ trong các ngân hàng cADN
Kỹ thuật tạo thư viện mẫu cADN
 Bước 1 – Tách mARN: có thể tách riêng mARN nhờ các tổ hợp Oligonucleotit
chỉ chứa desoxythimidin (Oligo dT). Gồm các công đoạn sau :
• Chiết xuất toàn bộ ARN của TB gồm : mARN, tARN, rARN
• Cho hỗn hợp này đi qua phễu chiết gắn xenlulo – oligo dT

• Các mARN sẽ bị giữ lại trong phễu do hình thành liên kết A – T
• Dùng dung dịch NaCl để đẩy tARN + rARN ra khỏi phễu
 Tách riêng được mARN
 Bước 2 - Giải phóng mARN khỏi phễu : dùng dung dịch đệm Tris EDTA cho
chảy qua phễu, các mARN sẽ được giải phóng do liên kết A – T bị phân giải
 Bước 3 - Dùng các mARN này làm khuôn với sự có mặt của Enzym sao chép
ngược + các nguyên liệu → Quá trình tổng hợp ADN xảy ra
=> Thu được các cADN
 Bước 4 - Các cADN sẽ tiếp tục được nhân dòng và tập hợp thành các thư viện
cADN. Để tìm ra các cADN cần thiết, người ta có thể sử dụng các phương
pháp lai ADN hoặc phản ứng với protein kháng thể.
PHẦN II. CÔNG NGHỆ SINH HỌC THỰC VẬT
Câu 1. Định nghĩa về công nghệ nuôi cấy mô tế bào thực vật ? Khả năng ứng dụng của
nuôi cấy mô tế bào thực vật trong công tác nhân và chọn tạo giống cây trồng ?
Trả lời
1. Định nghĩa về công nghệ nuôi cấy mô TBTV
Nuôi cấy mô tế bào thực vật (nuôi cấy in vitro) là phạm trù khái niệm để chỉ
chung cho tất cả các loại nuôi cấy nguyên liệu thực vật hoàn toàn sạch các vi sinh vật
trên môi trường dinh dưỡng nhân tạo trong điều kiện vô trùng.
Bao gồm :
• Nuôi cấy cây non và cây trưởng thành
• Nuôi cấy cơ quan : rễ, thân, lá, hoa, quả, bao phấn, noãn chưa thụ tinh
• Nuôi cấy phôi : phôi non và phôi trưởng thành
• Nuôi cấy mô sẹo (callus)
• Nuôi cấy TB đơn
• Nuôi cấy protoplast: nuôi cấy phần bên trong TBTV sau khi tách vỏ (nuôi
cấy TB trần)
2. Khả năng ứng dụng
Khả năng ứng dụng của nuôi cấy mô tế bào thực vật trong công tác nhân và
chọn tạo giống cây trồng được thể hiện qua bảng dưới đây

Bộ phận nuôi cấy Mục đích