Phương pháp đo hoạt độ enzyme

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP.HCM
BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC
TÀI LIỆU THỰC TẬP CÔNG NGHỆ ENZYME – PROTEIN
BÀI 1: CHUẨN BỊ HÓA CHẤT
1. Pha hóa chất chuẩn bị cho định hoạt tính enzyme protease:
- Dung dịch Na
2
HPO
4
1/15M: hòa tan 5,9690g Na
2
HPO
4
.12H
2
O trong
nước vừa đủ 250 ml.
- Dung dịch KH
2
PO
4
1/15M : hòa tan 0,9072 g KH
2
PO
4
trong nước
vừa đủ 100 ml
- Dung dịch đệm Sorensen pH 7,6: trộn chung dung dịch Na
2
HPO
4

1/15M với dung dịch KH
2
PO
4
1/15M đến khi pH đạt 7,6.
- Dung dịch casein 1%: pha 1g Casein trong 100 ml dung dịch đệm
Sorensen
- Dung dịch TCA 5%: hòa tan 5 g TCA trong nước cho đủ 100 ml
- Dung dich NaOH 0,5N: hòa tan 10 g NaOH trong nước cho đủ 500
ml.
- Thuốc thử Folin ( pha loãng với nước cất theo tỷ lệ 1:5)
- Dung dich HCl 0,2N: trộn 4,25 ml HCl đậm đặc với nước cho đủ
250 ml
- Dung dịch Tyrosine 20 µM/l : khuấy nghiền 1,8119 g Tyrosin trong
dung dịch HCl 0,2N vừa đủ 500 ml
- Dung dịch Tyrosin chuẩn 1 µM/l trong dung dịch HCl 0,2N: pha
loãng 5 ml dung dịch Tyrosine 20 µM/l trong dung dịch HCl 0,2N
thành 100 ml
2. Pha hóa chất chuẩn bị cho định hoạt tính enzyme phytase:
- Dung dịch cơ chất acid phytic 0,2% (m/v ) trong đệm sodium
acetae 0,1M pH5 : cân 1g sodium phytat trong 500ml sodium axetat
0,1M dùng acid acetic đậm đặc để chỉnh về pH5.
- Dung dịch phospho mẫu 0,01M: cân 0,136g KH
2
PO
4
hòa với nước
thành 100ml.
- Dung dịch phospho 500 nmo/ml: hút 5ml dung dịch phospho 0,01M,
pha thành 100ml .

- Dung dịch ammonium molybdat 1,5% (w/v) trong H
2
SO
4
5,5% ( kí hiệu
dung dịch a)
+ Hút 28ml H
2
SO
4
đđ (98%) pha với nước thành 500ml, được dung
dịch H
2
SO
4
5,5%
+ Cân 7,5g ammonium molybdate [(NH
4
)6Mo
7
O
24
. 4H
2
O] hòa tan
vào 500ml H
2
SO
4
5,5% vừa pha.

- Dung dịch FeSO
4
5%: cân 5g FeSO
4
hòa với nước cất lạnh thành
100ml ( kí hiệu dung dịch b). Pha trong điều kiện lạnh và dùng liền sau
khi pha ( dung dịch FeSO
4
phải trong suốt, không màu hoặc có màu
vàng rất nhạt, nếu có màu vàng đậm thì phải pha lại)
- Dung dịch thuốc thử phosphat (dùng trong ngày): hỗn hợp giữa
dung dịch a và b tỷ lệ a:b = 4:1
- Dung dịch TCA ( acid trichloro acetic) 5% : cân 25g TCA hòa với
nước thành 500ml
3. Pha hóa chất chuẩn bị cho xác định phương pháp Lowry
- Dung dịch Albumin 1% : pha 1 g Albumin trong 100 ml nước cất.
- Dung dịch NaOH 0,1N: pha 4 g NaOH trong 1000 ml nước cất.
- Dung dịch trisodium citrate 1% : pha 1 g trisodium citrate trong 100 ml
nước cất.
- Dung dịch A: hòa tan 2g Na
2
CO
3
trong NaOH 0,1N thành 100 ml.
- Dung dịch B: hòa tan 0,5g CuSO
4
.5H
2
O trong dung dịch trisodium citrate 1%
thành 100 ml.

- Dung dịch C: hỗn hợp dung dịch A và dung dịch B theo tỷ lệ 49:1. (Pha
trước khi dùng 30 phút).
- Thuốc thử Folin.
4. Pha hóa chất chuẩn bị cho xác định phương pháp Bradford
- Thuốc nhuộm Coomassie Brilliant Blue vào 50 ml etanol 96, them 100
ml H
3
PO
4
85% dẫn nước đến 1000 ml.
- Dung dịch protein chuẩn :
Cân 10 mg Albumin hòa tan vào 100 ml trong bình định mức 100, ta được
dung dịch protein 100µg/ml.
Bài 2 :
PHƯƠNG PHÁP THU NHẬN ENZYME VI SINH VẬT THÔ
TỪ PHƯƠNG PHÁP NUÔI CẤY BỀ MẶT
1. Chuẩn bị mơi trường và giữ giống vi sinh vật
Giống VSV sử dụng trong thí nghiệm là : Aspergillus niger,
Trichoderma….
Môi trường PGA ( dung giữ giống vi sinh vật) sau khi pha chế và đã hấp
khử trùng, lấy ra và để nghiêng 45
0
cho đến khi thạch đông cứng lại. Sử
dụng que cấy móc đã thanh trùng cấy chuyền theo từng điểm hay gõ
vào thành ống cho bào tử bung ra khắp bề mặt thạch.
Giống sau khi cấy, nuôi ở nhiệt độ phòng thí nghiệm trong thời gian 7 ngày,
sau đó bảo quản ở 4
0
C. Sau thời gian 2 tháng cấy chuyền giữ giống một lần
để bảo đảm nguồn dinh dưỡng cho vi sinh vật.

 Môi trường bán rắn khảo sát khả năng sinh tổng hợp enzym amylase
Trấu 55 g
Cám 30 g
Bột bắp 5 g
Bã khoai mì 5 g
Đường 4 g
(NH4)
2
HPO
4
0,1 g
Urê 0,2 g
CaCl
2
0,1 g
KCl 0,05g
MgSO
4
0,05g
Nước bổ sung để đạt thủy phần là 50-60%
Hấp khử trùng ở 121
o
C trong 45 phút
 Môi trường bán rắn khảo sát khả năng sinh tổng hợp enzym cellulase
Tương tự môi trường bán rắn khảo sát khả năng sinh tổng hợp
enzym amylase nhưng thay 5g bột bắp thành 5g bã mía. Hấp khử trùng ở
121
0
C trong 45 phút.
 Môi trường bán rắn khảo sát khả năng sinh tổng hợp enzym pectinase

Tương tự môi trường bán rắn khảo sát sinh tổng hợp enzym amylase
nhưng thay 5g bột bắp và 5 g bã khoai mỳ thành 10g bột cà rốt. Hấp khử
trùng ở 121
0
C trong 45 phút.
 Môi trường bán rắn khảo sát khả năng sinh tổng hợp enzym protease
Tương tự môi trường bán rắn khảo sát khả năng sinh tổng hợp
enzym amylase nhưng thay 5g bột bắp thành 5g bột đậu nành. Hấp khử
trùng ở 121
0
C trong 45 phút.
 Cách pha môi trường
Lần lượt cho các chất khoáng hoà tan trong nước cất trước khi trộn
chung nếu không sẽ tạo kết tủa không tan. Trộn đều hỗn hợp với nhau, cho
thêm nước sao cho độ ẩm là 50 - 60%.
Cho 15g môi trường đã trộn vào các erlen 100ml, hấp khử trùng ở
121
0
C, trong 45 phút. Sau khi hấp khử trùng, các erlen chứa môi trường
bán rắn được để nguội.
2. Phương pháp cấy vi sinh vật vào mơi trường bán rắn
Giống nấm mốc được giữ trong ống thạch nghiêng được cấy vào trong các
erlen. Cho 10ml nước cất vô trùng vào ống thạch nghiêng, hòa đều. Dùng
que cấy móc cà nhẹ lên bề mặt thạch để lấy hết bào tử, đánh nhẹ cho bào
tử ở dạng huyền phù. Tiến hành đếm bào tử bằng phòng đếm hồng cầu.
Cho vào các erlen chứa 15g môi trường một thể tích dòch huyền phù sao
cho đạt mật độ bào tử là 10
5
- 10
6

bào tử / 1g môi trường ( 2ml). Nuôi cấy
ở nhiệt độ phòng 28
0
- 32
0
C, độ ẩm 50 - 60 %.
3. Phương pháp tách chiết dòch enzym thô từ canh trường nuôi cấy
Sau thời gian nuôi cấy nấm mốc, dòch chứa enzym amylase, cellulase,
pectinase, protease thô được tách chiết bằng phương pháp sau:
Cho vào mỗi erlen (chứa 15g canh trường) 100 ml nước cất. Lắc 1 giờ,
đem lọc qua vải, dòch lọc ly tâm 5000 vòng/phút trong 10 phút. Thu lấy dòch ly
tâm rồi đònh mức 100ml. Ta thu được dòch enzym thô và đem xác đònh hoạt độ
amylase, cellulase, pectinase, protease.
BÀI 3.
THU NHẬN ENZYME TỪ THỰC VẬT VÀ PHƯƠNG PHÁP
TINH SẠCH
1.Ly trích enzyme bromelin từ quả dứa :
Dứa xanh tươi đem gọt vỏ, lấy phần thịt, lõi, mắt cho vào máy xay sinh tố xay nát(
không cho thêm nước).Đổ ra trên vải màn, vắt thật kỹ, lấy nước, đem ly tâm 4000
vòng/phút để loại bỏ chất xơ.
2.Tinh sạch bằng Ethanol
 Nguyên tắc
Các dung môi có hằng số điện môi nhỏ (acetol, ethanol…) ngăn cản sự phân
tán của các phân tử protein trong môi trường , làm giảm độ hòa tan của những
phân tử protein và xảy ra kết tủa. Do nhiệt độ bay hơi của dung môi thấp nên dễ
tách bỏ dung môi khỏi chế phẩm enzyme bằng cách sấy nhẹ dưới quạt gió.
 Cách tiến hành
Thu dịch chiết enzyme từ canh trường: Cân 1g bột xay nhuyễn trên rồi bổ
sung thêm nước cất cho đủ 100 ml, ta được dịch enzyme pha loãng 100 lần.
Nghiền, lắc cho enzyme trong canh trường tan đều trong nước rồi ly tâm 3000

vòng/phút trong 10 phút và thu dịch lỏng phía trên.
Làm lạnh đồng thời dịch chiết enzyme và ethanol ở nhiệt độ 0 – 4
o
C. Tiến
hành tủa ở tỷ lệ V
ddE
: V
ethanol
là 1:2. Cho từ từ ethanol vào dung dịch enzyme và
khuấy đều, giữ lạnh trong 40 phút, ly tâm 4000 vòng /phút trong 10 phút, thu lấy
kết tủa.
3.Tinh sạch bằng acetol
Thu dịch chiết enzyme từ canh trường: Cân 1g bột xay nhuyễn trên rồi bổ
sung thêm nước cất cho đủ 100 ml, ta được dịch enzyme pha loãng 100 lần.
Nghiền, lắc cho enzyme trong canh trường tan đều trong nước rồi ly tâm 3000
vòng/phút trong 10 phút và thu dịch lỏng phía trên.
Làm lạnh đồng thời dịch chiết enzyme và acetol ở nhiệt độ 0 – 4
o
C. Tiến
hành tủa ở tỷ lệ V
ddE
: V
acetol
là 1:3. Cho từ từ acetol vào dung dịch enzyme và
khuấy đều, giữ lạnh trong 40 phút, ly tâm 4000 vòng /phút trong 10 phút, thu lấy
kết tủa.
4. Tinh sạch bằng muối (NH
4
)
2

SO
4
Muối

(NH
4
)
2
SO
4
bão hòa có nồng độ 77,8% ( ở nhiệt độ 30
0
C). Cho từ từ
lượng muối vào dung dịch enzyme cho đến nồng độ 80 % bão hòa và khuấy đều,
giữ lạnh trong 60 phút, ly tâm 4000 vòng /phút trong 10 phút, thu lấy kết tủa.
5. Tinh sạch bằng muối NaCl
Muối

NaCl bão hòa có nồng độ 25% ( ở nhiệt độ 30
0
C). Cho từ từ lượng
muối NaCl vào dung dịch enzyme cho đến nồng độ 80 % bão hòa và khuấy đều,
giữ lạnh trong 60 phút, ly tâm 4000 vòng /phút trong 10 phút, thu lấy kết tủa.
BÀI 4:
XÁC ĐỊNH ENZYME PROTEASE BẰNG PHƯƠNG PHÁP ANSON
1. Nguyên lý của phương pháp
Casein bị phân giải trong môi trường kiềm dưới tác dụng của protease tạo
sản phẩm là các đoạn peptide ngắn hòa tan trong tricloroacetic acid (TCA), xác
định lượng tyrosine và tryptophan hòa tan bởi thuốc thử Folin.
2. Đối tượng áp dụng của phương pháp

Phương pháp này áp dụng để xác định hoạt độ enzyme trong thực phẩm,
thức ăn chăn nuôi, chế phẩm sinh học.
3. Dụng cụ và hoá chất
3.1 Dụng cụ, thiết bị
- Máy lắc
- Máy đo mật độ quang
- Bếp ổn nhiệt
- Bình tam giác 250 ml.
- Bình định mức 10 ml, 100 ml, 500ml
- Ống nghiệm
- Pipet 1 ml, 5 ml, 10 ml
3.2 Hoá chất
- Dung dịch Na
2
HPO
4
1/15M: hòa tan 5,9690g Na
2
HPO
4
.12H
2
O trong
nước vừa đủ 250 ml.
- Dung dịch KH
2
PO
4
1/15M : hòa tan 0,9072 g KH
2

PO
4
trong nước
vừa đủ 100 ml
- Dung dịch đệm Sorensen pH 7,6: trộn chung 88,5 ml dung dịch
Na
2
HPO
4
1/15M với 11,5 ml dung dịch KH
2
PO
4
1/15M đến khi pH
đạt 7,6.
- Dung dịch casein 1%: pha 1g Casein trong 100 ml dung dịch đệm
Sorensen
- Dung dịch TCA 5%: hòa tan 5 g TCA trong nước cho đủ 100 ml
- Dung dich NaOH 0,5N: hòa tan 10 g NaOH trong nước cho đủ 500
ml.
- Thuốc thử Folin ( pha loãng với nước cất theo tỷ lệ 1:4).
- Dung dich HCl 0,2N: trộn 4,25 ml HCl đậm đặc với nước cho đủ
250 ml
- Dung dịch Tyrosine 20 µM/l : khuấy nghiền 1,8119 g Tyrosin trong
dung dịch HCl 0,2N vừa đủ 500 ml
- Dung dịch Tyrosin chuẩn 1 µM/l trong dung dịch HCl 0,2N: pha
loãng 5 ml dung dịch Tyrosine 20 µM/l trong dung dịch HCl 0,2N
thành 100 ml
3.3 Chuẩn bị đường chuẩn
3.3.1 Chuẩn bị dung dịch tyrosin chuẩn

- Từ dung dịch tyrosin chuẩn 1 µM/l , xây dựng đường chuẩn với dung
dịch tyrosin có nồng độ từ 0,2 - 1,0 µM/l .
Dung dịch hóa chất
Ống nghiệm
1 2 3 4 5 6
Dung dịch tyrosine chuẩn (ml) 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 0
Lượng tyrosine tương ứng
(µM)
0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 5,0
Dung dịch HCl 0,2N (ml) 4,8 4,6 4,4 4,2 4,0 5,0
Dung dịch NaOH 0,5N (ml) 10 10 10 10 10 10
Thuốc thử Folin (ml) 3 3 3 3 3 3
Lắc mạnh, sau 10 phút đo OD ở bước sóng 660nm
Ống số 6 là ống kiểm chứng (KC), các ống còn lại là ống thí nghiệm (TN).
Vẽ đường chuẩn tyrosine tương quan tương quan giữa lượng tyrosine (µM) và
ΔOD (ΔOD = OD
TN
- OD
KC
).
4. Phương pháp tiến hành
4.1. Chiết mẫu
Mẫu cân chính xác 10g ( đối với mẫu rắn) hoặc 10 ml (đối với mẫu lỏng)
cho vào becher, định mức vừa đủ 100ml bằng nước cất đem lắc trên máy lắc trong
vòng 15 phút. Đem ly tâm lạnh với 4000 vòng/ phút trong 10 phút, thu dịch, bỏ bã
(đối với mẫu lỏng không cần ly tâm, chỉ lắc để đồng nhất mẫu).
4.2 Tiến hành
Lấy 6 ống nghiệm sạch, khô, tiến hành làm 3 ống thử thật, 3 ống thử không
Dung dịch hóa chất
Ống nghiệm

Thử thật Thử không
Dung dịch casein 1% (ml) 5 5
Dung dịch TCA 5% (ml) 0 10
Dung dịch enzyme mẫu (ml) 1 1
Lắc đều và giữ ở 35,5
o
C trong 20 phút
Dung dịch TCA 5% (ml) 10 0
Để yên 30 phút, lọc lấy dịch bên dưới
Lấy 2 ống nghiệm mới khác,cho vào ống thứ nhất 5ml dịch lọc của ống thử
thật và cho vào ống thứ hai 5ml dịch lọc cùa ống thử không.
Tiếp tục thêm vào mỗi ống 10ml NaOH 0,5N và 3ml thuốc thử Folin, lắc
mạnh, sau 10 phút đo OD ở bước sóng 660nm. ΔOD = OD
TT
– OD
TK
, sau đó dựa
vào đồ thị chuẩn suy ra được µM tyrosine.
4.3 Tính kết quả
Định nghĩa đơn vị Anson: một đơn vị Anson là lượng enzyme tối thiểu
trong điều kiện thí nghiệm ( 35,5
o
C: pH 7,6 … ) thủy phân casein trong 1 phút tạo
thành sản phẩm hòa tan trong TCA, phản ứng với thuốc thử Folin cho ta độ hấp
thu OD ở bước sóng 660nm tương ứng với 1 µM tyrosine trong đường chuẩn.


Với:
Hđ Protease : hoạt độ enzyme protease ( UI/g)
V : tổng thể tích hỗn hợp trong ống thử thật hoặc ống thử không (ml)

v : thể tích dịch lọc đem phân tích (ml)
t : thời gian thủy phân (phút)
m : khối lượng mẫu enzyme đem đi xác định hoạt tính (g)
L: độ pha loãng enzyme
µM tyrosine: lượng µM tyrosine trong v (ml) suy ra từ đường chuẩn
Bài 5. XÁC ĐỊNH HOẠT TÍNH PHYTASE (PHƯƠNG PHÁP
FISE VÀ SUBBAROW)
1. Nguyên tắc
Khi cho phosphate tác dụng với ammonium molybdat sẽ tạo ra
phosphomolybdat có màu vàng. Khi khử phosphomolybdat, màu vàng sẽ chuyển
thành màu xanh molybdat. Độ đậm của màu sắc tỉ lệ với hàm lượng phospho trong
mẫu.
Hđ Protease (UI/g)
µM tyrosine * V * L
t * m * v
=
Phản ứng được minh họa như sau:
2(MoO
2
.4MoO
3
) + H
3
PO
4
+ 4H
2
O (MoO
2
.4MoO

3
)
2
. H
3
PO
4.
H
2
O
Các chất khử thường sử dụng là SnCl
2
, hydrazin, acit ascorbic, FeSO
4
,
quinon, oxalat, sulfit. Các chất khử có thể sử dụng đơn độc hay phối hợp với nhau.
Ví dụ: phối hợp giữa sulfit và quinon .
Khi cho phytase tác dụng với cơ chất phytate sẽ giải phóng ra phosphate.
Dựa vào hàm lượng phosphate sinh ra này để đánh giá hoạt tính của enzyme
phytase.
2. Hóa chất
- Dung dịch cơ chất sodium phyta 0,2% (m/v ) trong đệm sodium axetae 0,1M
pH5 : cân 1g sodium phytat trong 500ml sodium acetat 0,1M dùng acid acetic
đậm đặc để chỉnh về pH5.
- Dung dịch phospho mẫu 0,01M: cân 0,136g KH
2
PO
4
hòa với nước thành
100ml.

- Dung dịch phospho 500 nmo/ml: hút 5ml dung dịch phospho 0,01M, pha
thành 100ml
- Dung dịch ammonium molybdat 1,5% (w/v) trong H
2
SO
4
5,5% ( kí hiệu dung dịch
a)
+ Hút 28ml H
2
SO
4
đđ (98%) pha với nước thành 500ml, được dung dịch
H
2
SO
4
5,5%
+ Cân 7,5g ammonium molybdate [(NH
4
)6Mo
7
O
24
. 4H
2
O] hòa tan vào
500ml H
2
SO

4
5,5% vừa pha.
- Dung dịch FeSO
4
5%: cân 5g FeSO
4
hòa với nước cất lạnh thành 100ml ( kí
hiệu dung dịch b). Pha trong điều kiện lạnh và dùng liền sau khi pha ( dung
dịch FeSO
4
phải trong suốt, không màu hoặc có màu vàng rất nhạt, nếu có màu
vàng đậm thì phải pha lại)
- Dung dịch thuốc thử phosphat (dùng trong ngày): hỗn hợp giữa dung dịch a
và b tỷ lệ a:b = 4:1
- Dung dịch TCA ( acid trichloro acetic) 5% : cân 25g TCA hòa với nước
thành 500ml
3. Cách tiến hành:
 Dựng đường chuẩn:
Lấy một loạt ống nghiệm sạch, tiến hành pha dung dịch phospho với nồng độ
theo bảng sau:
Ống nghiệm 0 1 2 3 4 5
Dung dịch phospho 500nmol/ml 0 1 2 3 4 5
Nước cất (ml) 5 4 3 2 1 0
Nồng độ phospho (nmol/ml) 0 100 200 300 400 500
Thuốc thử phosphat (ml) 5 5 5 5 5 5
Lắc đều, để yên ở nhiệt độ phòng (30
o
C), đem đo mật độ quang ở bước sóng
700nm. Dựng đồ thị biễu diễn sự biến thiên của mật độ quang (ΔOD) theo
nồng độ phospho (nmol/ml).

 Phản ứng enzyme:
Cân m(g) chế phẩm enzyme nghiền và hòa với V (ml) nước cất, lắc trên máy
lắc 45 phút để enzyme hòa tan hoàn toàn vào nước, lọc qua giấy lọc ta thu
được dịch enzyme thô. Xác định hoạt tính phytase trong dịch enzyme này.
Thực hiện phản ứng enzyme và phản ứng màu như sau:
Ống nghiệm Thử thật Thử không
Dung dịch cơ chất
phytate (ml)
2 2
Dung dịch TCA 5% (ml) 0 2,5
Dung dịch enzyme 0,5 0
Lắc đều để yên ở 39
o
C, trong 30 phút
Dung dịch TCA 5% (ml) 2,5 0
Dung dịch enzyme (ml) 0 0,5
Thuốc thử phosphat (ml) 5 5
Lắc đều, để yên 5 phút đo mật độ quang ở bước sóng 700 nm
4. Cách tính:
Một đơn vị hoạt tính (đvht) phytase được định nghĩa là lượng enzyme giải
phóng 1nm phospho vô cơ trong 1 phút từ sodium phytat ở 39
o
C, pH5
Hđ Phytase =
a * V * L
0,5 * m * t
(UI/g)
Với:
a: nồng độ phospho suy ra từ đường chuẩn (nmol)
V: thể tích dung dịch phospho trước khi cho thuốc thử (5ml)

L: độ pha loãng enzyme
0,5: thể tích enzyme cho vào phản ứng
m: khối lượng chế phẩm enzyme phân tích
T: thời gian phản ứng ( phút)
Bài 6. XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG PROTEIN BẰNG
PHƯƠNG PHÁP LOWRY
 Nguyên tắc
Hầu hết protein đều chứa tyrosine và tryptophan. Khi cho protein tác dụng với
thuốc thử Folin sẽ tạo thành một phức chất có màu, màu này tỉ lệ với hàm lượng
tyrosine và tryptophan ( hàm lượng protein ). Vì thế ta có thể dùng phương pháp
so màu để xác định hàm lượng protein.
 Hóa chất
Dung dịch Albumin 1% : pha 1 g Albumin trong 100 ml nước cất.
Dung dịch NaOH 0,1N: pha 4 g NaOH trong 1000 ml nước cất.
Dung dịch trisodium citrate 1% : pha 1 g trisodium citrate trong 100 ml nước
cất.
Dung dịch A: hòa tan 2g Na
2
CO
3
trong NaOH 0,1N thành 100 ml.
Dung dịch B: hòa tan 0,5g CuSO
4
.5H
2
O trong dung dịch trisodium citrate 1% thành
100 ml.
Dung dịch C: hỗn hợp dung dịch A và dung dịch B theo tỷ lệ 49:1. (Pha trước
khi dùng 30 phút).
Thuốc thử Folin.

 Cách tiến hành
Dựng đường chuẩn :
Tiến hành dựng đường chuẩn với dung dịch albumin chuẩn có nồng độ protein như sau:
Ống nghiệm 0 1 2 3 4 5
Dung dịch Albumin 0,1%
(ml)
0,0 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5
Nước cất (ml) 10,0 9,5 9,0 8,5 8,0 7,5
Nồng độ Protein (µg/ml) 0 50 100 150 200 250
Hút 0,4ml dung dịch protein có nồng độ khác nhau từ các ống nghiệm vừa
pha ở trên theo thứ tự từ 0 đến 5 vào các ống nghiệm khác. Thêm vào 0,2 ml thuốc
thử Folin, lắc đều trong 5 phút, thêm nước cất cho đủ 5 ml. Đem đo mật độ quang
ở bước sóng 750nm.
Tiến hành dựng đường chuẩn với trục X là nồng độ protein và trục Y là ΔOD
(ΔOD = OD
i
– OD
o
). Dựa vào đường chuẩn này ta xác định được nồng độ protein
trong dung dịch mẫu.
Xác định hàm lượng protein trong dung dịch nghiên cứu
Tiến hành tương tự như phần xây dựng đồ thị chuẩn.
 Cách tính
Dựa vào đường chuẩn Albumin, ta suy ra được nồng độ protein của mẫu.
Hàm lượng protein có trong 1g mẫu được tính theo công thức:
mg protein/g =
m
n *10 *a
-3
Với: a*10

-3
: nồng độ protein suy ra từ đường chuẩn (mg/ml)
n : độ pha loãng mẫu
m : khối lượng mẫu sử dụng (g)
Bài 7. XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG PROTEIN BẰNG
PHƯƠNG PHÁP BRADFORD
Nguyên tắc:
Phương pháp này dựa vào sự thay đổi màu xảy ra khi cho Coomassie Brilliant
Blue liên kết với protein trong dung dịch acid
Hóa chất:
Thuốc nhuộm Coomassie Brilliant Blue vào 50 ml etanol 96, them 100 ml
H
3
PO
4
85% dẫn nước đến 1000 ml.
Dung dịch protein chuẩn :
Cân 10 mg Albumin hòa tan vào 100 ml trong bình định mức 100, ta được dung
dịch protein 100µg/ml
Tiến hành thí nghiệm :
Xây dựng đường chuẩn:
Nồng độ
protein (µg/ml)
0 10 20 40 60 80 100
Dung dịch
protein chuẩn
(ml)
0 1 2 4 6 8 10
Nước cất ( ml) 10 9 8 6 4 2 0
Hút 0,1 ml dung dịch protein vừa pha lõang theo bảng trên, thêm vào 5 ml thuốc

nhuộm, trộn đều, để yên ở nhiệt độ phòng trong 10 phút. Đem đo OD tại bước
sóng 595 nm.
Tương tự, hút 0,1 ml protein cần phân tích, thêm 5 ml thuốc nhuộm, trộn đều, để
yên ở nhiệt độ phòng trong 10 phút. Đem đo OD tại bước sóng 595 nm.
Từ đường chuẩn suy ra hàm lượng protein cần phân tích
Bài 8: SẮC KÝ LỌC GEL SEPHADAX_G50
1. Bước đầu tinh sạch enzyme bằng sắc ký lọc gel.
Nguyên tắc
Kỷ thuật sắc ký lọc gel dùng để tách những phân tử có kích thước, trọng
lượng phân tử khác nhau bằng cách cho chúng đi qua cột gel. Những phân
tử có kích thước đủ nhỏ để lọt vào bên trong lỗ gel sẽ bị trì hoãn và di
chuyển chậm qua cột, trong khi những phân tử lớn hơn di chuyển bên ngoài
các hạt gel nên sẽ di chuyển nhanh và được giải hấp ra khỏi cột sớm hơn
các phân tử nhỏ.
Thực hành
• Dụng cụ và thiết bị
o Phễu đổ gel
o Bình hút chân không
o Cột sắc ký Bio-Rad, kích thước 30*1.5 cm, thể tích: 53 ml.
o Bình đựng dung dịch đệm
o Ống nghiệm 20 cái
• Hóa chất
o Gel “Sephadex G-100”.
o Dung dịch NaN
3
0,02%
o Dung dịch đệm
o Chuẩn bị gel
- Cân 5g gel “Sephadex G-100” khô, cho bột gel từ từ vào
dung dịch NaN

3
0,02 % trong thời gian 24 giờ để gel
trương nở hòan toàn, sau đó mới nhồi vào cột.
- Dùng dung dịch đệm ( phụ thuộc vào enzyme cần tinh
sạch) nhiều gấp 2 lần so với thể tích lớp nền gel cần cho
trong cột. Thêm dung dịch đệm khử khí với thể tích gấp
2 lần thể tích lớp nền và lắc nhẹ. Để gel ổn định cho đến
khi 90% - 95% số hạt ổn định.
- Gắn phễu đổ gel vào cột, đóng lỗ thoát của cột và cho
dung dịch đệm làm đầy 20% thể tích cột.
- Rót đều dung dịch gel vào cột thành một dòng di chuyển
nhẹ. Tránh làm bẩn gel, đảm bảo việc nhồi cột đều và
tránh bị bọt khí.
- Khi lớp nền đã hình thành trong cột từ 2-5cm, mở khóa
đầu ra của cột cho đến khi cột được nạp đầy gel.
- Khi cột đã nạp đầy gel, khóa đầu ra của cột và gắn flow
adaptor. Mở khóa đầu ra của cột và cho dung dịch đện với
thể tích gấp 2 lần thể tích lớp nền chảy qua cột lúc điều
khiển tốc độ chảy.
- Đóng đầu ra của cột và điều chỉnh flow adaptor xuống đến
lớp nền gel. Nạp mẫu vào trên bề mặt lớp nền bằng cách
bơm hoặc tiêm mẫu vào trên lớp nền gel qua flow adaptor.
Nếu tiêm mẫu thì tốc độ dòng tiêm không nên vượt quá
tốc độ dòng tách đề nghị.
o Chuẩn bị mẫu
- Hòa tan hoàn toàn protein trong dung dịch đệm, sau đó
tiến hành lọc. Vì mẫu chạy sắc ký phải sạch.
- Cân khoảng 0,5 mL mẫu có nồng độ 10 mg/mL
- Cho mẫu vào cột, khi đã hết mẫu, tiếp tục cho đệm qua cột
Thu mẫu:

- Mỗi ống nghiệm thu khỏang 2mL; 5- 10 phút /phân
đọan.Sau đó đo hàm lượng protein ở bước song 280 nm
- Ghi nhận các peak tạo thành, các ống có sự hiện diện của
protein sẽ dồn lại thành peak và tiến hành định họat tính
và hàm lượng protein
- Tính hiệu suất về hoạt tính và hàm lượng protein thu được
qua lọc gel.
Bài 9 : ĐIỆN DI
1. Nguyên tắc
SDS-PAGE (Sodium Dodecyl Sulfate-Polyacrylamid Gel
Eloctrophoresis)là một kỹ thuật điện di trên gel polyacrylamid khi có
sự hiện diện của SDS, đây là một tác nhân làm biến tính và âm tính
hóa các phân tử protein. Trong kỹ thuật này protein được xử lý với
chất tẩy SDS và tác nhân khử cầu nối disulfite là mercaptoethanol
hoặc dithiotheitol ( DDT). Với các tác nhân này protein từ cấu trúc
bậc 2, 3, 4 được biến đổi thành chuỗi polypeptide ( bậc 1) và tất cả
các protein đều được tách điện âm. Nhờ đó, sự di chuyển trong gel
của các phân tử protein chỉ phụ thuộc vào kích thước, những phân tử
có kích thước lớn sẽ di chuyển chậm hơn những phân tử có kích
thước nhỏ khi đi qua một lỗ gel có kích thước nhất định. Dưới tác
dụng của điện trường các phân tử tích điện âm sẽ di chuyển về cực
dương và các phân tử tích điện dương sẽ di chuyển về cực âm của
điện trường.
2. Dụng cụ và thiết bị.
- Bộ điện di đứng
- Bộ nguồn chạy điện di
- Pipetteteman 1000µl
- Pipetteteman 200µl
- Pipetteteman 10µl
- Típ xanh: 1 hộp

- Típ vàng: 1 hộp
- Típ trắng: 1 hộp
- Giấy lọc
- Giấy thấm
- Giăng tay: 1 đôi
- Phao để eppendorf.
- Eppendorf
- pH kế
3. Hóa chất.
- N, N, N’,N’-tetramethylenediamide.
- Dung dịch Acryamide/Bisacryamide 40% ( 29:1) (3.3%C)
- β –Mercapptoethanol.
- Thang protein chuẩn SDS-PAGE ( Bio- Rad), gồm các
protein chuẩn có kích thước xác định sau:
+ Phosphorylase b 97.400 Daltons
+ Bovine serum albumin 66.200 Daltons
+ Ovalbumin 45.000 Daltons
+ Carbonic anhydrase 31.000 Daltons
+ Soybean trypsin inhibitor21.500 Daltons
+ Lysozome 14.400 Daltons
- Sodium Dodecyl Sulfate.
- Ammonium persulfate.
- Coomassie Brilliant Blue G 250 dạng viên ( Bio- Rad)
- Cồn tuyệt đối 99,5
0
- Methanol.
- Tris ( hydroxymethyl ) amonimethane
- Axit acetic
- Bromophenol blue
- Glycerol

- Glycine
- Axit clohydric
- Sodium docecyl sulfate ( SDS) 10%: cân 10g SDS cho
100ml nước cất vào khuấy cho tới khi tan hết.
- Dung dich đệm gel phân tách Tris-Cl 1.5M, Ph8.8-
0.4%SDS: cân 36,3g Tris pha trong 100ml nước cất thêm
dần HCl 6N và khuấy dung dich trên cho tới khi pH kế chỉ
8.8. Hút 8ml dung dịch SDS 10% cho vào. Thêm nước cất
cho đủ 200ml, lắc đều giữ ở 4 độ.
- Dung dịch đệm gel gom Tris – Cl 0.5M, pH 6.8-0,4 %
SDS: cân 6.05g Tris pha trong 100ml nước cất thêm dần
HCl 6N và khuấy dung dịch trên cho tới khi ph kế chỉ 6.8.
Hút 4ml dung dịch SDS 10% cho vào. Thêm vào nước
cho đủ 100ml, lắc đều giữ ở 4 độ.
- Ammoniumpersulfate 10% ( chỉ pha trước khi dùng): cân
0.1g cho vào một eppendorf 1000µl thêm 1 ml nước cất,
lắc đều, để ở nhiệt độ phòng.
- Dung dịch đệm điện di Tris-glycine ph 8.3: pha dung dịch
mẹ 10X chứa 30g Tris, 144g Glycine, 10g SDS hòa trong
1000ml nước cất
- Dung dịch nạp mẫu 2X: có thành phần như sau: 2.5ml
dung dịch đệm Tris-Cl 0.5M , ph 6.8,4ml 10%SDS; 2ml
Glycerol; 2mg Bromophenol Blue; 0.2ml
mercaptoethanol; thêm nước đủ 10ml
- Dung dịch nhuộm gel: chuẩn bị 250ml dung dịch nhuộm
gel chứa 0,625g Coomassie Blue G 250, 112.5ml ethanol
tuyệt đối, 112.5ml nước cất và 25ml acid acetic, lắc đều,
giữ trong chai màu tối
- Dung dịch giải nhuộm: 30ml methanol: 10ml acid acetic:
60ml nước cất

4. Phương pháp
1. Đổ gel
Chú ý: Polyacrylamide là chất độc cho thần kinh. Vì vậy không được hít và
uống. khi dính vào nên rữa tay ngay
Chuẩn bị đổ một gel có kích thước 100*100*0.75mm có nồng độ
acrylamide là 10%.
a. Gel tách.
Cho các thành phần sau theo thứ tự vào becher 50ml sạch :
o Acrylamide 2 ml
o Đệm Tris-HCl1,5M pH 8,8 1.25 ml
o SDS 50 µl
o Nước cất 1.7 ml
o TEMED 5µl
o Fersulfatamonium 50 µl
Sau khi cho Amonium persulfate 10% vào, lắc nhẹ ống Falcon vài lần
(tránh tạo bọt khí), dùng pipette Pasteur hoặc pipetteman bơm dung dịch
gel vào khuôn, đổ gel sao cho mức dung dịch gel cao hơn 7cm( tránh tạo
bọt khí trong khuôn gel). Sau đó, nhẹ nhàng đặt một lớp nước cất lên trên
lớp gel để mặt gel được phẳng. chờ gel đông( khoảng 20-30 phút)
b. Gel gom
Cho các thành phần sau theo thứ tự vào một Becher50ml khác:
o Acrylamide 0,68 ml
o Tris-HCl1,5M ph6,8-0,4%SDS 1.25 ml
o SDS 50 µl
o Nước cất 3.05 ml
o TEMED 5 µl
o Fersulfatamonium. 50µl
2. Chuẩn bị mẫu và chạy điện di.
Dùng pipetman 10µl nạp mẫu vào các giếng rồi chạy điện di ổn định dòng:
100 V.Sau khi điện di, nhuộn gel với dung dịch nhuộm đã chuẩn bị trước.

Sau đó giải nhuộm bằng cách ngâm gel trong dung dịch giải nhuộm cho
đến khi gel trở nên trong suốt không màu, lúc này sẽ thấy xuất hiện những
vạch màu xanh lơ trên gel, chụp ảnh gel này để biện luận kết quả