Tạo chủng vi khuẩn edwardsiella ictaluri đột biến bằng phương pháp knockout gen wzz (O antigen chain length determinant gene)

7
ĐẠI HỌC QUỐC GIA THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN


TRẦN THỊ THANH THANH




TẠO CHỦNG VI KHUẨN EDWARDSIELLA ICTALURI ĐỘT BIẾN
BẰNG PHƯƠNG PHÁP KNOCKOUT GEN wzz
(O – ANTIGEN CHAIN LENGTH DETERMINANT GENE)

Chuyên ngành: Vi sinh
Mã số: 60 42 40


LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC


NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC
TS. NGUYỄN QUỐC BÌNH







THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH – 2010

LỜI CẢM ƠN
Để hoàn thành khóa luận này, tôi đã nhận được
rất nhiều sự quan tâm, động viên, giúp đỡ của ba mẹ,
thầy cô, anh chị và các bạn.
Con xin cảm ơn gia đình đã luôn ủng hộ và
động viên con trong cuộc sống cũng như trên con
đường học vấn.
Em xin gởi lời cảm ơn sâu sắc tới TS. Nguyễn
Quốc Bình. Thầy đã định hướng và tạo mọi điều kiện để
em hoàn thành tố
t khóa luận. Cảm ơn Thầy đã truyền
đạt cho em nhiều kiến thức và kinh nghiệm quý báu.
Xin chân thành cảm ơn các anh chị phòng
CNSH Thủy Sản, phòng CNSH Y Dược đã nhiệt tình
giúp đỡ em trong thời gian qua.
Cảm ơn những người bạn của tôi đã luôn bên
cạnh chia sẽ, động viên và cổ vũ tinh thần cho tôi
trong thời gian thực hiện khóa luận.

Trần Thị Thanh Thanh
Trần Thị Thanh Thanh Luận văn Thạc sĩ Sinh học
i
MỤC LỤC
Trang
MỤC LỤC i
DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU, TỪ VIẾT TẮT viii
DANH MỤC CÁC BẢNG ix
DANH MỤC CÁC HÌNH x

DANH MỤC SƠ ĐỒ xiv
MỞ ĐẦU 1
Chương 1 – TỔNG QUAN
1.1. Sơ lược về vi khuẩn Edwardsiella ictaluri gây bệnh mủ gan trên
cá tra 3
1.2. Tình hình nghiên cứu vaccine cho cá kháng vi khuẩn Edwardsiella
ictaluri 4
1.2.1. Những nghiên cứu trên thế giới 4
1.2.2. Những nghiên cứu ở Việt Nam 6
1.3. Lipopolysacharide (LPS) và vai trò của gen wzz trong quá trình tổng
hợp LPS 7
1.3.1. Cấu trúc và chức năng của LPS 7
1.3.2. Quá trình tổng hợp LPS và vai trò của gen wzz 9
1.3.3. Một số nghiên cứu về gen wzz 11
1.4. Phương pháp knockout gen sử dụng hệ thống tái tổ hợp
tương đồ
ng λ Red 12
Trần Thị Thanh Thanh Luận văn Thạc sĩ Sinh học
ii
1.5. Tạo chủng E. icataluri đột biến gen wzz bằng phương pháp
knockout gen và triển vọng làm vaccine 13
Chương 2 – VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP
2.1. Thiết bị, hóa chất, vật liệu 15
2.1.1. Thiết bị và dụng cụ 15
2.1.2. Hóa chất 1 5
2.1.2.1. Hóa chất dùng để tách chiết plasmid 15
2.1.2.2. Hóa chất dùng để tinh sạch sản phẩm PCR 15
2.1.2.3. Hóa chất dùng để tách chiết DNA từ gel agarose 16
2.1.2.4. Hóa chất dùng cho phản ứng cắt giới hạn 16
2.1.2.5. Hóa chất dùng cho phản ứng PCR 16

2.1.2.6. Hóa chất dùng cho điện di DNA 16
2.1.2.7. Thang DNA 17
2.1.2.8. Hóa chất dùng cho chuẩn bị tế bào khả nạp bằng phương pháp
hóa biến nạp 17
2.1.2.9. Hóa chất dùng cho chuẩn bị tế bào khả nạp bằng phương pháp
điện biến nạp 17
2.1.3. Môi trường 18
2.1.3.1. Môi trường LB (Luria Bertami) 18
2.1.3.2. Môi trường BHI (Brain Heart Infusion) 18
2.1.4. Chủng vi sinh vật 18
2.1.5. Plasmid 18
Trần Thị Thanh Thanh Luận văn Thạc sĩ Sinh học
iii
2.1.5.1. Plasmid pKD4 18
2.1.5.2. Plasmid pCAMBIA 1300 19
2.1.5.3. Plasmid pGEM-T Easy 20
2.1.5.4. Plasmid pJET1.2/blunt 20
2.1.5.5. Plasmid pKD46 21
2.1.5.6. Plasmid pGP704 22
2.2. Phương pháp nghiên cứu 23
2.2.1. Tạo dòng E. coli DH5α mang đoạn gen wzz của E. ictaluri 23
2.2.1.1. Thiết kế mồi 23
2.2.1.2. Khuếch đại và thu nhận đoạn gen wzz của E. ictaluri 23
2.2.1.3. Phản ứng nối tạo plasmid tái tổ hợp pGEM-T Easy mang
đoạn gen wzz (pGEMT::wzz) 24
2.2.1.4. Chuẩn bị tế bào khả nạp E. coli DH5α bằng phương pháp
hóa biến nạp 24
2.2.1.5. Biến nạp plasmid tái tổ
hợp pGEM-T::wzz vào E. coli DH5α 25
2.2.1.6. Kiểm tra dòng biến nạp bằng PCR khuẩn lạc 25

2.2.1.7. Kiểm tra dòng biến nạp bằng phản ứng cắt giới hạn 26
2.2.1.8. Giải trình tự gen wzz 26
2.2.2. Tạo chủng E. ictaluri mang plasmid pKD46 27
2.2.2.1. Chuẩn bị tế bào khả nạp E. ictaluri bằng phương pháp
điện biến nạp 27
2.2.2.2. Biến nạp plasmid pKD46 vào E. ictaluri 27
Trần Thị Thanh Thanh Luận văn Thạc sĩ Sinh học
iv
2.2.2.3. Kiểm tra dòng tế bào E. ictaluri mang pKD6 bằng phản ứng
cắt giới hạn 28
2.2.2.4. Chuẩn bị tế bào khả nạp E. ictaluri mang plasmid pKD46
bằng phương pháp điện biến nạp 28
2.2.3. Knockout gen wzz bằng phương pháp 1 STEP 29
2.2.3.1. Thiết kế mồi 29
2.2.3.2. Phản ứng PCR tạo cassette 1 STEP 30
2.2.3.3. Biến nạp cassette 1 STEP vào E. ictaluri mang pKD46 30
2.2.4. Knockout gen wzz bằng phương pháp 2 STEP 30
2.2.4.1. Thiết kế mồi 32
2.2.4.2. Phản ứng PCR tạo cassette 2 STEP 32
2.2.4.3. Biến nạp cassette 2 STEP vào E. ictaluri mang pKD46 33
2.2.5. Knockout gen wzz bằng phương pháp sử dụng suicide
plasmid pGP704 34
2.2.5.1. Tạo dòng E. coli DH5α chứa plasmid pJET1.2/blunt mang
đoạn đầu của gen wzz 35
2.2.5.2. Tạo dòng E. coli DH5α chứa plasmid pJET1.2/blunt mang
đoạn cuối của gen wzz 37
2.2.5.3. Tạo dòng E. coli DH5α chứa plasmid pJET1.2/blunt mang
đoạn đầu (Hwzz) và đoạn cuối (Twzz) của gen wzz 38
2.2.5.4. Tạo dòng E. coli DH5α chứa plasmid pJET1.2/blunt mang
đoạn gen kháng kanamycin từ pCAMBIA 1300 40

Trần Thị Thanh Thanh Luận văn Thạc sĩ Sinh học
v
2.2.5.5. Tạo dòng E. coli DH5α mang plasmid chứa
cassette HTK (pJET::HTK) 42
2.2.5.6. Tạo dòng tế bào E. coli DH5α λpir mang plasmid
tái tổ hợp pGP704::HTK 43
2.2.5.7. Biến nạp plasmid tái tổ hợp pGP704::HTK vào E. ictaluri::pKD46
để tạo chủng E. ictaluri đột biến gen wzz 45
2.2.5.8. Tạo dòng E. coli SM10 λpir chứa plasmid tái tổ hợp
pGP704::HTK 45
2.2.5.9. Tạo chủng E. ictalruri đột biến gen wzz bằng phương pháp
tiếp hợp 46
2.2.6. Loại bỏ plamid pKD46 ra khỏi chủng E. ictaluri đột biến gen wzz 47
Chương 3 – KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN
3.1. Nuôi cấy chủng E. ictaluri hoang dại 48
3.2. Tạo dòng E. coli DH5α mang đoạn gen wzz của E. ictaluri 49
3.2.1. Khuếch đại và thu nhận đoạn gen wzz của E. ictaluri 49
3.2.2. Kết quả nhân dòng gen wzz trong E. coli DH5α bằng
vector pGEM-T Easy 50
3.3. Tạo chủng E. ictaluri mang plasmid pKD46 53
3.4. Knockout gen wzz bằng phương pháp 1 STEP 54
3.4.1. Phản ứng PCR tạo cassette 1 STEP 54
3.4.2. Biến nạp cassette 1 STEP vào E. ictaluri mang pKD46 để
tạo chủng E. ictaluri đột biến gen wzz 55
Trần Thị Thanh Thanh Luận văn Thạc sĩ Sinh học
vi
3.5. Knockout gen wzz bằng phương pháp 2 STEP 55
3.5.1. Phản ứng PCR tạo cassette 2 STEP 55
3.5.2. Biến nạp cassette 2 STEP vào E. ictaluri mang pKD46 để
tạo chủng E. ictaluri đột biến gen wzz 57

3.6. Knockout gen wzz bằng phương pháp sử dụng
suicide plasmid pGP704 58
3.6.1. Tạo dòng E. coli DH5α chứa plasmid pJET1.2/blunt mang
đoạn đầu của gen wzz 58
3.6.1.1. Khuếch đại và thu nhận đoạn đầu gen wzz 58
3.6.1.2. Nhân dòng đoạn đầu của gen wzz trong E. coli DH5α
bằng vector pJET1.2/blunt 59
3.6.2. Tạ
o dòng E. coli DH5α chứa plasmid pJET1.2/blunt mang
đoạn cuối của gen wzz 61
3.6.2.1.Khuếch đại và thu nhận đoạn cuối gen wzz 61
3.6.2.2. Nhân dòng đoạn cuối của gen wzz trong E. coli DH5α
bằng vector pJET1.2/blunt 62
3.6.3. Tạo dòng tế bào E. coli DH5α chứa plasmid pJET1.2/blunt
mang đoạn đầu và đoạn cuối của gen wzz 64
3.6.4. Tạo dòng E. coli DH5α chứa plasmid pJET1.2/blunt mang
đoạn gen kháng kanamycin từ pCAMBIA 1300 66
3.6.4.1. Khuếch
đại và thu nhận đoạn gen kháng kanamycin
từ pCAMBIA 1300 66
Trần Thị Thanh Thanh Luận văn Thạc sĩ Sinh học
vii
3.6.4.2. Nhân dòng đoạn gen kháng kanamycin trong E. coli DH5α
bằng vector pJET1.2/blunt 67
3.6.5. Tạo dòng E. coli DH5α chứa plasmid pJET1.2/blunt
mang cassette HTK (pJET::HTK) 69
3.6.6. Tạo dòng tế bào E. coli DH5α λpir mang plasmid
tái tổ hợp pGP704::HTK 71
3.6.7. Biến nạp plasmid tái tổ hợp pGP704::HTK vào E. ictaluri::pKD46
để tạo chủng E. ictaluri đột biến gen wzz 73

3.6.8. Tạo dòng E. coli SM10 λpir chứa plasmid tái tổ hợp
pGP704::HTK 77
3.6.9. Tạo chủng E. ictalruri đột biến gen wzz bằng phương pháp
tiếp hợ
p 78
3.7. Loại bỏ plamid pKD46 ra khỏi chủng E. ictaluri đột biến gen wzz 82
Chương 4 – KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ
4.1. Kết luận 83
4.2. Đề nghị 83
TÀI LIỆU THAM KHẢO 84
PHỤ LỤC 89




Trần Thị Thanh Thanh Luận văn Thạc sĩ Sinh học
viii
DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU, TỪ VIẾT TẮT
BHI Brain heart infusion
CD14 Cluster of differentiation 14
CNSH Công nghệ sinh học
CFU Colony forming units
DNA Deoxyribonucleic acid
dNTP Deoxynucleotide triphosphate
FRT Flippase Recognition Target
LB Luria bertani
LPS Lipopolysaccharide
MCS Multi cloning site
NCBI National Center for Biotechnology Information
OMP Outer membrane protein

OD Optical density
PCR Polymerase chain reaction
RNA Ribonucleic acid
TCR T cell receptor

Trần Thị Thanh Thanh Luận văn Thạc sĩ Sinh học
ix
DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng 2.1. Thành phần phản ứn g PCR 1 6




















Trần Thị Thanh Thanh Luận văn Thạc sĩ Sinh học

x
DANH MỤC CÁC HÌNH
Hình 1.1 Hình thái vi khuẩn Edwardsiella ictaluri 3
Hình 1.2. Cấu trúc của LPS 8
Hình 1.3. Cấu trúc LPS trên màng vi khuẩn Gram âm 8
Hình 1.4. Quá trình tổng hợp LPS ở vi khuẩn Gram âm theo con đường
phụ thuộc wzy 10
Hình 2.1. Thang DNA 17
Hình 2.2. P las mid pK D4 19
Hình 2.3. Plasmid pCAMBIA 1300 19
Hình 2.4. Plasmid pGEM-T Easy 20
Hình 2.5. Plasmid pJET1.2/blunt 21
Hình 2.6. Plasmid pKD46 22
Hình 2.7. Plasmid pGP704 22
Hình 3.1. Khuẩn lạc của E. ictaluri phát triển trên môi trường BHI sau 72 giờ 48
Hình 3.2. Kết quả điện di sản phẩm PCR với cặp mồi FserC/RserC trên gel
agaros e 1 %. 48
Hình 3.3. Kế
t quả điện di sản phẩm PCR với cặp mồi đặc hiệu cho gen wzz trên
gel agarose 1%. 49
Hinh 3.4. Kết quả điện di sản phẩm PCR khuẩn lạc trên gel agarose 1%. 51
Hình 3.5. Kết quả điện di sản phẩm cắt bằng enzyme SalI và EcoRI trên gel
agarose 1%. 51
Trần Thị Thanh Thanh Luận văn Thạc sĩ Sinh học
xi
Hình 3.6. Kết quả so sánh trình tự nucleotide của gen wzz của chủng E. ictaluri
cung cấp bởi Trung tâm CNSH so với chủng E. ictaluri 93-146 trên ngân hàng gen
NCBI bằng công cụ Blast. 52
Hình 3.7. Kết quả điện di sản phẩm cắt bằng enzyme EcoRI trên gel
a garos e 1 %. 53

Hình 3.8. Kết quả điện di sản phẩm PCR 1 STEP trên gel agarose 1%. 54
Hình 3.9. Kết quả điện di sản phẩm PCR trên gel agarose 1 %. 56
Hình3.10. Kết quả điện di sản phẩm PCR 2 STEP trên gel agarose 1%. 57
Hình 3.11. Kết qu
ả điện di sản phẩm PCR với cặp mồi FHwzz/RHwzz trên
gel agarose 1%. 59
Hình 3.12. Kết quả điện di sản phẩm PCR khuẩn lạc trên gel agarose 1%. 60
Hình 3.13. Kết quả điện di sản phẩm cắt trên gel agarose 1% 60
Hình 3.14. Kết quả so sánh trình tự nucleotide đoạn Hwzz được nhân dòng trong
pJET1.2/blunt so với chủng E. ictaluri 93-146 trên ngân hàng gen NCBI bằng công
cụ Blast. 6 1
Hình 3.15. Kết quả điện di sản phẩm PCR với cặ
p mồi FTwzz và RTwzz trên
gel agarose 1%. 62
Hình 3.16. Kết quả điện di sản phẩm PCR khuẩn lạc trên gel agarose 1%. 63
Hình 3.17. Kết quả điện di sản phẩm cắt bằng enzyme BamHI và XbaI trên
gel agarose 1%. 63
Trần Thị Thanh Thanh Luận văn Thạc sĩ Sinh học
xii
Hình 3.18. Kết quả so sánh trình tự nucleotide đoạn Twzz được nhân dòng trong
pJET1.2/blunt so với chủng E. ictaluri 93-146 trên ngân hàng gen NCBI bằng công
cụ Blast. 6 4
Hình 3.19. Kết quả điện di sản phẩm PCR khuẩn lạc trên gel agarose 1%. 65
Hình 3.20. Kết quả điện di sản phẩm cắt bằng enzyme SalI và XbaI trên gel
agarose 1% 66
Hình 3.21. Kết quả điện di sản phẩm PCR với cặp mồi FKm/RKm trên gel
agarose 1% 67
Hình 3.22. Kết quả điện di s
ản phẩm PCR khuẩn lạc trên gel agarose 1%. 68
Hình 3.23. Kết quả điện di sản phẩm cắt bằng enzyme BamHI trên gel

a garos e 1 %. 68
Hình 3.24. Kết quả điện di sản phẩm cắt bằng enzyme BamHI trên gel
a garos e 1 %. 70
Hình 3.25. Kết quả điện di sản phẩm PCR khuẩn lạc trên gel agarose 1%. 70
Hình 3.26. Kết quả điện di sản phẩm cắt bằng enzyme BglII trên gel
a garos e 1 %. 71
Hình 3.27. Kết quả điện di sản ph
ẩm PCR khuẩn lạc trên gel agarose 1%. 72
Hình 3.28. Kết quả điện di sản phẩm cắt bằng enzyme BglII 73
Hình 3.29. Kết quả điện di sản phẩm PCR với cặp mồi FserC/RserC trên gel
a garos e 1 %. 75
Hình 3.30. Kết quả điện di sản phẩm PCR với cặp mồi FKm/RKm trên gel
a garos e 1 %. 75
Trần Thị Thanh Thanh Luận văn Thạc sĩ Sinh học
xiii
Hình 3.31. Kết quả điện di sản phẩm PCR cặp mồi WF1/WR1 trên gel
a garos e 1 %. 75
Hình 3.32. Kết quả điện di sản phẩm PCR với cặp mồi FpGP704/RpGP704 trên
gel agarose 1%. 76
Hình 3.33. Kết quả điện di sản phẩm PCR với cặp mồi OF1/OR1 trên gel
a garos e 1 %. 76
Hình 3.34. Kết quả điện di sản phẩm PCR khuẩn lạc trên gel agarose 1%. 77
Hình 3.35. Kết quả điện di sản phẩm cắt bằng enzyme BglII trên gel
a garos e 1 %. 78
Hình 3.36
. Kết quả điện di sản phẩm PCR với cặp mồi FserC/RserC trên gel
agaros e 1 %. 79
Hình 3.37. Kết quả điện di sản phẩm PCR với cặp mồi FKm/RKm trên gel
a garos e 1 %. 80
Hình 3.38. Kết quả điện di sản phẩm PCR với cặp mồi WF1/WR1 trên gel

a garos e 1 %. 80
Hình 3.39. Kết quả điện di sản phẩm PCR với cặp mồi FpGP704/RpGP704 trên
gel agarose 1%. 81
Hình 3.40. Kết quả điện di sản phẩm PCR với cặp m
ồi OF1/OR1trên gel
a garos e 1 %. 81



Trần Thị Thanh Thanh Luận văn Thạc sĩ Sinh học
xiv
DANH MỤC SƠ ĐỒ
Sơ đồ 2.1. Tạo chủng E. ictaluri đột biến gen wzz bằng phương pháp 1 STEP 29
Sơ đồ 2.2. Tạo chủng E. ictaluri đột biến gen wzz bằng phương pháp 2 STEP 31
Sơ đồ 2.3. Tạo chủng E. ictaluri đột biến gen wzz bằng phương pháp sử dụng
suicide plasmid pGP704 34


Trần Thị Thanh Thanh Luận văn Thạc sĩ Sinh học
Trang 1
MỞ ĐẦU
Cá tra (Pangasius hypophthalmus) là loài cá có tiềm năng xuất khẩu lớn và
mang lại lợi nhuận cao cho người nuôi. Theo Hiệp hội Chế biến và Xuất khẩu thuỷ
sản Việt Nam (The Vietnam Association of Seafood Exporters and Producers –
VASEP), sản phẩm cá tra Việt Nam đang dẫn đầu thị phần thế giới (2009). VASEP
dự báo, vị trí dẫn đầu thị trường thế giới của Cá tra Việt Nam sẽ còn giữ vững trong
nhiều năm tới. Với tiềm nă
ng kinh tế lớn như vậy, cá tra hiện là một trong những
sản phẩm xuất khẩu chủ lực của Việt Nam. Theo quy hoạch của Bộ Nông Nghiệp &
Phát Triển Nông Thôn, đến năm 2010 sản lượng cá tra là 1,5 triệu tấn, đạt kim

ngạch xuất khẩu 1,5 tỉ USD và đến năm 2020, sản lượng ước đạt 2 triệu tấn, kim
ngạch xuất khẩu 2 tỷ USD.
Một trong những giải pháp quan trọng để
nâng cao sản lượng cá tra là nuôi
công nghiệp tập trung với quy mô lớn. Tuy nhiên, việc nuôi cá với mật độ cao tạo
điều kiện cho các bệnh nhiễm khuẩn phát triển và lây lan như bệnh mủ gan, bệnh
đốm đỏ, bệnh do nấm, kí sinh trùng …Trong đó, đã và đang gây thiệt hại nghiêm
trọng nhất là bệnh gan thận mủ do vi khuẩn Edwardsiella ictaluri gây ra. Khi cá bị
nhiễm bệnh, tỷ lệ chết có thể lên đến 90%. Để điề
u trị bệnh, người nuôi thường sử
dụng thuốc hóa học và một số loại kháng sinh. Tuy nhiên, việc sử dụng thuốc và
hóa chất không đúng qui định và lặp đi lặp lại trong thời gian dài đã dẫn đến tình
trạng kháng thuốc và hiệu quả không cao. Hơn nữa, lượng tồn dư kháng sinh trong
cá không chỉ ảnh hưởng tới chất lượng của sản phẩm, mà còn ảnh hưởng đến sức
khỏe của người tiêu dùng. Để giải quyết vấn đề trên, biện pháp sử dụng vaccine
phòng bệnh được đánh giá là có hiệu quả, ít tốn kém và đảm bảo an toàn sinh học.
Do đó, việc tìm kiếm các loại vaccine cho cá tra kháng lại các bệnh nhiễm
khuẩn đang là vấn đề cấp bách cho công nghiệp nuôi cá tại Việt Nam.
Đối với vi khuẩn E. ictaluri, O antigen được chứng minh là một kháng
nguyên mạnh và là yếu tố gây độc quan trọng. Chiều dài chu
ỗi O antigen được điều
hòa bởi gen wzz (length chain determinant gene). Nghiên cứu ở các loài vi khuẩn
Gram âm khác như E. coli, Samonella, Yersinia… cho thấy khi chủng vi khuẩn đột
Trần Thị Thanh Thanh Luận văn Thạc sĩ Sinh học
Trang 2
biến gen wzz thì O antigen sẽ phân bố chiều dài chuỗi một cách ngẫu nhiên và có
độc tính thấp hơn so với chủng hoang dại.
Từ những thực tiễn nêu trên, chúng tôi thực hiện đề tài “Tạo chủng
Edwardsiella ictaluri đột biến gen wzz bằng phương pháp knockout gen” nhằm làm
cơ sở cho việc sản xuất vaccine nhược độc phòng bệnh cho cá tra.

Mục tiêu của đề tài
- Tạo chủng E. ictaluri đột biến gen wzz b
ằng phương pháp knockout gen.
Nội dung đề tài bao gồm
- Tạo dòng đoạn gen wzz của E. ictaluri trong E. coli DH5α.
- Tạo chủng E. ictaluri mang plasmid pKD46.
- Tạo chủng E. ictaluri đột biến gen wzz bằng phương pháp 1 STEP.
- Tạo chủng E. ictaluri đột biến gen wzz bằng phương pháp 2 STEP.
- Tạo chủng E. ictaluri đột biến gen wzz bằng phương pháp sử dụng
suicide plasmid pGP704.
- Loại bỏ plasmid pKD46 ra khỏi chủng E. ictaluri đột biến gen wzz









Trần Thị Thanh Thanh Luận văn Thạc sĩ Sinh học
Trang 3
Chương 1 – TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Sơ lược về vi khuẩn Edwardsiella ictaluri gây bệnh mủ gan trên cá tra
Edwardsiella ictaluri thuộc giống Edwardsiella, họ Enterobacteriaceae, bộ
Enterobacteriales, lớp Gammaproteobacteria, ngành Proteobacteria. E. ictaluri là
vi khuẩn Gram âm, hình que, phần lớn ở dạng đơn, đôi và một ít ở dạng chuỗi, kích
thước 1x 2 – 3 µm, không sinh bào tử, chuyển động nhờ tiêm mao, kị khí tùy ý,
catalase dương tính, cytocrom oxidase âm [14], [21].

Hình 1.1 Hình thái vi khuẩn Edwardsiella ictaluri
E. ictaluri được phân lập lần đầu tiên năm 1976 từ cá nheo Mỹ nhiễm bệnh
[13]. Chúng phát triển chậm trên môi trường nuôi cấy. Khi nuôi cấy trên môi trường
thạch BHI ở 28 – 30
0
C, sau 36 – 48 giờ, vi khuẩn phát triển hình thành những
khuẩn lạc nhỏ tròn lồi, trơn láng đường kính 1 – 2 mm. E. ictaluri phát triển yếu
hoặc không phát triển ở 37
0
C [26], [36].
E. ictaluri gây bệnh nhiễm trùng máu ở cá nheo Mỹ [21] và bệnh gan thận
mủ ở cá tra, cá basa Việt Nam [1]. Khi phẩu thuật cá bệnh thấy xuất hiện những
điểm hoại tử màu trắng đục chủ yếu ở thận, lách, gan đường kính từ 1 – 3 mm.
Bệnh gây chết hàng loạt và tỉ lệ chết rất cao có thể lên đến 90% [21].
E. ictaluri xâm nhiễm vào cá theo 2 con đường: (1) Từ nguồn nước, vi
khuẩn có thể xâm nhập vào cơ quan kh
ứu giác thông qua mũi cá đang mở, chúng di
chuyển vào bên trong dây thần kinh khứu giác và sau đó lên não. Sự truyền nhiễm
Trần Thị Thanh Thanh Luận văn Thạc sĩ Sinh học
Trang 4
lan rộng từ màng não đến sọ và da tạo nên những lỗ thủng trên đầu cá (thường gọi
là triệu chứng “hole-in-the-head”); (2) Vi khuẩn cũng có thể theo đường tiêu hóa và
đi vào trong máu dẫn đến nhiễm trùng máu. Bằng con đường này, vi khuẩn đi vào
mao mạch trong biểu bì dẫn đến hoại tử và làm mất sắc tố của da cá. Bệnh gây hoại
tử ruột, gan, lách và viêm cầu thận trong vòng 2 tuần sau khi nhiễm khuẩn [30].
Tuy nhiên, cơ chế gây độc của vi khu
ẩn vẫn chưa thực sự rõ ràng. Những
nghiên cứu về yếu tố gây độc của E. ictaluri chủ yếu tập trung vào LPS, OMP, các
gen gây độc…
LPS là một nội độc tố. Ngoài ra, LPS còn vai trò chủ yếu trong sự xâm

nhiễm của vi khuẩn vào tế bào chủ và có khả năng kích thích đáp ứng miễn dịch
mạnh mẽ. Nhiều nghiên cứu đã xác định LPS là yếu tố gây độc quan trọng của vi
khuẩn E. ictaluri
[3], [30]. Hoạt tính chondroitinase phân giải mô sụn gây triệu
chứng “hole in the head” ở cá. Copper và cộng sự cho rằng hoạt tính chondroitinase
cũng góp phần vào độc tính của E. ictaluri. Khi cá nheo Mỹ được xử lý với chủng
đột biến E. ictaluri MI 15 (bị mất hoạt tính chondroitinase) cho thấy không có cá
chết mà cũng không thấy dấu hiệu bệnh. Thune và cộng sự (2007) cũng đã xác định
những gen liên quan đến độc tính nằm trên vùng phát sinh bệnh 26,135 bp chứa 33
gen thuộc hệ thống tiế
t loại III [30]. Ngoài ra, một số nghiên cứu khác cũng xác
định protein màng và hemolysine cũng là nhân tố gây độc của E. ictaluri [17].
1.2. Tình hình nghiên cứu vaccine cho cá kháng vi khuẩn Edwardsiella ictaluri
1.2.1. Những nghiên cứu trên thế giới
Plumb J.A và cộng sự (1995) đã sử dụng chủng E. ictaluri chết (xử lý bằng
formalin) cấp cho cá tra bằng phương pháp ngâm tăng dần: ngâm một lần, ngâm hai
lần, ngâm và kết hợp cấp ba lần theo đường cho ăn. Kết quả cho tỉ lệ sống l
ần lượt
là 56,7%; 64,2% và 68,8% so với lô đối chứng là 43,6% [22]. Hiện nay, loại
vaccine vô hoạt này đã được công ty dược phẩm Biomed (Mỹ) sản xuất và đưa ra
thị trường với giấy phép tạm thời để điều trị bệnh nhiễm trùng máu đường ruột cho
cá nheo Mỹ [24].
Trần Thị Thanh Thanh Luận văn Thạc sĩ Sinh học
Trang 5
Công ty sức khỏe thủy sản Escogen, Canada cũng đã sản xuất và đưa ra thị
trường vaccine E. ictaluri vô hoạt (cấp theo đường miệng) để phòng chống bệnh
nhiễm trùng máu đường ruột [24].
Tuy nhiên, các loại vaccine vô hoạt không tạo được đáp ứng miễn dịch
trong thời gian dài và hiệu quả không rõ ràng [16], [23], [24], [29], [31].
Nhiều công trình nghiên cứu khác chủ yếu tập trung vào các yếu tố gây độc

và gây đáp ứng miễn dịch của E. ictaluri nh
ư LPS, protein màng và các gen gây
độc. Một số loại vaccine nhược độc đã cho thấy khả năng phòng bệnh khá hiệu quả,
và đã được thương mại hóa trên thị trường [3].
Lauwrence và cộng sự (1997) đã nghiên cứu tạo chủng E. ictaluri nhược
độc đột biến gen purA. Chủng này được sử dụng làm vaccine cho cá nheo Mỹ theo
phương pháp ngâm một lần ở nồng độ độ 3,65 x 10
7
CFU/ml cho tỉ lệ sống là
66,7% [16].
Nhóm tác giả Ronald L.Thune, Đại học bang Louisiana (1999) đã tạo thành
công chủng E. ictaluri đột biến gen aroA. Chủng đột biến được sử dụng làm
vaccine bằng phương pháp ngâm một lần và ngâm tăng cường ở nồng độ 10
7

CFU/ml và 10
8
CFU/mL. Kết quả là tỉ lệ sống của cá đạt 54,1 – 63,8% khi được
ngâm một lần và 77,3 – 94,4% khi được ngâm tăng cường [28].
Richard K.Cooper và cộng sự đã tạo thành công chủng E. ictaluri đột biến
gen mã hóa enzyme chondroitinase và đã đăng kí bản quyền (US patent No
5536658). Chủng này đã được thử nghiệm tiêm cho cá với nồng độ 10
8
CFU/ml để
kiểm tra độc lực. Lô cá đối chứng được tiêm chủng hoang dại, sau 4 ngày cá biểu
hiện bệnh và bắt đầu chết vào ngày thứ 6. Lô cá được tiêm chủng đột biến không có
dấu hiệu bệnh sau 2 tuần quan sát. Sau khi tiếp tục tiêm chủng hoang dại, cá vẫn
không có dấu hiệu bệnh trong khi lô cá đối chứng chết toàn bộ. Kết quả cho thấy tỷ
lệ bảo vệ của chủng đột biến là 100% [25].
Craig A và c

ộng sự đã nghiên cứu chủng đột biến E. ictaluri rifampicin –
mutant (RE – 33) sử dụng như một loại vaccine sống biến đổi (modified live
vaccine). Chủng E. ictaluri RE – 33 này đã được đăng kí bản quyền (US pantent
Trần Thị Thanh Thanh Luận văn Thạc sĩ Sinh học
Trang 6
No. 6019981) và loại vaccine này hiện nay đã được thương mại hóa (AQUAVAC –
ESC) [2], [31].
1.2.2. Những nghiên cứu ở Việt Nam
Ở nước ta hiện nay tuy đã có một số công trình nghiên cứu và phát triển
vaccine E. ictaluri cho cá tra nhưng chưa có sản phẩm thích hợp đáp ứng được nhu
cầu.
Từ năm 2006 đến cuối năm 2007, Viện Nghiên Cứu Nuôi Trồng Thủy Sản
II đã kết hợp với Công ty Thuốc Thú y TW (Navetco) thực hiện đề tài cấp nhà n
ước
“Nghiên cứu vaccine phòng bệnh nhiễm khuẩn cho cá tra, cá ba sa, cá mú, cá giò,
cá hồng mỹ nuôi công nghiệp”, trong đó đối tượng được quan tâm đặc biệt là cá tra.
Sau 2 năm thực hiện, nghiên cứu sử dụng vaccine phòng bệnh đốm trắng cho cá tra
đã đạt được một số kết quả khả quan và có triển vọng áp dụng vào thực tế. Tuy
nhiên hiện nay, vaccine vẫn còn đang thử nghiệm chưa thương mại hóa sản phẩm
[34].
Công ty dược phẩ
m thủy sản PHARMAQ của Na Uy đã chọn cá tra Việt
Nam là đối tượng nghiên cứu vaccine cho cá nuôi ở khu vực châu Á. Từ cuối năm
2009, công ty đã kết hợp với Đại học Cần Thơ tiến hành thử nghiệm vaccine E.
ictaluri cho cá tra ở 3 điểm thí nghiệm thuộc các tỉnh Đồng Tháp, An Giang và Bến
Tre. Thử nghiệm cho kết quả khả quan và có triễn vọng ứng dụng thực tiễn rộng rãi
[35].
Một nghiên c
ứu khác của Trường đại học Nông Lâm kết hợp với Công ty
Công nghệ Sinh học Schweizer, thử nghiệm vaccine vô hoạt (vi khuẩn đã chết)

bằng phương pháp ngâm và cho ăn 2 lần thì tỉ lệ sống là 52% [20].
Trung tâm Công Nghệ Sinh Học Thành phố Hồ Chí Minh đang tiến hành
nghiên cứu tạo các chủng E. ictaluri đột biến nhược độc bằng phương pháp
knockout gen và phương pháp sử dụng kháng sinh rifampicin. Hiện nay, trung tâm
đã tạo được 4 chủng E. ictaluri
đột biến bao gồm: Chủng E. ictaluri kháng
rifampicin; Chủng E. ictaluri đột biến gen purA; Chủng E. ictaluri đột biến gen
aroA; Chủng E. ictaluri đột biến gen mã hóa enzyme chondroitinase. Kết quả
Trần Thị Thanh Thanh Luận văn Thạc sĩ Sinh học
Trang 7
thử nghiệm độc lực của chủng đột biến gen purA (E. ictaluri PAM24) cho thấy
chủng này không gây chết cá ở nồng độ 3,4 x 10
5
CFU/ml, trong khi đó các
chủng hoang dại (có ký hiệu E. ictaluri ĐT và E. ictaluri VL33 ) gây chết cá
rất cao: 92,22% và 95,56% ở nồng độ lần lượt là 1,8x10
5
CFU/ml và 2,4x10
5
CFU/ml. Quá trình thử nghiệm độc lực đối với các chủng đột biến còn lại đang
được triển khai. Một hướng nghiên cứu khác cũng đang được thực hiện tại Trung
tâm là vaccine tiểu phần dựa trên một số protein có tính kháng nguyên của E.
ictaluri như OmpA, OmpN, GAPDH. Tuy nhiên, những nghiên cứu này đang ở
trong giai đoạn bước đầu thu nhận và tinh sạch protein.
1.3. Lipopolysacharide (LPS) và vai trò của gen wzz trong quá trình tổng hợp LPS
1.3.1. Cấu trúc và chức năng c
ủa LPS [4], [11], [12], [27], [33]
LPS là thành phần chính của lớp màng ngoài của vi khuẩn Gram âm, góp
phần quan trọng tạo nên sự toàn vẹn cấu trúc của vi khuẩn và giúp bảo vệ màng
khỏi sự tấn công của một vài loại hóa chất. LPS cũng tăng điện tích âm của màng tế

bào và giúp ổn định cấu trúc màng nói chung.
Cấu trúc LPS gồm 3 vùng khác nhau: lipid A, oligosaccharide lõi và O
antigen.
- Lipid A thường là đường đôi glucosamine gắn với nhiều acid béo. Những
chuỗi acid béo kị nước này gắn chặ
t LPS vào màng tế bào vi khuẩn. Lipid A là
thành phần gây độc chính của vi khuẩn Gram âm. Khi tế bào vi khuẩn bị ly giải bởi
hệ thống miễn dịch, những mảnh vỡ của màng chứa lipid A được giải phóng vào
vòng tuần hoàn, gây sốt, tiêu chảy, và có thể gây sốc nội độc tố (còn gọi là sốc
nhiễm trùng).
- Lõi của LPS luôn luôn chứa một thành phần oligosaccharide gắn trực tiếp
với lipid A và thường chứa đường như heptose và 3-deoxy-D-mannooctulosonic
Acid (KDO, keto-deoxyoctulosonate).
-
O antigen (O polysaccharide hoặc O side chain) là domain ngoài cùng của
LPS. O antigen gồm nhiều phiên bản lặp lại (thường là 10 – 30 lần) của một đơn vị
Trần Thị Thanh Thanh Luận văn Thạc sĩ Sinh học
Trang 8
oligosaccharide (O unit). Mỗi đơn vị Oligosaccharide gồm khoảng từ 2 đến 6 phân
tử đường. O antigen được phơi bày ra bên ngoài bề mặt tế bào vi khuẩn và do đó nó
là mục tiêu nhận biết của kháng thể vật chủ. O antigen có tính chuyên biệt kháng
nguyên cao. Sự thay đổi trong cách sắp xếp và liên kết giữa các phân tử đường
trong O unit tạo nên các cấu trúc khác nhau của O antigen, đặc trưng cho việc nhận
biết kháng nguyên.

Hình 1.2. Cấu trúc của LPS

Hình 1.3. Cấu trúc LPS trên màng vi khuẩn Gram âm
Trần Thị Thanh Thanh Luận văn Thạc sĩ Sinh học
Trang 9

Từ lâu, LPS được coi là nội độc tố và là nhân tố gây đáp ứng miễn dịch mạnh
ở động vật. LPS cũng tham gia vào quá trình sản xuất nhiều loại chất trung gian liên
quan tới sốc nhiễm khuẩn. LPS hoạt động như một nội độc tố đầu tiên bởi vì nó
bám vào phức hợp receptor CD14/TLR4/MD2 và xúc tiến sự tiết các cytokine tiền
viêm trong nhiều loại tế bào, đặc biệt là ở đại thực bào. Ngoài ra, những nghiên cứ
u
trong vài năm gần đây cho thấy LPS có vai trò trong việc hoạt hóa nhiều nhân tố
phiên mã.
1.3.2. Quá trình tổng hợp LPS và vai trò của gen wzz
Trong quá trình tổng hợp LPS, Lipid A và oligosaccharide lõi được tổng
hợp cùng với nhau, trong khi O antigen được tổng hợp độc lập [11].
Hầu hết các O antigen được tổng hợp theo con đường phụ thuộc Wzy (Wzy
dependent pathway), tuy nhiên cũng có một vài loại O antigen được tổng hợp bằng
các hình thức polymer hóa khác (Wzy independent pathway) [11].
Trong con đường tổng hợp phụ thuộc Wzy, đầu tiên O unit đượ
c tổng hợp
bằng cách chuyển liên tục những phân tử đường (từ đường tương ứng của
nucleotide) đến lipid vận chuyển undecaprenol-phosphate (UndP) nhờ những
enzyme glycosyltransferase chuyên biệt. Quá trình này xảy ra trong tế bào chất. Ban
đầu, O unit hoàn chỉnh vẫn tập hợp trên undecaprenylphosphate. Sau đó, enzyme O
unit flippase (Wzx) chuyển O unit từ màng trong ra màng ngoài. Ở đó, O unit được
polymer hóa tạo thành O antigen nhờ O antigen polymerase (Wzy) và sau đó được
nối với lipid lõi A nhờ enzyme WaaL ligase [4], [5], [12], [27]. Sự di chuyển cuối
cùng của phân tử LPS hoàn chỉnh ra bề
mặt tế bào được giả thiết là điều hòa bởi
một phức hợp protein ngoài màng Imp/RlpB [27].
Chiều dài chuỗi O antigen được điều hòa bởi gen wzz, còn được gọi là Cld
[chain length determinant] hay Rol [regulator of O antigen length]. Khi chủng vi
khuẩn bị đột biến gen wzz thì chiều dài chuỗi O antigen sẽ phân bố một cách ngẫu
nhiên [27].

Đến nay, cơ chế protein Wzz ảnh hưởng tới quá trình polymer hóa vẫn chưa
được hiểu rõ. Bastin và cộng sự cho rằng Wzz hoạt động như
thiết bị bấm giờ phân