Vai trò, ý nghĩa của các xét nghiệm phân tử trong chuẩn đoán và theo dõi điều trị bênh viêm gan siêu vi B và C

Vai trò và ý nghóa của các
xét nghiệm sinh học phân tử
trong chẩn đoán và theo dõi điều trò
bệnh viêm gan siêu vi B và C
BS. TS. Phạm Hùng Vân
(1)
(1) Giảng viên Bộ Môn Vi Sinh, Khoa Y, ĐHYD TP. HCM
Chủ nhiệm tổ Bộ Môn Vi Sinh, Khoa ĐDKTYH
Phó phòng thí nghiệm trung tâm ĐHYD
Thành viên chính của ANSORP và ARFID
Cố vấn khoa học Công Ty NAM KHOA

WHO 2001
Nhieãm vieâm gan sieâu vi B (HBV)


Xét nghiệm sinh học phân tử cho viêm gan B
PCR phát hiện HBV-DNA
qPCR định lượng HBV-DNA
qPCR định lượng
HBV-DNA
HBsAg [+]
HBVDNA [+]
qHBVDNA
≥10
5
ALT
ALT↑ ALT Normal
Biopsie
or Fibroscan

AFP
Bất thường
Điều trị
qHBVDNA/3th
LamR, AdfR≥105
Phát hiện đột biến precore
Phát hiện đột biến kháng
thuốc

Schering-Plough
Nhieãm vieâm gan sieâu vi C (HCV)

Nhiễm HCV (100)
(Phase cấp)
Mạn tính
85% (85)
Xơ gan
20% (17)
Ung thư gan
Xơ gan tiến triển
25% (4.5)
Khỏi
15% (15)
Ổn định
80% (68)
Diễn tiến chậm
75% (13)
Dieãn tieán nhieãm HCV

Genotype - 1

Điều trị 48 tuần
Genotype non-1
Điều trị 24 tuần
Định lượng
HCV genotype
<2 log
10
>2 log
10
hay âm tính
HCV-RNA
Cuối điều trị
HCV-RNA
Tuần 12
Định lượng
Cân nhắc ngưng
điều trị
Theo dõi sau 6 tháng
HCV-RNA
HCV RNA (+)
Không đáp ứng
HCV RNA (+)
Tái phát
HCV RNA (-)
Đáp ứng
(2002 NIH Consensus Conference)
Xét nghiệm sinh học phân tử cho viêm gan C
RT-qPCR ñònh löôïng HCV-RNA
Ñònh genotype HCV
RT-qPCR ñònh löôïng HCV-RNA

RT-PCR phaùt hieän HCV-RNA

Thực tế đã đòi hỏi các nhà khoa
học, đặc biệt là các nhà y học phải
nhanh chóng phát triển và ứng
dụng các kỹ thuật sinh học phân tử
hiện đại, nhất là PCR và real-time
PCR vào chẩn đoán và hổ trợ cho
theo dõi điều trị bệnh nhân viêm
gan siêu vi tại Việt Nam

PCR và real-time
PCR là một kỹ thuật
hoàn toàn mở do
vậy chúng ta có khả
năng không phải bị
lệ thuộc vào các
hãng sản xuất kit ở
nước ngoài, nhờ vậy
giá thành sẽ rẽ

Nguyên tắc PCR
1
2
3
4
n
2
n
DNA đích

1 Biến tính (94
o
C )
2 Bắt cặp (55-65
o
C)
3 Kéo dài (72
o
C)
5’
3’
3’
5’

Mồi
Taq polymerase
dNTP
PCR buffer + MgCl
2
PCR
MIX
DNA đích (Template)

30X-40X
94
o
C/15s-1min
55-65
o
C/15s-1min

72
o
C/30s-3min
Phát hiện
 qua kích thước (điện di)
 hay qua trình tự (lai)

Ct curve
Standard
curve
Melt curve
Real-time PCR
chạy PCR và đồng thời phát hiện sản phẩm khuếch đại

Laser or
UV
Camera
Thiết bị Real-time PCR

Primers
Taq polymerase
dNTP
PCR buffer + MgCl
2
Real-time
PCR MIX
Target DNA (Template)
Real-time PCR mix
Chất phát huỳnh quang

Đònh danh dựa vào kiểu hình sinh vật hóa học
biểu hiện từ các kiểu gen
Xác đònh dựa vào kích thước đoạn gen
hay một trình tự đặc hiệu của đoạn gen
Nuôi cấy PCR
PCR có đặc hiệu khơng?
PCR đặc hiệu tương đương ni cấy

Các bước trong xét nghiệm PCR phát hiện
tác nhân vi sinh vật
Mẫu thử
Chuẩn bị mẫu thử
Tách chiết nucleic acid
Chạy PCR
Phát hiện sản phẩm PCR và phân tích kết quả

Một xét nghiệm PCR định tính chuẩn mực

Một xét nghiệm qPCR định lượng chuẩn mực

Một xét nghiệm qPCR định lượng chuẩn mực





Xác định Genotype HCV

Phương pháp real-time


Phương pháp InoLIPA

Phương pháp giải trình tự