Nghiên cứu tạo một tổ hợp vi sinh vật để sản xuất phân vi sinh

Trang 1
MỞ ĐẦU
Việt Nam là nước nông nghiệp nên phân bón và giống có thể xem là 2 yếu
tố có tính quyết định đến năng suất và chất lượng cây trồng. Nhưng hiện nay,
việc lạm dụng các loại phân bón hoá học đã làm cho đất canh tác bị bạc màu đi
rất nhanh chóng, gây ô nhiễm môi trường và ảnh hưởng nhiều đến loài sinh vật
khác, trong đó bao gồm cả con người. Đây là một vấn đề cấp thiết hiện nay.
Trong nhiều cách giải quyết thì việc sử dụng phân vi sinh là một lựa chọn
tối ưu để giải quyết phần nào vấn đề đó. Tuy nhiên, hiện nay dù đã có nhiều loại
phân vi sinh bán trên thị trường nhưng trong đó chủ yếu là các loại sản phẩm
nhập ngoại nên giá thành còn khá cao.
Bên cạnh đó, trong các ứng dụng của công nghệ sinh học trong nông
nghiệp đã góp phần đáng kể vào sự nâng cao chất lượng đời sống của người dân
và xã hội thì trồng nấm ăn là một trong những ứng dụng rất thành công của công
nghệ sinh học trong nông nghiệp. Việc trồng nấm không chỉ tận dụng được các
nguồn phế liệu của nông lâm nghiệp như rơm rạ, bã mía, mùn cưa… mà còn tạo
ra các loại nấm ăn là nguồn nguyên liệu thực phẩm giàu dinh dưỡng, đáp ứng cho
nhu cầu thực phẩm của con người. Tuy nhiên, phần bã thải sau trồng nấm lại
chưa được quan tâm đúng mức. Đây là một nguồn nguyên liệu có giá trị dinh
dưỡng khá lớn vì thế đây sẽ là một nguồn nguyên liệu lý tưởng để sản xuất phân
vi sinh.
Và hiện nay, trên thị trường có bán nhiều loại chế phẩm vi sinh vật làm
phân bón vi sinh, nếu thử nghiệm các chế phẩm này trên đối tượng bã thải sau
trồng nấm và có đánh giá cụ thể về chất lượng và hiệu quả phân vi sinh sản xuất
được thì có thể sẽ cho ta cái nhìn rõ hơn trong việc so sánh chất lượng các loại
chế phẩm vi sinh đó.
Vì các lý do trên em chọn đề tài:”Nghiên cứu tạo một tổ hợp vi sinh vật
để sản xuất phân vi sinh” để phần nào giải quyết vấn đề trên.
SVTH: Nguyễn Hạnh Minh Uyên Lớp 10SHLT GVHD: Đặng Đức Long
Trang 2
PHẦN 1

TỔNG QUAN TÀI LIỆU
SVTH: Nguyễn Hạnh Minh Uyên Lớp 10SHLT GVHD: Đặng Đức Long
Trang 3
1.1. Giới thiệu chung về phân vi sinh
1.1.1. Khái niệm phân vi sinh
Phân vi sinh là sản phẩm của quá trình chuyển hóa sinh học các thành phần
chất hữu cơ khác nhau thành dạng bền vững, quá trình này được tăng cường và
tăng tốc nhờ hoạt động của các chủng vi sinh vật sống có ích được tuyển chọn
chứa trong đó. [17]
1.1.2. Các loại vi sinh vật dùng trong sản xuất phân vi sinh [17]
Có nhiều nhóm vi sinh vật có ích bao gồm vi khuẩn, nấm, xạ khuẩn được sử
dụng để làm phân bón vi sinh. Trong số đó quan trọng là các nhóm vi sinh vật
phân giải cellulose, vi sinh vật cố định đạm, hoà tan lân, kích thích sinh trưởng
cây trồng… như là:
- Bacillus subtilis
- Azotobacter
- Trichoderma
- Agrobacterium
- Aspergillus…
1.1.3. Vai trò và ứng dụng của phân vi sinh [18]
Các tác dụng của phân vi sinh:
- Cung cấp chất dinh dưỡng có nguồn gốc tự nhiên cho cây trồng
- Cải thiện chất lượng đất
- Cân bằng độ pH trong đất
- Duy trì độ ẩm cho đất
- Trung hòa độc tố trong đất trồng
- Dự trữ Nitơ
- Giúp thông khí
- Tăng khả năng chống chịu sâu bệnh
- Ức chế và tiêu diệt các loại nấm gây bệnh trên cây trồng

1.1.4. Tình hình sản xuất, sử dụng phân bón vi sinh hữu cơ trên thế giới và
Việt Nam
1.1.4.1. Tình hình sản xuất, sử dụng phân bón vi sinh vật trên thế giới [3]
Phân bón vi sinh đã được nhiều quốc gia trên thế giới sản xuất và sử dụng
từ rất sớm. Phân bón vi sinh được sản xuất đầu tiên bởi Noble Hiltner tại Đức
SVTH: Nguyễn Hạnh Minh Uyên Lớp 10SHLT GVHD: Đặng Đức Long
Trang 4
năm 1896 và được đặt tên là Nitragin. Sau đó phát triển sản xuất tại một số nước
khác như ở Mỹ (1896), Canada (1905), Nga (1907), Anh (1910) và Thụy Điển
(1914). Cho tới nay có gần 100 nước đã sản xuất và ứng dụng các chế phẩm sinh
học bón cho cây trồng.
Phân bón vi sinh đã trở nên quen thuộc với người nông dân trên toàn thế
giới. Với những đặc tính ưu việt của nó, hiện nay phân bón vi sinh đã trở thành
hàng hóa và được sử dụng rộng rãi. Hằng năm, doanh số thu được từ phân bón vi
sinh là rất lớn. Ở Mỹ, doanh thu hàng năm chỉ với phân bón có chứa nốt sần đã là
19 triệu USD. Ngày càng xuất hiện nhiều tập đoàn và công ty lớn chuyên sản
xuất và buôn bán phân vi sinh như: Helibioagri (Italia), Liphia (Pháp),
Agricultural Genetic (Anh)… với nhiều chủng loại phong phú
1.1.4.2. Tình hình sản xuất, sử dụng phân bón vi sinh hữu cơ tại Việt Nam [3]
Trước những lợi ích của phân vi sinh đem lại, Việt Nam đã bắt đầu có
nhiều công trình nghiên cứu ứng dụng công nghệ vi sinh trong việc tạo ra các
loại phân bón sinh học nhằm cải tiến, nâng cao hiệu quả của nền nông nghiệp :
phân vi sinh vật cố định đạm cây họ đậu và phân vi sinh vật phân giải lân đã
được nghiên cứu từ năm 1960. Đến năm 1987, phân Nitragin trên nền chất mang
than bùn đã được hoàn thiện. Năm 1991 đã có hơn 10 đơn vị trong cả nước tập
trung nghiên cứu phân vi sinh vật.
Sau nhiều năm nghiên cứu và thử nghiệm trên đồng ruộng Việt Nam, phân
bón vi sinh đã đạt được những hiệu quả nhất định. Phân bón vi khuẩn nốt sần đã
cho thấy tác dụng nâng cao hiệu quả đối với cây lạc ở hầu hết các tỉnh. Ở miền
Bắc và miền Trung năng suất lạc tăng 13,8% - 17,5% và 22% ở các tỉnh miền

Nam. Như vậy, việc sử dụng phân bón vi sinh là một trong những hướng đi có
lợi nhất nhằm phát triển một nền nông nghiệp bền vững. Tuy vậy, hiện nay phân
bón vi sinh vẫn chưa phải là sự lựa chọn số một trên hầu hết đồng ruộng Việt
Nam do nhiều nguyên nhân: số lượng phân bón vi sinh đưa ra thị trường là không
nhiều, giá thành đắt, khó khăn trong việc vận chuyển và bảo quản, thông tin của
người nông dân về loại phân nầy không nhiều ….
SVTH: Nguyễn Hạnh Minh Uyên Lớp 10SHLT GVHD: Đặng Đức Long
Trang 5
1.1.5. Ưu và nhược điểm của phân vi sinh [18]
• Ưu điểm
- Nâng cao năng suất, chất lượng sản phẩm nông sản
- Quy trình sản xuất đơn giản, chi phí thấp nên giá thành rẻ hơn
- Tác dụng với cây trồng tương đương với phân hóa học nhưng không làm
đất xấu đi mà còn giúp cải tạo đất tốt hơn, làm tăng lượng vi sinh vật có ích cho
đất.
- Tăng khả năng chống chịu sâu bệnh
• Nhược điểm:
- Tác dụng chậm hơn phân hóa học
- Thành phần phân thường không ổn định về chất lượng do thành phần
nguyên liệu đưa vào không đồng đều
1.1.6. Một số sản phẩm phân vi sinh hữu cơ bán trên thị trường [9]
1.1.6.1.Chế phẩm sinh học BIMA
(Trung tâm Công nghệ Sinh học TP.HCM - Km1900, Quốc lộ 1A, Quận
12, Tp. Hồ Chí Minh)
Các đặc tính về sản phẩm:
a. Thành phần:
• Các chủng nấm Trichoderma: 5×10
6
bào tử/gam
• Hữu cơ: 50%

• Độ ẩm < 30%
b. Công dụng:
- Chứa nấm đối kháng Trichoderma có khả năng tiêu diệt và khống chế
ngăn ngừa các loại nấm bệnh hại cây trồng gây bệnh xì mủ, vàng lá thối rễ, chết
yểu, héo rũ như: Rhizoctonia solani, Fusarium, Pythium, Phytophthora sp.,
Sclerotium rolfsii,…
- Tạo điều kiện tốt cho vi sinh vật cố định đạm phát triển sống trong đất
trồng. Kích thích sự tăng trưởng và phục hồi bộ rễ cây trồng.
- Phân giải tốt các chất xơ, chitin, lignin, pectin … trong phế thải hữu cơ
thành các đơn chất dinh dưỡng, giúp cho cây hấp thu được dễ dàng.
- Kết hợp với phân hữu cơ có tác dụng cải tạo đất xốp hơn, chất mùn nhiều
hơn, tăng mật độ côn trùng có ích và giữ được độ phì của đất.
SVTH: Nguyễn Hạnh Minh Uyên Lớp 10SHLT GVHD: Đặng Đức Long
Hình 1.1. Chế phẩm vi sinh BIMA
Trang 6
1.1.6.2. Phân lân hữu cơ vi sinh Sông Gianh
(Công ty cổ phần Sông Gianh – Thị Trấn Ba Đồn – Quảng Trạch – Quảng
Bình)
a. Thành phần
-
Hữu cơ > 23,5%
-
P
2
O
5
> 3,2%
-
Acid Humic – Fulvic > 5,6%
-

Độ ẩm < 25%
-
Vi sinh vật hữu ích: 5. 10
6
CFU/g
-
Các yếu tố vi lượng : Mg
2+,
Fe
3+,
Zn
2+,
Ni
2+,
SO
4
2-
-
Các hợp chất Humat, enzymes, coenzymes, chất kháng bệnh
b. Công dụng
- Cải tạo đất
- Cung cấp đầy đủ các dưỡng chất giúp cây trồng phát triển cân đối, đồng
bộ
- Tăng năng suất cây trồng và giá trị nông sản
- Bảo vệ môi trường
SVTH: Nguyễn Hạnh Minh Uyên Lớp 10SHLT GVHD: Đặng Đức Long
Hình 1.2. Sản phẩm phân bón vi sinh hữu cơ của Công ty Sông
Gianh
Trang 7
1.2. Tổng quan về nguyên liệu sản xuất phân vi sinh

Có nhiều loại nguyên liệu có thể được sử dụng để sản xuất phân vi sinh: bã
mía, phân chuồng, rơm, mùn cưa, bã thải trồng nấm, than bùn….Trong đó rơm
và bã thải trồng nấm từ rơm là đáng chú ý nhất.
- Rơm là sản phẩm phụ của cây ngũ cốc hay cây họ đậu, là phần thân của cây, là
phế liệu của ngành nông nghiệp [6].Việt Nam là một quốc gia phát triển mạnh
kinh tế nông nghiệp, trong đó chú yếu phát triển cây lúa nước nên ở Việt Nam,
rơm là phần thân của cây lúa nước sau khi đã thu hoạch thóc.
- Thành phần chính và chiếm nhiều nhất trong rơm là cellulose với hàm lượng
chiếm xấp xỉ 50% khối lượng. Ngoài cellulose, trong rơm rạ còn có các thành
phần khác như lignin, protein, khoáng, lipid với tỷ lệ khác nhau.
Bảng 1.1 Thành phần hóa học của rơm rạ[12]
Thành
Phần
Hàm lượng
(%)
Cellulose 32 – 47
Protein 3 – 4,5
Khoáng 14 – 15
Tro 9 - 14
Lipid 1,2 - 2
- Bình thường, rơm rạ được phơi khô, chất thành đống để làm thức ăn dự trữ vào
mùa đông cho gia súc, làm vật liệu lót nền chuồng trại, làm chất đốt hoặc được
đốt trực tiếp trên đồng ruộng. Vì vậy, giá trị sử dụng và giá trị kinh tế rất thấp.
SVTH: Nguyễn Hạnh Minh Uyên Lớp 10SHLT GVHD: Đặng Đức Long
Trang 8
Việc đốt rơm, rạ chẳng những lãng phí nguồn nguyên nhiên liệu mà còn gây ô
nhiễm môi trường. [9]
- Hiện nay, rơm rạ được sử dụng làm nguyên liệu trồng nấm, sản xuất phân hữu
cơ, ép làm vật liệu xây nhà như làm vật liệu xây tường thay gạch, sản xuất tấm
lợp cách nhiệt Đã có nhiều nghiên cứu ở trong nước cũng như nước ngoài

nhằm hướng đến việc sản xuất năng lượng sinh học từ rơm rạ.
- Bã thải rơm sau khi trồng nấm rơm: là một phụ phẩm của ngành trồng nấm.
Rơm rạ sau khi xử lý với vôi và tiến hành ủ được dùng làm giá thể trồng nấm
rơm. Khi kết thúc quá trình trồng nấm ta thu được bã thải trồng nấm, đây là
nguồn nguyên liệu để sản xuất phân vi sinh.
1.3. Tổng quan về các loài vi khuẩn thường được sử dụng để tạo phân vi
sinh
1.3.1. Tổng quan về Bacillus subtilis
1.3.1.1. Nguồn gốc [11]
Bacillus subtilis phân bố phổ biến trong môt trường đất, trong các chất hữu
cơ bị thối rửa, trong cỏ khô nên còn có tên gọi khác là trực khuẩn cỏ khô. Trong
các loại thực phẩm lên men truyền thống, đặc biệt là trong tương.
Bacillus subtilis thuộc:
- Giới : Bacterice
- Ngành : Firmicutes
- Lớp : Bacilie
- Bộ : Bacillales
- Họ : Bacillanceae
- Chi : Bacillus.
1.3.1.2. Đặc điểm hình thái, tính chất sinh lý
Bacillus là những trực khuẩn nhỏ, hai đầu tròn, kích thước 3 - 5 × 0,6µm, có
khả năng di động, tế bào đứng riêng rẽ hoặc nhiều tế bào nối với nhau thành
chuỗi dài ngắn khác nhau. Tập đoàn của nó phát triển lan rộng và có hình dạng
bất địnhError: Reference source not found. [9]
Bacillus subtilis là vi sinh vật tự dưỡng, Gram dương, hiếu khí hoặc kỵ khí
tùy tiện, có màng nhầy. Màng nhày của Bacillus subtilis giúp chúng có thể tồn tại
SVTH: Nguyễn Hạnh Minh Uyên Lớp 10SHLT GVHD: Đặng Đức Long
Trang 9
trong môi trường acid, base hay trong điều kiện nhiệt độ cao. Màng nhày cũng là
nơi dự trữ thức ăn, bảo vệ vi khuẩn trong những điều kiện khắc nghiệt. Khuẩn lạc

Bacillus subtilis khô, không màu hoặc màu xám nhạt, hơi nhăn hoặc tạo ra lớp
màng mịn lan trên bề mặt thạch, có mép nhăn bám chặt vào môi trường thạch [5].
Trong điều kiện môi trường bất lợi Bacillus subtilis sẽ hình thành nội bào
tử, bào tử có kích thước 0,6 - 0,9 µm. Nội bào tử này có thành tế bào rất dày, vì
vậy có thể tồn tại trong các điều kiện bất lợi của môi trường như ở nhiệt độ cao,
hay trong môi trường acid do đó có thể duy trì trạng thái sống tiềm tàng trong
nhiều năm, thậm chí hàng thế kỷ [5].
1.3.1.3. Ứng dụng của Bacillus subtilis [8]
- Ngoài việc sản xuất phân vi sinh, Bacillus subtilis còn được ứng dụng khá
nhiều trong các ngành công nghiệp. Đặc biệt là công nghiệp sản xuất enzyme
ngoại bào như protease trung tính và protease kiềm.
- Hiện nay Bacillus subtilis đã được thao tác trên gen nên có thể tạo ra các
vi sinh vật hiện đại được sử dụng rộng rãi trong nghiên cứu ở phòng thí nghiệm.
- Ngoài ra, Bacillus subtilis còn sản xuất enzym phân giải protein là
subtilisin, được xem là phương thuốc tiềm năng để chữa bệnh ung thư.
1.3.2. Tổng quan về Azotobacter [14]
1.3.2.1.Nguồn gốc
- Azotobacterium là vi khuẩn cố định N sống tự do trong đất.
- Được phân lập và nuôi cấy thuần khiết từ năm 1901 do nhà VSV Hà Lan
Beijerinck.
1.3.2.2. Đặc điểm hình thái, tính chất
- Khi còn non tế bào có dạng que đầu tròn đứng riêng lẻ hay xếp thành từng
đôi chồng chất, chất tế bào nhuộm màu đồng đều, có khả năng di động nhờ tiêm
SVTH: Nguyễn Hạnh Minh Uyên Lớp 10SHLT GVHD: Đặng Đức Long
Hình 1.3. Bacillus subtilis quan sát dưới kính hiển vi [11]
Trang 10
mao. Khi già tế bào Azotobacter mất khả năng di động, kích thước thu nhỏ lại
biến thành dạng hình cầu.
- Kích thước: 2,0-7,0 × 10-25 µm
- Vi khuẩn Gram âm không sinh bào tử, hiếu khí hoặc kỵ khí tùy tiện

- Hình dạng tế bào Azotobacter và chu kì biến đổi của chúng phụ thuộc vào
tuổi của ống giống và điều kiện phát triển.
1.3.2.3. Đặc tính sinh lý
- Trong điều kiện không có Nitơ, Azotobacter sẽ dùng Nitơ của không khí
để biến thành hợp chất Nitơ của cơ thể sống. Trong điều kiện thích hợp, cứ mỗi
khi tiêu thụ 1gam hydratcarbon Azotobacter có thể cố định được 10- 15mg Nitơ.
- Trên các môi trường không chứa Nitơ khuẩn lạc Azotobacter có dạng
nhầy, lồi, đôi khi nhăn nheo.
- Azotobacter sử dụng nhiều loại hợp chất hữu cơ khác nhau: disacaride,
dextrin, tinh bột, acid hữu cơ, hợp chất thơm, …
- Một số chủng Azotobacter không có khả năng đồng hoá lactose, manitol
hoặc natribenzoat.
- Có khả năng đồng hoá muối amonium, urê.
- Không có khả năng đồng hóa chất mùn, phát triển mạnh ở môi trường
giàu chất hữu cơ dễ đồng hóa (đất có bón phân xanh, phân chuồng, rơm rạ).
- Đồng hóa rất tốt các sản phẩm phân giải của cenlulose.
- Azotobacter mẫn cảm cao đối với phospho, canxi.
- Mẫn cảm với pH, phát triển ở pH 4,5–9,0, thích hợp nhất là pH 7,2 – 8,2.
- Đòi hỏi độ ẩm rất cao của đất, thích hợp nhất là 75- 80%.
- Nhiệt độ thích hợp 25 – 30
0
C, nhưng Azotobacter có khả năng chống chịu
tốt ở nhiệt độ thấp.
- Có khả năng tiết ra các loại vitamin và các chất sinh học như: B1, B6,
axit nicotinic, acid pentotenic, biotin, auxin.
- Có khả năng tiết kháng sinh để chống nấm thuộc nhóm Anixomixin. Một
số chủng A.chroococum có khả năng sinh ra một số chất chống nấm (Aspergillus,
Penicillium, Fusarium, Alternaria …)
SVTH: Nguyễn Hạnh Minh Uyên Lớp 10SHLT GVHD: Đặng Đức Long
Hình 1.4. Azotobactar quan sát dưới kính hiển vi [11]

Trang 11
1.3.2.4. Ứng dụng
- Sản xuất ở quy mô công nghiệp hoặc thủ công nghiệp những chế phẩm
Azotobacter và gọi là Azotobacterin. Đó là những dịch nuôi cấy Azotobacter
được hấp thụ vào than bùn hoặc các loại đất giàu chất hữu cơ đã trung hoà và bổ
sung thêm một ít phân phospho, kali…Hiệu quả hơn đối với các đất giàu chất
hữu cơ hoặc được bón thêm nhiều phân khoáng.
- Ngoài ra còn khai thác khía cạnh tổng hợp các chất hoạt động sinh học
kích thích sinh trưởng của cây trồng.
- Ở Việt Nam, việc sản xuất và sử dụng chế phẩm Azotobacterin chỉ đặt ra
trong những điều kiện thâm canh có khả năng dồi dào về phân bón, cần bón vôi
và bón phân lân để làm tăng số lượng Azotobacter trong đất.
1.3.3. Tổng quan về Trichoderma
1.3.3.1. Nguồn gốc, đặc điểm sinh học
- Trichoderma là một loại nấm mốc thuộc nhóm vi sinh vật phân giải chất
hữu cơ sống chủ yếu trong đất.
- Trichoderma được phân loại như sau [11]
• Giới : Fungi
• Ngành : Ascomycota
• Lớp : Euascomycetes
• Bộ : Hypocreales
• Họ : Hypocreaceae
• Chi : Trichoderma
- Là vi nấm ưa ẩm, chiếm ưu thế ở những nơi ẩm ướt.
- Trong đất, Trichoderma lấy dinh dưỡng để phát triển bằng cách hoại sinh
(phân hủy chất hữu cơ) và kí sinh (tấn công nấm, vi khuẩn, và tuyến trùng gây
bệnh). Cạnh tranh dinh dưỡng và không gian sống của các đối thủ, hoặc ức chế
và tiêu diệt bằng cách tiết ra các Enzyme và chất kháng sinh để tiêu diệt nấm, vi
khuẩn đối kháng, làm bất hoạt các Enzyme gây bệnh. [15]
- Ngoài ra Trichoderma còn có thể hình thành khuẩn lạc tập xung quanh

vùng rễ, giúp rễ cây hấp thụ dinh dưỡng và nước tốt hơn khi gặp điều kiện khắc
nghiệt bằng việc gia tăng sự phát triển của rễ và cây trồng. [15]
SVTH: Nguyễn Hạnh Minh Uyên Lớp 10SHLT GVHD: Đặng Đức Long
Trang 12
1.3.3.2. Đặc điểm hình thái[4]
- Trichoderma là một loài nấm bất toàn, sinh sản vô tính bằng đỉnh bào tử từ
khuẩn ty, sợi nấm không màu, có vách ngăn, có khả năng phân nhánh nhiều và
cho lượng bào tử lớn.
- Bào tử thường có màu xanh, đơn bào, hình trứng, tròn, elip hoặc oval tùy
loài, bào tử đính vào đỉnh của cành.
1.3.3.3. Nguồn carbon và năng lượng Trichoderma có thể sử dụng được[4]
-
Monosaccharides
-
Disaccharides
-
Hỗn hợp Polysaccharides, purine, pyrinidin, acid amin, tanmin
-
Hỗn hợp Aldehydes và acid hữu cơ
-
Acid béo
-
Methanol, methylamine
-
Formate
-
NH
3
-
Ngoài ra còn có các muối hay các nguồn sulfur và Vitamin

SVTH: Nguyễn Hạnh Minh Uyên Lớp 10SHLT GVHD: Đặng Đức Long
Hình 1.5. Nấm Trichoderma và bào tử
Trang 13
PHẦN 2
ĐỐI TƯỢNG, VẬT LIỆU
VÀ PHƯƠNG PHÁP
NGHIÊN CỨU
SVTH: Nguyễn Hạnh Minh Uyên Lớp 10SHLT GVHD: Đặng Đức Long
Trang 14
2.1. Vật liệu, đối tượng nghiên cứu
2.1.1. Đối tượng nghiên cứu
2.1.1.1. Bã thải trồng nấm
Bã thải trồng nấm rơm từ rơm: lấy từ trại nấm ở thôn Đông Sơn, xã Ninh,
huyện Hòa Vang, Đà Nẵng vào tháng 4 năm 2012.
2.1.1.2. Các chủng vi khuẩn
Trong quá trình thực hiện đề tài em sử dụng các chủng Bacillus subtilis,
Azotobacter, Trichoderma được nuôi cấy và bảo quản tại phòng Thí nghiệm
Công nghệ Sinh học thuộc khoa Hóa, trường Đại học Bách khoa Đà Nẵng.
2.1.1.3. Phân hữu cơ vi sinh
Trong đề tài này, em sử dụng 1 loại phân bón vi sinh hữu cơ có bán trên
thị trường làm đối tượng theo dõi, đánh giá chất lượng và hiệu quả sử dụng trong
các thí nghiệm kiểm nghiệm hiệu quả của phân bón để so sánh với chế phẩm vi
sinh vật đã tạo được. Đó là sản phẩm Phân bón vi sinh hữu cơ của Công ty Sông
Gianh được mua từ Trung tâm Vật tư nông nghiệp ở 42 Âu Cơ- quận Liên
Chiểu- Đà Nẵng.
2.1.1.4. Cây cải xanh
Để thực hiện thí nghiệm đánh giá hiệu quả sử dụng của phân bón vi sinh
sản xuất được từ đề tài nghiên cứu cũng như phân bón vi sinh trên thị trường, em
sử dụng cây rau cải xanh làm đối tượng thực nghiệm: giống Cải bẹ xanh nhãn
hiệu Trang Nông được mua từ cửa hàng tạp hóa Đoàn Loan ở 33 Vũ Ngọc Phan-

Liên Chiểu- Đà Nẵng.
Rau cải xanh còn được gọi là Cải bẹ xanh, Cải cay hay Cải canh, tên khoa
học là Brassica juncea, thuộc họ Cải (Brassicaceae). [16]
Cải xanh là cây thân thảo, hoàn toàn nhẵn, cao 40-60cm hay hơn, rễ trụ ít
phân nhánh. Lá mọc từ gốc, chu kỳ phát triển tương đối ngắn, từ lúc gieo hạt đến
lúc thu hoạch khoảng 30-35 ngày, có thể trồng quanh năm, cây dễ trồng, phát
triển nhanh. Ngoài ra, ngoài giá trị làm thực phẩm (rau), Cải còn là một vị thuốc
tốt cho sức khỏe, giúp lợi tiểu, giảm đau, an thần….Và hạt Cải cũng có thể dùng
để ép dầu dùng làm gia vị và trong công nghiệp. [16]
SVTH: Nguyễn Hạnh Minh Uyên Lớp 10SHLT GVHD: Đặng Đức Long
Trang 15
2.1.2. Dụng cụ - Thiết bị
Nghiên cứu đã được thực hiện với các dụng cụ, thiết bị và máy móc có độ
chính xác cao. Một số loại dụng cụ và thiết bị chính hay được sử dụng:
• Dụng cụ
- Đĩa petri
- Ống nghiệm, ống đong
- Bình tam giác
- Micropipet các loại 200µl, 1000µl
- Đầu côn các loại
- Eppendorf loại 1,5 ml
- Cuvet
• Thiết bị
- Cân phân tích, cân kỹ thuật (hãng Ohaus, Mỹ)
- Nồi hấp vô trùng (hãng ALP- Nhật Bản)
- Máy đo pH (Oakion 510, Mỹ)
- Máy nuôi lắc ổn định nhiệt (GLS400, hãng Grant, Anh)
- Máy đo quang phổ (hãng Pharmacia Biotech, Anh)
- Máy ly tâm lạnh (hãng Hettich, Đức)
- Máy cất nước (hãng Hamilton, Anh)

- Lò vi sóng (hãng Sharp, Mỹ)
- Tủ lạnh (giữ ở -20
o
C)
- Tủ mát ( giữ ở 4
o
C)
- Tủ ấm (nuôi ở 30
o
C, hãng Memmert)
- Bốc cấy vô trùng (hãng Esco)
2.2. Môi trường nuôi các chủng vi sinh vật
Môi trường dinh dưỡng là một yếu tố quan trọng ảnh hưởng rất lớn đến hoạt
động sống cũng như tốc độ sinh trưởng phát triển của vi sinh vật. Để đảm bảo
điều đó, môi trường nuôi cấy cần có các chất chứa cacbon, nitơ, hydro, oxy, …và
các thành phần khác (muối vi lượng, đa lượng, …)
SVTH: Nguyễn Hạnh Minh Uyên Lớp 10SHLT GVHD: Đặng Đức Long
Trang 16
2.2.1. Môi trường nuôi Bacillus subtilis
- Thành phần môi trường nuôi cấy chủng Bacillus subtilis gồm: [7]
- Thành
phần môi trường thử
hoạt tính sinh
enzyme cellulase
của Bacillus
subtilis[5]:
CMC
(Carboxylmethyl cellulose) 1%
Agar 2%
- Đối với môi trường hoạt hóa vi khuẩn Bacillus subtilis: sử dụng môi

trường thạch với các thành phần như trên (môi trường có agar)
- Đối với môi trường nhân giống vi khuẩn Bacillus subtilis: sử dụng môi
trường lỏng (không có agar)
2.2.2. Môi trường nuôi Azotobacter [14]
Môi trường nuôi Azotobacter là môi trường vô đạm Ashby. Thành phần môi
trường (g/l):
- Glucose 20
- K
2
HPO
4
.3H
2
O 0,2
- MgSO
4
.7H
2
O 0,2
- NaCl 0,2
- K
2
SO
4
0,1
- CaCO
3
5
- Agar 20
Điều chỉnh pH 6,5-7 và bổ sung nước cất đến 1000ml.

- Môi trường hoạt hóa Azotobacter là môi trường rắn (môi trường có agar)
- Môi trường nhân giống vi khuẩn Azotobacter là môi trường lỏng (không
có agar)
2.2.3. Môi trường nuôi Trichoderma
Thành phần môi trường nuôi cấy chủng Trichoderma (g/l) gồm:
SVTH: Nguyễn Hạnh Minh Uyên Lớp 10SHLT GVHD: Đặng Đức Long
Cao thịt 0,3 %
NaCl 0,5 %
Pepton 1 %
Agar 2 %
Cao nấm 2 %
pH 7
Bổ sung nước cất đến 1000ml
dsfdgfhh
Trang 17
-
Khoai tây 200
-
D-glucose 20
-
Agar 20
Điều chỉnh pH đến 7,2 và bổ sung nước cất đến 1000ml.
- Môi trường hoạt hóa Trichoderma là môi trường rắn (môi trường có agar)
- Môi trường nhân giống vi khuẩn Trichoderma là môi trường lỏng (không
có agar)
2.3. Phương pháp nghiên cứu
2.3.1. Phân tích một số thành phần cơ bản của bã thải nấm trước và sau khi
xử lý với vi sinh vật
2.3.1.1 Định lượng Cellulose [5]
a. Nguyên tắc:

Định lượng cellulose dựa trên tính chất bền của cellulose đối với tác dụng
của acid mạnh và kiềm mạnh, không bị phân hủy dưới tác dụng của acid yếu.
Các chất khác thường đi kèm theo cellulose như hemicellulose, lignin, tinh
bột ít bền hơn đối với tác dụng của acid và kiềm nên bị oxy hóa và phân giải
sau đó tan vào dung dịch sau khi xử lý nguyên liệu.
b.Hóa chất
- Dung dịch acid nitric HNO
3
đậm đặc(d=1,4)
- Dung dịch acid acetic CH
3
COOH đậm đặc
- Etanol 96%
c. Tiến hành
- Cân chính xác 1-2 gam mẫu đã nghiền nhỏ vào bình tam giác 250 ml.
- Thêm vào bình 16,5ml hỗn hợp gồm 15ml acid nitric đặc và 1,5ml acid
acetic đặc.
- Lắp ống làm lạnh hồi lưu vào bình và đun sôi hỗn hợp 30 phút. Sau đó để
nguội, pha loãng hỗn hợp bằng nước nóng.
- Lọc tất cả qua giấy lọc đã biết trước khối lượng.
- Rửa kết tủa cellulose nhiều lần bằng nước cất
- Rửa bằng etanol 1-2 lần
- Sấy giấy lọc chứa cellulose ở nhiệt độ 100-105
o
C đến khối lượng không
đổi
d. Tính kết quả
Hàm lượng cellulose được tính theo công thức sau:
SVTH: Nguyễn Hạnh Minh Uyên Lớp 10SHLT GVHD: Đặng Đức Long
Trang 18

m
100 x a
X(%)
=
Trong đó:
- X: hàm lượng cellulose tính bằng %
- a: khối lượng cellulose (g)
- m: khối lượng mẫu thí nghiệm (g)
2.3.1.2. Định lượng Lignin [8]
a. Nguyên lý
Lignin là phần còn lại sau khi ôxy hóa ADF trong dung dịch KMnO
4
và
dung dịch đệm lignin ở nhiệt độ cao.
b. Hóa chất
- KMnO
4
dung dịch (1): Hòa 50g KMnO
4
và 0,05g Ag
2
SO
4
trong 1 lít nước
cất vừa đủ. Bảo quản tránh ánh sáng.
-
Dung dịch đệm lignin (2): Hòa tan 6g Fe(NO
3
)
3

.9H
2
O và 0,15g AgNO
3
trong 100ml nước cất vừa đủ. Kết hợp với 500g acid acetic và 5g acetat kali.
Thêm 400ml cồn butyl và trộn đều.
-
Hỗn hợp dung dịch: pha trộn 2 phần dung dịch (1) và 1 phần dung dịch (2)
theo thể tích trước khi dùng. Tránh bảo quản lâu.
-
Ethanol : Trộn 155ml nước cất với 845ml ethanol 95%.
c. Tiến hành
- Chuẩn bị mẫu: Mẫu sau khi phân tích ADF (trước khi khoáng hóa) được
giữ lại để sử dụng cho phân tích lignin.
- Ôxy hóa :
o Thêm vào mẫu ADF 50ml hỗn hợp 2 dung dịch KMnO
4
và dung dịch
đệm lignin tỷ lệ 2:1 vào cốc và ngâm 20 - 30 phút cho đến khi xơ có màu trắng.
o Khuấy 3 lần trong khi ôxy hóa.
- Xác định khối lượng :
o Lọc rửa nhiều lần với cồn ethanol và 2 lần cuối với aceton.
o Đợi aceton bay hơi hết và đem sấy 105
o
C qua đêm (10 - 12 giờ).
o Làm nguội trong bình hút ẩm 30 phút và cân.
o Lặp lại việc sấy (khoảng 1 giờ) và cân đến khi có khối lượng không đổi.
d.Tính kết quả
Hàm lượng % lignin (Lig) được tính theo công thức sau :
Lig (%) = (W

d
- W
t
)/W
×
100
SVTH: Nguyễn Hạnh Minh Uyên Lớp 10SHLT GVHD: Đặng Đức Long
Trang 19
Trong đó:
- W
d
là khối lượng cốc và lignin sau khi sấy, (g)
- W
t
là khối lượng cốc (g)
- W là khối lượng mẫu (g)
2.3.1.3. Xác định hàm lượng Nitrat [1]
a. Nguyên tắc:
Acid nitric giải phóng từ muối nitrat tác dụng với acid phenoldisunfonic cho
ra acid nitrophenoldisunfonic. Amoniac tác dụng với nitrophenoldisunfonic cho
phức màu vàng. Đem so màu của phức chất với thang màu nitrat chuẩn sẽ biết
được hàm lượng nitrat có trong mẫu nước.
b. Hóa chất:
- Thuốc thử acid phenoldisunfonic: lấy 3ml phenol tinh khiết, nguyên chất
hòa tan vào trong 20ml H
2
SO
4
đậm đặc khuấy đều, để nguội, sau 24 giờ mới sử
dụng. Dung dịch không bền, do đó pha đủ dùng để tránh lãng phí.

- Dung dịch NO
3
- tiêu chuẩn: Cân chính xác 1,609g KNO
3
, hòa tan vào
trong một ít nước cất sau đó định mức thành 1000ml. Ta có 1ml dung dịch vừa
chuẩn bị tương ứng với 1mg NO
3
- tính chuyển ra HNO
3
Lấy dung dịch trên pha
loãng 10 lần ta được 1ml dung dịch này tương ứng với 0,1mg HNO
3
.
- Amon hydroxit đậm đặc.
c. Tiến hành:
- Lấy 25 ml dung dịch NO
3
- tiêu chuẩn có nồng độ 0,1g/ml cho vào cốc
thủy tinh chịu nhiệt (có 2,5g HNO
3
) chưng cách thủy cho đến cô cạn, để nguội.
Cho 2ml thuốc thử acid phenoldisunfonic vào rải đều, thêm nước cất vào và dùng
đủa thủy tinh khuấy đều rồi chuyển tất cả vào bình định mức 50ml và tráng cốc
thủy tinh nhiều lần bằng nước cất, cho nước tráng vào bình định mức và định
mức thành 50ml. Vậy 1ml dung dịch đã pha loãng có 0,005mg HNO
3
- Chuẩn bị thang mẫu theo bảng sau:
Bảng 2.1. Chuẩn bị dung dịch đo OD để xây dựng đường chuẩn xác định
NO

3
-
Dung dịch (ml)
Số thứ tự cốc thủy tinh
0 1 2 3 4 5 6 7 8
SVTH: Nguyễn Hạnh Minh Uyên Lớp 10SHLT GVHD: Đặng Đức Long
Trang 20
Dung dịch
HNO
3
pha
loãng:
0,005mg/ml
0 1 2 3 5 6 8 10 12,5
Amon hydroxit
đậm đặc
5 5 5 5 5 5 5 5 5
Nước cất Định mức thành 50ml
Lượng HNO
3
trong mỗi cốc
thủy tinh
0 0,005 0,01 0,015 0,02 0,03 0,04 0,05 0,0625
Nồng độ HNO
3
(mg/l)
0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,6 0,8 1,0 1,25
Để thang màu ổn định (từ 5-10 phút) rồi tiến hành đo độ hấp thụ trên máy
so màu ở bước sóng α = 400nm. Ghi mật độ quang theo thứ tự của từng cốc.
Vẽ đồ thị biểu diễn mối quan hệ giữa độ hấp thụ (trục tung) với hàm lượng NO

3
-
của dung dịch chuẩn (trục hoành). Dựa vào số liệu đo đạt được, ta tiến hành vẽ
đồ thị bằng phần mềm MS. Excel, tương ứng giá trị nồng độ của dung dịch mẫu
và chỉ số OD đo được, ta xác định được các điểm trên đồ thị. Đường thẳng đi qua
lân cận các điểm xác định được là đường chuẩn ta cần tìm. Kết quả xây dựng
đường chuẩn được trình bày ở mục 3.1.3. Mỗi lần thí nghiệm ta phải xây dựng
một đường chuẩn riêng để xác định giá trị của mẫu tại cùng thời điểm dựng
đường chuẩn.
- Xác định hàm lượng NO
3
- trong mẫu thí nghiệm:
Cho 50ml mẫu nước cần thử vào trong cốc thủy tinh chịu nhiệt, đun cách
thủy cho đến khô cạn, để nguội. Cho 2ml thuốc thử acid phenilsunfonic vào rải
đều, thêm nước (khoảng 10ml) và 5ml amon hydroxit đậm đặc vào, dùng đũa
thủy tinh khuấy đều (nếu có xuất hiện màu vàng, chứng tỏ có ion NO
3
-)
Chuyển tất cả vào bình định mức 50ml và tráng cốc thủy tinh nhiều lần
bằng nước cất, cho nước tráng vào bình định mức và định mức thành 50ml. Đem
đo trên máy so màu ở bước sóng α = 400nm. Ghi lại mật độ quang của mẫu thử.
SVTH: Nguyễn Hạnh Minh Uyên Lớp 10SHLT GVHD: Đặng Đức Long
Trang 21
Dựa vào đường chuẩn đã xây dựng được để xác định hàm lượng nitrat thông qua
mối quan hệ với mật độ quang.
2.3.1.4. Xác định hàm lượng Nitơ theo phương pháp Biure [8]
a. Nguyên tắc
Các chất chứa từ 2 liên kết peptid (-CO-NH-) trở lên đều cho phản ứng
Biure: trong môi trường kiềm mạnh, các liên kết peptit phản ứng với CuSO
4

tạo
thành một phức chất có màu từ tím đỏ tới xanh.
Vì cường độ màu tỷ lệ thuận với nồng độ protein (nồng độ protein càng cao
thì màu sắc càng đậm) do đó có thể đo cường độ màu bằng máy quang phổ rồi
suy ra nồng độ protein của một dung dịch bất kỳ.
b. Hóa chất
• Dung dịch Albumin 1%
• Thuốc thử Biure, là hỗn hợp của các dung dịch sau:
- Dung dịch NaOH 10% (dung dịch A)
Chuẩn bị NaOH bão hòa không lẫn carbonat. Hòa tan 500g NaOH trong
500ml nước cất, khuấy từ từ, đậy kín, để lắng sau nhiều ngày, gạn lấy phần nước
trong. Cho 24ml NaOH bão hòa vào bình định mức 200ml rồi định mức tới vạch.
- Dung dịch đồng sulfat với natri, kalitatrat (dung dịch B)
Cân 1,5g CuSO
4
.5H
2
O, 6g Na- K tartrat và một ít nước vất vào becher
500ml, hòa tan dần rồi chuyển vào bình định mức 500ml, định mức tới vạch.
- Trộn A, B và nước cất theo tỷ lệ 3:5:2 ta được thuốc thử Biure.
c. Tiến hành
Để tiến hành xác định nồng độ của một dung dịch theo phương pháp so
màu, trước tiên ta phải dựng một đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc của độ hấp thu
màu và một dãy dung dịch protien chuẩn đã biết trước nồng độ. Từ đó chỉ cần đo
độ hấp thu của dung dịch chưa biết nồng độ, rồi đối chiếu lên đồ thị chuẩn này sẽ
suy ra nồng độ của dung dịch muốn biết.
Chuẩn bị 7 ống nghiệm sạch, khô rồi làm theo bảng sau:
Bảng 2.2. Dung dịch protein chuẩn
Ống nghiệm số 1 2 3 4 5 6 7
SVTH: Nguyễn Hạnh Minh Uyên Lớp 10SHLT GVHD: Đặng Đức Long

Trang 22
Nồng độ Protein
(mg/ml)
0 0 2 4 6 8 10
Albumin 1% (ml) 0 0 2 4 6 8 10
Nước cất (ml) 10 10 8 6 4 2 0
Lắc đều rồi lấy một loạt 7 ống nghiệm khác, hút từ các dung dịch protein có
nồng độ vừa pha ở bảng 2.2 ở trên vào các ống nghiệm theo bảng sau:
Ống nghiệm số 1 2 3 4 5 6 7
Nồng độ protein của dung
dịch chuẩn (mg/ml)
0 0 2 4 6 8 10
Dung dịch protein chuẩn
(ml)
1 1 1 1 1 1 1
Thuốc thử Biure (ml) 4 4 4 4 4 4 4
Lắc đều, để yên 20 phút ở nhiệt độ phòng. Rồi đo độ hấp thụ ở bước sóng 540nm
Độ hấp thu (OD) OD
1
OD
2
OD
3
OD
4
OD
5
OD
6
OD

7
ΔOD 0 0 ΔOD
3
ΔOD
4
ΔOD
5
ΔOD
6
ΔOD
7
Ghi chú : ΔOD = OD
n
– OD
0
(với OD
0
= (OD
1
+ OD
2
)/2 là mẫu thử không)
Vẽ đồ thị protein chuẩn với trục tung là ΔOD, trục hoành là hàm lượng protein
(mg). Dựa vào số liệu đo đạt được, ta tiến hành vẽ đồ thị bằng phần mềm MS.
Excel, tương ứng giá trị nồng độ của dung dịch mẫu và chỉ số OD đo được, ta
xác định được các điểm trên đồ thị. Đường thẳng đi qua lân cận các điểm xác
định được là đường chuẩn ta cần tìm.
• Xác định protein trong có trong mẫu:
Lấy hai ống nghiệm sạch, cho vào 1ml dung dịch protein mẫu cần xác định nồng
độ, thêm 4ml thuốc thử Biure. Lắc đều để yên 20 phút rồi đem đo độ hấp thụ ở

bước sóng 540nm. Giả sử được giá trị OD
M1
, OD
M2
rồi lấy trung bình cộng được
OD
M
, ΔOD
M
= OD
M
– OD
0
. Dựa vào đồ thị chuẩn đã dựng ở trên để suy ra hàm
lượng protein có trong 100g mẫu ban đầu.
* Lưu ý :
- Nếu ΔOD
M
nằm ngoài đồ thị chuẩn, phải pha loãng dung dịch protein.
SVTH: Nguyễn Hạnh Minh Uyên Lớp 10SHLT GVHD: Đặng Đức Long
Trang 23
- Phương pháp Biure được sử dụng với mẫu nghiên cứu có hàm lượng
protein tương đối lớn (> vài mg/ml). Trường hợp mẫu qua ít protein thì phải dùng
phương pháp khác phù hợp hơn.
2.3.2. Phương pháp hoạt hóa vi sinh vật
Quá trình hoạt hóa 3 chủng vi sinh vật: Bacillus subtilis, Azotobacter,
Trichoderma được tiến hành như nhau trên các môi trường hoạt hóa thích hợp
với chúng (thành phần được trình bày ở trên) bằng cách cấy trang và cấy zíc zắc.
Toàn bộ quá trình được thực hiện trong bốc cấy vô trùng. Quá trình hoạt hóa
được thực hiện bằng cách nuôi các đĩa thạch trong tủ ấm ở nhiệt độ 30

o
C với
thời gian phù hợp.
Hình 2.1. Quy trình tiến hành hoạt hóa giống
2.3.3. Phương pháp xác định khả năng sinh enzyme cellulase của Bacillus
subtilis
Để định tính được khả năng sinh tổng hợp enzyme cellulase của chủng
Bacillus subtilis nuôi cấy được, tiến hành chọn những khuẩn lạc tốt thu được sau
quá trình hoạt hóa rồi cấy vào môi trường thử hoạt tính sinh enzyme cellulase.
Sau đó nuôi trong tủ ấm ở 30
o
C trong 24 giờ.
Sử dụng thuốc nhuộm Lugol để kiểm tra khả năng thủy phân cellulose của
enzyme cellulase và đo đường kính vòng thủy phân. Đường kính vòng thủy phân
quan sát được tương ứng với độ phân giải cellulose của enzyme cellulase.
SVTH: Nguyễn Hạnh Minh Uyên Lớp 10SHLT GVHD: Đặng Đức Long
Trang 24
2.3.4. Phương pháp nuôi cấy thu sinh khối của các chủng vi sinh vật
Quá trình nuôi cấy nhằm thu sinh khối của 3 chủng vi sinh vật được thực
hiện bằng cách thu nhận khuẩn lạc của Bacillus subtilis, Azotobacter,
Trichoderma có được sau khi hoạt hóa đem nuôi cấy lắc trên môi trường lỏng
(môi trường hoạt hóa không bổ sung Agar) ở nhiệt độ 30
o
C
Để xác định thời điểm thu nhận sinh khối của các chủng vi sinh vật thì
hành theo dõi đường cong sinh trưởng của chúng ở các bước sóng thích hợp.
2.3.5. Phương pháp đo mật độ quang
Nguyên tắc của phương pháp này dựa theo định luật Lambert-Beer, độ lớn
của tín hiệu hấp thụ tỷ lệ thuận với nồng độ chất phân tích, các chất khác nhau sẽ
hấp thụ tốt ở các bước sóng khác nhau.

-
Đối với Bacillus subtilis: quá trình đo được thực hiện ở OD
600nm
để xác
định tốc độ sinh trưởng của chủng theo từng thời điểm nuôi cấy nhằm xây dựng
đường cong sinh trưởng.
-
Đối với Azotobacter: quá trình đo được thực hiện ở OD
520nm
-
Đối với Trichoderma: quá trình đo được thực hiện ở OD
540nm
2.3.6. Phương pháp giữ giống
Quá trình giữ giống được thực hiện bằng cách cấy chuyền giống trên môi
trường thạch thích hợp, nuôi trong tủ ấm ở 30
o
C trong thời gian thích hợp cho vi
sinh vật phát triển. Thời gian nuôi thích hợp cũng là thời gian hoạt hóa các vi
sinh vật.
Sau đó giống được đem bảo quản trong tủ lạnh ở nhiệt độ 4
o
C.
2.3.7. Xử lý bã thải nấm (phương pháp ủ)
Trước khi ủ bã thải trồng nấm bằng vi sinh vật cần xử lý bã thải bằng vôi
bột để tiêu diệt một phần vi sinh vật tạp. Tỷ lệ vôi bổ sung vào bã thải là 3-4%,
thời gian ủ là 2 ngày.
Sau khi ủ với vôi, bã thải được đem xử lý lý theo phương pháp ủ với chế
phẩm vi sinh vật trong thời gian từ 12 - 30 ngày để thu sản phẩm phân vi sinh
hữu cơ.
Trong đề tài này, tôi sử dụng sinh khối của 3 chủng vi sinh vật sau khi

nuôi cấy được để xử lý bã thải trồng nấm có nguồn gốc từ rơm với tỷ lệ là 10%
SVTH: Nguyễn Hạnh Minh Uyên Lớp 10SHLT GVHD: Đặng Đức Long
Trang 25
cho mỗi giống.
2.3.8. Phương pháp xác định hiệu quả của phân vi sinh hữu cơ đến sự sinh
trưởng và phát triển của cây rau Cải [2]
Thí nghiệm được thực hiện trong các thùng xốp có kích thước 45 x 230 x 25
cm trên nền đất thịt trung bình
- Chuẩn bị đất: đất được lấy từ Phường Bắc Mỹ An- Quận Ngũ Hành Sơn- Đà
Nẵng, sau khi lấy về tiến hành sàng lọc loại bỏ các phần không phải đất, sau đó
cho vào thùng xốp. Mỗi thùng sử dụng 10kg đất để trồng cây, khối lượng phân
bón trên các thùng như nhau chỉ khác về chủng loại. Công thức thí nghiệm được
trình bày ở bảng dưới đây, mỗi công thức lặp lại 2 lần:
Bảng 2.3. Công thức phân bón sử dụng để trồng cây
Công
thức
Khối lượng
đất (kg)
Loại phân bón (PB)
Khối lượng
phân bón (g)
ĐC 10 Không có phân bón 0
BAT 10
Phân bón ủ từ bã rơm với sinh khối
3 chủng vi sinh vật
500
SG 10
Phân bón vi sinh hữu cơ Sông
Gianh
500

SVTH: Nguyễn Hạnh Minh Uyên Lớp 10SHLT GVHD: Đặng Đức Long
BAT 2SG 1ĐC 1
ĐC 2BAT 1SG 2
Hình 2.2. Sơ đồ bố trí thí nghiệm
Hình 2.3. Bố trí thí nghiệm trên thực địa