NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG CHUNG CỦA ENZYME PROTEASE

A. ENZYME PROTEASE:
I. TỔNG QUAN VỀ ENZYME PROTEASE
II. NGUỒN THU NHẬN ENZYME PROTEASE
III. CÁC YẾU TỐ ẢNH HƯỞNG ĐẾN HOẠT ĐỘ
ENZYME
IV. ỨNG DỤNG CHUNG CỦA ENZYME
PROTEASE
B. ỨNG DỤNG CỤ THỂ (BROMELIN)
I.TỔNG QUAN VỀ ENZYME PROTEASE:
-
Nhóm enzyme protease xúc tác quá trình thủy phân liên kết
peptide (-CO-NH)
n
trong phân tử protein, polypeptide đến sản
phẩm thủy phân cuối cùng là các acid amin. Ngoài ra, nhiều
protease cũng có khả năng thủy phân liên kết este và vận
chuyển amine
MÔ HÌNH ENZYME PROTEASE THỦY PHÂN
PHÂN TỬ PROTEIN
Phân loại protease
Căn cứ vào các tiêu chí:
•
Dựa vào cơ chế phản ứng của enzyme tham gia.
•
Dựa vào pH tối thích cho hoạt động của enzyme
như: protease acid, protease kiềm, protease trung
tính.
•
Tính đặc hiệu cơ chất của enzyme : endopeptidase
và exopeptidase…

•
Nguồn thu nhận enzyme:enzyme từ động
vật,enzyme từ thực vật,enzyme từ vi sinh vật.
Phân loại protease:
Peptidase (Protease)
(E.C.3.4)
Exopeptidase
(E.C. 3.4.11-17)
Endopeptidase
(E.C. 3.4.21-99)
Aminopeptidase
Carboxypeptidase
Serine proteinase
Cystein proteinase
Aspartic proteinase
Metallo proteinase

Dựa vào vị trí tác động trên mạch polypeptide, exopeptidase được
phân chia thành 2 loại:
•
Aminopeptidase: xúc tác thủy phân liên kết peptide ở đầu N tự do
của chuỗi polypeptide để giải phóng ra một amino acid, các
polypeptide.
•
Carboxypeptidase: xúc tác thủy phân liên kết peptide ở đầu C của
chuỗi polypeptide giải phóng ra một amino acid hoặc các
polypeptide.

Dựa vào động học của cơ chế xúc tác, endopeptidase được
chia thành 4 nhóm:

•
Serin proteinase: là những proteinase chứa nhóm –OH của
gốc Serine trong trung tâm hoạt động (TTHĐ) và có vai trò
đặc biệt quan trọng đối với hoạt động xúc tác của enzyme.
Gồm 2 nhóm nhỏ là chymotrypsin và subtilicin .
•
Cystein proteinase: các proteinase chứa nhóm –SH trong
TTHĐ bao gồm: protease thực vật (papain, bromelin,ficin),
một vài protease động vật. Các enzyme này thường hoạt động
ở vùng pH trung tính.
•
Aspartic protease: là 1 loại protease có chứa carboxyl trong
TTHĐ, thường hoạt động ở pH acid.
•
Metallo protease: là nhóm proteinase được tìm thấy ở vi
khuẩn, các vi sinh vật bậc cao, hoạt động vùng pH trung tính
và hoạt độ giảm mạnh dưới tác dụng của EDTA
Ngoài ra, protease được phân loại một cách đơn giản thành 3
nhóm:
-
Protease acid: pH 2-4
-
Protease trung tính: pH 7-8
-
Protease kiềm: pH 9-11
II.NGUỒN THU NHẬN ENZYME PROTEASE:
- Nguồn động vật Tụy tạng (nguồn lâu đời): Tripsin

Dạ dày bê: Renin biến đổi casein
thành paracasein có khả năng kết tủa trong môi trường sữa có

đủ nồng độ Ca
2+

-Nguồn thực vật:
+ Bromelain: thu từ quả, chồi dứa,
vỏ dứa (Pineapple plant)
+Papain: thu từ nhựa của lá, thân,
quả đu đủ ( Carica papaya)
+Ficin: thu từ nhựa thân cây cọ
( Ficus carica )

-Nguồn vi sinh vật :
+vi khuẩn: lượng protease được sản xuất 59% lượng enzyme sử
dụng Bacillus subtilis, B.mesentericus, B.thermorpoteoliticus
và một số giống thuộc chi Clostridium…
+nấm: Aspergillus oryzase, A.terricola, A.fumigatus, A.saitoi…
+xạ khuẩn: Streptomyces grieus, S.fradiae, S. Trerimosus…

III.CÁC YẾU TỐ ẢNH HƯỞNG ĐẾN HOẠT ĐỘ ENZYME:
-
Ảnh hưởng của nồng độ enzyme
-
Ảnh hưởng của nồng độ cơ chất
-
Ảnh hưởng của các chất kìm hãm
-
Ảnh hưởng của các chất hoạt hóa
-
Ảnh hưởng của nhiệt độ
-

Ảnh hưởng của nồng độ muối
Ngoài các yếu tố trên hoạt độ enzyme còn phụ
thuộc vào nhiều yếu tố khác như: ánh sáng (đặc biệt là
tia tử ngoại), sóng siêu âm, tia bức xạ
IV.ỨNG DỤNG CHUNG CỦA PROTEASE:
Trong công nghiệp thực phẩm:
Trong công nghiệp chế biến thịt: protease thủy phân một phần
protein trong thịt, làm cho thịt có một độ mềm thích hợp và
tăng hương vị cho thịt.
- Các enzyme thường dùng
+ Protease thực vật: papain, bromelain, ficin
+ Protease vi sinh vật: từ nấm mốc, xạ khuẩn
Sản xuất dịch đạm: từ Streptomyces fradiae tách được chế
phẩm keratineza thủy phân được keratin rất có giá trị để sản
xuất dịch đạm từ da, lông vũ
Trong công nghiệp sữa: protease được dùng để sản xuất pho
mat nhờ hoạt tính làm đông tụ sữa của chúng.
-
VD: renine, pepsine, một số protease vi sinh vật: A.candidus,
P.roquerti, P.mesentericus…
Trong công nghiệp sản xuất bánh: chỉ dùng prorease ở giai
đoạn cực ngắn để amino acid và peptide tự do phản ứng với
một số thành phần của bột để làm giảm thời gian đảo trộn,
tăng độ dẻo và làm nhuyễn bột, tạo độ xốp và nở tốt hơn.
Trong công nghiệp sản xuất bia: dùng protease để thủy phân
có giới hạn protein của bia để tạo thành các peptid có trọng
lượng phân tử trung bình để tạo bọt cho bia và sau khi thanh
trùng không tạo kết tủa.
- VD: Protease của A.oryzae dùng thủy phân protein trong hạt
ngủ cốc tạo điều kiện xử lý bia tốt hơn

Trong công nghiệp da: protease được sử dụng để làm
mềm da nhờ sự thuỷ phân sơ bộ lông, tách các mô liên kết
phía ngoài ra, chỉ còn lớp collagen tạo lớp mỏng và mềm
da.
-
VD:
+ Protease được tách từ vi khuẩn: P.mesentevicus,
P.suptilis.
+ Từ nấm mốc: A.oryzae, A.flavus
+ Từ xạ khuẩn: S.fradiae, S.griseus, S.rimosus…
Trong công nghiệp dệt: đây là protease được sử dụng để
xử lý bên ngoài các sợi tơ, làm nhiệm vụ kết dính các sợi
tơ. Protease có tác dụng thủy phân lớp protein serisin đã
làm dính bết các sợi tơ tự nhiên, làm bong và tách rời các
loại tơ tằm do đó làm giảm lượng hóa chất để tẩy trắng
Trong chế biến thủy sản: tăng lượng nước mắm nhờ
thủy phân protein thành các acid amin làm tăng hiệu
suất thu hồi đạm của nước mắm.
Một số ứng dụng khác:
-
Điều chế dịch đạm thủy phân làm chất dinh dưỡng,
chất tăng vị trong thực phẩm và sản xuất một số thức
ăn kiêng.
-
Protease của nấm mốc và vi khuẩn phối hợp với
amilase tạo thành hỗn hợp enzyme dùng làm sức ăn
gia súc, có ý nghĩa lớn trong chăn nuôi gia súc và gia
cầm.
-
Sản xuất keo động vật, chất giặt tổng hợp để giặt tẩy

các chất bẩn protein, sản xuất mỹ phẩm
-
Sử dụng nhiều enzyme protease để sản xuất thuốc hổ
trợ tiêu hóa, nấu cao động vật, chữa bệnh nghẽn mạch
máu, tiêu viêm vết thương.
I. Tổng quan về enzyme bromelain
1. Đặc điểm của enzyme bromelain:
•
Bromelain là tên gọi chung cho nhóm enzyme thực
vật có chứa nhóm –SH, có khả năng phân giải protein
được thu nhận từ họ Bromeliaceae , đặc biệt là ở cây
dứa (thân, chồi, trái, vỏ).
•
Bromelain chiếm 50% protein trong quả dứa.
•
Có khả năng thủy phân mạnh và hoạt động tốt ở
pH = 6-8
•
Trọng lượng phân tử khoảng 33000 Da
•
Trong dịch chiết có chứa một ít peroxydase,
photphatase acid và chất cản protease
2. Cấu tạo hóa học:
•
Bromelain là một glycoprotein, mỗi phân tử có
glycan gồm 3 manose, 2 glucosamine, 1 xylose và 1
fructose.
•
Sợi hydrate carbon này liên kết hoán vị với sợi
polypeptide

•
Bromelain có thành phần amino acid thay đổi trong
khoảng 321-144 amino acid (thân), 283-161 amino
acid (quả).
•
Bromelain thân là một sợi polypeptide có amino acid
ở đầu amin là valine và ở đầu carbonhydrate là
glycine.
•
Bromelain quả có amino acid ở đầu amin la alanine
3. Cấu trúc không gian:
•
Cấu trúc bậc 1:
Ser-Val-Lys-Asn-Gln-Asn-Pro-Cys-Gly-Ala-Cys-Tryp-
-Gly-Cys-Lys-
•
Trong trung tâm hoạt động có chứa cysteine và 2 sợi
polypeptide liên kết với nhau bằng cầu nối -S-S
•
Phân tử dạng hình cầu.
•
Trong phân tử có chứa nhóm sulfhydryl , 5 cầu nối
–S-S- và các ion Zn
2+
có vai trò trong duy trì cấu trúc
không gian của enzyme.
4. Tính chất vật lý:*: Tính bằng phương pháp sa lắng khuếch tán
**:Tính từ hằng số sa lắng và độ nhớt bên trong
***:Tính bằng phương pháp Archibald
Hằng số sa lắng

S 2,73S
Hằng số khuếch tán D 7.77x10
-7
cm
2
/s
Thể tích riêng phần V 0,743ml/g
Độ nhớt bên trong [I] 0,038dl/g
Chỉ số ma sát f/fo 1,26
Điểm đẳng điện pI 9,55
Sự hấp thu A
1%
cm ở 280nm 20,1
Trọng lượng phân tử 33.200*
32.100**
35.500***
II. Phương pháp thu nhận bromelin:
Chồi, thân, lá
dứa
Xay nhuyễn
Quy trình công nghệ
Lọc
bã
Hấp phụ
Ly tâm 2
Sấy
bromelin
Dịch
Siêu lọc
Kết tủa

Ly tâm 1
bã
1.Thu nhận Bromelin từ dứa:
b. Thu dịch enzyme
thô:
•
Quả dứa (chồi ) được
xay nhuyễn, vắt kỹ, lọc
bỏ bã, thu dịch lọc ly
tâm dịch lọc với tốc độ
6000 vòng/phút trong
10 phút để loại bỏ chất
xơ, thu được dịch chiết
có chứa bromelain.
c. Tách enzyme:
•
Các phương pháp:
- Phương pháp kết tủa:
Tủa bằng acetone: thêm 1 thể tích acetone lạnh hoặc
20% acetone lạnh vào một thể tích dd nước dứa sau
ly tâm, trong 1 giờ ở to 0-4
o
C. Ly tâm hỗn hợp 6000
vòng /phút, trong 5 phút, loại bỏ tủa. Thêm 2 thể tích
acetone lạnh, để 1h ở 0-4
o
C, ly tâm thu tủa và rửa tủa
bằng acetone lạnh.