ứng dụng phương pháp phân tích dna góp phần vào việc phân loại một số loài gỗ quý thuộc chi dalbergia của việt nam

Số hóa bởi Trung tâm Học Liệu – Đại học Thái Nguyên

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
VIỆN KHOA HỌC
VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT


DƢƠNG VĂN TĂNG


ỨNG DỤNG PHƢƠNG PHÁP PHÂN TÍCH DNA GÓP
PHẦN VÀO VIỆC PHÂN LOẠI MỘT SỐ LOÀI GỖ QUÝ
THUỘC CHI DALBERGIA CỦA VIỆT NAM




LUẬN VĂN THẠC SỸ SINH HỌC










Hà Nội – 2010

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
VIỆN KHOA HỌC
VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT


LUẬN VĂN THẠC SỸ SINH HỌC


Đề tài :
ỨNG DỤNG PHƢƠNG PHÁP PHÂN TÍCH DNA GÓP PHẦN
VÀO VIỆC PHÂN LOẠI MỘT SỐ LOÀI GỖ QUÝ THUỘC
CHI DALBERGIA CỦA VIỆT NAM






Học viên: Dƣơng Văn Tăng
Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm
Mã số: 60 42 30
Ngƣời hƣớng dẫn: PGS. TS. Đinh Thị Phòng
Bảo tàng Thiên nhiên Việt Nam

Việ

Lời cảm ơn
Trƣớc tiên tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến PGS.TS. Đinh Thị Phòng,
Phòng Phân loại thực nghiệm và Đa dạng nguồn gen, Bảo tàng Thiên nhiên Việt Nam
đã tận tình, hƣớng dẫn và tạo mọi điều kiện thuận lợi giúp đỡ tôi trong suốt quá trình
hoàn thành khóa luận này.
Tôi xin bày tỏ lòng cảm ơn chân thành đến Ban Giám đốc Bảo tàng Thiên nhiên
Việt Nam đã giúp đỡ và tạo điều kiện cho tôi trong cả quá trình học tập, thực hiện
nghiên cứu và hoàn thiện luận văn.
Tôi xin chân thành cảm ơn các thầy cô giáo, các cán bộ của cơ sở đào tạo sau
Đại học Viện Sinh thái và Tài nguyên Sinh vật đã tận tâm truyền đạt kiến thức cho tôi
trong suốt khóa học.
Nhân dịp này, tôi xin cảm ơn những chia sẻ, hỗ trợ nhiệt tình và các ý kiến đóng
góp của TS. Nguyễn Minh Tâm, Ths. Trần Thị Việt Thanh và CN. Vũ Thị Thu Hiền
cùng toàn thể cán bộ phòng Phân loại thực nghiệm và Đa dạng nguồn gen, Bảo tàng
Thiên nhiên Việt Nam.
Để hoàn thành bản luận văn này, tôi chân thành cảm ơn Ths. Nguyễn Quốc
Bình, Bảo tàng Thiên nhiên Việt Nam đã cung cấp mẫu cho nghiên cứu và sự hỗ trợ kỹ
thuật của Phòng thí nghiệm trọng điểm Công nghệ gen, Viện Công nghệ sinh học trong
việc xác định trình tự DNA.
Cuối cùng tôi xin chân thành cảm ơn gia đình, bạn bè và các đồng nghiệp đã
luôn động viên, khích lệ và là chỗ dựa vững chắc cho tôi hoàn thành khóa luận này.
Hà Nội, ngày 29 tháng 12 năm 2010
Học viên
Dƣơng Văn Tăng

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan số liệu và kết quả nghiên cứu trong luận văn này là trung thực
và chƣa đƣợc sử dụng công bố trong bất kỳ tài liệu nào.
Tôi xin cam đoan mọi sự giúp đỡ cho việc thực hiện luận văn này đã đƣợc cảm
ơn và các thông tin trích dẫn trong luận văn đều đã đƣợc chỉ rõ nguồn gốc.
Hà Nội, ngày 29 tháng 12 năm 2010
Học viên



Dƣơng Văn Tăng


MỤC LỤC
Lời cảm ơn
Lời cam đoan
Mục lục
Danh mục các chữ viết tắt
Danh mục các bảng
Danh mục các hình
MỞ ĐẦU 1
Chƣơng I. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3
1.1. Giới thiệu tổng quát về một số loài gỗ quý hiếm thuộc chi trắc (Dalbergia) 3
1.1.1. Vị trí phân loại 3
1.1.2. Một số đặc điểm sinh học chính và giá trị bảo tồn một số loài gỗ quý 4
1.1.2.1. Dalbergia assamica Benth 5
1.1.2.2. Dalbergia cochinchinensis Pierre 6
1.1.2.3. Dalbergia oliveri Gamble ex Prain 7
1.1.2.4. Dalbergia tonkinensis Prain 7
1.1.2.5. Dalbergia nigrescens Kurz 8
1.2. Giới thiệu một số phƣơng pháp phân loại thực vật 9

1.2.1. Phƣơng pháp hình thái học (phân loại học truyền thống) 9
1.2.2. Phƣơng pháp giải phẫu so sánh 10
1.2.3. Phƣơng pháp hoá học 10
1.2.4. Phƣơng pháp phân loại học phân tử 11
1.3. Hệ gen sử dụng trong nghiên cứu phân loại phân tử ở thực vật 13
1.3.1. Cấu trúc hệ gene lục lạp 13
1.3.2. Vùng ITS nhân 15
1.4. Một số thành tựu nghiên cứu về phân loại học phân tử 16
Chƣơng II. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 20
2.1. Vật liệu nghiên cứu 20
2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu 23
2.2.1. Phƣơng pháp tách chiết DNA và làm sạch DNA tổng số 23
2.2.2. Thiết kế cặp mồi 23
2.2.3. Nhân bản trình tự đích bằng kỹ thuật PCR 23
2.2.4. Thôi gel và tinh sạch sản phẩm PCR 24
2.2.5. Giải trình tự DNA 24
2.2.6. Phân tích số liệu 24
Chƣơng III. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 25
3.1. Kết quả tách chiết DNA 25
3.2. Kết quả nhân bản trình tự DNA đích ở 01 vùng gen nhân và 03 vùng gen lục lạp 26
3.2.1. Kết quả nhân bản trình tự DNA với cặp mồi ITS1/ITS4 26
3.2.2. Kết quả nhân bản trình tự DNA với cặp mồi psbA - trnH 27
3.2.3. Kết quả nhân bản trình tự DNA với cặp mồi matK - matK 28
3.2.4. Kết quả nhân bản trình tự DNA với cặp mồi trnL - trnL 29
3.3. Kết quả giải mã trình tự 4 gen nghiên cứu 30
3.3.1. Kết quả xác định trình tự gen ITS nhân 30
3.3.2. Kết quả giải trình tự vùng psbA - trnH 33
3.3.3. Kết quả giải mã trình tự gen matK 35
3.3.4. Kết quả giải mã trình tự gen trnL 38
3.4. Kết quả thống kê đặc điểm DNA của bộ số liệu trình tự giữa 5 loài 40

3.4.1. Các vị trí nucleotide mang thông tin tiến hoá (parsimony) 40
3.4.2. So sánh sự biến đổi nucleotide giữa 4 vùng gen nghiên cứu của 5 loài gỗ quý
thuộc chi Dalbergia 43
3.4.3. Khoảng cách di truyền giữa 5 loài nghiên cứu 44
3.4.4. Cây phát sinh chủng loại 48
3.5. Xác định nguồn gốc loài 50
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 57
Kết luận 57
Kiến nghị 58
PHỤ LỤC 67














DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT
AFLP Đa hình chiều dài các đoạn nhân chọn lọc (Amplified Fragment Length
Polymorphism)
Barcode Mã vạch
bp Cặp bazơ (base pair)
BTTNVN Bảo tàng Thiên nhiên Việt Nam

CITES Công ƣớc về buôn bán quốc tế các loài động, thực vật hoang dã nguy cấp
(Convention on International Trade in Endangered Species)
cpDNA Axít Deoxyribonucleotide lục lạp (Choloroplast Deoxyribo Nucleotide Acid)
cpSSR Các trình tự lặp lại đơn giản của lục lạp (Chloroplast Simple Sequence
Repeat)
DNA Axít Deoxyribonucleotide
EDTA Ethylenediaminetetraacetic acid
EN Nguy cấp (Endangered)
Genbank Ngân hàng gen quốc tế
ISSR Các trình tự lặp lại bên trong (Inter-Simple Sequence Repeat)
ITS Internal Transcribed Spacer
IUCN Hiệp hội bảo vệ thiên nhiên quốc tế (International Union for
Conservation of Nature)
MEGA Phần mềm phân tích di truyền tiến hoá phân tử (Molecular Evolutionary
Genetics Analysis)
NCBI Trung tâm thông tin công nghệ sinh học quốc gia (Nationa Center for
Biotechnology Information)
NJ Neighbor Joining
NTS Khoảng trống không đƣợc sao chép (Non Transcribed Spacer)
OD Mật độ quan học (Optical Density)
PCR Phản ứng chuỗi polymerase (Polymerase Chain Reaction)
psbA Gen mã hóa protein D1, enzyme tham gia quang hóa II
RAPD Đa hình các đoạn nhân bản ngẫu nhiên (Randomly Amplified
Polymorphic DNA)
RNA Axít Ribonucleotide
RFLP Đa hình chiều dài các đoạn cắt giới hạn (Restriction Fragment Length
Polymorphism)
SSR Các đoạn lặp lại (Simple Sequence Repeat)
tRNA RNA vận chuyển (transfer- RNA)
trnF RNA vận chuyển Phenylalanine

trnH RNA vận chuyển Histidine
trnL RNA vận chuyển Leucine
trnT RNA vận chuyển Threonine
UV Ánh sáng tử ngoại (Ultraviolet)
VQG Vƣờn quốc gia







DANH MỤC CÁC BẢNG


Bảng 2.1. Danh sách và một số thông tin về mẫu vật nghiên cứu
20
Bảng 2.2. Các cặp mồi sử dụng trong nghiên cứu
21
Bảng 2.3. Mã số của 50 trình tự nulcleotide gen trnL thuộc 36 loài trong Genbank sử
dụng lập cây phân loại
22
Bảng 3.1. Một số thông số thống kê biến đổi nucleotide khi so sánh giữa 5 loài
nghiên cứu
42
Bảng 3.2. Khoảng cách di truyền giữa 25 mẫu nghiên cứu của 5 loài gỗ quý
47

DANH MỤC CÁC HÌNH


Hnh 1.1. Hệ gen lụ c lạ p của hoa Nhài Jasminum nudiflorum (Lee et al, 2007)
13
Hình 1.2. Sơ đồ vùng gen ITS
15
Hình 3.1. Kết quả kiểm tra DNA tổng số từ một số mẫu lá nghiên cứu trên gel agarose
0,9%
25
Hình 3.2. Kết quả điện di sản phẩm PCR nhân bản đƣợc của một số mẫu đại
diện với cặp mồi ITS1 - ITS4 trên gel agarose 0,9%
27
Hình 3.3. Kết quả điện di sản phẩm PCR nhân bản đƣợc của một số mẫu đại diện với
cặp mồi psbA - trnH trên gel agarose 0,9%

28
Hình 3.4. Kết quả điện di sản phẩm PCR nhân bản đƣợc của một số mẫu đại diện
với cặp mồi matK - matK trên gel agarose 0,9%
29
Hình 3.5. Kết quả điện di sản phẩm PCR nhân bản đƣợc của một số mẫu đại diện với
cặp mồi trnL - trnL trên gel agarose 0,9%
29
Hình 3.6. Kết quả so sánh trình tự nucleotide vùng ITS giải mã từ 25 mẫu nghiên
cứu
33
Hình 3.7. Kết quả so sánh trình nucleotide vùng đệm psbA - trnH giải mã từ 25
mẫu nghiên cứu
35
Hình 3.8. Kết quả so sánh trình nucleotide gen matK giải mã từ 25 mẫu nghiên
cứu
37
Hình 3.9. Kết quả so sánh trình nucleotide gen trnL giải mã từ 25 mẫu nghiên
cứu
39
Hình 3.10. Mô hình 6 loại đột biến nucleotide
45
Hình 3.11. Cây phát sinh chủng loại của 5 loài Dalbergia nghiên cứu với 4 gen
ITS, trnL, matK và psbA – trnH
50
Hình 3.12. Cây phát sinh chủng loại đƣợc xây dựng theo phƣơng pháp Neighbor
– Joining của 5 loài nghiên cứu với 35 loài thực vật khác dựa trên phân tích trình
tự gen trnL
52
Hình 3.13. Cây hình toả tròn của 5 loài nghiên cứu với 35 loài thực vật khác dựa
trên phân tích trình tự gen trnL

54
Dương Văn Tăng

1
MỞ ĐẦU
Chi trắc (Dalbergia) gồm nhiều loài cây thân gỗ có kích thƣớc từ nhỏ đến
trung bình, thuộc họ đậu (Febaceae). Đây là chi điển hình của rừng nhiệt đới với
khoảng 300 loài. Ở Việt Nam có khoảng 27 loài, phân bố rộng khắp ở các vùng rừng
kín từ Bắc vào Nam [13]. Hiện nay, nhiều loài cây gỗ quý thuộc chi Dalbergia đang
bị khai thác cạn kiệt do có giá trị kinh tế và thƣơng mại cao nhƣ Cẩm lai (Dalbergia
oliveri Gamble ex Prain), Trắc đỏ (Dalbergia cochinchinensis Pierre), Trắc đen
(Dalbergia nignescens Kurz), cây Sƣa (Dalbergia tonkinensis Prain), Cọ khẹt
(Dalbergia assamica Benth) và Trắc dao (Dalbergia cultrata Grah. ex Benth). Trong
đó, ba loài Cẩm lai, Trắc đỏ và Sƣa đã đƣợc ghi vào “Danh Lục Đỏ Việt Nam, 2007”
[1] và cũng đã đƣợc Chính phủ Việt Nam quy định trong Nghị định 32/2006/NĐ-CP
về quản lý thực vật rừng, động vật rừng nguy cấp, quý, hiếm (Nghị định số
32/2006/NĐ-CP ngày 30/6/2006).
Mặc dù việc phân loại những loài thuộc chi Trắc ở Việt Nam đã đƣợc thực hiện
từ những năm 1875 (Niyomdham et al, 1987), [50] nhƣng đến nay vẫn chƣa có công
trình nghiên cứu phân loại nào đƣợc thực hiện có hệ thống chi tiết cho tới loài. Hiện
nay, phƣơng pháp phân loại vẫn chủ yếu dựa trên đặc điểm hình thái trƣớc hết là cơ
quan sinh sản nên thƣờng gặp khó khăn trong nhiều trƣờng hợp do quá trình biến đổi
trung gian về một số đặc điểm. Hơn nữa, trong thực tế, sự biến đổi hình thái theo môi
trƣờng sống của một loài đã tạo ra không ít khó khăn cho việc nhận dạng bằng phƣơng
pháp hình thái, thậm chí trong một số trƣờng hợp còn có sự nhầm lẫn và sai lệch về vị
trí phân loại. Công nghệ sinh học hiện đại hoàn toàn có thể khắc phục đƣợc nhƣợc
điểm này mà không lệ thuộc vào bất cứ yếu tố khách quan nào của mẫu.
Phƣơng pháp phân loại học phân tử (Molecular taxonomy) sử dụng các dữ liệu
về cấu trúc phân tử DNA, ARN, protein để xây dựng mối quan hệ tiến hoá giữa các
loài sinh vật, giải thích tính đa dạng sinh học ở mức độ phân tử giữa các loài và trong

Luận văn Thạc sỹ sinh học
2
phạm vi loài. Mặc dù mới ra đời nhƣng phƣơng pháp phân loại học phân tử đã nhanh
chóng trở thành một phƣơng pháp nghiên cứu có hiệu quả trong việc nhận dạng taxon
mức độ loài. Tuy chƣa thể trở thành phƣơng pháp phân loại chính thống, xong phân
loại học phân tử đang là công cụ đắc lực hỗ trợ cho nghiên cứu phân loại hình thái và
là phƣơng pháp phù hợp cho nghiên cứu phân loại học hiện nay (Weiguo et al., 2005;
Eric et al., 1992; Jose et al., 2007) [71, 36]. Đối với thực vật hai nhóm gen chính
thƣờng đƣợc sử dụng là gen nhân (ITS) và hệ gen lục lạp (cpDNA). So với chỉ thị hình
thái thì chỉ thị DNA cho độ chính xác cao mà không lệ thuộc vào các yếu tố môi
trƣờng. Vì tính ƣu việt này, đến nay trong ngân hàng Genbank đã lƣu trữ hàng trăm
trình tự DNA khác nhau đặc trƣng cho chi Dalbergia, đây là nguồn dữ liệu có giá trị để
chúng ta có thể khai thác ứng dụng để nghiên cứu phân loại (Benedic et al., 2007;
Juschum et al., 2007) [25, 37].
Nhằm ứng dụng phƣơng pháp phân loại phân tử vào phân loại và nhận dạng
những loài gỗ quý thuộc chi Dalbergia, chúng tôi đã tiến hành nghiên cứu: “Ứng dụng
phương pháp phân tích DNA góp phần vào việc phân loại một số loài gỗ quý thuộc
chi Dalbergia của Việt Nam” với các mục tiêu và nội dung nghiên cứu sau:
- Sử dụng hai vùng gen nhân và vùng gen lục lạp góp phần vào việc phân loại 5
loài gỗ quý thuộc chi Dalbergia đang bị đe doạ tuyệt chủng của Việt Nam.
- Góp phần đánh giá nhanh và hữu hiệu tính đa dạng sinh học làm cơ sở cho
việc bảo tồn và phục hồi một số loài gỗ quý hiếm ở Việt Nam đồng thời giúp các nhà
quản lý và cộng đồng các nhà khoa học hiểu biết sâu hơn về quan hệ họ hàng ở mức độ
taxon và mức độ tiến hoá phân tử.
Dương Văn Tăng

3
Chƣơng I. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Giới thiệu tổng quát về một số loài gỗ quý hiếm thuộc chi trắc (Dalbergia)
1.1.1. Vị trí phân loại

Dalbergia là một chi lớn thuộc họ đậu (Fabaceae) nằm trong bộ Đậu (Fabales)
phân lớp Hoa hồng (Rosidae) thuộc lớp hai lá mầm (Dicotydoneae) ngành thực vật
hạt kín (Magnoliophyta). Tên họ trƣớc đây là Leguminosae. Đứng sau họ
Orchidaceae và Asteraceae, với khoảng 730 chi và hơn 19400 loài. Chi lớn nhất là
Astragalus với hơn 2000 loài, tiếp sau là Acacia với hơn 900 loài và Indigofera với
khoảng 700 loài. Các chi lớn khác bao gồm Crotalaria với 600 loài và Mimosa với
500 loài [53,54]. Các loài thuộc họ đậu phân bố khắp thế giới, một số loài là cây nông
nghiệp quan trọng, bao gồm đậu tƣơng (Glycine max), đậu Hà Lan (Pisum sativum), đậu
nhỏ (Cicer arietinum), lạc (Arachis hypogaea), cây carob (Ceratonia siliqua) và cam
thảo (Glycyrrhiza glabra)
Họ đậu đƣợc xếp vào bộ đậu Fabales theo hệ thống phân loại APG III (2009).
Họ đậu gồm 3 phân họ (theo hệ thống Cronquist và Dahlgren) :
+ Mimosoideae: gồm 80 chi và 3200 loài. Hầu hết phân bố ở vùng nhiệt đới
châu Á và châu Mỹ, nơi có nhiệt độ ấm áp.
+ Caesalpinioideae: gồm 170 chi và 2000 loài
+ Faboideae: gồm 470 chi và 14000 loài
Tuy nhiên, sự phân chia của Cronquist và Dahlgren không đƣợc các nhà nghiên
cứu DNA cuối thể kỷ XX và đầu thế kỷ XXI ủng hộ. Kết quả nghiên cứu sinh học phân
tử cho thấy phân họ Caesalpinoideae là một paraphyly, nghĩa là các loài trong phân họ
này không có cùng nguồn gốc tiến hoá. Ngƣợc lại 2 phân họ Faboideae và
Mimosoideae là những monophyly lớn, nghĩa là các loài trong phân họ có cùng nguồn
gốc tiến hoá. Tông Cercideae của phân họ Caesalpinioideae có thể là một nhóm chị em
với nhóm các loài còn lại của phân họ này. Hơn nữa, một số chi đƣợc xếp vào phân họ
Luận văn Thạc sỹ sinh học
4
Caesalpinioideae không đƣợc chấp nhận. Các bằng chứng hoá thạch và phát sinh loài
cho thấy họ đậu đƣợc hình thành ở những vùng khô hạn hoặc nửa khô hạn dọc theo con
đƣờng biển Tethys ở kỷ thứ ba (Tertiary) của quá trình hình thành địa chất.
Họ đậu gồm các cây từ thân gỗ lớn đến các cây bụi, có cụm hoa không rõ ràng,
đôi khi tiêu biến thành hoa đơn tính. Hoa có đài hoa (hypanthium) ngắn và noãn đơn

với cuống noãn ngắn sau khi thụ phấn sẽ tạo thành quả đƣợc gọi là quả đậu. Lá thƣờng
kép mọc so le, có thể chẵn hoặc lẻ, có hình xẻ lông chim, luôn luôn có lá kèm. Lá kèm
có dạng hình lá, hình gai hoặc khó nhìn thấy. Mép lá có thể liền hoặc xẻ răng cƣa.
Tuyến mật ngoài hoa thƣờng thấy ở những loài thuộc phân họ Mimosoideae và
Caesalpinioideae, nó cũng có ở một số loài thuộc phân họ đậu Faboideae [53, 55].
1.1.2. Một số đặc điểm sinh học chính và giá trị bảo tồn một số loài gỗ quý
Dalbergia là một chi lớn bao gồm những cây có kích thƣớc trung bình và nhỏ,
thân bụi hoặc dây leo, thuộc họ đậu Fabaceae, phân họ Faboideae. Chi này có phân bố
rộng ở các vùng nhiệt đới Trung, Nam Mỹ, Châu Phi, Madagascar và Châu Á. Số
lƣợng loài trong chi đến nay vẫn là dấu hỏi và chƣa có câu trả lời chính xác. Theo
thống kê của các nhà khoa học trên thế giới, hiện nay ƣớc tính có từ 100 – 600 loài
(International Legume Database & Information Service) Nhiều loài trong chi Dalbergia
là những cây gỗ quý, có hoa vân đẹp, có giá trị kinh tế và giá trị bảo tồn cao. Một số
loài có giá trị trong chi Dalbergia nhƣ hai loài hồng sắc (rosewood), một loài có ở tây
bán cầu (Hồng Sắc Brazilian - D. nigra) đƣợc đƣa vào phụ lục I của CITES (Công ƣớc
về buôn bán quốc tế các loài động, thực vật hoang dã nguy cấp). Loài thứ hai là hồng
sắc Ấn Độ - D. latifolia, loài này có giá trị kinh tế cao vì gỗ cứng và có vân rất đẹp.
Ngoài ra trong chi Dalbergia còn có nhiều loài có giá trị bảo tồn nhƣ: Dalbergia
baronii, Dalbergia brownei, Dalbergia cearensis, Dalbergia cochinchinensis,
Dalbergia decipularis, Dalbergia ecastaphyllum, Dalbergia frutescens, Dalbergia
louvelii, Dalbergia madagascariensis, Dalbergia melanoxylon, Dalbergia nigra,
Dương Văn Tăng

5
Dalbergia oliveri, Dalbergia sissoo, Dalbergia stevensonii, Dalbergia tonkinensis,
Dalbergia tucarensis, Dalbergia variabilis
Ở Việt Nam, chi Dalbergia có khoảng 27 loài, trong đó nhiều loài còn chƣa rõ
ràng (chƣa định tên chính xác hoặc còn nghi ngờ). Ba loài Cẩm Lai (Dalbergia
oliverri), Trắc đỏ (Dalbergia cochinchinensis) và Sƣa (Dalbergia tonkinensis) là loài
đặc hữu và có giá trị bảo tồn cao. Tuy nhiên, những năm gần đây, số lƣợng cá thể của

những loài này đã giảm sút nghiêm trọng do nhiều nguyên nhân khác nhau, nhƣng chủ
yếu là do lợi nhuận kinh tế nên 3 loài trên bị khai thác quá mức. Năm 2007, ba loài
Cẩm lai, Trắc đỏ, Sƣa đƣợc đƣa vào Sách Đỏ Việt Nam - cấp EN A1a, c,d (có nguy cơ
tuyệt chủng) (Đặng Ngọc Thanh et al., 2007) [1] và đƣợc Chính phủ Việt Nam quy
định trong Nghị định 32/2006/NĐ-CP về quản lý thực vật rừng, động vật rừng nguy
cấp, quý, hiếm. Ngoài ra hai loài Trắc đen (Dalbergia nigresens) và Cọ khẹt
(Dalbergia assamica) là những loài gỗ quý có giá trị kinh tế và đang có nguy cơ bị thu
hẹp do vậy hai loài này cũng cần đƣợc quan tâm bảo vệ và khai thác một cách hợp lý.
1.1.2.1. Dalbergia assamica Benth
Dalbergia assamica Benth đƣợc Bennth đặt tên vào năm 1852, có tên gọi khác
là D. lanceolaria (Thoth, 1983), D. balansae (Prain, 1901). Ở Việt Nam thƣờng gọi là
Cọ khẹt, Cọ khiết, Bạt ong, Trắc balansa, Sƣa hạt tròn, Muồng nƣớc, Trắc assam.
Cọ khẹt là cây gỗ trung bình, cao từ 12 – 20m. Lá có sóng dài 20 – 25cm; lá phụ
13 – 21, tròn dài 4- 5 x 2-3 cm, đầu tròn hay hơi lõm, gân - phụ rất mảnh, mặt dƣới có
lông nằm cuống - phụ 4 – 5 mm. Chùm tụ tán ngắn ở nách lá, cao 10 – 15cm, trục và
nhánh có lông mịn; vành trắng; tiểu nhuỵ 5. Nhánh mang trái đen kích thƣớc 5- 7 x
1,2cm, không lông; hột 1 (có thể có 3 – 4 hột), tròn, rộng 12mm.
Cọ khẹt là cây ƣa sáng, phát triển nhanh, mọc trong rừng hỗn giao thứ sinh
thƣờng xanh hoặc rụng lá, ở độ cao 1500m, trên đất sung tích ven sông suối. Ra hoa
vào thời gian từ tháng 5 đến tháng 7, có quả tháng 9 -12 và tồn tại lâu trên cây.
Luận văn Thạc sỹ sinh học
6
Ở Việt Nam: Cọ khẹt phân bố ở Lai Châu (Pù Nhung), Lào Cai (Bắc Hà, Phố
Lu, Bảo Nhai), Sơn La (Thuận Châu, Sông mã, Mộc Châu), Quảng Ninh (Hà Cối),
Vĩnh Phúc, Hà Tây (Ba Vì), Hoà Bình (Chợ Bờ), Hà Nam (Đại Đồng), Ninh Bình (Cúc
Phƣơng), Thanh Hoá (Phong Y), Nghệ An (Quỳ Châu), Hà Tĩnh (Hƣơng Sơn), Quảng
Trị (đèo Ailao, Đông Chê), Lâm Đồng (Đơn Dƣơng), Đồng Nai.
Trên thế giới: Cọ khẹt chỉ còn ở Ấn Độ, My-an-ma, Trung Quốc, Lào, Căm-pu-
chia và Thái Lan [13, 14, 41, 6].
1.1.2.2. Dalbergia cochinchinensis Pierre

Do Pierre đặt tên vào năm 1898. Có tên gọi khác là Dalbergia cambodiana
(1898, Pierre), tên thƣờng gọi ở Việt Nam là Trắc đỏ, Trắc bông, Cẩm lai nam, Giầu
ca (Gia Rai), Ka rắc (Ba Na), Ka nhoung.
Trắc đỏ là cây gỗ trung bình, cao 15 – 30m đƣờng kính 80cm hoặc hơn. Gỗ đỏ
sậm, sau đen đi. Lá dài 15 – 20 cm; lá - phụ 7 – 9 mọc nhƣ đối, dài 3 – 5 cm, xoan, có
mũi ngắn, không lông, mốc mốc mặt dƣới. Chùm-tụ tán dài 7 -15cm; hoa trắng; đài
không lông; tiểu nhuỵ 9. Trái rất mỏng, hẹp, có kích thƣớc 5 – 6 x 1cm, hột 1 – 2, màu
nâu. Cây mọc trong rừng rậm nửa rụng lá hoặc rừng thƣa hỗn giao rụng lá, ở độ cao
dƣới 800m, ƣa đất sét pha cát có lớp đất sâu. Ra hoa tháng 5 – 8, có quả tháng 9 – 12.
Ở Việt Nam Trắc đỏ phân bố ở Quảng Nam, Kon Tum, Gia Lai, Đắc Lắc, Lâm
Đồng, Bình Dƣơng, Tây Ninh, Đồng Nai, Bà Rịa – Vũng Tàu, Thành phố Hồ Chí
Minh, Kiên Giang (VQG Phú Quốc).
Trên thế giới Trắc đỏ chỉ có ở Lào, Căm-pu-chia và Thái Lan.
Trắc đỏ là loài gỗ quý, thớ mịn, nặng, rất cứng, không bị mối mọt, dùng đóng đồ
mộc cao cấp (bàn ghế, salông, sập, giƣờng, tủ), làm nhạc cụ, đồ chạm trổ và hàng mỹ
nghệ. Trắc đỏ là cây gỗ quý nên bị khai thác cạn kiệt, số cá thể trƣởng thành giảm
Dương Văn Tăng

7
mạnh, hơn nữa nạn phá rừng đã làm cho loài này bị xâm hại nghiêm trọng. Sách Đỏ
Việt Nam 2007 đã xếp loài này vào loại nguy cấp EN A1a, c, d. [13, 1, 14, 41, 6]
1.1.2.3. Dalbergia oliveri Gamble ex Prain
Do Prain và Gamble đặt tên năm 1897, tên gọi khác là Dalbergia bariensis
(Pierre, 1898), Dalbergia dongnaiensis (Pierre, 1898). Tên thƣờng gọi là Cẩm lai,
Cẩm lai bà rịa, Cẩm lai đồng nai, Cẩm lai vú, Cẩm lai bông, Cẩm lai mật, Trắc lai.
Cẩm lai đƣợc ghi nhận trong Sách Đỏ Việt Nam, 2007 – cấp EN A1a, c, d (đang có
nguy cơ rất lớn bị tuyệt chủng ngoài thiên nhiên)
Cẩm lai là loài gỗ lớn, cao từ 25 – 30m, đƣờng kính 60 – 80cm, rụng lá mùa
khô, gỗ quý, màu đỏ, thớ mịn, nặng, cứng, không bị mối mọt dùng đóng đồ mộc cao
cấp. Cây ƣa sáng, mọc trong rừng rậm thƣờng xanh hoặc nửa rụng lá, rừng thƣa hỗn

giao rụng lá và rừng thƣa cây họ Dầu, ở độ cao tới 1000m, phát triển mạnh trên đất
feralit đỏ nâu và vàng nâu, đất đỏ bazan ẩm, ven suối. Ra hoa tháng 12 – 1 (năm sau),
có quả tháng 2 – 4.
Ở Việt Nam: Cẩm lai phân bố ở Quảng Trị, Đà Nẵng, Kon Tum, Gia Lai, Đắk
Lắk, Lâm Đồng, Phú Yên, Khánh Hoà, Ninh Thuận, Bình Thuận, Bình Dƣơng, Tây
Ninh, Đồng Nai, Bà Rịa – Vũng Tàu.
Trên thế giới: quần thể Cẩm lai chỉ còn ở My-an-ma, Lào, Căm-pu-chia, Thái Lan [1,
13, 41].
1.1.2.4. Dalbergia tonkinensis Prain
Đƣợc đặt tên bởi Prain, 1901. Tên gọi khác là Dalbergia rimosa (Phamh, 1991).
Tên thƣờng gọi là Sƣa, Sƣa trắng, Trắc bắc bộ, Trắc thối.
Cây Sƣa cao 15 – 25m, đƣờng kính 40 – 80 cm, gỗ thớ mịn, cứng, thơm, không
bị mối mọt, dùng trong xây dựng, đóng đồ mộc cao cấp, làm hàng mỹ nghệ và đồ tiện
Luận văn Thạc sỹ sinh học
8
khắc. Mọc rải rác trong rừng rậm thƣờng xanh nguyên sinh và thứ sinh, ở độ cao tới
350–500m, trên đất tốt, sâu, dày. Ra hoa tháng 3–5, có quả tháng 9–11.
Ở Việt Nam: cây Sƣa phân bố ở Lạng Sơn, Quảng Ninh, Bắc Giang, Phú Thọ,
Hà Tây, Hoà Bình, Ninh Bình, Nghệ An.
Trên thế giới: cây Sƣa chỉ có còn ở Trung Quốc.
Với quần thể ngày càng thu hep, cây Sƣa đang có nguy cơ tuyệt chủng cao
ngoài thiên nhiên. Cây Sƣa đƣợc ghi nhận trong Sách Đỏ Việt Nam, 2007 – cấp EN
A1a, c, d. Hiện nay cây Sƣa đang bị “tàn sát” ngoài thiên nhiên do giá trị kinh tế cao và
có những thông tin cho rằng ngƣời Trung Quốc dùng gỗ cây Sƣa để làm đồ thờ, chế
thuốc chữa ung thƣ dạ dầy và các chủ buôn săn lùng Sƣa với giá 200 triệu đồng/1kg.
Chính những nhu cầu “thất thiệt” đã đẩy cây Sƣa phải đối mặt với nguy cơ tuyệt chủng
rất cao [13, 1, 14, 41].
1.1.2.5. Dalbergia nigrescens Kurz
Do Kurz đặt tên năm 1875. Tên gọi khác là Dalbergia paniculata (Roxb, 1789)
Dalbergia lanceolaria (Thoth, 1987). Tên thƣờng gọi là Trắc đen, Quành quạch.

Trắc đen là cây gỗ trung bình, cao 10 – 20m, dùng trong xây dựng, đóng đồ
mộc cao cấp, vỏ dùng nhuộm đen. Trắc đen thƣờng mọc rải rác trong rừng thƣa và
rừng hỗn giao rụng lá, ở độ cao dƣới 500m. Ra hoa tháng 3–5, có quả tháng 8–12.
Ở Việt Nam: Trắc đen phân bố ở Đắk Lắc, Đồng Nai, Biên Hòa, Tây Ninh, Sơn La.
Trên thế giới: Trắc đen chỉ có ở My-an-ma, Lào và Thái Lan.
Gỗ của loài Trắc đen đƣợc dùng trong xây dựng hay đóng đồ mộc nhƣ giƣờng,
tủ, bàn, ghế. Với quần thể hẹp và có giá trị sử dụng, loài này đang bị săn lùng quá mức
(Nguyễn Tiến Bân, 2003) [13].
Dương Văn Tăng

9
1.2. Giới thiệu một số phƣơng pháp phân loại thực vật
Hiện nay, phƣơng pháp phân loại thực vật đều dựa trên nguyên tắc chung đó là
những thực vật có chung nguồn gốc thì có những tính chất giống nhau, thực vật càng
gần nhau tính chất giống nhau càng nhiều. Sự giống nhau có thể về đặc điểm hình thái,
giải phẫu, sinh lý sinh hoá , một số phƣơng pháp thƣờng đƣợc sử dụng nhƣ:
1.2.1. Phƣơng pháp hnh thái học (phân loại học truyền thống)
Dựa vào đặc điểm hình thái, đặc biệt là hình thái cơ quan sinh sản, vì cơ quan
này ít biến đổi hơn so với cơ quan sinh dƣỡng khi điều kiện môi trƣờng thay đổi.
Những thực vật càng gần nhau càng có nhiều đặc điểm chung về hình thái. Đây là
phƣơng pháp cổ điển nhƣng hiện nay vẫn đƣợc dùng phổ biến [10]. hạn chế của
phƣơng pháp này đã đƣợc ghi nhận trên một số taxa, thực tế nhiều loài khác nhau
nhƣng có hình thái rất giống nhau và ngƣợc lại. Phƣơng pháp phân loại hình thái thực
sự gặp khó khăn khi phân loại ở các đơn vị taxon dƣới loài [2].
Phân loại học truyền thống sử dụng chủ yếu các đặc điểm hình thái nhƣng các
tính trạng hình thái thƣờng biến đổi rất phức tạp, nên đôi khi việc xác định sự tƣơng
đồng là rất khó. Hiện tƣợng tiến hoá hội tụ, tiến hoá song song và tiến hoá ngƣợc dẫn
đến các đặc điểm tƣơng tự giữa các loài có họ hàng rất xa nhau, nghĩa là các đặc điểm
giống nhau do tiến hoá độc lập từ các nguồn gốc khác nhau để thích nghi với điều kiện
môi trƣờng giống nhau là khá phổ biến trong sinh giới. Việc phân biệt đặc điểm tƣơng

đồng với đặc điểm tƣơng tự trong hệ thống học truyền thống là không dễ dàng, nhất là
ở các bậc phân loại thấp. Ngoài ra, việc so sánh trực tiếp giữa các bậc phân loại cao là
rất khó, vì nhiều đặc điểm không còn khả năng xác định đƣợc sự tƣơng đồng. Vì vậy
hệ thống học truyền thống phải sử dụng các đặc điểm, các khoá định loại riêng cho
những nhóm sinh vật nhất định. Ƣu điểm lớn nhất của hệ thống học truyền thống là có
lịch sử phát triển lâu dài và đã xây dựng đƣợc một hệ thống phân loại sinh vật tƣơng
đối đầy đủ, tiện lợi trong nghiên cứu ứng dụng. Nhƣng hệ thống học truyền thống có
Luận văn Thạc sỹ sinh học
10
nhƣợc điểm là thiếu tính thống nhất, phải sử dụng nhiều tiêu chuần và nhiều khoá phân
loại khác nhau, nên bị hạn chế khi nghiên cứu các biến đổi tiến hoá nhỏ, khó xác định
chính xác mối quan hệ giữa các nhóm sinh vật ở bậc phân loại thấp nhƣ loài và dƣới loài
[2].
1.2.2. Phƣơng pháp giải phẫu so sánh
Đến thế kỷ IXX, nhờ sự phát triển của kính hiển vi mà giải phẫu học thực vật có
điều kiện phát triển. Ngoài những đặc điểm hình thái bên ngoài, các nhà phân loại học
còn sử dụng cả những đặc điểm hình thái giải phẫu hay vi hình
thái (micromorphologie), tức là hình thái cấu trúc bên trong cơ thể, của mô, của tế bào,
kể cả cấu trúc siêu hiển vi, để phân loại. Việc sử dụng phƣơng pháp này đã nhận đƣợc
các kết quả nghiên cứu chính xác và khách quan cho phân loại thực vật. Các đặc điểm
giải phẫu so sánh cho phép xác lập mối quan hệ gần gũi không những của các nhóm
lớn, mà cả của các bậc taxon nhỏ, có thể xây dựng đƣợc những tiêu chuẩn phân loại
cho các chi, các loài thuộc họ Labiaceae.
Phƣơng pháp giải phẫu so sánh không đòi hỏi kỹ thuật quá phức tạp nhƣng cho
kết quả khá chính xác. Đối với các loài cây gỗ thƣờng sử dụng đặc điểm giải phẫu thân
gỗ để định loại, ngƣợc lại các loài thân thảo thƣờng sử dụng đặc điểm cấu trúc của biểu
bì. Phƣơng pháp này đƣợc sử dụng để định loại gỗ và các thanh gỗ thành phẩm dùng
để xuất khẩu.
1.2.3. Phƣơng pháp hoá học
Có nhiều phƣơng pháp phân tích hoá học khác nhau đƣợc sử dụng trong nghiên

cứu và kiểm định nhất là đối với mẫu cây chứa các nhóm chất có hoạt tính sinh học,
các cây chứa tinh dầu (Trầm hƣơng, Xá xị, Pơ mu ) dùng phƣơng pháp sắc ký lớp
mỏng, sắc ký cao áp, điện di mao quản, sắc kí khí - khối phổ… đặc điểm chung của
phƣơng pháp hóa học là cho kết quả nhanh, chính xác và có thể cho các thông số về
cấu trúc hoá học. Ƣu điểm của phƣơng pháp này là yêu cầu về tính nguyên vẹn của
Dương Văn Tăng

11
mẫu vật không cao. Trên thế giới, phƣơng pháp này đang đƣợc sử dụng nhiều. Ở nƣớc
ta, phƣơng pháp này mới chỉ đƣợc bắt đầu nghiên cứu ở một vài cơ sở.
1.2.4. Phƣơng pháp phân loại học phân tử
Phân loại học phân tử là phƣơng pháp phân loại sử dụng sự khác biệt các cấu
trúc phân tử để đạt đƣợc các thông tin về mối quan hệ tiến hoá giữa các loài. Kết quả
của một phân tích hệ thống phân tử đƣợc thể hiện bằng cây phát sinh loài. Phƣơng
pháp phân loại phân tử ra đời vào những năm 1960 với các nghiên cứu của Emile và
công sự (1999), Zuckerkandl , Emanuel Margoliash , Linus Pauling và Walter M. Fitch
[66]. Những hệ thống học phân tử đƣợc thực hiện đầu tiên là của tác giả Charles G.
Sibley (nghiên cứu về chim), Herbert (nghiên cứu về lƣỡng cƣ), Morris Goodman
(nghiên cứu về linh trƣởng) [61, 28, 43, 44, 45], và đƣợc phát triển tiếp bởi các nhà
nghiên cứu Allan C. Wilson, Robert K. Selander, John C. Avise và đã thu đƣợc những
thành công lớn, làm sáng tỏ nhiều vấn đề trong phân loại và tiến hoá [15, 18, 20, 27].
Phân loại học phân tử đƣợc sử dụng ban đầu là phân tử protein, với kỹ thuật điện di
protein. Mặc dù khi thực hiện cách này đã không đem lại nhiều hiệu quả xong đã thúc
đẩy sự phát triển của phân loại học phân tử. Giai đoạn từ 1974 – 1986, phân loại học
phân tử chuyển sang sử dụng các đặc điểm của vật chất di truyền (DNA) với kỹ thuật
ứng dụng lai DNA – DNA, tiếp đến là các kỹ thuật phân tích bằng enzyme giới hạn và
cuối cùng là kỹ thuật đọc trình tự DNA [15, 19].
Nguyên lý của phân loại học phân tử: Phân loại học phân tử dựa trên nguyên
lý mỗi sinh vật sống đều mang các phân tử DNA, ARN và protein, các sinh vật có họ
hàng gần gũi sẽ có mức độ tƣơng đồng cao trong cấu trúc phân tử những chất này,

ngƣợc lại những sinh vật có họ hàng xa nhau sẽ cho thấy những đặc điểm cấu trúc khác
nhau. Hiện nay, các phân tử có tính bảo thủ nhƣ DNA ty thể, DNA lục lạp đang đƣợc
sử dụng nhiều nhất cho phân loại và đƣợc coi là tích luỹ các đột biến theo thời gian.
Thêm vào đó nếu coi tốc độ đột biến không đổi, chúng ta sẽ tạo ra đƣợc một đồng hồ
Luận văn Thạc sỹ sinh học
12
phân tử cho biết thời gian diễn ra các đột biến, nói cách khác chúng ta có thể ƣớc lƣợng
đƣợc thời gian hình thành loài. Mặc dù phân loại học phân tử là phƣơng pháp phân loại
sử dụng đặc điểm cấu trúc của các phân tử để xây dựng hệ thống phát sinh chủng loại,
tuy nhiên mãi cho đến những thập kỷ gần đây, con ngƣời mới có khả năng tách chiết và
xác định đƣợc cấu trúc phân tử của những chất này.
Sự ra đời của kỹ thuật giải trình tự DNA của Maxam – Gilbert (1977, 1980) và
Singer (1977) [19] đã mở ra một ứng dụng to lớn cho phân loại học phân tử. Hiện nay
phân tích hay đƣợc sử dụng trong phân loại học phân tử là so sánh trình tự DNA, sử
dụng kỹ thuật sắp xếp phân tử (alignment) để xác định mức độ giống nhau. Các biến
đổi phân tử đơn giản hơn nhiều so với các biến đổi hình thái, vì vật chất di truyền DNA
chỉ cấu thành từ 4 loại nucleotide (adenine, guanine, thymine và cytosine). Mặc khác,
các biến đổi phân tử ít bị ảnh hƣởng bởi các điều kiện môi trƣờng. Ƣu thế lớn nhất của
hệ thống học phân tử là có thể phân biệt rõ ràng các đặc điểm tƣơng đồng với đặc điểm
tƣơng tự (Avise, 1993; Page, 2000) [19, 51]. Ngoài ra, nhiều phần của vật chất di
truyền có nguồn gốc và kiểu biến đổi chung cho mọi sinh vật, nên có thể so sánh trực
tiếp bất kể nhóm sinh vật nào với nhau. Các biến đổi tiến hoá nhỏ (microevolution),
hay đa dạng di truyền giữa các quần thể sinh vật cũng thể hiện qua các biến đổi phân tử
rõ hơn so với các biến đổi hình thái.
Tính thống nhất cao là một trong những ƣu điểm của hệ thống học phân tử, sử
dụng tiêu chuẩn phân tử chung cho cả sinh giới, có lợi thế trong nghiên cứu biến đổi
tiến hoá nhỏ, nên số liệu phân tử có giá trị cao trong phân tích quan hệ phát sinh chủng
loại giữa các taxon ở bậc phân loại thấp, cũng nhƣ đa dạng di truyền quân thể. Nhƣợc
điểm chính của hệ thống học phân tử là không tiện dụng khi nghiên cứu và ứng dụng
trong tự nhiên và hiện chƣa hình thành một hệ thống phân loại riêng.

Sự kết hợp giữa hai hệ thống phân loại phân tử và phân loại truyền thống sẽ đem
lại kết quả tốt nhất. Thực tế cũng chứng minh rằng hầu hết những gì hệ thống học
Dương Văn Tăng

13
truyền thống đã giải quyết tốt, đều không mâu thuẫn với các kết quả nghiên cứu của hệ
thống học phân tử (Avise, 1993) [19]. Phân tích phân tử thƣờng đƣợc sử dụng để giải
quyết một số vấn đề mà hệ thống học truyền thống còn gặp khó khăn, trong khi chỉ thị
phân tử có lợi thế hơn. Hiện tại, hệ thống học phân tử là phƣơng pháp hữu hiệu hỗ trợ
cho phƣơng pháp phân loại truyền thống và cho kết quả khá tin cậy.
1.3. Hệ gen sử dụng trong nghiên cứu phân loại phân tử ở thực vật
1.3.1. Cấu trúc hệ gene lục lạp
Lục lạp là bào quan nằm trong tế bào chất của thực vật và tảo (algae), chúng có
chứa DNA riêng. DNA lục lạp có từ 10
2
– 10
4
bản sao trong mỗi tế bào [51]. Lục lạp
có chứa chất diệp lục (chlorophyll) và là nơi thực hiện quá trình quang hợp của cây.
Genome lục lạp thƣờng đƣợc sử dụng cho phân loại ở thực vật do đặc tính di truyền
theo dòng me, không bị tái tổ hợp di truyền cho thế hệ sau và tốc độ đột biến cũng khá
cao. Hệ gen lục lạp đƣợc các nhà phân loại học phân tử đánh giá chúng là sự tích luỹ các đột biến
theo thời gian, do vậy sẽ phản ánh đúng mức độ tiến hoá giữa các loài.
Genome lục lạp (cpDNA) thực chất là một phân tử DNA vòng, sợi đơn, mỗi gen
thƣờng không lặp lại. Không giống nhƣ các gen nhân, các gen lục lạp chỉ mã hoá cho

Hnh 1.1 Hệ gen lụ c lạ p của hoa Nhài Jasminum nudiflorum (Lee et al, 2007) [42]
Luận văn Thạc sỹ sinh học
14
các protein cần thiết cho chức năng quang hợp và bộ máy biểu hiện những protein này.

Vùng DNA không mã hoá trên hệ gen lục lạp là rất ít.
Genome lục lạp (cpDNA) có kích thƣớc từ 120kb – 220 kb (hình 1.1), kích
thƣớc này thay đổi do có sự tồn tại của 2 vùng lặp lại ngƣợc chiều nhau (Inverted
repeat), tách genome lục lạp thành hai vùng (vùng lớn LSC và vùng nhỏ SSC). Mặc dù
phần lớn DNA lục lạp đều mang số lƣợng gen nhƣ nhau, tuy nhiên đôi khi một số gen
di trú vào DNA nhân và biến mất khỏi hệ gen lục lạp. Các gen lục lạp có tốc độ đột
biến thấp hơn từ 4 – 5 lần so với gen trong nhân, nhƣng nhanh hơn khoảng ba lần so
với DNA ty thể thực vật và thƣờng xuyên đƣợc sử dụng trong nghiên cứu phân loại
[19, 51].
Hiện nay, các gen lục lạp thƣờng đƣợc sử dụng trong nghiên cứu hệ thống học
phân tử thực vật bao gồm: gen matK, gen trnL, vùng đệm trnH – psbA, tất cả các gen
thuộc hệ gen lục lạp thƣờng có mức độ biến đổi không lớn hơn 2% giữa các loài lân
cận.
Vùng đệm psbA - trnH: thƣờng đƣợc sử dụng cho nghiên cứu phân loại (Shaw
et al, 2005) [59, 60]. Vùng này có kích thức xấp xỉ 450bp, xác suất nhân bản thành
công rất cao (100% với các loài đã đƣợc nghiên cứu). Mức độ khác biệt trình tự
nucleotide giữa các loài là 1,24% và sự khác biệt bên trong loài rất thấp từ 0.00 –
0.08% (Kress et al, 2005) [40]. Trình tự psbA - trnH cũng đã đƣợc công bố trên ngân
hàng gen với nhiều loài khác nhau thuộc thực vật hạt trần, dƣơng xỉ, rêu và rêu tản
(liverwort).
Gen matK: cùng với vùng đệm psbA - trnH đã đƣợc đề xuất làm DNA
barcoding cho nhóm thực vật có hoa. Kết quả sử dụng gen matK cho phân loại đã thu
đƣợc sự tƣơng đồng rất cao với phân loại hình thái và cho giá trị bootstrap từ 92 –
100% (Mort et al., 2001) [47, 48].
Dương Văn Tăng

15
Gen trnL: Là gen mã hoá cho tRNA vận chuyển Leucine trong lục lạp, có kích
thƣớc từ 452bp đến 528bp với các loài thuộc họ đâu. Gen này đƣợc sử dụng nhiều
trong nghiên cứu phân loại phân tử (Mort, 2005; Kim, 2007; Son, 2010) [46, 39, 65].

Các kết quả thu đƣợc trong các nghiên cứu nguồn gốc phát sinh loài sử dụng gen trnL
cho thấy đây là một vùng DNA hữu ích cho phân loại.
Ngoài các locus đƣợc nêu trên, các vùng DNA: gen rbcL, vùng đệm trnL – trnF,
trnT – trnL thuộc hệ gen lục lạp cũng thƣờng đƣợc sử dụng cho phân tích. Việc sử
dụng mỗi đoạn gen cho những ƣu nhƣợc điểm khác nhau, kết quả phân loại sẽ chính
xác hơn khi phân tích tổ hợp nhiều gen.
1.3.2. Vùng ITS nhân
Vùng gen ITS: vùng ITS (internal transcribed spacer) của gen mã hoá cho
ribosome nhân gồm các đơn vị gen 18S, 5,8S và 26S (hình 1.2). Giữa các đơn vị gen
có các đoạn ITS-1 và ITS-2, các thành phần này tạo thành một nhóm gen cơ bản. Các
nhóm gen nhƣ vậy lặp lại liên tục trong hàng nghìn bản sao trong hệ gen nhân và
chúng đƣợc ngăn cách bởi vùng NTS (nontranscribed spacer) (hình 1.2).







Hình 1.2. Sơ đồ vùng gen ITS (Hillis, 2006)
Trong các nghiên cứu phân loại thực vật ở mức độ loài, vùng ITS là locus đƣợc
giải mã phổ biến nhất (Alvarez et al, 2003) [22]. Vùng ITS cho thấy có sự hiệu quả cao
trong nghiên cứu phân loại nhiều đối tƣợng thực vật và nấm (ngoại trừ dƣơng xỉ), và


mồi
mồi