muôi cấy mô, tế bào thực vật, nuôi cấy tế bào trần

TIỂU LUẬN
NUÔI CẤY MÔ TẾ BÀO THỰC VẬT
Đề tài:
Nuôi cấy tế bào trần
G/V hướng dẫn: PGS.TS Nguyễn Thị Lý Anh
Nhóm thực hiện : Trần Thị Chiên
Lê Thị Cẩm Lê
Phan Thị Thanh
Phạm Thu Trang
Nguyễn Thị Tuyết

I. Mở đầu
Các tế bào thực vật có tính toàn năng,có thể nuôi
cấy, điều khiển sự phát sinh hình thái của chúng
cho tới thành một cây hoàn chỉnh. Có thể nói, nội
dung bên trong vỏ tế bào trong đó vật chất chính là
các thông tin di truyền chứa trong nhân của tế bào
đã quyết định mọi đường hướng của quá trình thực
hiện tính toàn năng của tế bào. Vì thế,hoàn toàn có
thể nuôi cấy tạo cây hoàn chỉnh từ khối nguyên sinh
chất chứa nhân của tế bào. Từ đấy đưa đến khái
niệm nuôi cấy tế bào trần thực vật.
Tế bào trần được sử dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh
vực thí nghiệm từ nghiên cứu những tính chất vật lý
của màng sinh chất đến những nghiên cứu nhập
bào và hấp thu các phần tử, các bào quan và vi
sinh vật.

Protoplast

1.Khái niệm về Protoplast
Protoplast là các tế bào trong đó có
thành tế bào được loại bỏ và màng tế
bào chất là lớp ngoài cùng nhất trong tế
bào.
Protoplast có thể thu được bằng enzyme
lytic cụ thể để loại bỏ vách dung hợp.


Tế bào trần có thể được tạo ra bằng nhiều cách:
từ dịch huyền phù tế bào, tế bào mô sẹo hoặc từ
mô tươi nguyên trạng như lá qua tác động của
các enzym; Pectinase phân hủy pectin, cellulas
phân hủy hemicellulose. Các tế bào trần nếu để
trên môi trường dinh dưỡng thì sau 5-10 ngày
sẽ tạo vách tế bào và phân chia.
Các tế bào trần, thậm chí khác loài,có thể kết
hợp với nhau tạo tế bào lai và quan trình này gọi
là sự dung hợp tế bào trần.

2. Tại sao cần phải nuôi cấy tế bào trần ?

Nuôi cấy tế bào trần sẽ mở ra 1 mô hình hấp
dẫn để theo dõi quá trình sinh phôi từ 1 tế bào
cô lập. Đặc biệt biết được sự sắp xếp các sợi
Xenluloz để xác định hướng kéo dài tế bào, vị trí
và hướng của mặt phẳng phân chia.

So với các kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào khác,
nuôi cấy dung hợp tế bào trần giúp tạo ra các cơ

thể lai mang các đặc điểm di truyền của các bố
mẹ có nguồn gen khác xa nhau mà lai hữu tính
không thể thực hiện được.

3.So sánh đặc điểm nuôi cấy tế bào trần với nuôi
cấy các tế bào vẫn còn thành tế bào:

So với quy trình nuôi cấy mô tế bào bình thường thì
nuôi cấy tế bào trần thường yêu cầu 1 số thay đổi do
bản chất của tế bào trần. Các thay đổi thường liên
quan đến sự điều chỉnh nồng độ muối vô cơ, thêm vào
các hợp chất hữu cơ, vitamin, đường để đảm bảo khả
năng thẩm thấu và chất điều tiết sinh trưởng để kích
thích sự phân chia tế bào.

Nuôi cấy tế bào trần có nhiều ưu thế hơn so với nuôi
cấy các tế bào vẫn còn thành tế bào



Ưu thế của kĩ thuật nuôi cấy và tách tế bào trần là tế
bào không có màng cứng, ở trạng thái đơn bào, mật
độ tế bào thu được trên một một đơn vị thể tích môi
trường có thể rất cao (đạt 106 tế bào/ 1ml môi
trường).

Tế bào trần ở một số cây trồng có khả năng tái sinh
rất mạnh, ví dụ tế bào mô thịt lá ở thuốc lá, cải dầu…
Bằng thao tác di truyền ở tế bào trần có thể dễ dàng
tạo ra các tế bào biến đổi gen. Tế bào với kiểu gen

biến đổi sẽ được bảo tồn khi tái sinh tế bào thành cây
hoàn chỉnh. Điều này rất khó thực hiện ở các tế bào
vẫn còn thành tế bào.


Nuôi cấy tế bào trần cho phép khả năng biến
nạp các gen thuận lợi vào tế bào thực vật mà
trước kia thường bị vỏ tế bào ngăn cản.

Nuôi cấy tế bào trần cho phép khả năng dung
hợp tế bào – gắn hai tế bào trần lại thành một
tế bào với hai bộ thông tin di truyền của hai tế
bào tạo nên một thể lai vô tính mà không cần
hiểu biết chính xác về sự liên hệ giữa các gen,
ít tốn kém, nhanh,trực tiếp và áp dụng các kĩ
thuật chuyển gen( bơm AND, hóa thẩm, điện
thẩm…)giúp loại trừ tính bất thụ hữu tính, tạo
cây lai hữu thụ; Giúp chuyển những đặc tính có
lợi vào cây trồng, ít đòi hỏi phương tiện phức
tạp.


Tế bào lai thu được từ việc dung hợp hai tế bào trần
được tái sinh và thành một cây lai. Quá trình này xảy
ra ở tế bào nên gọi là lai tế bào và thông qua tế bào
soma nên gọi là lai soma hay lai vô tính tế bào. Từ
phương pháp này đẻ ra phương pháp lai xa giữa các
loài- điều không thể thực hiện bằng phương pháp lai
hữu tính thông thường.


Tuy nhiên quá trình nuôi cấy protoplast còn tồn tại một
số trở ngại đó là:

Quá trình cô lập nuôi cấy phải hoàn thiện.

Chưa có phương pháp hiệu quả để tuyển chọn các
sản phẩm phù hợp.

4. Kĩ thuật tách tế bào trần:

4.1. Phương pháp
cơ học:

Phương pháp này
dựa trên cơ sở phá
các mối liên kết của
mô bằng các dao sắc
nhọn ( sharp-edged
knife) và giải phóng
các protoplast riêng
rẽ. Phương pháp này
cho hiệu suất thấp.


4.2. Phương pháp enzyme:

Để phá vỡ thành tế bào người ta thường sử
dụng các enzyme chiết xuất từ các sinh vật
chứa nhiều enzyme phân giải thành vách tế bào
như: nấm, ốc và mối. Các enzyme này đã được

thương mại hóa theo các phương pháp khác
nhau với mức độ tinh khiết khác nhau


Hỗn hợp enzyme thường dùng là enzyme celluloza và
macerozim được chiết xuất từ nấm Trichdearina virde
và Aspergillus niger và đã được sản xuất công nghiệp.
Nồng độ dung dịch enzyme sử dụng tùy thuộc đối
tượng. Các hỗn hợp enzyme thường được sử dụng ở
pH 5,5 – 5,8 trong 3-8h.

Ngoài ra để protoplast không bị vỡ sau khi thành
cellulose bị phân hủy người ta phải bổ sung những
chất tăng áp lực thẩm thấu vào dung dịch enzyme để
duy trì cân bằng thẩm thấu giữa nội bào và môi
trường bên ngoài. Các dung dịch thường dùng là
dung dịch đường manitol, sorbitol. Nồng độ sử dụng
khoảng 0,3 – 0,7M tùy theo đối tượng thực vật.


So với phương pháp cơ học thì phương pháp này có
hiệu quả cao hơn rất nhiều. Phương pháp enzyme
cho phép tách được hàng gram protoplast. Có thể thu
được từ 1 gam lá cỏ luzec hoặc khoai tây là 6-12 triệu
tế bào trần.

Vì protoplast thực chất là tế bào trần không có thành
cho nên có thể tách được từ nhiều nguồn khác nhau
như các bộ phận của cây ( rễ, lá, hạt phấn), callus, tế
bào đơn…

Xác định chất lượng tế bào trần

Sau khi phá vỏ tế bào vẫn có những mảnh thành
tế bào còn xót lại làm ảnh hưởng đến những
nghiên cứu sau này

Cách tốt nhất để phát hiện thành tế bào là dùng
calcofluor, một hóa chất sẽ bám vào phân tử
xenlulozo và gây ra phát ánh sáng huỳnh quang
với màu xanh rực rỡ khi soi dưới tia cực tím.
Nếu các tế bào trần đã bị loại bỏ hoàn toàn
thành tế bào hiển vi trường có màu tối thẫm các
tế bào trần sẽ không nhìn thấy được ngoại trừ
sự tự phát ánh sáng huỳnh quang đỏ của các
lạp thể

Còn một phương pháp khác là dùng kính
hiển vi huỳnh quang kết hợp với nhuộm
xanh Evan để xác định sức sống của tế
bào trần. Những tế bào còn nguyên vẹn
sẽ ngăn không cho thuốc nhuộm xâm
nhập vào nguyên sinh chất ngược lại các
tế bào có màng sinh chất bị mất chức
năng sẽ bắt màu xanh và chúng không thể
sinh trưởng được

5. Nuôi cấy tế bào trần

Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình nuôi cấy

- Thành phần của môi trường nuôi cấy lỏng hay đặc tùy
thuộc vào vật liệu thực vật.Môi trường này có thêm
Auxin và Xitokinin để giúp sự tái tạo vách và các lần
phân chia đầu tiên.
- Đảm bảo đủ các yếu tố dinh dưỡng: axit amin,
polyamin, Hydrolysat Cazein, nước dừa, mạch nha…
- Đảm bảo điều kiện nhiệt độ, PH, ánh sáng,áp suát
thẩm thấu….
- Trong lần tự nhân đôi đầu tiên, môi trường phải có áp
suất thẩm thấu cao, Auxin, Xitikinin thích hợp, ánh sáng
yếu. Sau đó cần giảm áp suất thẩm thấu bắng cách pha
loãng môi trường để giúp cho sự tăng trưởng tế bào.
Khi mô sẹo được hình thành cần chuyển chúng vào
trong môi trường rắn chứa Auxin ở nồng độ thấp hơn và
Xitokinin cao hơn. Sau cùng kích thích ra rễ cần loại
Xitokinin, tăng nồng độ Auxin.

Nuôi cấy tế bào trần chia làm 2 giai đoạn
Giai đoạn 1

Từ tế bào trần tao thành tế bào, phân chia tạo thành
microcallus.

Sau một thời gian nuôi cấy một đến hai tuần các tế bào
trần tái tạo vỏ và phân chia tạo nên các microcallus.

Điều kiện nuôi cấy

Nuôi trong môi trường lỏng lắc


Lớp nuôi trợ dưỡng: tế bào trần, lớp xốp có khả năng
thấm từ dưới lên, callus từ mô tế bào mà từ đó tách tế
bào trần,agar.


Nuôi trong điều kiện ánh sáng yếu, nuôi tối.
Ánh sáng thẩm thấu đẳng trương.
Thời gian nuôi từ 1 đến 2 tuần.

Giai đoạn 2

Microcallus thành callus
ổn định hình thành phát
sinh cơ quan.

Chuyển các microcallus
lên môi trường cứng,
chúng sẽ tạo thành các
mô sẹo. Từ đó chuyển
sang môi trường tái sinh
chồi và cây hoàn chỉnh.

Điều kiện nuôi cấy.

Nuôi cấy trên môi trường
đặc

Chú ý tới ánh sáng và
quang chu kì


Có chất điều tiết sinh
trưởng cho qua trình tái
sinh cây

Loại bỏ chất gây ánh
sáng thẩm thấu

Các yếu tố ảnh hưởng đến sinh trưởng, phát triển của tế
bào trần

Nuôi cấy tế bào trần thường yêu cầu 1 số thay
đổi so với quy trình nuôi cấy mô bình thường do
bản chất của tế bào trần.

Các thay đổi thường liên quan đến sự điều chỉnh
nồng độ muối vô cơ, thêm vào các hợp chất hữu
cơ, vitamin, đường để đảm bảo khả năng thẩm
thấu và chất điều tiết sinh trưởng để kích thích
sự phân chia tế bào.

6. Dung hợp tế bào trần

Dung hợp là hiện tượng cắt đứt màng sinh chất
nơi tiếp xúc giữa 2 tế bào trần khác loài do tác
động của các nhân tố bên ngoài. Sau đó là sự
tái tổ chức các màng ban đầu thành 1 và bao lấy
tế bào chất và 2 nhân cha mẹ.


Có thể nói việc dung hợp tế bào trần và tái sinh

thành cây lai từ tế bào trần là 1 trong những
thành tựu tuyệt vời của kĩ thuật nuôi cấy mô tế
bào. Bằng phương pháp này đẻ ra phương pháp
lai xa giữa các loài điều mà không thể thực hiện
bằng các phương pháp lai hữu tính thông
thường.
Tế bào trần là những tế bào không có thành tế
bào. Chính vì thế chúng có thể hòa lẫn vào nhau
(dung hợp) và thành 1 tế bào lai mang trong
mình vật chất di truyền của cả 2 tế bào.

Tế bào lai này được tái sinh và thành 1 cây lai.
Quá trình này xảy ra ở tế bào nên gọi là lai tế
bào và thông qua tế bào soma nên gọi là lai
soma hay lai vô tính tế bào

Sơ đồ chọn lọc các thể lai soma bằng cách ứng dụng sự mẫn cảm
khác nhau của các protoplast thịt lá đối với actinomycin D

Có 2 phương pháp dung hợp tế bào trần:
+ Dung hợp bằng hóa chất
+ Dung hợp bằng điện