Nghiên cứu tuyển chọn chủng vi sinh vật sinh tổng hợp xylanase từ lõi ngô dùng trong sản xuất đường xylose

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ðẠI HỌC NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI




NGUYỄN TIẾN NAM




NGHIÊN CứU TUYểN CHọN CHủNG VI SINH VậT SINH
TổNG HợP XYLANASE Từ LÕI NGÔ DÙNG TRONG SảN
XUấT ðƯờNG XYLOSE



LUẬN VĂN THẠC SĨ NÔNG NGHIỆP


Chuyên ngành: Công nghệ sinh học
Mã số: 60 42 02 01


Người hướng dẫn khoa học:
1. TS. NGUYỄN VĂN GIANG
Trường Đại học Nông nghiệp Hà Nội
2. TS. NGUYỄN TẤT THẮNG
Viện Cơ điện Nông nghiệp và Công nghệ sau thu hoạch

HÀ NỘI, 2013
Trường ðại Học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp
i

LỜI CAM ðOAN


Tôi xin cam ñoan ñây là công trình nghiên cứu của riêng tôi, các số
liệu và kết quả nghiên cứu trong luận văn này là trung thực và chưa ñược sử
dụng trong bất kỳ một nghiên cứu nào.
Tôi xin cam ñoan, mọi sự giúp ñỡ cho việc thực hiện luận văn này ñã
ñược cảm ơn và các thông tin trích dẫn trong luận văn này ñều ñã ñược chỉ
rõ nguồn gốc
Hà Nội, ngày tháng năm 2013
Tác giả


Nguyễn Tiến Nam

Trường ðại Học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp
ii

LỜI CẢM ƠN

ðể hoàn thành ñề tài tốt nghiệp, ngoài sự cố gắng của bản thân tôi ñã
nhận ñược rất nhiều sự quan tâm giúp ñỡ nhiệt tình của thầy cô, bạn bè và
người thân.
Trước tiên, tôi xin ñược bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS. Nguyễn Văn
Giang – Khoa công nghệ sinh học - Trường ñại học nông nghiệp Hà Nội ñã
tận tình hướng dẫn, giúp ñỡ tôi trong quá trình thực hiện ñề tài và hoàn thành

bản luận văn này.
ðồng thời, tôi xin ñược cảm ơn TS. Nguyễn Tất Thắng - Viện cơ ñiện
nông nghiệp và Công nghệ sau thu hoạch ñã nhiệt tình giúp ñỡ và tạo mọi
ñiều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt quá trình làm luận văn.
Tôi xin ñược gửi lời cảm ơn chân thành tới các thầy cô giáo trong Khoa
công nghệ sinh học, Viện ñào tại sau ñại học – Trường ðại học Nông nghiệp
Hà Nội
Hà Nội, ngày tháng năm 2013
Tác giả




Nguyễn Tiến Nam

Trường ðại Học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp
iii

MỤC LỤC
Trang

LỜI CAM ĐOAN i
LỜI CẢM ƠN ii
MỤC LỤC iii
DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT vi
DANH MỤC BẢNG vii
DANH MỤC HÌNH ix
PHẦN I. MỞ ĐẦU 1
I. Đặt vấn đề 1
II. Mục đích và yêu cầu của đề tài 2

PHẦN II. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3
2.2. Enzyme xylanase 4
2.2.1. Cấu tạo và cơ chế xúc tác của enzyme xylanase 4
2.2.2. Nguồn enzyme xylanase 7
2.2.3. Ứng dụng thực tiễn của enzyme xylanase 9
2.3. Lõi ngô - nguồn xylan 11
2.4. Giới thiệu chung về đường xylose 14
2.4.1. Đặc điểm của đường xylose 14
2.4.2. Các phương pháp sản xuất đường xylose 17
2.4.3. Ứng dụng của đường xylose 21
2.5. Tình hình nghiên cứu và sản xuất đường xylose trên thế giới và ở
Việt Nam 22
2.5.1. Tình hình nghiên cứu và sản xuất đường xylose trên thế giới 22
2.5.2. Tình hình nghiên cứu và sản xuất đường xylose ở Việt Nam 23
PHẦN III: VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 25
3.1. Vật liệu, hóa chất nghiên cứu 25
3.1.1. Vật liệu và đối tượng nghiên cứu 25
Trường ðại Học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp
iv

3.1.2. Thiết bị, hóa chất dùng trong nghiên cứu 25
3.2. Thời gian và địa điểm nghiên cứu 27
3.3. Nội dung nghiên cứu: 28
3.4. Phương pháp nghiên cứu 29
3.4.1. Sơ đồ quy trình công nghệ sản xuất enzyme xylanse quy mô
phòng thí nghiệm 29
3.4.2. Phương pháp vi sinh 31
3.4.3. Phương pháp phân tích các chỉ tiêu vật lý 32
3.4.4. Phương pháp phân tích chỉ tiêu hoá học 33
3.4.5. Phương pháp tách chiết eyme xylanase 35

3.4.6. Phương pháp bố trí thí nghiệm 37
3.4.7. Nghiên cứu ứng dụng enzyme xylanase để thu nhận đường
xylose từ xy lan quy mô phòng thí nghiệm 41
3.4.8. Nghiên cứu công nghệ tách chiết, làm sạch và thu hồi đường
xylose quy mô thí nghiệm 43
3.5. Phương pháp xử lý số liệu 44
PHẦN IV. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 45
4.1. Tuyển chọn một số chủng nấm mốc có khả năng sinh tổng hợp
enzyme xylanase đạt hiệu quả cao 45
4.1.1. Kết quả tuyển chọn một số chủng nấm mốc có khả năng sinh
tổng hợp enzyme xylanase 45
4.1.2. Nghiên cứu một số đặc điểm hình thái của chủng nấm mốc An
NVT3 tuyển chọn 46
4.2. Nghiên cứu xác định một số điều kiện (nhiệt độ, pH, dinh dưỡng,
…) để sinh tổng hợp enzyme xylanase đạt hiệu quả cao 48
4.2.1. Nghiên cứu ảnh hưởng của pH ban đầu đến khả nắng sinh tổng
hợp enzyme xylanase 48
4.2.2 Ảnh hưởng của nhiệt độ nuôi cấy đến khả năng sinh tổng hợp
enzyme xylanase 49
Trường ðại Học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp
v

4.2.3. Ảnh hưởng của nguồn nitơ đến khả năng sinh tổng hợp xylanase 50
4.2.4. Xác định nguồn và nồng độ nitơ vô cơ thích hợp đến khả năng
sinh tổng hợp enzyme xylanase 52
4.3. Nghiên cứu điều kiện thu hồi enzyme xylanase quy mô phòng thí
nghiệm 53
4.3.1. Cô đặc dịch xylanase bằng màng siêu lọc Amicon (PM10) 53
4.3.2. Nghiên cứu công nghệ tách chiết enzyme xylanase 54
4.4. Nghiên cứu ảnh hưởng của pH, nhiệt độ đến hoạt lực của enzyme

xylanase 56
4.4.1. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt tính enzyme xylanase 56
4.4.2. Ảnh hưởng của độ bền nhiệt đến hoạt tính enzyme xylanase 57
4.4.3. Ảnh hưởng của pH và độ bền pH đến hoạt tính enzyme xylanase 58
4.5. Nghiên cứu ứng dụng enzyme xylanase để thu nhận đường xylose
từ xylan quy mô phòng thí nghiệm 60
4.5.1. Ảnh hưởng của nồng độ enzyme xylanase đến hiệu quả thủy
phân xylan 60
4.5.2. Ảnh hưởng của nồng độ cơ chất đến hiệu quả thủy phân xylan 61
4.5.3. Ảnh hưởng của thời gian thuỷ phân đến hiệu quả thủy phân
xylan 63
4.5.4. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hiệu quả thủy phân xylan 65
4.5.5. Ảnh hưởng của pH đến hiệu quả thủy phân xylan 66
4.5.6. Nghiên cứu thu hồi đường xylose quy mô phòng thí nghiệm 67
PHẦN V. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 72
5.1. Kết luận 72
5.2. Đề nghị 73
TÀI LIỆU THAM KHẢO 74
PHỤ LỤC 80


Trường ðại Học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp
vi

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT

Chữ viết tắt
A. niger
CNTP
g

HPLC
l
ml
mg
RS
TS
V/ph
Xyl

Chữ viết thường
Aspergillus niger
Công nghiệp thực phẩm
gam
Sắc ký lỏng cao áp
lít
mililit
miligam
Đường khử
Đường tổng số
Vòng/phút
Xylose

Trường ðại Học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp
vii

DANH MỤC BẢNG

TT Tên bảng Trang

Bảng 2.1. Khả năng sinh enzyme xylanase trên phế phụ phẩm

nông nghiệp của một số chủng Aspergillus 8

Bảng 2.2. Tình hình sản xuất ngô tại Việt Nam (2007 - 2011) 12

Bảng 2.3. Thành phần các hợp chất của lõi ngô 13

Bảng 2.4. Thành phần hemicellulose trong sinh khối thực vật 14

Bảng 2.5. Lượng sản xuất và giá cả các loại đường trên thế giới 23

Bảng 4.1. Kết quả tuyển chọn chủng nấm mốc sinh xylanase 45

Bảng 4.2. Một số đặc điểm hình thái của chủng nấm mốc An NVT3 47

Bảng 4.3 Ảnh hưởng của pH ban đầu đến khả năng sinh tổng hợp
enzyme xylanase 49

Bảng 4.4 Ảnh hưởng của nhiệt độ đến khả năng sinh tổng
hợpxylanase 50

Bảng 4.5. Ảnh hưởng của nguồn nitơ đến khả năng sinh tổng hợp
xylanase 51

Bảng 4.6. Ảnh hưởng của nồng độ các nguồn nitơ vô cơ đến khả năg
sinh tổng hợp enzyme xylanase 52

Bảng 4.7. Các bước tinh sạch xylanase quy mô phòng thí nghiệm 54

Bảng 4.8. Hiệu quả của một số phương pháp tách chiết enzyme 55

Bảng 4.9. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt tính của enzyme
xylanase 56

Bảng 4.10. Ảnh hưởng của độ bền nhiệt đến hoạt tính của enzyme
xylanase 57

Bảng 4.11. Ảnh hưởng của pH đến hoạt tính enzyme xylanase 58

Bảng 4.12. Ảnh hưởng của độ bền nhiệt đến hoạt tính của enzyme
xylanase 59

Trường ðại Học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp
viii

Bảng 4.13. Ảnh hưởng của nồng độ enzyme xylanase đến hiệu quả
thủy phân dịch xylan 60

Bảng 4.14. Ảnh hưởng của nồng độ cơ chất đến hiệu quả thủy phân
dịch xylan lõi ngô 62

Bảng 4.15. Ảnh hưởng của thời gian phản ứng đến hiệu quả thủy phân
dịch xylan 64

Bảng 4.16. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hiệu quả thủy phân xylan 65

Bảng 4.17. Ảnh hưởng của pH đến hiệu quả thủy phân xylan 66

Bảng 4.18. Ảnh hưởng của tỷ lệ than hoạt tính đến hiệu quả tinh sạch
dịch đường sau thủy phân 68

Bảng 4.19. Ảnh hưởng của tỷ lệ mầm tinh thể đường xylose bổ sung
để làm mồi đến hiệu suất kết tinh 69

Bảng 4.20. Ảnh hưởng của nhiệt độ tới quá trình sấy khô đường 71



Trường ðại Học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp
ix

DANH MỤC HÌNH

TT Tên hình Trang

Hình 2.1. Tác động của các loại enzyme xylanase lên mạch xylan 6

Hình 2.2. Công thức cấu tạo của đường xylose 14

Hình 2.3. Công thức cấu tạo của xylan 15

Hình 2.4. Công thức cấu tạo hóa học của một số loại xylan 16

Hình 4.1. Bào tử của chủng nấm mốc A. niger NVT3 48

Hình 4.2. Hình thái khuẩn lạc của chủng nấm mốc A. niger NVT3 trên
môi trường PDA sau 7 ngày nuôi cấy 48

Hình 4.3. Nấm mốc A. niger trên môi trường giữ giống 48

Trường ðại Học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp

1

PHẦN I. MỞ ðẦU
I. ðặt vấn ñề
Hiện nay trên thế giới nguồn thực phẩm chức năng đóng vai trò quan
trọng. Nó giúp cho con người duy trì và tăng cường sức khỏe, kéo dài tuổi
thọ, phòng và chữa được nhiều bệnh hiểm nghèo nhất là trong giai đoạn hiện
nay, khi đời sống con người ngày càng tăng cao và yêu cầu về sức khỏe ngày
càng được xem trọng. Thực phẩm chức năng là loại thực phẩm được chế biến
từ các nguyên liệu tự nhiên như các nguồn thực vật và động vật giàu hoạt chất
sinh học. Thực phẩm chức năng giúp cho con người duy trì và tăng cường sức
khỏe, kéo dài tuổi thọ, phòng và chữa được nhiều bệnh hiểm nghèo [10].
Những năm gần đây một loại đường chức năng đang có xu hướng gia
tăng ở nhiều quốc gia trên thế giới với các ứng dụng rộng rãi trong công
nghiệp thực phẩm và dược phẩm như là chất phụ gia, bổ sung vào đồ uống
dinh dưỡng, là nguyên liệu đầu của thuốc trổng hợp điều trị bệnh ung thư,
phòng chống một số bệnh (tiểu đường, mất ngủ, đường ruột…) đó là đường
xylose. Trong công nghiệp thực phẩm, xylose được sử dụng để sản xuất bánh
kẹo, dùng làm chất phụ gia thực phẩm và là sản phẩm được bổ sung vào các
loại đồ uống. Nhờ xylose có độ ngọt tương đương với đường sucrose và do
đặc điểm mất nhiệt khi hoà tan nên tạo cảm giác mát lạnh trong miệng. Đặc
tính này làm cho xylose rất hấp dẫn trong một số sản phẩm thực phẩm, đặc
biệt là đồ uống. Trong lĩnh vực y dược, xylose được biết đến như một trong
những nguyên liệu đầu của việc tổng hợp thuốc trị bệnh ung thư, AIDS và
một số bệnh khác (Trương Thị Minh Hải và cs., 2008)[9]. Có 2 phương pháp
chính để sản xuất đường xylose là phương pháp hóa học và phương pháp lên
men nhờ vi sinh vật. Trong đó sản xuất xylose theo phương pháp lên men từ
xylan nhờ vi sinh vật tỏ ra có nhiều ưu điểm trong việc khắc phục các nhược
điểm của phương pháp hóa học.
Trường ðại Học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp

2

Tuy nhiên, ở Việt Nam vấn đề này vẫn còn rất mới. Trong khi đó, nước ta là
một nước nông nghiệp, cùng với lượng nông sản tạo ra khá lớn là các phế phụ
phẩm và các phế thải mà ngành nông nghiệp thải ra, trong đó có lõi ngô. Việc
xử lý các phế thải nông nghiệp này không hợp lý không những gây ra ô nhiễm
môi trường trầm trọng mà còn làm giảm hiệu quả sản xuất của ngành công
nghệ sau thu hoạch. Vì vậy, việc nghiên cứu công nghệ sản xuất đường xylose
từ lõi ngô bằng enzyme xylanase sẽ giúp nâng cao giá trị nông sản, giảm thiểu
ô nhiễm môi trường trong việc tận dụng loại phế phụ phẩm nông nghiệp này.
Xuất phát từ vấn đề nêu trên, chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài:
“Nghiên cứu tuyển chọn chủng vi sinh vật sinh tổng hợp xylanase từ lõi
ngô dùng trong sản xuất ñư
ờng Xylose”.
II. Mục ñích và yêu cầu của ñề tài
1. Mục ñích của ñề tài
Tuyển chọn được một số chủng nấm mốc có hoạt lực sinh tổng hợp
enzyme xylanase cao từ lõi ngô.
2. Yêu cầu của ñề tài
- Tuyển chọn được một số chủng nấm mốc có hoạt lực sinh tổng hợp
enzyme xylanase với hoạt lực cao (đạt 400 IU/ ml).
- Xác định các điều kiện (nhiệt độ, pH, dinh dưỡng,…) để sinh tổng
hợp enzyme xylanase đạt hiệu quả cao.
- Ứng dụng enzyme xylanase để thủy phân xylan từ lõi ngô thành
đường xylose quy mô phòng thí nghiệm.

Trường ðại Học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp
3

PHẦN II. TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1. Tuyển chọn chủng vi sinh vật có hoạt lực sinh tổng hợp enzyme
xylanse cao
Aspergillus là một chi nấm có ý nghĩa công nghiệp cao do có khả năng
sản sinh nhiều loại enzyme thủy phân ngoại bào có giá trị công nghiệp, trong
đó có xylanase. Với khả năng sinh đồng thời nhiều loại enzyme thủy phân
ngoại bào (cenllulase, protease, pectinase, amylase, xylanse) nên đa số các
loài của chi nấm này đều có khả năng sinh mạnh xylanase trên nhiều cơ chất
tự nhiên khác nhau bao gồm cả các phụ phẩm nông nghiệp chứa lignocellulo
trong đó có lõi ngô. Tuy nhiên khả năng sản sinh ra xylanase còn phụ thuộc
vào rất nhiều yếu tố như: chủng giống, chất lượng lõi ngô, nhiệt độ, pH, độ
ẩm,… Trong đó yếu tố đầu tiên đóng vai trò quyết định là chất lượng chủng vi
sinh vật. Chính vì vậy việc tuyển chọn chủng vi sinh vật có hoạt lực sinh tổng
hợp enzyme xylanase cao là một vấn đề vô cùng cần thiết.
Trong quá trình nghiên cứu tuyển chọn chủng vi sinh vật sinh tổng hợp
xylanase trên phế phụ phẩm nông nghiệp phục vụ chăn nuôi, từ 129 chủng vi
khuẩn và nấm sợi có nguồn gốc từ rừng ngập mặn, tác giả Phương Phú Công
(2009) đã tuyển chọn được chủng Aspergillus Gm56 có khả năng sinh mạnh
xylanase (đạt 485,05 IU/g khi lên men chìm và 1329,9 IU/g khi lên men rắn
với cơ chất lõi ngô. Enzyme xylanase được sinh ra từ chủng Gm56 có thể hoạt
động tốt và bền ở acid ở ngưỡng từ 2,0-6,0, nhiệt độ gần với hoạt động của bộ
máy tiêu hóa vật nuôi [6].
Tác giả Trần Hữu Phong (2007) [22] khi nghiên cứu một số đặc điểm
xylanase từ chủng Aspergillus niger ĐB106 cho biết chủng Aspergillus niger
ĐB106 có khả năng sinh tổng hợp enzyme thủy phân polysaccharide
(amylase, cellulase, xylanase, α-galactosidase), không sinh protease và

phytase. Có khả năng sinh enzyme xylanase mạnh (endoxylanase: 3105,5
Trường ðại Học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp
4

IU/g cơ chất khô và β-xylosidase: 2,432 IU/g cơ chất khô). Đây là chủng an
toàn (không sinh độc tố Aflatoxin và Ochratoxin), không ảnh hưởng xấu lên
động vật thí nghiệm.
Khi nghiên cứu về xylanase nấm mốc dùng cho chăn nuôi, tác giả Đào
Thị Hải Lý (2006) đã tuyển chọn được chủng Aspergillus oryzae NM1 có
hoạt tính xylanase mạnh, đạt 667 IU/g cơ chất lõi ngô. Chủng Aspergillus
oryzae NM1 không sinh các độc tố aflatoxin khi lên men bề mặt trên cơ chất
lõi ngô, không gây bệnh trên động vật thí nghiệm nên hoàn toàn yên tâm sử
dụng để sản xuất enzyme xylanase. Enzyme xylanase được sinh tổng hợp từ
chủng Aspergillus oryzae NM1 có pH tối ưu là 5.0, hoạt động ổn định trong
khoảng pH 4.0-7.0; Nhiệt độ tối ưu là 50
0
C và dưới nhiệt độ này hoạt tính vẫn
giữ được trên 90%; Enzyme xylanase có khả năng phân cắt xylan trong cơ
chất chăn nuôi giải phóng xylose và oligoxylose.
2.2. Enzyme xylanase
2.2.1. Cấu tạo và cơ chế xúc tác của enzyme xylanase
2.2.1.1. Cấu tạo của enzyme xylanase
Các xylanase có cấu tạo gồm nhiều chuỗi polypeptide xoắn lại với nhau
tạo cấu trúc bậc 2 và tiếp tục cuộn xoắn trong không gian để tạo thành cấu
trúc bậc 3. Các chuỗi có cấu trúc bậc 3 kết hợp với nhau tạo cấu trúc bậc 4
[31]. Ở mức phân tử protein, xylanase gồm vùng chức năng, vùng không chức
năng và vùng nối. Vùng nối thường có nhiều amino axit, hydroxyl được
glycosyl hóa ở vị trí O. Sự glycosyl hóa này giúp chúng không bị enzyme
protease phân cắt. Vùng chức năng được chia thành vùng xúc tác và vùng
bám cơ chất, hai vùng này có thể tách biệt nhau về cấu trúc hoặc không. Tính

chất của xylanase có mối tương quan rất lớn đến các gốc hydro liên kết với
các xylanase. Nếu xylanase có tính bazơ thì amino axit là asparagines,
xylanase có tính axit thì amino axit là aspartic [30].
Trường ðại Học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp
5

2.2.1.2. Cơ chế xúc tác của enzyme xylanase
Cơ chế hoạt động của xylanase bao gồm các bước sau [6, 29]:
Bước 1: Enzyme xylanase nhận mặt xylan và liên kết với nó bằng cách
thay đổi cấu hình ở phần cánh trái cuộn xoắn lại 3 lần.
Bước 2: Gốc xylosyl ở vị trí thứ nhất bị vặn méo và hút về phía gốc xúc
tác, liên kết glycoside bị kéo căng và bị bẻ gãy và tạo thành dạng trung gian
đồng hóa trị enzyme - cơ chất.
Bước 3: Dạng trung gian bị tấn công bởi một phân tử nước hoạt động.
Phân tử nước này tách thành ion H
+
và OH
-
. Ion H
+
gắn vào gốc glycosyl vừa
được tách ra trong khi ion OH
-
gắn vào đầu khử của mạch xylan vừa tạo ra
theo cơ chế thủy phân glycosyl, nhờ đó sản phẩm được giải phóng, đồng thời
enzyme tiếp tục xúc tác cho phản ứng khác.
Sơ đồ tóm tắt của quá trình như sau:
Xylanase + xylan xylan-xylanase xylanase + sản phẩm
Đầu tiên cơ chất xylan xoắn ốc được đặt vào vị trí đối diện với khe giữ
Tyr 65 và Tyr 69. Axit glutamic 172 là chất xúc tác axit/bazơ và axit

Glutamic 78 là chất cho điện tử (nucleophile). Cơ chất bám vào vị trí
Glutamic 78 tạo thành dạng sản phẩm trung gian và được giữ vững trong suốt
quá trình phản ứng chuyển glycosylate. Một phân tử nước thay thế vị trí của
chất cho điện tử (nucleophile). Có sự phân tách và phân tán các đường
(xylobiose) cho phép enzyme di chuyển đến một vị trí mới trên cơ chất [3].
2.2.1.3. Enzyme xylanase và sự thuỷ phân xylan
Thủy phân xylan bằng enzyme là quá trình để phá vỡ chuỗi xylan thu
được từ quá trình tiền xử lý lõi ngô thành các phân tử đường xylose bằng tác
dụng của các enzyme thủy phân. Quá trình này còn được gọi là quá trình
đường hóa. Xylan có cấu tạo phức tạp và nguồn xylan phong phú nên các
enzyme xylanase có cấu tạo cũng rất phức tạp. Mỗi loại vi sinh vật khác nhau
sẽ thu được sẽ khác nhau. Hầu hết enzyme xylanase từ các chủng vi sinh vật
Trường ðại Học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp
6

đều chứa trên một hoạt tính. Để phân giải xylan thành xylose cần tác dụng
đồng thời của 2 loại enzyme chính bao gồm: endoxylanase (còn được gọi là β-
1,4-xylanase, β-D-xylanase hay Endo-1,4-β-D-xylanase) và β-xylosidase.
Endo-xylanase thường cắt mạch chính của xylan ở những điểm bất kỳ tại giữa
mạch và giải phóng olygoxylose. Sau đó, β-xylosidase cắt các đoạn
olygoxylose để giải phóng đường đơn xylose. Ngoài ra còn cần thêm các loại
enzyme để phân cắt đường chuỗi bên như α-L-arabinofuranosidase, α-
glucuronidase,…[29]. Nguyên tắc các enzyme thuỷ phân mạch xylan được
mô tả trong hình 2.1.

Hình 2.1. Tác ñộng của các loại enzyme xylanase lên mạch xylan
Trường ðại Học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp
7

2.2.2. Nguồn enzyme xylanase

Trong thời gian gần đây việc nghiên cứu sản xuất enzyme xylanase đã
thu hút được sự quan tâm của nhiều nhà khoa học, trong đó các công trình
nghiên cứu sản xuất enzyme xylanase chủ yếu từ vi sinh vật như nấm và vi
khuẩn [6].
* Enzyme xylanase từ vi khuẩn: Là một trong số rất nhiều enzyme
xylanase được nghiên cứu và ứng dụng trong công nghiệp. Trong số đó, chi
Bacillus và Streptomyces là hai chi sản sinh enzyme xylanase khá phổ biến đã
được công bố và sử dụng rộng rãi. Xylanase của các họ vi khuẩn thường hoạt
động tối ưu ở pH từ 5,0 - 8,0, ở nhiệt độ 50 - 80
o
C. Nakamura và cs khi
nghiên cứu enzyme xylanase của Bacillus sp. 41-1 cho thấy chúng hoạt động
tốt ở nhiệt độ 50
o
C [54].
* Enzyme xylanase từ nấm: Enzyme xylanase được sản xuất từ nấm
đặc biệt là các loại nấm sợi được ứng dụng rất nhiều trong công nghiệp. Khả
năng sinh enzyme xylanase của nấm sợi cao hơn nhiều so với khả năng sinh
enzyme xylanase của vi khuẩn và nấm men. Ngoài ra, nấm sợi thường sản
sinh một hệ enzyme phân giải xylan bao gồm endoxylanase, β-xylosidase và
các enzyme phân cắt nhóm thế khác. Các enzyme xylanase của nấm sợi
thường là các enzyme ngoại bào. Với những ưu thế về khả năng sinh enzyme
xylanase như vậy nên hiện nay trên thị trường các chế phẩm enzyme xylanase
chủ yếu sản xuất từ nấm sợi. Đặc tính chung của đa số các xylanase từ nấm là
hoạt động hiệu quả nhất ở nhiệt độ 35 - 50
o
C, pH 3,0 - 5,5 và bền ở dải pH từ
4,0 - 8,0 [5].
Trong số các chi nấm sợi thì các chi Aspergillus và Trichoderma là hai
chi sinh enzyme xylanase được nghiên cứu nhiều nhất. Đặc biệt Aspergillus là

Trường ðại Học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp
8

một chi nấm sợi có ý nghĩa công nghiệp cao do có khả năng sinh nhiều loại
enzyme thủy phân ngoại bào. Chính vì khả năng sinh đồng thời nhiều loại
enzyme thủy phân ngoại bào nên đa số các loài của các chi nấm này đều có
khả năng sinh ra nhiều enzyme xylanase trên các cơ chất tự nhiên, phế phụ
phẩm nông nghiệp chứa lignocellulose như bã dầu cọ, lõi ngô, vỏ lúa mì,…
Khả năng sinh enzyme xylanase trên phế phụ phẩm nông nghiệp của một số
chủng Aspergillus được thể hiện ở bảng 2.6 [6].
Christov và cs [43] khi cấy các chủng A. foetidus, A. oryzae, A. niger và
A. phoenicis trên môi trường chứa lõi ngô đã thu được hàm lượng xylanase
tương ứng là 82,3 IU/g; 547,4 IU/g; 99,9 IU/g và 225,6 IU/g [33]. Khả năng
sinh enzyme xylanase từ nấm cao hơn rất nhiều so với khả năng sinh enzyme
xylanase từ vi khuẩn. Để sản xuất enzyme xylanase từ nấm người ta có thể sử
dụng các phương pháp truyền thống để nâng cao hoạt tính của enzyme như
chọn lọc chủng đầu dòng, tối ưu hóa môi trường nuôi cấy, gây đột biến bằng
tác nhân vật lý, hóa học để có thể thu được chủng mong muốn.
Bảng 2.1. Khả năng sinh enzyme xylanase trên phế phụ phẩm
nông nghiệp của một số chủng Aspergillus
Chủng
vi sinh vật
Cơ chất
Khối
lượng
(%)
ðiều kiện
nuôi cấy
(
0

C/h)
IU/g khối
lượng
khô
A. fumigatus
4-45-IF
Rơm 81 40/96 545
A. niger
BS11042
Cám mỳ/Bột củ cải
(Tỷ lệ 4/1)
50 30/48 283
Cám mỳ/xylan
(Tỷ lệ 25/1)
60 28/336 724
A. ochraceus
Thân mỳ 60 28/336 448
Trường ðại Học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp
9

2.2.3. Ứng dụng thực tiễn của enzyme xylanase
2.2.3.1. Tình hình sản xuất và thương mại enzyme xylanase
Những thành tựu nổi bật trong quá trình nghiên cứu và ứng dụng
xylanase được sản xuất và ngày càng được sử dụng phổ biến. Trên thế giới có
khoảng 10 công ty sản xuất lớn và hàng loạt các công ty nhỏ sản xuất enzyme
công nghiệp, nhưng công ty của Novo- Nordisk của Đan Mạch là công ty sản
xuất enzyme lớn nhất trên thế giới. Chỉ tính đến năm 1994 họ đã sản xuất đến
32% enzyme tẩy rửa, chế biến các sản phẩm từ sữa 14%, dệt 10%, thuỷ phân
tinh bột 15% và các enzyme khác khoảng 29%. Nhưng thành tựu nổi bật nhất
trong quá trình nghiên cứu và ứng dụng xylanase chính là các chế phẩm

xylanase phục vụ cho công nghiệp giấy, dược phẩm đã được sản xuất và ngày
càng được sử dụng rộng rãi. Hiện nay đã có một số sản phẩm đang lưu hành
trên thị trường như: enzyme xylanase X2753-50G từ Thermomyces
lanuginosus của hãng Sigma, enzyme xylanase X400 OL từ Trichoderma
longibrachiatum của hãng Gramma Chemie GMbH (Đức), Novoenzyme 431
từ Trichoderma longibrachiatum của hãng Novo Nordisk và Grydazym GP
5000 (Đan Mạch) [31, 42].
Trung Quốc đã sản xuất một số enzyme thương mại trong đó có
xylanase như: DKN xylanase 10000 dry của hãng Qingdao Continent Industry
Co., sản phẩm có hoạt tính xylanase không dưới 10000 IU/g; xylanase XCB
của hãng Hunan New Century BioChemical Co., sản phẩm có hoạt tính
xylanase 5000 IU/g; Green enzyme có tổ hợp enzyme gồm: β-glucanase
(50000 U/g); protease (1000 U/g), xylanase (60000 U/g); pectinase (6000
U/g); cellulase (12000 U/g) [31].
Các nước Đông Nam Á như Singapore cũng có hàng loạt các sản phẩm
enzyme xylanase như: Kemzyme dry KM-24-10/99 được sản xuất bởi công ty
Kemin Industries (Asia) Pte Limited; Rovabio Excel AP AA-54-2/01 được
sản xuất bởi công ty Adisseo.
Trường ðại Học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp
10

Ở Việt Nam đã có một số công trình nghiên cứu về xylanase từ vi sinh
vật. Tuy nhiên, các công trình nghiên cứu mới chỉ dừng lại ở mức độ tìm hiểu
hoạt tính enzyme xylanase của các chủng vi sinh vật được sản xuất trong
nước. Chúng ta chưa tự sản xuất được enzyme xylanase để phục vụ cho nhu
cầu nghiên cứu và sản xuất trong nước. Các enzyme hầu hết đều được nhập
khẩu về nước ở dạng thành phẩm và bán thành phẩm [6].
2.2.3.2. Ứng dụng trong chuyển hóa các chất lignocenlulose
Xylan còn là cơ chất dùng để sản xuất các loại đường xylo-oligosac-
charide. Xylo-oligosaccharide là một trong số các oligo-saccharide chức năng

(prebiotic) có cấu tạo từ 2 đến 7 phân tử đường β-xylose liên kết với nhau
bằng liên kết 1,4- β-xyloside. Prebiotic có nhiều lợi ích về mặt dược phẩm
cũng như có ảnh hưởng tốt đến sức khỏe. Khi được bổ sung vào cơ thể người,
prebiotic có nhiều tác động sinh lý quan trọng như ngăn cản quá trình gây
bệnh của vi khuẩn và các tác nhân gây tiêu chảy, tăng khả năng miễn dịch của
cơ thể, kháng lại bệnh ung thư, cản trở sự phát triển của các vi sinh vật trong
khoang miệng. Các sản phẩm phụ nông nghiệp như lõi ngô, cám gạo, vỏ trấu
là cơ chất lý tưởng cho việc sản xuất xylo-oligosaccharide. Các enzyme tốt
nhất sử dụng cho quá trình này là các enzyme từ nấm mốc. Hiện nay nhu cầu
về oligosaccharide trên thế giới là rất lớn. Tại Nhật Bản, nhu cầu hàng năm về
oligosaccharide vào khoảng 1000 - 2000 tấn/năm [16].
2.2.3.3. Ứng dụng trong sản xuất thức ăn chăn nuôi
Việc sử dụng enzyme xylanase cho thức ăn của động vật đã thu hút sự
quan tâm của rất nhiều nhà khoa học. Bổ sung enzyme xylanase vào thức ăn
của gà con làm giảm độ nhớt trong ruột gà, tăng hiệu quả hấp thu thức ăn của
gà con và kết quả là cải thiện đáng kể trọng lượng của chúng. Theo Feoli và
cộng sự thì việc bổ xung enzyme xylanase vào bột mì và bột đậu tương trong
Trường ðại Học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp
1
1

thức ăn gia súc với một tỷ lệ nhất định cải thiện được năng suất và khả năng
tiêu thụ thức ăn của lợn.
Các nghiên cứu khác cũng chỉ ra rằng việc bổ sung enzyme xylanase vào thức
ăn chăn nuôi có nguồn gốc từ thực vật (cỏ linh lăng, ngũ cốc ) đã làm tăng
hiệu quả tiêu thụ chất dinh dưỡng và năng suất trong chăn nuôi [34].
2.2.3.4. Ứng dụng trong sản xuất bánh và các ứng dụng khác
Các enzyme xylanase có khả năng cải thiện chất lượng của bánh mì bởi
vì nó làm tăng thể tích của bánh. Chất lượng của bánh được cải thiện tốt hơn
khi sử dụng enzyme xylanase kết hợp với enzyme amylase. Enzyme xylanase

có tính axit từ nấm Aspergillus oryzae được sử dụng để sản xuất các sản phẩm
thương mại truyền thống của Nhật như sake và shoyu koji. Hiện nay một số
enzyme xylanase được thương mại hoá và sử dụng trong công nghệ làm bánh
với các tên như Multifect và Enzeko Novozyme đưa ra một số các enzyme
xylanase mới, có thể là kết hợp với các enzym khác, để cải thiện tính chất của
bột nhào, đặc biệt là trong các nhà máy bánh mỳ [36].
2.3. Lõi ngô - nguồn xylan
Cây ngô (Zea Mays L.) với vai trò là cây lương thực cho con người. Ngô
góp phần nuôi sống gần 1/3 dân số thế giới và là nguồn lương thực không thể
thiếu trong bữa ăn hàng ngày đối với một số nước như Peru, Kenia, Mexico…
Ngô chiếm 17% tổng sản lượng lương thực, là nguồn thức ăn chăn nuôi
(66,8%), nguyên liệu cho ngành công nghiệp (5%), và phục vụ cho xuất khẩu
(hơn 10%). Cây ngô hiện nay đã trở thành cây trồng góp phần đảm bảo an
ninh lương thực, góp phần chuyển đổi cơ cấu nông nghiệp từ trồng trọt sang
chăn nuôi, cung cấp nguyên liệu cho công nghiệp và sản phẩm hàng hóa xuất
khẩu ở nhiều nước trên thế giới.
Trường ðại Học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp
12

Trong những năm qua, cây ngô ở nước ta đã có những bước tiến dài cả
về diện tích, năng suất và sản lượng nhờ ứng dụng khoa học kỹ thuật tiên tiến
trong sản xuất, chuyển đổi cơ cấu giống, thâm canh. Tình hình sản xuất ngô
của nước ta trong những năm gần đây được thể hiện qua bảng 2.7 [24].
Bảng 2.2. Tình hình sản xuất ngô tại Việt Nam (2007 - 2011)
Năm
Di
ện tích
(1000 ha)
Sản lượng
(1000 Tấn)

Năng su
ất
(Tạ/ ha)
2007 1096,1 4303,2 39,3
2008 1140,2 4573,1 40,1
2009 1089,2 4371,7 40,1
2010 1126,9 4606,8 40,9
2011 1082,7 4613,5 43,0
(Nguồn: Niên giám thống kê năm 2011)
Số liệu bảng 2.2 cho thấy diện tích và năng suất và sản lượng ngô của
nước ta từ năm 2007 đến năm 2010 liên tục tăng. Diện tích ngô năm 2011
giảm so với năm 2010 là 44,2 nghìn ha (giảm 3,9%), giảm chủ yếu ở vụ đông
Miền Bắc, nhưng năng suất ngô vẫn đạt 43,0 tạ/ha. Sản lượng ngô năm 2011
vẫn tăng nhẹ so với năm trước. Cùng với sản lượng ngô liên tục tăng đó là
những phế thải mà quá trình sản xuất ngô tạo ra như thân ngô, lá ngô, lõi ngô.
Trong đó lõi ngô chiếm tỷ lệ khá lớn. Hiện nay các giống ngô thường có tỷ lệ
lõi/hạt chiếm từ 30 - 40%. Như vậy với sản lượng ngô khoảng 4,5 triệu tấn
mỗi năm thì lượng lõi ngô thải ra tương đương mỗi năm khoảng 1,35 - 1,8
triệu tấn, đây là một con số rất lớn. Thành phần các hợp chất trong lõi ngô
được thể hiện qua bảng 2.3 [4].
Trường ðại Học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp
13

Bảng 2.3. Thành phần các hợp chất của lõi ngô
STT Thành phần các hợp chất Hàm lượng chất khô %
1 Tro 1,13
2 Các chất hoà tan trong rượu 0,27
Các chất hoà tan trong nước ở 50
o
C

2,41
3
Các chất hoà tan trong nước ở 90
o
C

0,97
4 Các polysaccharide dễ thuỷ phân 38,13
5 Các polysaccharide khó thuỷ phân 34,03
6 Cellulose 31,07
7 Pentozan 35,11
8 Đường 7,91
Nguồn lõi ngô hiện nay được sử dụng trong một số lĩnh vực như tạo
điện năng, tạo bê tông chống thấm, làm phân bón, làm cơ chất để nuôi trồng
một số loại nấm. Tuy nhiên, hiệu quả từ các ngành nghề này đem lại chưa
cao. Vì vậy không những chưa tận dụng được nguồn phế phụ thải này để
mang lại hiệu quả kinh tế mà còn gây ảnh hưởng không ít đến môi trường nếu
lõi ngô không được xử lý (nhất là đối với các vùng trồng ngô tập trung có
diện tích lớn).
Sản lượng ngô ngày càng lớn thì lượng lõi ngô thải ra ngày càng cao.
Việc nghiên cứu và áp dụng sản xuất đường xylose từ lõi ngô không chỉ giúp
tận dụng tốt hơn nguồn phế thải này mà còn góp phần cải thiện kinh tế cho
người trồng ngô, phát triển ngành công nghiệp thực phẩm trong nước, đồng
thời làm giảm thiểu ô nhiễm môi trường [4].
Trường ðại Học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp
14

Theo các nghiên cứu thì lõi ngô chính là nguồn xylan phong phú. Lõi
ngô có hàm lượng xylan khá lớn (khoảng 19 - 23% khối lượng chất khô).

Hàm lượng xylan trong một số loại thực vật được thể hiện qua bảng 2.9 [4,7].
Bảng 2.4. Thành phần hemicellulose trong sinh khối thực vật
Thành phần hemicellulose (% khối lượng khô)
Loại thực vật
Galactan Xylan Arabino Mannan
Thân ngô, lõi ngô khô 1,0 - 1,2 19,0 - 23,0 1,8 - 3,4 0,3 - 0,7
Cỏ Switchgass khô 1,0 - 1,1 23,0 - 25,0 3,0 - 3,4 0,1 - 0,8
Cây gỗ ngắn ngày 0,7 - 1,2 13,0 – 17,0 0,4 - 1,1 0,9 - 1,3
Sợi khô 3,8 25,0 18,0 -
2.4. Giới thiệu chung về ñường xylose
2.4.1. ðặc ñiểm của ñường xylose
Xylose là một đường 5 cacbon, có công thức phân tử là C
5
H
10
O
5
.
Xylose còn có tên gọi là “đường gỗ”, là đường có mặt trong nhiều loại gỗ.
Khi thủy phân hemicellulose trong thân lúa mì người ta thu được 31% xylose,
59% glucose và khoảng vài phần trăm các đường khác (arabinose, galactose,
mannose…). Khi thuỷ phân rơm rạ thu được khoảng 18% pentose và 26,8%
hexose [1]. Công thức cấu tạo của đường xylose được thể hiện ở hình 2.1.

Hình 2.2. Công thức cấu tạo của ñường xylose
Trường ðại Học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp
15

Xylose là thành phần chủ yếu thuộc đường pentose, cùng với glucose
là hai nhóm đường chính thu được khi thủy phân hemicellulose trong

nguyên liệu gỗ và chất thải nông nghiệp. Khi thủy phân hemicellulose bằng
axit có thể giải phóng ra nhiều loại đường khác nhau ngoài đường xylose
như D - galactose, D - glucose, D - mannose và L - arabinose. Kèm theo đó
còn là các sản phẩm thủy phân khác như fucfural, 5 - hydroxymethyl
fucfural, axit acetic, axit syringic [28].
Khi một chuỗi các nhóm xylose liên kết với nhau qua liên kết β - (1 - 4)
glycoside và phân nhánh bởi các chuỗi carbonhydrate ngắn như axit D -
glucuronic hoặc đồng phân của nó 4 - O - methylether, α - arabinose hoặc các
Oligosaccharide tạo thành từ D - xylose, L - arabinose, D - hay L - galactose
và D - glucose sẽ tạo thành xylan. Cấu tạo của xylan được thể hiện qua hình
2.2.

Hình 2.3. Công thức cấu tạo của xylan
Xylan là thành phần chính cấu tạo nên hemicellulose. Xylan được tìm
thấy chủ yếu trong cấu trúc thứ cấp của thành tế bào thực vật và tạo thành pha
giữa giữa lignin và các hợp chất polysaccharide khác .
Xylan gồm nhiều loại khác nhau, có thể được chia thành homoxylan và
heteroxylan bao gồm: glucuronoxylan, (arabino) glucuronoxylan, (glucurono)
arabinoxylan, arabinoxylan và tổ hợp heteroxylan. Homoxylan có cấu tạo bao
gồm các xylopyranose được liên kết với nhau bởi liên kết β - (1 - 3) glycoside
hoặc hỗn hợp β - (1 - 3, 1 - 4) glycoside. Cấu tạo kiểu homoxylan được tìm
thấy trong tảo biển Palmariales và Nemaliales. Heteroxylan có cấu tạo là các