Tài liệu Tuyển chọn chủng vi sinh vật có khả năng phân giải xenluloza cao cho sản xuất chế phẩm xử lý phế thải chăn nuôi dạng rắn pptx

TUYN CHN CHNG VI SINH VT Cể KH NNG PHN GII
XENLULOZA CAO CHO SN XUT CH PHM X Lí PH THI
CHN NUễI DNG RN
Phm Bớch Hiờn, o Vn Thụng,
Lng Hu Thnh, V Thỳy Nga.
SUMMARY
Selection microorganism able high decompose of xenluloza for production inoculant
treatments of solid waste livestock.
Selection microorganisms able high decompose of xenluloza will play an important role in the
production inoculant for treatment of solid waste livestock. This paper showed that the strain of
microorganisms signed PTCX04 was selected. It can be decomposed of pig manure. By colony
characteristic, cell morphology, and sequencing of DNA fragment of 16S rRNA gene the PTCN04
strain was determined as Streptomyces rochei. According to European Community, species are
selected have high biosafety and they are permission to apply in common. The Streptomyces
rochei will be continuous research to apply for production of inoculant.
Keywords: Xenluloza, Streptomyces rochei, innoculant.
I. ĐặT VấN Đề
S liu c tớnh n gia sỳc, gia cm
ca Vit Nam thi ra khong 539.733,15
tn cht thi rn/ngy, trong ú khong
50% c x lý bng phng phỏp truc
khi bún rung, phn cũn li c s dng
ngay hoc cho thi trc tip ra mụi trng
gõy nhiu vn ụ nhim lm lõy lan
ngun bnh nh hng n sc khe cng
ng cng nh chớnh ngnh chn nuụi. Ph
thi chn nuụi, ngoi hm lng dinh
dng cũn cha khong 20 - 30% cỏc hp
cht hydratcacbon m cõy trng khụng s
dng c, trong ú xenluloza chim t l
cao nht. Phõn gii xenluloza t nhiờn l

quỏ trỡnh phc tp, thng kộo di 3 - 6
thỏng. Trong cỏc bin phỏp x lý ph thi
chn nuụi hin nay, phng phỏp nhanh
cú s tr giỳp ca vi sinh vt khi ng cú
kh nng sinh enzym xenlulaza ngoi bo
em li hiu qu cao nht. Nghiờn cu
Tuyn chn chng vi sinh vt cú kh nng
phõn gii xenluloza cao s dng trong
sn xut ch phm vi sinh vt x lý nhanh
ph thi chn nuụi nhm mc tiờu rỳt ngn
thi gian , hn ch ụ nhim mụi trng,
to ra sn phNm phõn bún hu c cú cht
lng, ỏp ng yờu cu qun lý tng hp
dinh dng cõy trng v phỏt trin nụng
nghip bn vng.
II. Vật liệu và phơng pháp nghiên cứu
1. Vt liu nghiờn cu
- B chng ging VSV phõn gii
xenluloza cú ký hiu t PTCX01 - PTCX10
c lu gi ti Vin Mụi trng N ụng
nghip.
- Húa cht v cỏc thit b cn thit trong
phõn tớch, ỏnh giỏ VSV.
2. Phng phỏp nghiờn cu
+ Phng phỏp xỏc nh kh nng phõn
gii xenluloza
- Phng phỏp nh tớnh: S dng
phng phỏp khuych tỏn trờn thch a
Enzym xenlulaza thy phõn CMC trong
mụi trng s to thnh vũng khụng mu

vi thuc th lugol quanh ging cha dch
enzym. Hot lc enzym ca VSV c biu
th bng giỏ tr D - d (mm) trong ú: D l
ưng kính vòng thy phân và d là ưng
kính ca l khoan.
- Phương pháp nh lưng: Da trên
nguyên tc xác nh hot lc enzym C
1
và
C
x
xúc tác phn ng phân ct bt giy hoc
CMC thành các gc ưng kh.
- nh lưng ưng kh: Xác nh
bng thuc th DN SA.
+ Phương pháp xác nh tên vi sinh vt
bng k thut phân t
nh tên VSV bng phương pháp phân
loi hc phân t da trên cơ s gii trình t
on gien 16s ARN riboxom ca chng
nghiên cu, so sánh vi các trình t có sn
trong N gân hàng Gien Quc t EMBL bng
phương pháp FASTA 33  nh loi n
loài. Cp mi ưc thit k da trên trình t
on gien mã hóa 16s ARN riboxom ca
chng E. coli (J01695), tương ng vi các
v trí nucleotit 15 - 33 (cho mi xuôi) và
1548 - 1532 (cho mi ngưc). Trình t
nucleotit ca các chng nghiên cu ưc
gii trình trên máy t ng ABI - 377, sau

ó ưc x lý bng chương trình
SeqEd1.03 và chương trình AssemblyLIGN
1.9 trong h chương trình MacVector 6.5.3.
Truy cp N gân hàng Gien bng chương
trình Entrez/nucleotide/ tìm kim các trình
t gien 16s ARN riboxom ca VSV. So
sánh i chiu và x lý s liu ca tt c
các chui bng chương trình GEN DOC2.5.
Thành phn nucleotit ưc thu nhn bng
cách s dng b mã ca VSV bc thp (vi
khuNn) trong N gân hàng Gien (bng mã di
truyn s 11) thông qua chương trình
GEN DOC 2.5. Tên VSV ưc xác nh vi
xác sut tương ng cao nht.
III. KÕt qu¶ vµ th¶o luËn
1. Tuyển chọn chủng vi sinh vật có khả
năng phân giải xenluloza cao
1.1. Xác định định tính khả năng
phân giải xenluloza
T b chng ging VSV ưc phân lp,
lưu gi bo qun ti B môn Sinh hc môi
trưng - Vin Môi trưng Nông nghip, ã
xác nh nh tính và tuyn chn chng có
kh năng phân gii xenluloza cao.
Bảng 1. Tuyển chọn vi sinh vật phân giải xenluloza.
STT

Ký hiệu chủng

Nguồn gốc Nhóm VSV

Đương kính vòng phân giải xenluloza (D-d)mm

1 PTCX01 Phân lập từ đất Vi khuẩn 17,0
2 PTCX02 - nt - Vi khuẩn 20,0
3 PTCX03 - nt - Xạ khuẩn 15,0
4 PTCX04 - nt - Xạ khuẩn 30,0
5 PTCX05 Từ phế thải chăn nuôi

Xạ khuẩn 23,0
6 PTCX06 - nt - Vi khuẩn 21,0
7 PTCX07 - nt - Vi khuẩn 15,0
8 PTCX08 Phân lập từ đất Xạ khuẩn 13,0
9 PTCX09 - nt - Xạ khuẩn 18,0
10 PTCX10 - nt - Vi khuẩn 17,0

Trong 10 chng VSV nghiên cu có 5
chng thuc nhóm vi khuNn và 5 chng thuc
nhóm x khuNn. Tt c các chng u có hot
tính phân gii xenluloza. Chng PTCX08 có
hot lc enzym xenlulaza thp nht (t
13,0mm), cao nht là chng x khuNn
PTCX04 (t 30,0mm). Các chng còn li có
ưng kính vòng phân gii xenluloza (D - d)
trung bình t 17,0 n 23,0mm. T kt qu
nghiên cu,  tài ã la chn ưc 1 chng
x khuNn ký hiu PTCX04 s dng cho các
nghiên cu tip theo.
1.2. Định lượng hoạt độ xenlulaza
của chủng xạ khuẩn PTCX04.

Xenlulaza là mt phc h enzym bao
gm 3 enzym ch yu sau: Endo-1,4-
glucanaza (hay CMC-aza, C
x)
,

Exo-1,4-
glucanaza (hay xenlobiohydrolaza, C
1
) và
β- 1,4-glucanaza (hay xenlobiaza). Nhng
enzym này hot ng cùng nhau  thy
phân xenluloza (Bng 2).
Bảng 2. Kết quả xác định hoạt độ enzime
của chủng PTCX04.
Hoạt tính Mật độ
(OD
540nm
)
Hoạt lực
enzyme (U/ml)
Endo-glucanase

0,84 5,32
Exo-glucanase 0,23 0,41
Kt qu nh lưng và nh tính khng
nh chng x khuNn PTCX04 có hot tính
phân gii xenluloza cao.

Dch enzyme ngoi

bào ca chng PTCX04 có kh năng thy
phân c 2 loi cơ cht CMC và bt giy, do
ó có th s dng tt cho sn xut ch
phNm VSV x lý ph thi chăn nuôi giàu cơ
cht xenluloza.
2. Đặc điểm sinh hóa của chủng vi sinh
vật nghiên cứu
- c im sinh lý, hình thái: KhuNn lc
PTCX04 nuôi cy trên môi trưng Gauze có
hình tròn, ưng kính 2,2 - 2,5mm, màu trng
ngà, chân khuNn lc bám sâu trong môi
trưng. Nuôi cy lc trên môi trưng dch th,
sau 72 gi to thành ht nh kích c khong 1
mm, làm trong môi trưng nuôi cy, trên
thành bình to vòng váng màu trng, bám
cht vào thành bình, mt  t bào t 2.10
9
CFU/ml, hot  enzyme là 3,0mm. Sau 3
tháng lưu gi, mt  t bào t 3,6.10
8
, hot
 enzym là 2,8mm (Bng 3).
Bảng 3. Các điều kiện nuôi cấy thích hợp
cho hoạt tính sinh xenlulaza của chủng
PTCX04
Điều kiện nuôi cấy Kết quả xác định
Nhiệt độ thích hợp 35±2
Phổ pH 6,0 - 7,5
Nhu cầu O
2

(Lưu lượng cấp
khí (dm
3
O
2
/dm
3
môi trường/h)

0,75
Thời gian nuôi cấy (h) 72
Nguồn hydratcacbon CMC, bột giấy, tinh
bột, rỉ đường
Nguồn Nitơ Pepton, cao nấm men

3. Thử nghiệm sử dụng chủng PCTX04
trong ủ, xử lý phế thải chăn nuôi
Th nghim kh năng ng dng chng
PCTX04 trong , x lý ph thi chăn nuôi.
o nhit  ng  theo thi gian, sau 21
ngày xác nh mt s c im lý hoá ca
phân   ánh giá kh năng chuyn hoá
cht hu cơ trong ph thi chăn nuôi.
Biểu đồ 1. Biến động nhiệt độ trong khối ủ phế thải chăn nuôi lợn
0
10
20
30
40
50

60
70
0 giờ 2 ngày 7 ngày 9 ngày 15 ngày 17 ngày 21 ngày
Thời gian
Nhiệt độ
Đối chứng
Thí nghiệm

Biểu đồ 1. Biến động nhiệt độ trong khối ủ phế thải chăn nuôi lợn
Bảng 4. Biến đổi thành phần lý, hóa học của phế thải chăn nuôi lợn
được xử lý bằng chủng PTCXO4
Công thức
Định tính sự biến đổi lý học
Hàm lượng OC
tổng số (%)
Thành phần cơ giới Màu sắc Mùi
Trước xử lý Bết, không xốp Vàng Hôi 45,5
Sau xử lý Tơi xốp Nâu sẫm Không còn mùi 25,7
Bảng 5. Quần thể vi sinh vật gây bệnh trong phế thải chăn nuôi lợn
được xử lý bằng chủng PTCXO4
Công thức Định tính sự biến đổi lý học Trứng giun (trứng/gr)
Coliform (CFU/g) Salmonella (CFU/g)
0 giờ Sau 21 ngày 0 giờ Sau 21 ngày 0 giờ Sau 21 ngày
Đối chứng 5,2 x10
5
2,2 x10
3
6,3 x10
3
1,6x10

2
15 10
Thí nghiệm 5,2 x10
5
- 6,3 x10
3
- 15 0
( - ): Không phát hin  nng  pha loãng 10
- 1

B sung chng PTCX04 trong ng 
ã em li hiu qu rõ rt trong x lý ph
thi chăn nuôi ln. Ch s OC ca ph thi
chăn nuôi ln t 45,5% gim xung còn
25,7%. Trong quá trình chuyn hoá các hp
cht hydratcacbon, nhit  tăng cao không
nhng làm rút ngn thi gian , tăng hiu
qu chuyn hoá cơ cht, to sn phNm sau
x lý tơi xp, chuyn sang màu nâu sm,
không còn mùi hôi mà còn giúp loi b các
yu t sinh hc gây hi.
4. Định danh chủng xạ khuẩn nghiên cứu
*. Gii trình t gen chng x khuNn PTCX04.
GAAAGCTCCGGCGGTGCAGGATGAGCCCGCGGCCTATCAGCTTGTTGGTGAGGTAATGGCTCACCAAGGC
GACGACGGGTAGCCGGCCTGAGAGGGCGACCGGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGG
GAGGCAGCAGTGGGGAATATTGCACAATGGGCGCAAGCCTGATGCAGCGACGCCGCGTGAGGGATGACGG
CCTTCGGGTTGTAAACCTCTTTCAGCAGGGAAGAAGCGAAAGTGACGGTACCTGCAGAAGAAGCGCCGGC
TAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGGCGCAAGCGTTGTCCGGAATTATTGGGCGTAAAGAG
CTCGTAGGCGGCTTGTCGCGTCGGTTGTGAAAGCCCGGGGCTTAACCCCGGGTCTGCAGTCGATACGGGCA
GGCTAGAGTTCGGTAGGGGAGATCGGAATTCCTGGTGTAGCGGTGAAATGCGCAGATATCAGGAGGAACA

CCGGTGGCGAAGGCGGATCTCTGGGCCGATACTGACGCTGAGGAGCGAAAGCGTGGGGAGCGAACAGGAT
TAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGGTGGGCACTAGGTGTGGGCAACATTCCACGTTGTCCGTGCC
GCAGCTAACGCATTAAGTGCCCCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGCTAAAACTCAAAGGAATTGACGGG
GGCCCGCACAAGCGGCGGAGCATGTGGCTTAATTCGACGCAACGCGAAGAACCTTACCAAGGCTTGACAT
ACACCGGAAAACCCTGGAGACAGGGTCCCCCTTGTGGTCGGTGTACAGGTGGTGCATGGCTGTCGTCAGCT
CGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTGTCCCGTGTTGCCAGCAGGCCCTTG
TGGTGCTGGGGACTCACGGGAGACCGCCGGGGTCAACTCGGAGGAAGGTGGGGACGACGTCAAGTCATCA
TGCCCCTTATGTCTTGGGCTGCACACGTGCTACAATGGCCGGTACAATGAGCTGCGATACCGCGAGGTGGA
GCGAATCTCAAAAAGCCGGTCTCAGTTCGGATTGGGGTCTGCAACTCGACCCCATGAAGTCGGAGTCGCTA
GTAATCGCAGATCAGCATTGCTGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCG
CCCGTCACGTCACGAAAGTCGGTAACACCCGAAGCCGGTGGCCCAACCCCTTGTGGGAGG
GAGCTGTCGAAGGTGGGACTGGCGATTGGGACGAAGTCGTAACAAGGTAGCCGTACCGGA
AGGTGCGGCTGGATCACCTCCTTT











Vị trí phân loại của chủng PTCX04 và các loài có quan hệ họ hàng gần dựa vào trình tự
ADr 16S vùng V1 - V3 (vị trí 968 - 1401 của E. coli)
* Xác nh tên: Trình t gen rARN 16S
ca chng PTCX04 tương ng 99,7%
(1297 - 1296/1300 bp) vi on 16S ca x
khuNn Streptomyces aurantiogriseus,

Streptomyces levis, Streptomyces
djakartensis, Streptomyces rochei,
Streptomyces mutabilis, Streptomyces
fungicidicus, Streptomyces anandii,
Streptomyces geysiriensis, Streptomyces
tuirus, Streptomyces gancidicus
.
Da vào kt qu xác nh trình t gen
và c im sinh hóa ca x khuNn nghiên
cu, chng PTCX04 có c im trùng vi
chng x khuNn có tên là Streptomyces
rochei.
5. Xác định mức độ an toàn sinh học
Theo Hưng dn s 90/679/EWG ca
Cng ng châu Âu v an toàn sinh hc,
nhóm tác nhân sinh hc ưc phân làm 4
cp  an toàn, trong ó ch các VSV  cp
 1 và 2 ưc ng dng trong sn xut 
iu kin bình thưng. Mc an toàn sinh
hc 1 - 4 là các mc an toàn sinh hc
chung, ch yu cho các tác nhân sinh hc
như vi khuNn, virut, nm, ký sinh trùng (k
c có và không có bin i gien).
Kt qu i chiu vi danh mc cho
thy chng x khuNn phân gii xenluloza
Streptomyces rochei ưc xp vào nhóm
VSV có  an toàn sinh hc mc 2, có th
ng dng rng rãi trong sn xut ch phNm
vi sinh vt x lý nhanh ph thi chăn nuôi.
IV. KÕt luËn

- ã tuyn chn ưc chng x khuNn
có hot tính phân gii xenluloza cao, các
c im sinh hc thích hp cho s dng
sn xut ch phNm VSV, bưc u ng
Kitasatos
poria setalba_U93332
Streptomyces virens_DQ442554
Streptomyces asterosporus_ AY999902
Streptomyces gancidicus_ AY999919
Streptomyces tuirus_AF503493
Streptomyces geysiriensis_ DQ442501
Streptomyces anandii_AY999803
Streptomyces fungicidicus_ AB184529
Streptomyces mutabilis_ EU741237
Streptomyces rochei_GQ392058
PTCX04

Streptomyces aurantiogriseus_ AY999793
Streptomyces naganishii_ DQ442529
Streptomyces shandongensis_ AY875718
Streptomyces djakartensis_ AB184657
Streptomyces lavendulocolor_ DQ442516
Streptomyces minutiscleroticus_ EF178696
Streptomyces levis_DQ442517
0.01
dng cho thy chng vi sinh vt này có hiu
qu trong x lý ph thi dng rn trong
chăn nuôi gà, ln.
- Kt qu phân loi xác nh chng x
khuNn tuyn chn thuc loài Streptomyces

rochei, ưc xp vào nhóm vi sinh vt có
 an toàn sinh hc mc 2, có th ng dng
rng rãi trong sn xut ch phNm vi sinh vt
x lý nhanh ph thi chăn nuôi.
TÀI LIỆU THAM KHẢO
1. Ajay (EDT) Singh, Owen P. (EDT)
Ward (2004), Biodegradation and
Bioremediation, Springer 57 - 74.
2. Coughlan, M. and Mayer F. (1998),
Cellulose decomposing bacteria and
their enzyme system. The procayotes,
chapter 20, 460 - 502
3. Gaur A. C. (1980), Microbial
decomposition of organic matterial and
humus in soil and compost,
FAO/UNDP, Technology composting.
4. Holt J. G., Krieg N. R., Sneath P. H. A,
Staley J. T., Williams S. T. (2000),
Bergey’s Manual of Determinative.,
Bacteriology, 9
th
Edition, Lippincott
Williams & Wilkins, (4),
5. Meinke A., Gilkes N. R., Kilburn D.
G., Miller R. C., Jr. and Warren R. A. J.
(1993), “Cellulose - binding
polypeptides from Cellulomonas fimi:
endoglucanase D (CenD), a family A α
- 1,4 - glucanase”, J. Bacteriol, (175),
pp. 1910 - 1918.

6. Smith, R. C. (1995), Composting
practices, NDSU Extension Service.
North Dakota State University of
Agriculture and Applied Science, and
USDA.
7. TCVN 6168:2002, Chế phm vi sinh
vật phân giải xenluloza.
Người phản biện
GS. TSKH. Trần Duy Quý
T¹p chÝ khoa häc vµ c«ng nghÖ n«ng nghiÖp ViÖt Nam
7