Nghiên cứu xác định bệnh virus đậu đỏ tại hải phòng năm 2013

50

BỘ GIÁO DỤC VÀ ðÀO TẠO
TRƯỜNG ðẠI HỌC NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI









NGUYỄN ðỨC HOAN



NGHIÊN CỨU XÁC ðỊNH BỆNH VIRUS ðẬU ðỖ
TẠI HẢI PHÒNG NĂM 2013



CHUYÊN NGÀNH : BẢO VỆ THỰC VẬT
MÃ SỐ : 60.62.10



NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:
TS. HÀ VIẾT CƯỜNG

HÀ NỘI - 2013


Trường ðại Học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp

i

LỜI CAM ðOAN

Tôi xin cam đoan, các số liệu và kết quả nghiên cứu trình bày trong luận văn
này là trung thực và chưa được sử dụng để bảo vệ một học vị nào.
Tôi xin cam đoan, mọi sự giúp đỡ cho việc thực hiện luận văn này đã được
cám ơn và các thông tin trích dẫn trong luận văn đều đã được chỉ rõ nguồn gốc.
Hà Nội, ngày … tháng … năm 2013
Tác giả


Nguyễn ðức Hoan
Trường ðại Học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp

ii

LỜI CẢM ƠN

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành và sâu sắc tới TS. Hà Viết Cường. Thầy
ñã luôn tận tình chỉ bảo, hướng dẫn tôi trong suốt quá trình thực hiện ñề tài và hoàn
thành luận văn tốt nghiệp của mình.
Tôi xin chân thành cảm ơn các thầy, cô giáo Khoa Sau ðại học; Khoa Nông
học và ñặc biệt là các thầy, cô giáo, các cán bộ nhân viên Bộ môn Bệnh cây - Trường
ðH Nông Nghiệp Hà Nội ñã tạo ñiều kiện thuận lợi cho tôi trong thời gian thực hiện

ñề tài và hoàn thành luận văn tốt nghiệp.
Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn tới gia ñình, bạn bè ñã nhiệt tình giúp ñỡ, cộng tác
và khích lệ tôi thực hiện ñề tài tốt nghiệp này.
Hà Nội, ngày … tháng … năm 2013
Tác giả


Nguyễn ðức Hoan
Trường ðại Học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp

iii

MỤC LỤC
Lời cam đoan………………………………………………………………… i
Lời cảm ơn………………………………………………………………… ii
Mục lục………………………………………………………………………iii
Danh mục bảng……………………………………………………………….vi
Danh mục đồ thị…………………………………………………………… vii
Danh mục viết tắt………………………………………………………… viii
1. MỞ ðẦU 50
1.1. Đặt vấn đề 1
1.2. Mục đích và yêu cầu của đề tài 2
2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3
2.1. Bệnh virus hại cây họ đậu 3
2.1.1. Soybean mosaic virus (SMV, chi Potyvirus) 3
2.1.2. Bean common mosaic virus (BCMV, chi Potyvirus) 6
2.1.3. Các begomovirus gây hại cây họ đậu 10
2.2. Những nghiên cứu về bệnh virus hại cây họ đậu tại Việt Nam 12
3. VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 14
3.1. Đối tượng, địa điểm và thời gian nghiên cứu 14

3.1.1. Đối tượng nghiên cứu 14
3.1.2. Địa điểm nghiên cứu 14
3.1.3. Thời gian nghiên cứu 14
3.2. Vật liệu nghiên cứu 14
3.3. Nội dung nghiên cứu 15
3.3.1. Phương pháp nghiên cứu 15
3.3.2. Phương pháp kiểm tra virus bằng PCR 18
4. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 21
4.1. Điều tra bệnh virus hại cây họ đậu tại Hải Phòng năm 2013 21
Trường ðại Học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp

iv

4.2. Xác định virus bằng ELISA từ các mẫu đậu đỗ thu tại Hải
Phòng năm 2013 28
4.3. Xác định begomovirus bằng PCR các mẫu đậu đỗ thu tại Hải
Phòng năm 2013 51
4.3.1. Phát hiện begomovirus bằng PCR 51
4.3.2. Phát hiện legumovirus bằng PCR …………………………………52
4.3.3. Phát hiện KuMV bằng PCR 55
4.3.4. Phát hiện MYMV bằng PCR 57
4.4. Kiểm tra ELISA phát hiện một số virus truyền qua hạt đậu đỗ
nhập khẩu
60
4.5. Kiểm tra ELISA 62
5. KẾT LUẬN VÀ ðỀ NGHỊ 66
TÀI LIỆU THAM KHẢO 68

Trường ðại Học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp

v

DANH MỤC BẢNG

Bảng 3.1. Các kít ELISA phát hiện virus đậu đỗ (Viện DSMZ) 16
Bảng 3.2. Các mồi được sử dụng trong nghiên cứu 19
Bảng 4.1. Điều tra bệnh virus trên đậu tương tại Hải Phòng năm 2013 23
Bảng 4.2. Điều tra bệnh virus trên đậu xanh tại Hải Phòng năm 2013 25
Bảng 4.3. Điều tra bệnh virus trên đậu đen tại Hải Phòng năm 2013 26
Bảng 4.4. Phát hiện các potyvirus (chi Potyvirus) trên các mẫu đậu đỗ
thu tại Hải Phòng năm 2013 30
Bảng 4.5. Phát hiện các comovirus (chi Comovirus) trên các mẫu đậu đỗ
thu tại Hải Phòng năm 2013 34
Bảng 4.6. Phát hiện các luteovirus (họ Luteoviridae) trên các mẫu đậu đỗ
thu tại Hải Phòng năm 2013 38
Bảng 4.7. Phát hiện các carlavirus (họ Betaflexiviridae ) trên các mẫu
đậu đỗ thu tại Hải Phòng năm 2013 41
Bảng 4.8. Phát hiện CMV (Cucumber mosaic virus) trên các mẫu đậu đỗ
thu tại Hải Phòng năm 2013 44
Bảng 4.9. Phát hiện TMV, CPMoV, SBMV trên các mẫu đậu đỗ thu tại
Hải Phòng năm 2013 47
Bảng 4.10. PCR phát hiện begomovirus trên các mẫu đậu đỗ thu tại Hải
Phòng năm 2013 dùng cặp mồi chung BegoAFor1/BegoARev1 52
Bảng 4.11. PCR phát hiện legumovirus trên các mẫu đậu đỗ thu tại Hải
Phòng năm 2013 dùng cặp mồi chung LegA-cpF1 và LegA-
cpR1 54
Bảng 4.12. PCR phát hiện Kudzu mosaic virus (KuMV) trên các mẫu
đậu đỗ thu tại Hải Phòng năm 2013 dùng cặp mồi đặc hiệu
KuA-For1 và KuA-Rev1 56
Trường ðại Học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp

vi

Bảng 4.13. PCR phát hiện Mungbean yellow mosaic virus (MYMV) trên
các mẫu đậu đỗ thu tại Hải Phòng năm 2013 dùng cặp mồi đặc
hiệu MyA-For1 và MyA-Rev1 59
Bảng 4. 14. Danh lục các mẫu đậu đỗ thu thập tại các cửa khẩu cảng biển
Hải Phòng 60
Bảng 4.15. Kiểm tra ELISA phát hiện BCMV (Bean common mosaic
virus) chủng BlCMV trên các mẫu đậu đỗ thu thập tại các cửa
khẩu cảng biển Hải Phòng
63
Bảng 4.16. Kiểm tra ELISA phát hiện BYMV (Bean yellow mosaic
virus) chủng BlCMV trên các mẫu đậu đỗ thu thập tại các cửa
khẩu cảng biển Hải Phòng
64

Bảng 4.17. Kiểm tra ELISA phát hiện CMV (Cucumber mosaic virus)
trên các mẫu đậu đỗ thu thập tại các cửa khẩu cảng biển Hải
Phòng 65



Trường ðại Học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp

vii

DANH MỤC HÌNH

Hình 4.1. Điều tra bệnh virus trên đậu đỗ tại Hải Phòng, 2013 22

Hình 4.2. Triệu chứng bệnh virus trên đậu tương Hải Phòng: 24
Hình 4.3. Triệu chứng bệnh virus trên đậu xanh Hải Phòng: Khảm 25
Hình 4.4. Triệu chứng bệnh virus trên đậu đen Hải Phòng 27
Hình 4.5. Triệu chứng bệnh khảm lá virus trên đậu đũa Hải Phòng 27
Hình 4.6. Kiểm tra ELISA phát hiện virus trên mẫu đậu đỗ thu tại Hải
Phòng 2013……………………………………………………… 28
Hình 4.7. PCR phát hiện begomovirus trên các mẫu đậu đỗ thu tại Hải
Phòng năm 2013 dùng cặp mồi chung BegoAFor1/BegoARev1 53
Hình 4.8. PCR phát hiện legumovirus trên các mẫu đậu đỗ thu tại Hải Phòng
năm 2013 dùng cặp mồi chung LegA-cpF1 và LegA-cpR1 55
Hình 4.9. PCR phát hiện Kudzu mosaic virus (KuMV) trên các mẫu đậu
đỗ thu tại Hải Phòng năm 2013 dùng cặp mồi đặc hiệu KuA-
For1 và KuA-Rev1
57
Hình 4.10. Cây sắn dây nhiễm KuMV cạnh ruộng đậu tương nhiễm
KuMV tại Hải Phòng (ảnh giữa). Triệu chứng nhiễm KuMV trên
đậu tương (ảnh trái) và trên sắn dây (ảnh phải) 57
Hình 4.11. Thu thập và phân loại mẫu hạt đậu đỗ nhập khẩu thu thập tại
cảng Hải phòng 61
Hình 4.12 . Chuẩn bị mẫu kiểm tra ELISA mậu đậu đỗ nhập khẩu 61
Hình 4.13: Kiểm tra ELISA phát hiện virus trên đậu đỗ nhập khẩu 62

Trường ðại Học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp

1

1. MỞ ðẦU
1.1. ðặt vấn ñề
Cây đậu đỗ (Fabaceae) là nhóm cây trồng quan trọng của Việt Nam và
thế giới do có hàm lượng dinh dưỡng, đặc biệt là protein cao. Cây họ đậu, tùy

theo loài, có thể được sử dụng như cây rau, cây công nghiệp, thậm chí cây
dược liệu. Ngoài tác dụng về dinh dưỡng, cây họ đậu là cây trồng duy nhất có
tác dụng cải tạo đất, làm tăng độ màu mỡ cho đất nông nghiệp.
Một trong những yếu tố chính hạn chế năng suất đậu đỗ là sâu bệnh hại,
trong đó có các bệnh về virus. Thành phần virus hại cây họ đậu rất đa dạng.
Trên thế giới, ít nhất 76 virus thuộc các loài khác nhau đã được xác định gây
hại trên cây họ đậu (CABI, 2007).
Ở Việt Nam, cho tới nay có rất ít các công bố về thành phần virus
nhiễm trên cây họ đậu. Đầu tiên là một nghiên cứu dựa trên phân tích miễn
dịch liên kết men (Enzyme Liked Immunosorbent Assay - ELISA) và giải
trình tự từ các mẫu hạt giống đậu đỗ thu thập ở miền Bắc Việt Nam. Dựa trên
nghiên cứu này, các tác giả (Ngô Bích Hảo và cs, 2003) đã xác nhận sự có
mặt của Bean common mosaic virus (BCMV) trên hạt đậu (Vigna
unguiculata) và cho thấy tỷ lệ hạt đậu nhiễm virus là từ 0,8 tới 12,4 %.
Nghiên cứu thứ hai là các phân tích trình tự gen từ 9 mẫu BCMV phân lập từ
các cây họ đậu biểu hiện triệu chứng bệnh như đậu đen, đậu đỏ, đậu đũa, đậu
tương và muồng 3 lá (một cây che phủ cà phê) thu thập tại nhiều tỉnh ở Việt
Nam (Hà Viết Cường và cs, 2008). Gần đây hơn, một begomovirus là Kudzu
mosaic virus (KuMV) cũng mới được phát hiện thấy gây hại trên cây đậu
tương tại miền Bắc Việt Nam (Hà Viết Cường, 2011).
Tuy nhiên, trên đồng ruộng triệu chứng nhiễm virus thường quan sát thấy
trên các cây họ đậu. Việc xác định thành phần bệnh virus hại cây họ đậu là
Trường ðại Học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp

2

yêu cầu quan trọng nhằm cung cấp thông tin khoa học cho công tác phòng
chống như xây dựng và điều chỉnh danh mục đối tượng kiểm dịch thực vật và
tạo giống kháng bệnh.
Xuất phát từ tình hình thực tiễn trên, được sự phân công của Bộ môn Bệnh

cây, Khoa Nông học, Trường Đại học Nông nghiệp Hải Phòng, dưới sự hướng
dẫn của TS. Hà Viết Cường, chúng tôi tiến hành nghiên cứu, thực hiện đề tài:
“Nghiên cứu xác ñịnh bệnh virus hại ñậu ñỗ tại Hải Phòng năm 2013”

1.2. Mục ñích và yêu cầu của ñề tài
1.2.1. Mục ñích
Xác định thành phần bệnh virus trên cây họ đậu tại Hải Phòng.
1.2.2. Yêu cầu
- Điều tra tình hình bệnh virus hại cây họ đậu tại một số vùng thuộc Hải
Phòng năm 2013.
- Thu thập mẫu bệnh virus tại một số vùng thuộc Hải Phòng và phụ cận
năm 2013
- Mô tả các dạng triệu chứng bệnh trên cây họ đậu do virus gây ra.
- Xác định bệnh virus trên cây họ đậu bằng phản ứng ELISA và PCR
(Polymerase chain reaction).

Trường ðại Học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp

3

2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1. Bệnh virus hại cây họ ñậu
Theo Iwaki (1992), cây đậu tương ở các nước Đông Nam Á bị 13 loài
virus gây hại, trong đó virus khảm lá đậu tương (soybean mosaic virus, SMV)
là virus phổ biến và có ý nghĩa kinh tế nhất.
Theo Schwartz (2005), ở Hoa Kỳ và nhiều nước trên thế giới có khoảng
27 loại virus khác nhau gây hại trên đậu đỗ (Phaseolus vulgaris L.).
Theo CABI (2007), có tới 76 virus gây hại trên cây họ đậu lan truyền
bằng nhiều hình thức khác nhau, trong đó các virus thuộc hai chi chiếm số

lượng lớn nhất là Chi Potyvirus, họ Potyviridae (13 virus) và chi
Begomovirus, họ Geminiviridae (8 loài).
2.1.1. Soybean mosaic virus (SMV, chi Potyvirus)
2.1.1.1. Lịch sử nghiên cứu và phân bố ñịa lý
Bệnh được Clinton (1915), Gardener & Kendrick (1921) phát hiện, quan
sát và mô tả lần đầu tiên ở bang Connecticut thuộc Mỹ (Brunt và cs, 1996).
SMV có mặt ở hầu hết các vùng trồng đậu tương trên thế giới như ở Châu
Á (Trung Quốc, Ấn Độ, Thái Lan, Philippines ), Châu Phi (Ethiopia,
Uganda ), Bắc Mỹ (Mỹ, Canada ), ở Trung Mỹ (Jamaica), Nam Mỹ
(Argentina, Brazil …), Châu Âu (Đức, Hà Lan …), Châu Đại Dương
(Australia, New Zealand) (CABI, 2010a).
2.1.1.2.Phân loại và danh pháp:
Virus có ARN sợi đơn dương (ssRNA), họ Potyviridae, giống Potyvirus,
loài Soybean mosaic potyvirus, ngoài ra virus còn có một số tên khác như
Soja virus 1, Soybean virus 1.
Trường ðại Học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp

4

Tên thường dùng Soybean mosaic virus, viết tắt SMV.
SMV và các Potyvirus như Cowpea aphid-borne mosaic virus,
Passionfruit woodiness virus, Zucchini yellow mosaic virus) hiện nay được
coi là có liên quan chặt chẽ đến BCMV và BCMNV nhưng vẫn được phân
loại là loài riêng biệt như là Bean yellow mosaic, sugarcane mosaic virus và
Potato Y viruses (trong đó PVY là một thành viên của chi) (CABI, 2010a).
Tuy nhiên các virus Azuki bean mosaic, Blackeye cowpea mosaic và Peanut
stripe viruses, và các mẫu phân lập SMV ở Đài Loan được coi là có liên quan
đến các chủng của BCMV (McKern và cs, 1992; Vetten và cs, 1992). Do vậy
để xác định các Potyvirus và để chẩn đoán những bệnh do chúng gây ra cần
sử dụng những phương pháp chẩn đoán phức tạp như sử dụng kháng thể đơn

dòng, giải trình tự gen, chính dựa trên các kỹ thuật này mà khi so sánh trình tự
gen của Peanut stripe virus người ta thấy chúng có liên quan mật thiết đến
SMV (Gunasinghe và cs, 1994).
Dựa vào xác định trình tự gen của vỏ protein người ta có thể phân biệt
được các virus với nhau, nhưng vỏ protein không phải lúc nào cũng liên quan
đến tính gây bệnh của virus và do đó không được sử dụng trong việc phân biệt
các chủng virus. Vùng không mã hóa 3' (3' NCR) đã được sử dụng trong lai
tạo và giải trình tự gen đã chứng minh là đặc biệt hữu ích cho việc phân biệt
giữa các chủng potyvirus và các chủng của SMV (Benscher và cs, 1996).
2.1.1.3. Thiệt hại về kinh tế
SMV là một thành viên của chi potyvirus, họ potyviridae, nó là một virus
gây thiệt hại nghiêm trọng cho cây đậu tương, năng suất có thể bị sụt giảm tới
100% (Gagarinova và cs, 2008). SMV được coi là một trong những loài virus
gây hại quan trọng nhất cho cây đậu tương trên toàn thế giới (Bos, 1972). Khi
cây đậu tương bị nhiễm SMV, các bộ phận của cây thường nhỏ về kích thước
và trọng lượng, cây thường bị còi cọc, giảm khối lượng tươi của cây sau trồng
Trường ðại Học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp

5

60 ngày từ 35 – 73% là tùy thuộc vào chủng virus (Tu, 1989). Theo Haque và
cs (1993) khi cây đậu tương bị nhiễm SMV khối lượng cây giảm 4,0-16,9%,
số lượng hạt trên quả giảm 6,4 – 15,2% và tổng khối lượng hạt trên cây giảm
6,6 – 17,8% so với cây khỏe (CABI, 2010a).
2.1.1.4. Triệu chứng do SMV
SMV có thể tạo ra các dạng triệu chứng như khảm, đốm, úa vàng, nhăn
nheo trên lá (Gagarinova và cs, 2008). Cây đậu tương nhỏ bị bệnh ban đầu là
những vệt sáng gân mờ ở trên lá sau đó là hiện tượng khảm lá, khi bệnh phát
triển mép lá bệnh cụp xuống và xuất hiện những vùng có màu xanh tối dọc
theo gân phát triển thành các nốt phồng hay làm cho lá bị cuốn và nhăn.

Trong trường hợp cây bị nhiễm bệnh sớm hay nhiễm bệnh từ hạt cây sẽ bị còi
cọc và lùn xuống (CABI, 2010a).
2.1.1.5 Phạm vi ký chủ:
Ký chủ tự nhiên: SMV có phạm vi ký chủ tự nhiên hẹp và có mức độ
chuyên hóa với cây ký chủ - đậu tương cao, cây đậu tương trồng là ký chủ tự
nhiên chính của virus.
Ký chủ nhân tạo: SMV có thể lan truyền nhờ sát thương cơ giới tới một số
cây họ đậu khác ngoài đậu tương như: Cassia occidentalis, Crotalaria
spectabilis, Dolichos falcatus, Lablab purpureus, Hippocrepis multisiliquosa,
Indigofera hirsuta, Tetragonolobus purpureus, Lupinus albus, L.
angustifolius, Macroptilium (Phaseolus) lathyroides, Phaseolus nigricans, P.
speciosus, P. vulgaris, Scorpiurus sulcatus, Sesbania exaltata, Trigonella
caerulea, T. foenum-graecum và Vigna unguiculata (CABI, 2010a).
2.1.1.6 Truyền lan của SMV
Truyền lan qua côn trùng môi giới: Người ta đã ghi nhận có khoảng 11 loài
rệp khác nhau có thể truyền SMV theo phương thức không bền vững, nhất là
những loài Cyrthosiphon pisum, Aphis fabae và Myzus persicae (Bos, 1971).
Trường ðại Học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp

6

- Truyền lan qua hạt giống: Đây là nguồn bệnh quan trọng nhất trên đồng
ruộng, có tới 83% số hạt giống cây bệnh có thể bị nhiễm bệnh. Cây bị nhiễm
bệnh sau khi ra hoa thì hạt giống không bị nhiễm bệnh, phân bố của virus
trong hạt giống nhiễm bệnh ở các vỏ của hạt là thất thường. Virus được tìm
thấy trong phôi và lá mầm, nhưng hiếm khi tìm thấy ở ngoài vỏ hạt giống,
virus có thể tồn tại trong hạt giống được lưu trữ trong 30 năm. Virus xâm
nhập vào hạt giống có thể là từ phấn hoa bị nhiễm bệnh (Bos, 1971).
2.1.2. Bean common mosaic virus (BCMV, chi Potyvirus)
2.1.2.1. Lịch sử nghiên cứu và phân bố ñịa lý:

Bệnh được Stewart & Reddick (1917), Pierce (1934) phát hiện, quan sát
và mô tả lần đầu tiên ở Mỹ (Brunt và cs, 1996).
BCMV có thể tìm thấy ở bất kỳ nơi nào trồng đậu trên thế giới như các
nước thuộc vùng ôn đới, vùng cận nhiệt đới và vùng nhiệt đới của thế giới
(CABI, 2010b).

2.1.2.2.Phân loại và danh pháp:
Virus có ARN sợi đơn dương (ssRNA), họ Potyviridae, chi Potyvirus,
loài Bean commom mosaic virus. Virus còn có một số tên khác như Bean
common mosaic potyvirus, Bean mosaic virus, Bean virus 1, Bean western
mosaic virus, Phaseolus virus 1, Mungbean mosaic virus, Common bean
mosaic virus (CABI, 2010b).
Tên thường được dùng phổ biến là Bean commom mosaic virus, viết tắt
BCMV.
Theo kết quả nghiên cứu của Berger và cs (1997), khi phân tích trình tự
đầu 3’ không mã hoá và gen CP của 13 chủng của BCMV và 1 chủng của
Bean common necrosis mosaic virus (BCNMV) để phân tích phả hệ gen đã
Trường ðại Học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp

7

cho thấy rằng BCNMV là một chủng khác biệt của BCMV. Các virus hại đậu
đỗ được sắp xếp vào nhóm BCMV, BCNMV và các nhóm phụ khác.
Vetten và cs (1992) mô tả sự khác biệt trong các triệu chứng của cây ký
chủ, huyết thanh học, tế bào học, chiều dài và trọng lượng phân tử protein
giữa các chủng gây triệu chứng hoại tử (NL8) và không hoại tử (NL4) của
BCMV, đã kết luận rằng BCMV nên được phân loại lại thành hai potyviruses
khác biệt, các chủng hoại tử được phân loại thành Bean necrosis mosaic virus
(BNMV), các chủng không hoại tử vẫn được phân loại như BCMV.
McKern và cs (1992) công bố kết quả nghiên cứu dựa vào phân tích

peptide bằng kỹ thuật sắc ký lỏng hiệu năng cao (high-performance liquid
chromatographic) và trình tự gen của 22 chủng BCMV, chủng Blackeye
cowpea mosaic virus (BlCMV) và chủng Peanut stripe virus (PStV) cho thấy
có hai Potyvirus rõ ràng với chủng chết hoại tử NL3, NL5, NL8 và TN-1, có
90% mức độ tương đồng được xếp trong một nhóm A, các chủng BCMV với
mức độ tương đồng từ 60 đến 80% được xếp vào nhóm B, các chủng không
chết hoại NL4 và NL6, có chỉ 35-40% tính tương đồng với dòng chết hoại.
Dựa trên các nghiên cứu này, Ủy ban Phân loại Virus Quốc tế (ICTV) đã
chấp nhận để xuất của Mink và cs (1994) rằng các isolate của serotype A là
thành viên của loài Bean common mosaic necrosis virus (BCMNV) và các
isolate của serotype B là thành viên của của loài BCMV. Một phân tích dựa
trên vùng 3’ không mã hóa (3’UTR) và vùng mã hóa gen vỏ protein (CP) của
các isolate đại diện cho tất cả các loài/chủng Potyvirus nhiễm trên cây họ đậu
cũng xác nhận kết luận phân loại của ICTV (Berger và cs, 1997).
Các nghiên cứu phả hệ học (phylogenetic) của Berger và cs (1997)
cũng cho thấy BCMV và nhiều Potyvirus nhiễm trên cây đậu đỗ như SMV,
Bean yellow mosaic virus (BYMV) và Cowpea aphid borne mosaic virus
(CABMV), cũng như nhiều Potyvirus không nhiễm trên đậu đỗ như Dasheen
Trường ðại Học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp

8

mosaic virus (DsMV), Passion fruit woodiness virus (PWV), South African
passiflora virus (SAPV), Watermelon mosaic virus II (WMVII) và Zucchini
yellow mosaic virus (ZYMV) phân cụm với nhau và hình thành nên một
nhóm thuộc chi Potyvirus gọi là “BCMV subgroup”.
2.1.2.3 Thiệt hại kinh tế do BCMV gây ra:
BCMV là virus gây thiệt hại quan trong trên cây họ đậu trên khắp Châu
Phi, Châu Âu, Bắc Mỹ và Mỹ Latinh. Mức độ nhiễm bệnh có thể đạt tới
100% và có thể làm sụt giảm sản lượng từ 35 – 98% (Galvez, 1980). Theo

Hampton (1975) ở Oregon (Mỹ) bệnh có thể làm giảm năng suất từ 53 – 68%
là tùy thuộc vào mức độ bị bệnh.
Nghiêm trọng hơn vào những năm 1972 và 1975 dịch bệnh BCMV xảy ra
tại Marốc, trong đó 50 % tất cả các cây đậu trồng nhiễm BCMV từ hạt của vụ
trước và lan truyền nhờ rệp (Lockhart & Fischer, 1974), thiệt hại năng suất
ước tính tới 50% và 34% hạt bị nhiễm bệnh sau thu hoạch (CABI, 2010b).
2.1.2.4. Triệu chứng do BCMV gây ra trên cây họ ñậu
Virus gây bệnh có thể tạo ra nhiều dạng triệu chứng khác nhau trên mỗi
loại cây trồng. Thường gây ra hiện tượng khảm tạo thành sọc xanh nhạt hay
bạc xen kẽ sọc xanh thẫm trên lá non cây đậu. Khi bệnh nặng các lá bị co hẹp
và biến dạng, một số lá cuộn lại (Brunt và cs, 1996).
2.1.2.5. Phạm vi ký chủ:
BCMV có phạm vi ký chủ hẹp, ngoài tự nhiên BCMV chủ yếu nhiễm trên
các loài đậu đỗ thuộc chi Phaseolus, đặc biệt là P. vulgaris. Trên cây P. vulgaris,
BCMV có thể làm giảm năng suất tới 60 % (Robert & Maury, 1997). Tuy vậy
trong tự nhiên BCMV cũng được tìm thấy trên nhiều cây đậu khác gồm V.
unguiculata (Zaumeyer & Thomas, 1957), V. radiata (Kaiser & Mossahebi,
Trường ðại Học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp

9

1974), Crotalaria juncea (Singh & Singh, 1977), C. striata (Sarkar &
Kulshreshtha, 1978), và Lupinus luteus (Frencel & Pospieszny, 1979).
BCMV được phân lập từ một số loài cây họ đậu hoang dã ở châu Phi
bao gồm: Glycine max, Crotalaria incana, Senna hirsuta và Macroptilium
atropurpureum ở Uganda; Vigna unguiculata và Senna sophera ở Rwanda;
Rhynchosia spp. ở Malawi; Vigna vexillata và Crotalaria comanestiana ở
Kenya (Spence & Walkey, 1995), Macrotyloma axillare ở Ethiopia (Edeme &
Hanson, 2000).
2.1.2.6 Truyền lan của BCMV

Truyền lan qua côn trùng môi giới: BCMV có thể lan truyền nhờ một số
loài rệp bằng phương thức không bền vững như Acyrthosiphon pisum, Aphis
fabae và Myzus persicae (Kennedy và cs, 1962; Zettler & Wilkinson, 1966).
Ngoài ra còn có một số loài rệp khác giúp BCMV lan truyền là Aphis
gossypii, A. medicaginis, A. rumicis, Hayhurstia atriplicis, Uroleucon
ambrosiae, Macrosiphum euphorbiae và Acyrthosiphon pisum (Zaumeyer &
Thomas, 1957).
Truyền lan qua hạt giống: Reddick và Stewart (1919) là hai tác giả đầu
tiên phát hiện thấy BCMV truyền lan được qua hạt giống, hạt giống được coi
như nguồn bệnh đầu tiên của BCMV và có lẽ đây là yếu tố quan trọng nhất
trong sự gây hại của virus trên đồng ruộng (Morales & Bos, 1988). Tỷ lệ bệnh
truyền qua hạt giống là trên 35% đã được ghi nhận trên nhiều giống đậu
(Lockhart & Fischer, 1974; Provvidenti & Cobb, 1975; Provvidenti &
Braverman, 1976).
Kết quả phân tích hơn 8.000 mẫu hạt đậu đỗ thu thập tại các vùng ở Bancăng
cho thấy tỷ lệ hạt nhiễm CMV lên tới 20% và 26% nhiễm BCMV. Đây được coi
là nguồn bệnh ban đầu lây lan trên đồng ruộng (Babovic và cs, 2000).
Trường ðại Học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp

10

Khi mật độ rệp không cánh cao làm cho 100 % thực vật thứ yếu ở
Colombia nhiễm BCMV và có 15 – 20% hạt giống bị nhiễm bệnh. Ở Ấn Độ,
cây đậu non mẫm cảm với BCMV hơn cây đậu già, virus lan truyền bởi

loài
rệp

M. persicae. Ấu trùng và rệp trưởng thành không cánh lan truyền BCMV
hiệu quả hơn rệp trưởng thành có cánh (Yash & Chowfla, 1988).

2.1.3. Các begomovirus gây hại cây họ ñậu
Begomovirus (Chi Begomovirus, họ Geminiviridae) được đặt tên từ
bean golden mosaic virus (BGMV) là các virus có bộ gen DNA sợi vòng đơn,
kích thước khoảng 2,7 kb, lan truyền tự nhiên trên đồng ruộng bằng bọ phấn
(Bemisia tabaci) theo kiểu bền vững tuần hoàn.
Nghiên cứu hệ thống phát sinh có thể chia begomovirus ra làm hai
nhóm chính là nhóm tân thế giới (New world) bao gồm khu vực Châu Mỹ và
nhóm cựu thế giới (Old world) là khu vực bán cầu đông bao gồm châu Âu,
châu Phi, châu Á (Padidam và cs, 1999; Rybicky, 1994).
Các begomovirus của hai nhóm tân thế giới và cựu thế giới được phân
biệt nhau bởi đặc điểm bộ gen. Tất cả các begomovirus ở cụm Tân thế giới
đều có bộ gen kép, trong khi đó các begomovirus ở cụm Cựu thế giới có cả bộ
gen đơn và kép, thêm vào đó tất cả các begomovirus của cụm Cựu thế giới có
thêm một gen AV2 trên DNA-A, gen này không tồn tại ở các virus của cụm
Tân thế giới (Rybicki, 1994; Stanley và cs, 2005).
Begomovirus hại trên nhiều đối tượng cây trồng và cây dại khác nhau, tuy
nhiên bệnh hại nặng nhất trên cà chua, bông, sắn và đậu.
BGMV là virus gây triệu chứng khảm vàng trên cây họ đậu thuộc chi
begomovirus được phát hiện đầu tiên vào năm 1965 tại Costarica (Goodman &
Bird, 1978). Do BGMV được phát hiện đầu tiên trong chi begomovirrus nên
BGMV đã trở thành virus điển hình của các begomovirrus và được sử dụng để
đặt tên cho chi begomovirus. Từ đó đến nay BGMV lần lượt được tìm thấy ở
Trường ðại Học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp

11

Châu Phi (Nigenia), Trung Mỹ (Cuba, Jamaica ), Bắc Mỹ (Mexico, Mỹ) và
Nam Mỹ (Argentia, Brazil, Colombia, Venezuela) (CABI, 2007a).
Sau đó nhiều begomovius trên đậu đỗ khác cũng được phát hiện thấy tại
khu vực Châu Mỹ như:

- Bean calico mosaic virus (BcaMV) gây hại trên cây đậu cove leo được
công bố ở Mexico năm 1988 (ICTV, 2006).
- Bean golden yellow mosaic virus (BGYMV) gây hại trên cây đậu cove
leo được mô tả lần đầu tiên ở Colombia năm 1976.
- Bean dwarf mosaic virus (BDMV), cowpea golden mosaic virus
(CpGMV), vigna mungo yellow mosaic virus (VMYMV), soybean blistering
mosaic virus (SbBMV), bean leaf curl Madagascar virus (BLCMV)
Ơ khu vực Châu Á, begomovirus đầu tiên được phát hiện thấy trên cây họ
đậu là virus khảm vàng đậu xanh - mungbean yellow mosaic virus (MYMV).
MYMV được phát hiện đầu tiên tại Ấn Độ (1960), sau đó virus lần lượt được
công bố tại các nước trồng đậu khu vực Nam Á và Đông Nam Á như
Bangladesh (1991), Pakistan (1998), Philippines (1977), SriLanka (1988),
Thailand (1981), Papua New Guinea (1981) (CABI, 2007b).
Mungbean yellow mosaic India virus (MYMIV) một begomovirus có bộ gen
kép bao gồm hai phân tử DNA-A và DNA-B gây triệu chứng khảm vàng trên
cây đậu xanh được mô tả lần đầu tiên tại Ấn Độ vào năm 2002 (Pant và cs,
2001). Đến năm 2004, người ta cũng đã tìm thấy MYMIV gây hại trên cây đậu
xanh với triệu chứng khảm vàng lá được thu thập từ mười địa điểm khác biệt tại
tỉnh biên giới Tây Bắc và tỉnh Punjab của Pakistan (Hussain và cs, 2004).
Soybean crinkle virus (SCLV) một begomovirus có bộ gien đơn gây
triệu chứng nhăn lá trên đậu tương đã được công bố lần đầu tiên ở Thái Lan
Trường ðại Học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp

12

năm 1983, đến năm 2001, bộ gen của SCLV đã được giải trình tự toàn bộ
(CABI, 2007c).
Năm 2010 hai virus mới gây hại trên đậu tương đã được công bố ở
Nigeria là soybean mild mottle virus (SbMMV) và soybean chlorotic blotch
virus (SbCBV). SbMMV có bộ gen DNA-A sợi vòng đơn có chiều dài 2768

nucleotide, SbCBV có bộ gen kép gồm 2 phân tử DNA-A và DNA-B có chiều
dài lần lượt là 2708 và 2647 nucleotide (Alabi và cs, 2010).
Ngày nay, với sự trợ giúp của những tiến bộ mới trong lĩnh vực công nghệ
sinh học phân tử nên số lượng begomovirus được xác định khắp nơi trên thế
giới ngày càng nhiều. Số lượng begomovirus được xác định không ngừng gia
tăng, 117 loài năm 2007 nhưng đến năm 2009 đã tăng lên 196 loài (ICTV,
2007; ICTV, 2009).
2.2. Những nghiên cứu về bệnh virus hại cây họ ñậu tại Việt Nam
Kết quả điều tra cơ bản bệnh cây 1967 – 1968 của Viện bảo vệ thực vật
đã tìm thấy trên cây họ đậu bị các virus sau gây hại:
- Cây lạc bị Arachis virus 1 Smith gây hại toàn thân.
- Cây đậu đũa, đậu cove vàng bị bệnh phát búi do rosette virus gây hại
toàn thân.
Vũ Triệu Mân (1993) đã cho biết 14 virus thuộc chi Potyvirus gây hại trên
nhiều loài cây trồng có ý nghĩa kinh tế, trong đó cây họ đậu bị nhiễm các virus
sau: BCMV, SMV, BYMV và cowpea aphid-borne mosaic virus (CAMV).
Kiritani và cs (1993), dựa trên kỹ thuật ELISA, đã cho biết các virus sau
gây hại trên cây họ đậu: BYMV (gây bệnh khảm vàng trên cây cốt khí), cowpea
stunt virus (gây triệu chứng lùn cây trên đậu đen) và mungbean yellow mosaic
Trường ðại Học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp

13

virus (MYMV), chi begomovirus, họ geminiviridae, gây triệu chứng khảm vàng
trên đậu xanh).
Vũ Triệu Mân và Ngô Bích Hảo (Vũ Hồng Xa, 2002), dựa trên phản
ứng ELISA, đã phát hiện thấy cucumber mosaic virus (CMV, chi
Cucumovirus) trên cây đậu đỗ.
Ngô Bích Hảo và cs (2001), dựa trên phản ứng ELISA, đã tìm thấy các
virus truyền qua hạt giống cây họ đậu là BCMV chủng NY15, blackeye

cowpea mosaic virus (là 1 chủng của BCMV) và bean common mosaic
necrosis virus (BCMNV, chi Potyvirus).
Ngô Bích Hảo và cs (2003) đã xác nhận sự có mặt của BCMV trên hạt đậu
(V. unguiculata spp.) và cho thấy tỷ lệ hạt đậu nhiễm virus là từ 0,8 đến 12,4%.
Tác giả cũng đã xác định được các virus truyền qua hạt giống ở miền bắc Việt
Nam như BCMV, BlCMV, cowpea mosaic virus (CPMV), SCPMV, CMV.
Hà Viết Cường và cs (2008), dựa trên phân tích đầu 3’ của bộ gen
potyvirus đã phát hiện 3 chủng khác nhau của BCMV là chủng peanut stunt
(BCMV-PSt), chủng black eye cowpea mosaic (BCMV-BlCM) và một chủng
mới (BCMV-VN/BB2-5 và BCMV-VN/YB2) trên nhiều loại cây đậu đỗ thu
thập khắp cả nước.
Hà Viết Cường và cs (2008), dựa trên phân tích toàn bộ bộ gen, đã phát
hiện thấy 2 virus mới thuộc chi Begomovirus nhiễm trên cây họ đậu là kudzu
mosaic virus (KuMV) trên cây sắn dây và mimosa yellow leaf curl virus
(MiYLCV) trên cây xấu hổ.




Trường ðại Học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp

14

3. VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.1. ðối tượng, ñịa ñiểm và thời gian nghiên cứu
3.1.1. ðối tượng nghiên cứu
Bệnh virus hại cây họ đậu.
3.1.2. ðịa ñiểm nghiên cứu
- Vùng trồng cây họ đậu ở Hải Phòng và phụ cận.
- Trung tâm Nghiên cứu Bệnh cây nhiệt đới - Trường Đại học Nông

nghiệp Hải Phòng.
3.1.3. Thời gian nghiên cứu
- Năm 2013
3.2. Vật liệu nghiên cứu
- Mẫu cây bệnh có triệu chứng điển hình được thu thập từ các địa điểm
điều tra, sau đó được bảo quản khô bằng hạt Silicagel để kiểm tra virus.
* Thiết bị nghiên cứu:
Máy đọc bản ELISA, máy PCR, tủ lạnh bảo quản mẫu, tủ định ôn.
* Dụng cụ nghiên cứu:
- Pipet tự động 1 đầu côn: 10 - 20 µm, 100 µm, 200 µm, v.v
- Ống đong 10 - 1000 ml.
- Bình thuỷ tinh loại 50 - 1000 ml.
- Phễu lọc, vải lọc, giấy thấm.
- Hộp nhựa có nắp để đựng bản ELISA.
- Các dụng cụ khác: găng tay cao su, que thuỷ tinh, túi nhựa, v.v
* Hoá chất:
Trường ðại Học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp

15

- Các hoá chất thông dụng và hoá chất để pha dung dịch đệm, chất nền,
các kháng huyết thanh của các virus thử nghiệm.
- Các hoá chất dùng trong RT - PCR.
3.3. Nội dung nghiên cứu
1. Mô tả các dạng triệu chứng bệnh trên cây họ đậu do virus gây ra.
2. Điều tra diễn biến bệnh virus hại cây họ đậu tại một số vùng thuộc Hải
Phòng năm 2013.
3. Thu thập mẫu bệnh virus tại một số vùng thuộc Hải Phòng năm 2013,
kể cả mẫu hạt nhập khẩu.
4. Xác định bệnh virus trên cây họ đậu và cây thí nghiệm bằng phản ứng

ELISA, PCR và RT – PCR.
3.3.1. Phương pháp nghiên cứu
3.3.1.1. Phương pháp ñiều tra ngoài ñồng
Phương pháp điều tra tỷ lệ bệnh virus hại cây họ đậu ở ruộng sản xuất: Áp
dụng phương pháp nghiên cứu, điều tra và phát hiện bệnh hại theo “Phương
pháp nghiên cứu bảo vệ thực vật” của Viện Bảo vệ thực vật (2003).
Chọn 1 ruộng đại diện cho giống, đại diện cho giai đoạn sinh trưởng và
phát triển của cây. Điều tra theo phương pháp 5 điểm trên đường chéo góc
(cách bờ 2 mét) mỗi điểm điều tra từ 50 - 100 cây đối với ruộng có diện tích
lớn, điều tra 100% số cây đối với ruộng có diện tích nhỏ.
Tính tỷ lệ bệnh. Quan sát và mô tả đặc điểm cây nhiễm bệnh.
3.3.1.2.Phương pháp thu thập bảo quản mẫu lá bệnh
Được tiến hành theo giai đoạn sinh trưởng, chọn những lá có triệu
chứng điển hình đem về bảo quản khô bằng hạt Silicagel.
Trường ðại Học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp

16

3.3.1.3. Phương pháp kiểm tra virus bằng ELISA
Sử dụng các kít ELISA phát hiện virus cây họ đậu do Viện DSMZ cung
cấp. Các kít và phương pháp thử ELISA bao trình bày ở Bảng 1.
Bảng 3.1. Các kít ELISA phát hiện virus ñậu ñỗ (Viện DSMZ)
STT

Virus Viết tắt Phương pháp Mã kít
1 Bean common mosaic necrosis virus BCMNV DAS-ELISA AS2039
2 Bean common mosaic virus BCMV TAS-ELISA AS0915-0228/1
3 Bean leaf roll virus BLRV TAS-ELISA AS0142-0227/1
4 Bean yellow mosaic virus BYMV DAS-ELISA AS-0717
5 Broad bean true mosaic virus BBTMV DAS-ELISA AS-0152

6 Broad bean wilt virus 2 BBWV-2 DAS-ELISA AS-0862
7 Cowpea aphid-born mosaic virus CABMV DAS-ELISA AS-0417
8 Cowpea mild mottle virus CPMMV DAS-ELISA AS-0907
9 Cowpea mosaic virus CPMV DAS-ELISA AS-0012
10 Cowpea mottle virus CPMoV DAS-ELISA AS-0212
11 Cowpea severe mosaic virus CPSMV DAS-ELISA AS-0013
12 Pea enation mosaic virus PEMV DAS-ELISA AS-0017
13 Pea seed-borne mosaic virus PSbMV DAS-ELISA AS-0129
14 Southern bean mosaic virus SBMV DAS-ELISA AS-0033
15 Soybean mosaic virus SMV DAS-ELISA AS-0543
16 Tobacco mosaic virus TMV DAS-ELISA AS-0041
17 Cucumber mosaic virus CMV DAS-ELISA AS-0929

Qui trình thử ELISA gồm 2 phương pháp là TAS-ELISA và DAS-
ELISA) được thực hiện theo hướng dẫn của nhà sản xuất.
Ngoài ra, kiểm tra virus bằng ELISA gián tiếp dùng kháng huyết thanh
Trường ðại Học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp

17

thô được thực hiện theo phương pháp của Mofat (1999) như sau:
Bước 1: Nghiền mẫu
-
Tiến hành nghiền mẫu trong dung dịch đệm Carbonate pH 9,6 với tỷ
lệ 0,5 g lá/1 ml dung dịch đệm.
-
Nghiền mẫu đối chứng dương
-
Nhỏ vào mỗi giếng ELISA 100 µl/giếng. Sau đó để bản ELISA vào
hộp ẩm và ủ qua một đêm ở tủ lạnh thường.

Bước 2: Rửa bản ELISA
-
Sau khi ủ qua đêm, sáng hôm sau đem bản ELISA đi rửa (trước khi
rửa vảy mạnh bản ELISA để loại hết nước ở trong bản ELISA) 3 lần
bằng đệm PBS – T, mỗi lần cách nhau 3 – 4 phút. Mỗi lần rửa bản
ELISA đều vảy mạnh để loại hết đệm PBS – T ra khỏi các giếng, sau
đó mới tiến hành nhỏ đệm PBS – T mới vào để rửa tiếp.
-
Ủ bản ELISA ở 37
0
C trong 45 phút.
Bước 3: Cố định kháng thể thỏ đặc hiệu virus vào bản ELISA
-
Nghiền lá cây khỏe trong dung dịch đệm PBST – PO với tỷ lệ 1 g
lá/30 ml dung dịch đệm PBST – PO.
-
Lọc lấy dịch cây khỏe, hòa kháng huyết thanh của virus BCMV với
tỷ lệ 1/500 và kháng huyết thanh của BlCMV với tỷ lệ 1/500.
-
Nhỏ dịch cây khỏe + kháng huyết thanh của BCMV và BlCMV vào
bản ELISA, mỗi giếng nhỏ 100 µl.
-
Để bản ELISA trong hộp ẩm rồi đem ủ ở 37
0
C trong 2 giờ.
Bước 4: Hòa kháng thể đơn dòng IgG (thỏ) của hãng Sigma với tỷ lệ
1/10000 trong đệm PBST – Ovanbumel.
-
Rửa bản ELISA 3 lần bằng đệm PBS – T, mỗi lần cách nhau 2 phút.
Bước 5: Cố định chất nền

-
Hòa 2 viên chất nền của hãng Sigma vào 2 ml đện cơ chất đã pha,
nhỏ 100 µl/giếng.