nghiên cứu tính nhạy cảm kháng sinh của trực khuẩn mủ xanh (pseudomonas aeruginosa)

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM
––––––––––––




NGUYỄN THỊ HẢI





NGHIÊN CỨU TÍNH NHẠY CẢM
KHÁNG SINH CỦA TRỰC KHUẨN MỦ XANH
(PSEUDOMONAS AERUGINOSA)


Chuyên ngành: SINH HỌC THỰC NGHIỆM
Mã số: 60 42 30



L
L
U
U
Ậ
Ậ

N
N


V
V
Ă
Ă
N
N


T
T
H
H
Ạ
Ạ
C
C


S
S
Ĩ
Ĩ


S
S

I
I
N
N
H
H


H
H
Ọ
Ọ
C
C






Người hướng dẫn khoa học: TS.BS. LƯU THỊ KIM THANH






THÁI NGUYÊN - 2010

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

1
MỞ ĐẦU
1. Đặt vấn đề
Xã hội càng phát triển thì nhu cầu về chăm sóc và bảo vệ sức khoẻ của con
người ngày càng cao; có sức khoẻ con người có thể làm ra nhiều của cải vật chất,
nâng cao chất lượng cuộc sống. Vì vậy việc tìm hiểu, nghiên cứu các tác nhân gây
bệnh và cách chữa trị cho con người là việc làm thiết thực có ý nghĩa quan trọng,
góp phần vào sự phát triển chung của nhân loại.
Tồn tại xung quanh chúng ta có biết bao nhiêu tác nhân gây bệnh mà mắt
thường không nhận biết được, trong đó có các vi sinh vật. Khi cơ thể suy yếu, sức
đề kháng giảm, chúng ta đều có thể bị tấn công.
Hiện nay, nhờ sự phát triển mạnh mẽ của khoa học cũng như y học, người ta đã
phân lập, phát hiện ra rất nhiều loại vi khuẩn có khả năng gây bệnh; đặc biệt là loại vi
khuẩn gây nhiễm trùng cơ hội Trực khuẩn mủ xanh (tên khoa học là Pseudomonas
aeruginosa) - một trong những tác nhân quan trọng gây nhiễm khuẩn bệnh viện.
Trực khuẩn mủ xanh là trực khuẩn Gram âm, chúng phân bố rộng rãi trong
các môi trường ngoại cảnh như đất, nước, không khí, nhất là ở môi trường ẩm ướt
chúng có nhiều cơ hội xâm nhập và gây bệnh. Nhiễm trùng do Trực khuẩn mủ xanh
gây ra điển hình là nhiễm trùng da (nhiễm trùng vết thương, vết bỏng…), nhiễm
trùng đường hô hấp (viêm phổi, viêm phế quản…), nhiễm trùng đường tiểu và nặng
hơn là gây nhiễm trùng huyết. Nếu vi khuẩn xâm nhập vào các cơ quan thiết yếu
của cơ thể như phổi, đường tiết niệu, và thận, sẽ gây ra những hậu quả chết
người vì vi khuẩn này phát triển tốt trên các bề mặt bên trong cơ thể.
Trực khuẩn mủ xanh là loại vi khuẩn có khả năng kháng lại nhiều loại kháng
sinh, việc sử dụng kháng sinh không đúng cách trong cộng đồng và chưa hợp lý
trong bệnh viện đã đưa tới mức độ đề kháng kháng sinh của vi khuẩn nói chung và
Trực khuẩn mủ xanh nói riêng ngày một tăng.
Sử dụng kháng sinh an toàn và hợp lý trên cơ sở hiểu biết những cơ chế tác

dụng của kháng sinh cũng như đặc tính của vi khuẩn và mức độ nhạy cảm với
kháng sinh của chúng đóng vai trò góp phần hết sức quan trọng trong việc điều trị
bệnh cho bệnh nhân.

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

2
Trước yêu cầu của thực tiễn, chúng tôi tiến hành đề tài: “Nghiên cứu tính
nhạy cảm kháng sinh của Trực khuẩn mủ xanh (Pseudomonas aeruginosa)”
nhằm những mục tiêu nghiên cứu sau:
2. Mục tiêu nghiên cứu
- Xác định tỷ lệ nhiễm trùng do Trực khuẩn mủ xanh trên bệnh nhân và tỉ lệ
ô nhiễm Trực khuẩn mủ xanh ở môi trường bệnh viện.
- Định loại Trực khuẩn mủ xanh.
- Xác định mức độ đơn kháng và đa kháng kháng sinh của Trực khuẩn mủ xanh.
3. Nội dung nghiên cứu
- Phân lập P.aeruginosa từ một số bệnh phẩm (mủ vết thương, dịch mũi
họng, nước tiểu), từ môi trường (nước, không khí, bề mặt dụng cụ y tế đang sử
dụng) trong bệnh viện.
- Nghiên cứu mức độ kháng kháng sinh của P.aeruginosa dựa trên kết quả
kháng sinh đồ của các chủng P.aeruginosa phân lập được.

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

3
CHƢƠNG 1
TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1. Những nghiên cứu về Pseudomonas aeruginosa
1.1.1. Lược sử nghiên cứu P.aeruginosa
Năm 1872, P.aeruginosa được Schroeter mô tả lần đầu tiên với tên gọi là
Bacterium aeruginosa [8].
Ngay từ trước khi phân lập, đã có nhiều nhận xét cho rằng trong một số
trường hợp vết thương sinh ra một loại mủ đặc biệt có màu xanh như màu rỉ đồng.
Hiện tượng này được giải thích theo nhiều ý kiến khác nhau, nhưng lời giải thích
thỏa đáng khi người ta phân lập được vi khuẩn từ ổ mủ thuần khiết.
Năm 1882, nhà khoa học đầu tiên nghiên cứu về Bacterium aeruginosa đó là
dược sĩ Carle Gessard. Ông phân lập vi khuẩn này trên mủ vết thương và kết quả
nghiên cứu đã tìm thấy đặc trưng của Bacterium aeruginosa là sinh sắc tố có màu xanh,
tan trong nước. Từ đó người ta còn gọi vi khuẩn này là trực khuẩn mủ xanh [32].
Năm 1900, Migula đã nghiên cứu và phân loại vi khuẩn này vào chi
Pseudomonas; từ đó vi khuẩn này mang tên P.aeruginosa [8].
Năm 2000, một nhóm các nhà khoa học đại học Washington và khoa sinh
của trường đại học California, San Diego đã nghiên cứu và giải được trình tự
genome của P.aeruginosa PA01 [33].
Năm năm sau đó, trình tự genome của PA14 cũng đã được tìm ra bởi các nhà
khoa học thuộc trường Đại học Y Harvard [33].
Trong những năm gần đây, P.aeruginosa là một trong những căn nguyên gây

bệnh rất phổ biến và kháng lại hầu hết các kháng sinh đang dùng. Vì vậy, nó thu hút rất
nhiều đề tài nghiên cứu của các nhà khoa học và các y bác sĩ trong cũng như ngoài nước.
Nghiên cứu nhiễm khuẩn huyết bỏng do P.aeruginosa gây ra tại Viện Bỏng
Quốc gia (6/1996 - 12/1998) đã cho thấy P.aeruginosa là vi khuẩn gây nhiễm khuẩn
huyết bỏng hàng đầu (chiếm khoảng 66,7%) [10].
Năm 2002, Chu Anh Tuấn, Nguyễn Văn Huệ, Lê Đức Mẫn nghiên cứu căn
nguyên gây nhiễm khuẩn huyết và yếu tố bệnh lý liên quan tại Viện Bỏng Quốc Gia
đã cho thấy P.aeruginosa là căn nguyên gây nhiễm hàng đầu (74,3%) [24].

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

4
Năm 2003, theo kết quả giám sát của Bộ y tế về các vi khuẩn gây bệnh
thường gặp ở Việt Nam thì P.aeruginosa là vi khuẩn đứng đầu trong số các vi
khuẩn đó chiếm tỷ lệ 22,3% [11].
Hoàng Kim Tuyến và cộng sự nghiên cứu tình hình kháng kháng sinh của vi
khuẩn gây bệnh phân lập tại bệnh viện Thống Nhất (8/2002 - 8/2005) đã chứng
minh được P.aeruginosa là nguyên nhân hàng đầu gây viêm phổi tại bệnh viện với
tỷ lệ kháng thuốc khá cao (>60%) [25].
Lê Thu Hồng, Hoàng Ngọc Hiện (bộ môn vi sinh - Học viện quân y) đã
nghiên cứu chế tạo huyết thanh kháng P.aeruginosa đa giá, tinh chế và đánh giá
hiệu quả điều trị tại chỗ của chế phẩm trên động vật và bệnh nhân bỏng [12].
Theo một nguồn tin mới đây, một loại vaccine đường uống có thể bảo vệ cơ
thể người kháng lại P.aeruginosa mang tên Pseudostat - 1 đã được công bố bởi các
nhà khoa học Anh và Úc vào tháng 6/2006. Đây là một loại vaccine sử dụng
P.aeruginosa tinh chế đã bất hoạt [26].
Ngoài ra, còn rất nhiều nghiên cứu khác ở trong nước và trên thế giới đánh
giá tình trạng nhiễm trùng và mức độ kháng thuốc của loài vi khuẩn này.
1.1.2. Đặc điểm sinh vật học của P.aeruginosa
1.1.2.1. Hình thái, cấu tạo

Là trực khuẩn gram âm, hình que, thẳng hoặc hơi cong nhưng không xoắn,
hai đầu tròn, chiều dài 1 - 1,5μm, rộng 0,5 - 1μm, đứng một mình hay thành đôi
hoặc kết hợp thành chuỗi ngắn. Trực khuẩn mủ xanh không sinh bào tử, có khả
năng di động nhờ một tiêm mao đơn cực [32].

Hình 1.1: P.aeruginosa soi trên kính hiển vi quang học

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

5
1.1.2.2. Cấu trúc tế bào
 Vỏ polysaccaride:
P. aeruginosa tiết ra chất nhầy có cấu tạo là polysaccharide gồm nhiều tiểu
phần mannuronic acid và glucuronic acid hay còn được gọi là alginate. Các dạng
alginate này kết hợp với nhau tạo thành dạng cấu trúc biofilm giúp bảo vệ che chở
vi khuẩn tồn tại được trong môi trường tự nhiên cũng như tránh được hệ miễn dịch
của cơ thể vật chủ. [34].
 Màng sinh chất:
Hầu hết các chủng P.aeruginosa có khả năng tổng hợp một loại protein trên
bề mặt màng sinh chất (pr F). Protein F vận chuyển có chọn lọc các chất qua lại
màng trong giới hạn khoảng 500Da. Vì vậy, nó làm giảm tính thấm của màng, ngăn
không cho các chất có hại đi vào bên trong tế bào giúp cho P.aeruginosa có khả
năng đề kháng cao với nhiều loại kháng sinh [30].
 Tiên mao:
P.aeruginosa có một tiên mao duy nhất ở một cực, tiên mao giúp cho vi
khuẩn di động. Về cấu tạo hoá học, tiên mao được cấu tạo bởi các protein gọi là
Flagellin. Các Flagellin mang tính chất kháng nguyên gọi là kháng nguyên lông H.
 Tiêm mao:
- Là những sợi lông rất mảnh, dài khoảng 6nm, mọc quanh bề mặt tế bào.
Vai trò: Giúp cho vi khuẩn bám vào môi trường lỏng hay bề mặt biểu mô của

tế bào vật chủ trong quá trình lây nhiễm.
 Nhân:
Vật chất di truyền của P.aeruginosa là một phân tử DNA trần, dạng vòng tồn tại
trong nguyên sinh chất. Kích thước DNA từ 5,2 - 7 triệu cặp base chứa khoảng 65% là
(Guanine + Cytosine). Ngoài ra, P.aeruginosa cũng có chứa vật chất di truyền ngoài
nhân đó là các plasmid. Các plasmid chứa các đoạn gen như TEM, OXA, PSE mã hóa
sinh ra enzyme betalactamase làm phá huỷ vòng betalactam của chất kháng sinh dẫn
tới P.aeruginosa kháng lại với hầu hết các kháng sinh thuộc nhóm này. Do vậy mà rất
khó khăn trong việc lựa chọn thuốc điều trị nhiễm khuẩn do P.aeruginosa gây ra [35].

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

6
1.1.2.3. Phân bố
Trực khuẩn mủ xanh được tìm thấy ở rất nhiều nơi trong môi trường sống
như: trong đất, nước, các bể bơi, hồ tắm nước nóng…nhưng phổ biến nhất là những
nơi ẩm thấp. Ở người, chúng có thể sống ở vùng da ẩm như nách, háng và một số ít
sống trong ruột. Ngoài ra, vi khuẩn này còn được phát hiện sống bám bên ngoài của
thực vật, động vật, kể cả trong bệnh viện [28].
Ít khi có nhiễm trùng do P.aeruginosa ở người khỏe mạnh. Chúng là căn
nguyên quan trọng nhất trong các nhiễm khuẩn ở bệnh nhân bị bệnh nặng như bệnh
tăng bạch cầu, u xơ bàng quang và bệnh nhân có bỏng rộng. Trong điều kiện ướt,
nước và nếu thêm yếu tố giàu chất khoáng, giàu dinh dưỡng thì rất thuận lợi cho sự
tồn tại và phát triển của trực khuẩn P.aeruginosa (như dụng cụ làm ẩm oxy, ống
hút, lavabo rửa tay, nước lưu cữu…). Vi khuẩn chứa trong các hạt khí dung khi
được hít vào cơ thể thì có thể tránh được những cơ chế bảo vệ bình thường của
đường hô hấp để gây ra nhiễm khuẩn. Có nhiễm khuẩn do P.aeruginosa sinh trưởng
ngay trong các thuốc dùng cho điều trị. Thậm chí vi khuẩn này tồn tại được ngay cả
trong một số chất tẩy uế. Bồn và các dụng cụ làm thông khí có thể ô nhiễm nặng và
là nguồn gây nhiễm ra môt trường. Tuy nhiên, nguy cơ chính bị nhiễm khuẩn do

P.aeruginosa là từ sự phơi nhiễm, tiếp xúc của các bộ phận mẫn cảm với những
dụng cụ, phương tiện… ô nhiễm vi khuẩn này [6].
Ở bênh viện, trực khuẩn mủ xanh thường tìm thấy ở đầu các ống thông, máy
khí dung, máy hô hấp nhân tạo, máy hút ẩm, bình chứa nước, thậm chí ở trong cả
một số dung dịch sát khuẩn dùng để rửa vết thương.
1.1.2.4. Đặc điểm nuôi cấy
Trực khuẩn mủ xanh hiếu khí, mọc dễ dàng trên các môi trường nuôi cấy
thông thường như thạch dinh dưỡng, thạch máu, canh thang nhưng thích hợp nhất là
môi trường SS. Nhiệt độ thích hợp từ 30 - 37
0
C, PH = 4,5 - 9,0; tối ưu là 37
0
C, pH
từ 7,2 - 7,5 [1].
Trên môi trường lỏng làm đục đều, trên bề mặt có váng. Trên môi trường đặc
có hai loại khuẩn lạc: Khuẩn lạc S (tròn đều mặt nhẵn, trung tâm hơi lồi). Khuẩn lạc
R (nhỏ, xù xì hoặc nhầy, lồi) (hình 1.2 phụ lục ảnh).

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

7
Tính chất đặc trưng của trực khuẩn mủ xanh là sinh sắc tố (hình 1.3 phụ
lục ảnh) và chất thơm. Trên môi trường nuôi cấy có pepton, nó có thể tiết ra các
loại sắc tố sau:
+ Pyocyanin: Là loại sắc tố phenazin có màu xanh lơ, tan trong nước và
chlorofoc, khuyếch tán ra môi trường nuôi cấy làm cho môi trường và khuẩn lạc có
màu xanh. Sắc tố này sinh ra thuận lợi trong môi trường tiếp xúc nhiều với không
khí. Chỉ có trực khuẩn mủ xanh sinh sắc tố pyocyanin. Đây là một đặc điểm quan
trọng để phân biệt P.aeruginosa với các vi khuẩn khác.
+ Pyoverdin: Là loại sắc tố huỳnh quang, phát màu xanh khi chiếu tia cực

tím có bước sóng 400nm, tan trong nước nhưng không tan trong chlorofoc. Ngoài
trực khuẩn mủ xanh chỉ có một số loài Psedomonas tạo sắc tố này.
+ Pyorubrin: Sắc tố màu hồng nhạt, chỉ 1% trực khuẩn mủ xanh sinh sắc tố này.
+ Pyomelanin: Sắc tố màu nâu đen, chỉ 1-2% số chủng trực khuẩn mủ xanh
sinh sắc tố Pyomelanin.
Có khoảng 5-10% số chủng trực khuẩn mủ xanh không sinh sắc tố.
1.1.3. Một số tính chất sinh hóa cơ bản
- Hiếu khí tuyệt đối, oxidase (+), lên men đường glucoza, không lên men đường
lactose, xitrat simmons (+), mannit (+), idol (-), H2S (-), LDC (-), ODC (-), ADH (-).
1.1.4. Sức đề kháng
Trực khuẩn mủ xanh có sức đề kháng cao với nhiều yếu tố ở ngoại cảnh,
chúng có thể tồn tại được ngay cả trong một số chất tẩy uế. Trong số các vi khuẩn,
Trực khuẩn mủ xanh có sức kháng lại mạnh nhất với các thuốc kháng sinh. Mức độ
kháng thuốc này là do cấu trúc các lỗ porin của màng ngoài làm hạn chế các thuốc
kháng sinh đi vào khoảng trống của màng bào tương hơn so với những vi khuẩn
Gram âm khác[6].
1.1.5. Cấu trúc kháng nguyên
Vi khuẩn có kháng nguyên H và kháng nguyên O chịu nhiệt.
- Kháng nguyên H: Là kháng nguyên lông của vi khuẩn. Kháng nguyên có
đặc điểm: Không chịu được nhiệt, bị cồn 50% và các men tiêu protein phá hủy, chịu
được tác động của focmol 0,5%.

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

8
- Kháng nguyên O: Là kháng nguyên thân, đã có đến 16 loại do đó dựa vào
kháng nguyên O để phân chia P.aeruginosa thành 16 typ huyết thanh ký hiệu từ P1
đến P16. Kháng nguyên O có đặc điểm: Chịu được nhiệt, rất độc, kháng cồn,
bị phá hủy bởi focmon 0,5%.
1.1.6. Độc tố

Trong quá trình xâm nhập và gây bệnh P.aeruginosa tiết ra một số ngoại độc
tố sau: [31].
+ Exoenzyme S: Chủ yếu được sinh ra khi vi khuẩn có mặt trong những mô
bỏng, độc tố này tác động lên tế bào bạch cầu trung tính và gây độc cho tế bào vật chủ.
+ Exotoxin A: Phần lớn P.aeruginosa sinh ra độc tố này, độc tố A không bền
nhiệt, chúng có vai trò làm kìm hãm sự tổng hợp protein và gây chết tế bào.
- Heamolysin: P.aeruginosa sinh ra 2 heamolysins đó là phospholipit C và
rhamnolipit, chúng có vai trò phân hủy lecithin và lipit tạo ra các lỗ thủng trên
màng tế bào làm tăng khả năng xâm nhiễm của vi khuẩn vào trong tế bào vật chủ.
Ngoài ra, Paeruginosa tiết ra một số enzym ngoại bào có vai trò trong tính
độc của vi khuẩn trong quá trình xâm nhiễm là Elastase và Alkaline protease. Các
protein enzyme này phá hủy các phân tử protein của vật chủ một cách đặc hiệu gây
nên những đặc tính lâm sàng riêng của bệnh.
+ Các elastase (LasB elastase, LasA elastase): Phân cắt các protein của tế
bào nhân chuẩn như collagen, elatin và hủy hoại cấu trúc protein của các tế bào này.
Đồng thời nó cũng phá vỡ hệ thống miễn dịch đặc hiệu của cơ thể (IgG, IgA, bổ
thể), các phân tử ngoại bào làm cho nhiễm trùng lan tỏa đến các khu vực xa hơn với
các biểu hiện lâm sàng như viêm màng keratin, hoại tử tổ chức trong bỏng và tạo
các xơ nang. Ngoài ra, Elastase còn dung giải fibronectin giúp cho vi khuẩn dễ
dàng bám vào màng nhầy phổi. Elastase phá vỡ biểu mô và cản trở chức năng của
các lông mao bên trong đường hô hấp [29].
+ Alkalinne protease: Can thiệp vào sự hình thành fibrin và phân giải fibrin.
Đồng thời, elastase và alkaline protease phân hủy chất nền của giác mạc và những
cấu trúc bảo vệ khác cấu tạo nên fibrin và elastin. Hai enzym này cũng được cho
rằng gây ra sự bất hoạt đối với hai yếu tố quan trọng của hệ miễn dịch là interferon
gamma (IFN) và TNF (Tumor Necrosis Factor) [32].

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

9

1.1.7. Khả năng gây bệnh của P.aeruginosa
Mặc dù P.aeruginosa là vi khuẩn gây bệnh cơ hội nhưng nó là vi khuẩn có
độc lực đặc biệt. Khi tuyến phòng thủ đầu tiên (hàng rào bảo vệ không đặc hiệu ở
da, niêm mạc) bị phá vỡ (như khi bị vết thương) hoặc vi khuẩn được đưa vào cơ thể
tắt qua hàng rào này (như theo dụng cụ nội soi hoặc ống thông khí quản…) thì gây
ra nhiễm khuẩn. Đầu tiên vi khuẩn bám dính vào bề mặt tế bào biểu mô và giai đoạn
này cần đến vai trò của pili và polisaccharide ngoại bào. Các chủng nhầy phân lập
từ bệnh nhân bị xơ phế nang tạo ra các polisaccharide chứa nhiều vi khuẩn làm tăng
sự kết dính của vi khuẩn với biểu mô đường hô hấp và giúp chúng kháng lại thực
bào. Sau khi xâm nhập, sự bảo vệ dựa vào thực bào và vỏ nhầy do polisaccharide
có đủ khả năng và đủ thời gian để sản xuất collagenase, elastase, pyocyanin và các
sản phẩm khác để làm lan truyền và phá hủy tổ chức cục bộ. Ngoại độc tố A có thể
là nhân tố góp phần quan trọng gây tổn thương tổ chức và tác dụng làm lan tỏa
nhiễm khuẩn. Nghiên cứu in vitro gần đây đã cho thấy sắc tố pyocyanin ức chế sự
sản sinh superoxide của bạch cầu đa nhân. Có thể các nhân tố này rất quan trọng
làm thuận lợi cho việc hình thành, lan tỏa và kéo dài nhiễm khuẩn.[6]
Nhiễm trùng thường xảy ra ở những người mà cơ chế bảo vệ bị tổn thương
như sử dụng corticoit hay kháng sinh dài ngày, bỏng nặng hoặc tiêm tĩnh mạch ma
túy…Vị trí nhiễm trùng thông thường là đường tiểu và vết thương hở (nhất là vết
bỏng). Tại chỗ xâm nhiễm chúng gây viêm có mủ màu xanh, ở những cơ thể suy
giảm sức đề kháng chúng có thể xâm nhập vào sâu hơn bên trong cơ thể và gây
viêm ở các phủ tạng như các nhiễm trùng nung mủ và những áp xe ở những phần
khác nhau của cơ thể người. Những trường hợp viêm màng trong tim, viêm phổi,
viêm màng não tuy hiếm nhưng cũng xảy ra hoặc gây bệnh toàn thân như nhiễm
khuẩn huyết, nhiễm khuẩn ở trẻ mới sinh thường gây bệnh rất trầm trọng. Nhiễm
khuẩn huyết thường gây chết ở những cơ thể suy nhược [29].
P.aeruginosa là tác nhân gây viêm tai ngoài, thường là những người hay đi
bơi. Loài vi khuẩn này có thể xâm nhập vào mắt (qua chấn thương hoặc do đưa
thuốc bị nhiễm khuẩn vào) gây viêm màng kết mạc mắt, viêm giác mạc mắt hoặc

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

10
viêm nội nhãn cầu. Viêm giác mạc có khi tiến triển nhanh và làm tổn thương giác
mạc sau 24 - 48 giờ[6]. Ngoài ra P.aeruginosa còn là tác nhân chính gây nhiễm
trùng bệnh viện như nhiễm trùng sau mổ, bỏng nặng…
1.2. Kháng sinh
1.2.1. Khái niệm
Chất kháng sinh được hiểu là các chất hóa học xác định, không có bản chất
enzyme, có nguồn gốc sinh học (trong đó phổ biến nhất là từ vi sinh vật), với đặc
tính là ngay ở nồng độ thấp hoặc rất thấp đã có khả năng ức chế mạnh mẽ hoặc tiêu
diệt được các vi sinh vật gây bệnh mà vẫn đảm bảo an toàn cho người và động vật
được điều trị [9].
1.2.2. Hiện tượng và bản chất kháng thuốc của vi sinh vật
Hiệu quả điều trị của chất kháng sinh phụ thuộc rất nhiều vào độ nhảy cảm
của vi sinh vật gây bệnh với chất kháng sinh. Khi điều trị kháng sinh, mầm bệnh
bao giờ cũng có những “đáp ứng phản hồi lại” sự có mặt của chất kháng sinh trong
môi trường và kết quả là sẽ có hai khả năng xảy ra:
+ Vi sinh vật sẽ bị chết do kháng sinh
+ Vi sinh vật vẫn sống sót
Vi khuẩn được coi là kháng một loại kháng sinh nào đó nếu sự phát triển của
nó không bị ngừng lại khi kháng sinh đó đã được dùng ở nồng độ tối đa mà bệnh
nhân còn dung nạp thuốc [22].
Các kiểu kháng thuốc của vi sinh vật:
 Đề kháng tự nhiên:
Đề kháng tự nhiên là khả năng đã được hình thành ở mầm bệnh ngay khi
chúng chưa tiếp xúc với môi trường có kháng sinh.
Nguyên nhân: Có thể do đột biến ngẫu nhiên trong nhiễm sắc thể làm cho
quần thể vi sinh vật gây bệnh xuất hiện các chủng có khả năng kháng thuốc. Khi
bệnh nhân được điều trị trong thời gian nhất định thì chỉ có các chủng bình thường

bị tiêu diệt, còn những chủng kháng thuốc sẽ sống sót, tiếp tục sinh trưởng, phát
triển. Cuối cùng làm thay đổi hoàn toàn bản chất vi sinh của bệnh và vô hiệu hóa tác
dung điều trị của kháng sinh đó.

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

11
 Đề kháng thu được:
Là khả năng kháng thuốc của vi sinh vật xuất hiện sau khi chúng tiếp xúc với
kháng sinh.
Nguyên nhân của đề kháng thu được: Do biến cố di truyền mà vi khuẩn từ
chỗ không có trở nên có gen đề kháng với kháng sinh. Những biến cố này bao gồm
đột biến gen và nhận được gen kháng thuốc.
* Đột biến gen: Biến cố này xảy ra trước hoặc sau khi vi khuẩn tiếp xúc với
kháng sinh.
+ Đột biến một bước: mức độ đề kháng không phụ thuộc vào nồng độ
kháng sinh được tiếp xúc; có thể chỉ sau một lần đột biến, vi khuẩn đã đề kháng
rất cao. Đột biến kháng streptomycin, lincomycin và isoniazid là những đột biến
kiểu một bước.
+ Đột biến nhiều bước: mức độ đề kháng có liên quan tới nồng độ kháng
sinh. Trong trường hợp này kháng sinh là nhân tố chọn lọc giữ lại những cá thể đột
biến, cho nên ở lần đột biến sau thì nồng độ ức chế tối thiểu sẽ cao hơn lần trước. Đột
biến kháng penicillin, cephalosporin, tetracycline, chloramphenicol, aminoglycoside,
sulfamide và colistin là những đột biến kiểu nhiều bước.
Gen đề kháng xuất hiện do đột biến sẽ được lan truyền từ thế hệ này sang thế
hệ khác cùng với sự phân chia của tế bào vi khuẩn. Xác suất xuất hiện một đột biến
rất nhỏ (10
-6
- 10
-11

).
* Nhận gen kháng thuốc:
Gen kháng thuốc có thể nằm trên nhiễm sắc thể, trên plasmid hay trên transposon.
- Plasmid là những phân tử DNA xoắn kép dạng vòng khép kín, nằm ngoài
nhiễm sắc thể vi khuẩn, có khả năng tự sao chép, chúng mang các gen quyết định
cho sự xuất hiện một số tính chất mới của vi khuẩn. Plasmid kháng thuốc (R-
plasmid) là plasmid mang một hoặc nhiều gen mã hoá cho sự đề kháng với một
hoặc nhiều kháng sinh khác nhau. Vi khuẩn mang R-plasmid có thể cùng một lúc
kháng lại nhiều thuốc kháng sinh khác nhau (do mang nhiều gen kháng thuốc). Các
R-plasmid không chỉ có khả năng lan truyền dọc từ thế hệ trước sang thế hệ sau qua

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

12
sự phân chia của tế bào vi khuẩn, mà chúng còn có khả năng lan truyền ngang giữa
các vi khuẩn cùng loài hay khác loài qua sự tiếp hợp.
- Transposon (“gen nhảy”): là những đoạn DNA chứa một hoặc nhiều gen,
có thể “nhảy”từ plasmid vào nhiễm sắc thể và ngược lại hoặc từ plasmid này sang
plasmid khác.
 Đề kháng chéo:
Kháng chéo là hiện tượng một chủng vi sinh vật có khả năng kháng lại chất
kháng sinh nhất định thì cũng có khả năng kháng luôn một số chất kháng sinh khác
cùng nhóm cấu trúc hay có đặc tính tương đồng với chất kháng sinh ấy.
Nguyên nhân: Do cấu trúc hóa học của những kháng sinh đó tương tự nhau
và do chủng vi sinh vật đó có khả năng tiết ra độc tố làm mất tác dụng của một số
kháng sinh.
Đƣờng truyền tính kháng thuốc ở vi khuẩn
Gen kháng thuốc có thể lan truyền từ vi khuẩn này sang vi khuẩn khác qua
các hình thức sau:
+ Phân bào: gen kháng thuốc được vi khuẩn truyền lại cho thế hệ sau qua sự

phân chia của tế bào vi khuẩn.
+ Tiếp hợp: là hiện tượng hai vi khuẩn tiếp xúc trực tiếp với nhau và truyền
cho nhau đoạn DNA có mang gen đề kháng.
+ Biến nạp: là hiện tượng xảy ra khi vi khuẩn đề kháng bị li giải, giải phóng
các đoạn DNA tự do và những đoạn này xâm nhập vào các tế bào vi khuẩn khác.
+ Tải nạp: là hiện tượng phage mang gen đề kháng từ vi khuẩn này sang nạp
vào tế bào vi khuẩn khác
1.2.3. Cơ chế tác động của kháng sinh lên vi khuẩn
 Ức chế tổng hợp thành tế bào: Kháng sinh ức chế thành tế bào thực chất là
ức chế một bước nào đó của tổng hợp peptidoglycan của vi khuẩn. Khi mất thành
phần peptidoglycan cứng xung quanh tế bào vi khuẩn, tế bào thường bị chết do
trương nước, sưng lên hoặc bị nổ và khi không có thành tế bào chúng cũng dễ bị các
tế bào thực bào tiêu diệt.

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

13
 Gây rối loạn chức năng thẩm thấu chọn lọc của màng nguyên tương: Làm
cho các thành phần cần thiết bên trong tế bào thoát ra ngoài và nước đi vào trong
khiến tế bào bị vỡ.
 Ức chế tổng hợp protein: Bằng cách gắn vào ribosom 70S của vi khuẩn.
Kháng sinh gắn vào tiểu phần 30S (như Steptomycin) sẽ ngăn cản hoạt động của ARN
thông tin hoặc ức chế chức năng của ARN vận chuyển (như Tetracyclin). Kháng sinh
gắn vào tiểu phần 50S (như Erythromycin, chloramphenicol), làm cản trở sự liên kết,
hình thành các chuỗi acid amin tạo phân tử protein cần thiết cho tế bào sống.
 Ức chế sinh tổng hợp acid nucleic: Ngăn cản sự sao chép DNA (nhóm
Quinon), ức chế sao mã RNA (Rifampicin) hay ức chế sinh tổng hợp các chất
chuyển hóa cần thiết để ngăn cản hình thành nên các nucleotid như Sunfamid và
Trimethorpim.
1.2.4. Biện pháp hạn chế sự kháng thuốc

Để khắc phục hiện tượng kháng thuốc kháng sinh của vi sinh vật gây bệnh,
giải pháp trực quan và đơn giản là sử dụng các kháng sinh mới. Tuy nhiên, việc tìm
kiếm, phát hiện và sản xuất ra một kháng sinh mới là cả một khối lượng công việc
khổng lồ, tiêu tốn nhiều thời gian, nhân lực và tiền bạc. Đồng thời, để sự kháng
thuốc xảy ra cũng đồng nghĩa với việc phải trả giá bằng sức khoẻ, tính mạng của
bệnh nhân. Chính vì vậy, mọi nỗ lực nhằm hạn chế xuất hiện khả năng kháng thuốc
càng trở nên cần thiết và hiệu quả mà trước hết cần tôn trọng các nguyên tắc sau khi
sử dụng thuốc kháng sinh:
 Chỉ dùng kháng sinh để điều trị những bệnh nhiễm khuẩn (những kháng
sinh kháng khuẩn không có tác dụng trên virus).
 Chọn kháng sinh theo kết quả kháng sinh đồ, nên ưu tiên kháng sinh có
hoạt phổ hẹp.
 Dùng kháng sinh đủ liều lượng và thời gian (cho một đợt điều trị).
 Đề cao các biện pháp khử trùng và tiệt trùng, ngăn ngừa sự lan truyền vi
khuẩn đề kháng.
 Liên tục giám sát sự đề kháng kháng sinh của vi khuẩn để có chiến lược sử
dụng kháng sinh hợp lý [27].

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

14
1.3. Phân loại vi sinh vật
1.3.1. Khái quát về các phương pháp phân loại vi sinh vật truyền thống
Trước đây công tác phân loại vi sinh vật vẫn dựa căn bản trên các đặc tính
hình thái, sinh lý và hóa vi sinh vật: nhuộm, hình dạng tế bào khuẩn lạc, khả năng di
động, nhu cầu dinh dưỡng, khả năng sinh acid trong môi trường cũng như sắc tố tạo
thành v.v Các đặc trưng này đôi khi cũng bộc lộ những hạn chế do các đặc tính
được dùng cho nhóm vi sinh vật này (Enterobacteriaceae) nhưng lại không có ý
nghĩa đối với nhóm khác (vi khuẩn gram âm - gram negative bacteria). Hạn chế của
các phương pháp phân loại truyền thống dẫn đến nhiều trường hợp phải xác định lại

tên phân loại của một số vi sinh vật. Từ trước đến nay, đơn vị cơ bản của định tên vi
sinh vật là loài, bao gồm nhóm các cơ thể có mức độ tương đồng cao về các đặc
điểm hình thái.
Các phƣơng pháp dựa trên các phản ứng sinh hóa:
Từ những hạn chế của việc xác định các đặc tính hình thái dẫn đến nhiều
nghiên cứu tập trung vào các phản ứng sinh hóa đặc trưng cho các vi sinh vật riêng
biệt. Sự khác biệt của các phản ứng có ý nghĩa cho phân loại các vi sinh vật.
- API20E KIT
Nguyên tắc: Dựa vào 20 phản ứng khác nhau. Nói chung hiện nay có nhiều nơi
vẫn dùng kỹ thuật này nhưng nhìn chung kết quả cũng còn nhiều sai số do nhiều
nguyên nhân khác nhau: cụ thể trong các trường hợp gen quyết định phản ứng sinh hóa
nằm trong plasmid lại bị mất do nhiều nguyên nhân khác nhau như tuổi tế bào, lượng
giống cấy hay thay đổi trong quá trình nuôi cấy dẫn đến sai khác và làm sai kết quả.
Phân biệt bằng thực khuẩn thể
Các vi khuẩn có độ mẫn cảm với thực khuẩn thể khác nhau. Có thực khuẩn
thể xâm nhiễm làm tan tế bào ngay lập tức để sau đó thực khuẩn thể nhân lên thành
các hạt trong tế bào chủ, trong khi đó với một số vi khuẩn thì thực khuẩn thể xâm
nhiễm nhưng lại không làm tan tế bào vi khuẩn và chúng cùng tồn tại với tế bào vật
chủ. Dựa vào sự khác biệt này mà người ta dùng các thực khuẩn thể khác nhau để
phân biệt các đối tượng vi khuẩn nghiên cứu.

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

15
Tuy nhiên, phương pháp này cũng bộc lộ một số nhược điểm khó giải quyết
là các đặc tính mẫn cảm của vi khuẩn với thực khuẩn thể lại thay đổi do điều kiện
ngoại cảnh hoặc là vi khuẩn lại có mức độ mẫn cảm khác nhau đối với các thực
khuẩn thể khác nhau. Mặt khác nữa, thực khuẩn thể rất dễ thay đổi các đặc tính do
đó cũng làm thay đổi cơ chế xâm nhiễm vào vi khuẩn chủ.
- Phân biệt theo Typ huyết thanh

Đây là phương pháp được dùng khá lâu nhưng rất hiệu quả và hiện vẫn đang
được sử dụng (ví dụ nhóm vi khuẩn Bt). Nguyên tắc là dựa vào nhóm quyết định
kháng nguyên trên tế bào vi sinh vật (bề mặt tế bào tiên mao hoặc protein vỏ). Ưu
thế của phương pháp này là các kháng huyết thanh được dùng để biệt hóa nhiều chi
khác nhau, trong nhiều trường hợp đặc trưng cho loài. Nói chung đây là phương
pháp khá ổn định nhưng hạn chế chủ yếu của phương pháp này ở chỗ: yêu cầu kỹ
thuật sản xuất kháng huyết thanh và tiêu chuẩn hóa phản ứng kháng huyết thanh
không đồng nhất tại các phòng thí nghiệm và tính ổn định giữa các lần lặp lại [13].
1.3.2. Phương pháp phân loại bằng sinh học phân tử
Phân loại bằng sinh học phân tử là phương pháp mới có độ chuẩn xác cao.
Phương pháp này có thể phát hiện mô tả và giải thích tính đa dạng sinh học ở mức
độ phân tử và quan hệ giữa các loài trong phạm vi loài.
Ngày nay phương pháp phân loại vi khuẩn bằng phương pháp xác định và so
sánh trình tự gen mã hóa 16S rRNA đang được áp dụng phổ biến. Việc nghiên cứu
phân tử rRNA là phương pháp hữu hiệu nhất để xác định mối quan hệ, tiến hóa của
các vi sinh vật, có khả năng xác định, có tính bảo thủ cao, chúng chỉ khác nhau rất ít
giữa các nhóm vi sinh vật. Tuy nhiên, dựa vào sự khác nhau này, người ta có thể
đánh giá được mối quan hệ phát sinh chủng loại và phân loại vi sinh vật. Trong ba
gen mã hóa rRNA của vi khuẩn 5S rRNA, 16S rRNA và 23S rRNA thì gen 16S
rRNA là phù hợp nhất cho việc nghiên cứu phân loại hiện nay.
Gen mã hóa 5S rRNA có kích thước khoảng 120 nucleotid do có kích thước
nhỏ nên thông tin chứa đựng ít do đó khó phân biệt được chính xác sự khác nhau
giữa chi, loài và trong loài của vi sinh vật cũng như vị trí phân loại của chúng. Gen

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

16
mã hóa 23S rRNA có kích thước khoảng 2900bp quá lớn cho nên không thuận lợi
cho tách dòng, xác định trình tự và phân loại vi khuẩn. Gen mã hóa 16S rRNA có
kích thước khoảng 1500 nucleotid vùa đủ để phân loại chi tiết giữa các chủng vi

sinh vật không gây khó khăn trong các bước xác định trình tự gen. Và được ưu tiên
chọn lựa trong phân loại vi khuẩn. Cấu trúc của gen mã hóa 16S đã được các nhà
khoa học nghiên cứu kỹ và đã thiết kế rất nhiều cặp mồi chung dùng cho nhiều
nhóm vi khuẩn cũng như các cặp mồi đặc hiệu riêng cho các chi và loài. Đây là
thuận lợi lớn chi các nghiên cứu phân loại vi khuẩn và xạ khuẩn dựa trên gen mã
hóa 16S rRNA, [18][16].














Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

17
CHƢƠNG 2
ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1. Đối tƣợng và phạm vi nghiên cứu
* Đối tƣợng nghiên cứu: Các chủng P.aeruginosa phân lập được từ các
bệnh phẩm và môi trường bệnh viện.
* Địa điểm nghiên cứu: Bệnh viện Đa Khoa Trung Ương Thái Nguyên.

2.2. Vật liệu
2.2.1. Các mẫu nghiên cứu
- Các mẫu bệnh phẩm:
+ Mủ vết thương: 200 mẫu.
+ Dịch mũi họng: 100 mẫu.
+ Nước tiểu: 100 mẫu.
- Các mẫu lấy từ môi trường bệnh viện:
+ Nước: 100 mẫu, lấy từ các nguồn nước đang sử dụng trong bệnh viện
(nước rửa tay của bác sĩ, nước từ phòng mổ…)
+ Không khí: 100 mẫu, lấy từ các phòng mổ, phòng đẻ, phòng gây mê hồi
sức cấp cứu…
+ Trên bề mặt các dụng cụ y tế đang được sử dụng tại các phòng khám và xét
nghiệm trong bệnh viện: 200 mẫu.
2.2.2. Các thiết bị , hóa chất
* Thiết bị và dụng cụ
Tên dụng cụ Hãng sản xuất
- Kính hiển vi quang học: Đức
- Tủ ấm: Nhật
- Máy đặt khoanh giấy kháng sinh: Thụy Điển
- Box cấy vô trùng: Nhật
- Nồi hấp tiệt trùng: Hàn Quốc
- Thước đo vòng ức chế: Nhật Bản

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

18
Ngoài ra các dụng cụ vô khuẩn cần thiết cho việc lấy mẫu và nuôi cấy gồm:
- Dụng cụ lấy mẫu: Ống đựng bệnh phẩm, xi lanh, lọ thuỷ tinh có nút
mài vô khuẩn.
- Dụng cụ nuôi cấy: Đĩa petri, pipet, ống nghiệm, lam kính, la men, đèn cồn,

que cấy, khay men hoặc sắt không rỉ, giá để ống nghiệm…
* Hóa chất
- Thuốc nhuộm Gram: Thuốc nhuộm tím gentian, dung dịch lugol, cồn 90
0
,
dung dịch fucsin kiềm.
- Thuốc thử tính chất sinh vật hoá học: Thuốc thử oxidase. Dung dịch xanh
brommothymol 1,5% trong cồn 90
0
. Dung dịch đỏ methyl: Đỏ methyl 0,1g + cồn
95
0
.Thuốc thử kowaca (thử tính chất sinh indol).
- Thuốc thử phản ứng VP: Dung dịch A: α naphton 6% trong cồn 90
0
, để tủ
lạnh trước khi dùng. Dung dịch B: NaOH 16% trong nước.
- Nước muối NaCl 9‰
- Các hóa chất và thiết bị, máy móc sử dụng tại phòng thí nghiệm Công nghệ
Sinh học Môi trường và Phòng thí nghiệm trọng điểm Quốc gia về Công nghệ gen -
Viện Công nghệ Sinh học.
Các khoanh giấy kháng sinh
- Các khoanh giấy kháng sinh được sử dụng của hãng Bio - Rad (Pháp)
bao gồm:
Ampicillin (AM), Piperacine (PIP), Cefalexine (CN), Cefotaxime (CTX),
Cephalothin (CF), Cefazoline (CZ), Ceftazidime (CAZ), Ceftriaxone (CRO),
Gentamycine (GM), Amikacine (AN), Netromycine (NET), Tobramycine (TM), Co-
trimoxazol (SXT), Ciprofloxacine (CIP), Norfloxacin (NOR), Pefloxacine (PEF),
Doxycylin (DO), Chloramphenicol (C), Rifamycine (RA), Nitrofurantoin (FT).

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

19
2.2.3. Môi trường nuôi cấy, phân lập, xác định tính chất sinh hóa và làm kháng
sinh đồ
Thành phần và cách pha chế các môi trường được trình bày trong bảng 2.1
Bảng 2.1 Môi trƣờng nuôi cấy, phân lập, xác định tính chất sinh hóa
và làm kháng sinh đồ
Môi trƣờng
Thành phần
Số
lƣợng
Cách pha chế
Thạch
thƣờng
Cao thịt
Pepton
Bột NaCl tinh khiết
Thạch sợi
Nước cất

5g
10g
5g
20g
1000ml
Cân đong đầy đủ các thành phần
môi trường cho vào nồi nhôm, đun
nóng cho tan. Điều chỉnh pH (7,4 -
7,6) bằng NaOH 20%. Hấp ở 120

0
C
trong 15 phút. Đổ môi trường ra các
đĩa Petri.
Thạch
máu
Thạch thường
Máu thỏ đã loại tơ huyết

250ml
15ml
Đun nóng chảy 250 ml thạch
thường đựng trong bình cầu, để
nguội khoảng 55
0
C - 66
0
C. Cho 15
ml máu thỏ vào bình thạch. Lấy tay
lắc xoay tròn cho máu tan đều. Đổ
môi trường vào đĩa Petri.
Chocolate
Thạch thường
Máu thỏ đã loại tơ huyết

250ml
15ml
Làm như thạch máu rồi đun cách
thuỷ 80
0

C trong 10 phút. Chú ý phải
lắc đều bình thạch. Để nguội 45 -
50
o
C đổ ra đĩa.
Xitrat
simmon
NaCl
Nước cất vừa đủ
Natri xitrat (NH
4
)HPO
4

Magie sunfat, K
2
HPO
4

Thạch
Dung dịch xanh
brommothymol 1,5%
trong cồn 90
0

5g
1000ml
2g
1g
0,2g

1g
20g
10ml
Đun sôi tất cả các thành phần môi
trường cho đến khi tan hoàn toàn.
Điều chỉnh pH: 7,2. Thêm dung dịch
xanh brommothymol, môi trường sẽ
có màu xanh lá cây. Đổ môi trường
ra các ống nghiệm, hấp ở 110
0
C
trong 30 phút sau đó đem ra để
nghiêng cho môi trường đông lại.
Thạch
mềm
Pepton
Cao thịt
Muối tinh khiết
Cao men
Thạch
10g
3g
5g
6g
6g
Đun sôi cho tan hoàn toàn các chất.
Điều chỉnh pH = 7,6. Hấp ở 110
0
C
trong 30 phút. Đổ ra các ống

nghiệm 12mm mỗi ống khoảng 3ml.

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

20
Môi trƣờng
Thành phần
Số
lƣợng
Cách pha chế
Kligler
Cao thịt
Cao men
Pepton
NaCl tinh khiết
Lactoza
Glucoza
Natri thyosulfat
Feric xitrat
Thạch
Nước cất
3g
3g
20g
5g
10g
1000ml
0,5g
0,5g
12g

1000ml
Cho thạch vào nước, đun sôi cho
đến khi tan hoàn toàn. Thêm các
hoá chất còn lại vào để hoà tan.
Điều chỉnh pH: 7,4. Cho 6ml dung
dịch đỏ phenol 0,5%, khuấy đều rồi
phân phối vào các ống nghiệm
12nm mỗi ống khoảng 3ml. Hấp
110
0
C trong 30 phút, đem ra để ống
môi trường nằm nghiêng, sao cho
mặt nghiêng và mặt đứng dài
khoảng 2 - 2,5cm.
Mannitol
di động
Pepton
Thạch
Manitol
Kalinitrat
Dung dịch đỏ phenol 1%
trong nước
20g
4g
10g
1g
4 ml
Đun sôi, khuấy đều để hoà tan hoàn
toàn các hoá chất. Điều chỉnh pH:
7,6. Thêm dung dịch đỏ phenol,

phân phối môi trường ra các ống
nghiệm. Hấp 110
0
C trong 30 phút.

Clarklubs
Pepton
Bipotasic photphat
(K
2
HPO
4
)
Glucoza
Nước cất
5g
5g

5g
1000ml
Đun sôi để hoà tan các hoá chất.
Điều chỉnh pH 7,5; lọc trong. Phân
phối vào các ống nghiệm. Hấp ở
110
0
C trong 30 phút.
Urê indol
L.Tryptophan
Natri clorua
Photphat dipotasic

Urê
Nước cất
Dung dịch đỏ phenol
trong cồn
3g
5g
1g
20g
1000ml
2ml
Đun nóng 50 - 60
0
C để hoà tan các
chất. Điều chỉnh pH 7,2. Phân phối
vào các ống nghiệm mỗi ống 1 -
2ml. Hấp ở 110
0
C trong 30 phút.
Muller -
Hinton
Muller - Hinton
Nước cất
pH 7,0 - 7,2.
15g
0,3l
Đun cách thủy môi trường cho tan
thạch. Hấp ở 121
0
C trong 15 phút.
Để nguội 45

0
C - 50
0
C, đổ ra đĩa
Petri (độ dày môi trường ± 4mm)
trong box vô trùng.


Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

21
2.3. Phƣơng pháp và kỹ thuật nghiên cứu
Tiến hành lấy mẫu từ môi trường bệnh viện (nước, dụng cụ y tế, không
khí…), từ bệnh nhân (dịch khí phế quản, mủ vết thương…) nuôi cấy, phân lập, xác
định tỷ lệ nhiễm trùng P.aeruginosa trên bệnh nhân và tỷ lệ ô nhiễm P.aeruginosa ở
môi trường bệnh viện. Làm kháng sinh đồ để đánh giá mức độ kháng kháng sinh.
2.3.1. Phương pháp nghiên cứu
Phương pháp nghiên cứu mô tả
2.3.2. Các kỹ thuật nghiên cứu
- Nuôi cấy, phân lập, định danh vi khuẩn theo quy trình của Bộ y tế.
- Xác định tính nhạy cảm kháng sinh của vi khuẩn theo KIRBY - BAUR.
- Quan sát, mô tả, phân tích các chỉ số nghiên cứu.
- Phân nhóm Trực khuẩn mủ xanh dựa vào typ kháng huyết thanh.
- Phân loại vi khuẩn dựa trên so sánh trình tự gen mã hóa 16S rRNA
- Xử lý số liệu bằng phương pháp thống kê sinh học.
2.3.2.1. Kỹ thuật lấy bệnh phẩm
Tùy vào từng loại bệnh phẩm mà ta có kỹ thuật lấy khác nhau:
+ Bệnh phẩm mủ: Dùng tăm bông vô trùng lấy bệnh phẩm tại nơi ranh giới
tiếp giáp tổ chức vết thương với tổ chức lành, lấy mủ mới.
+ Bệnh phẩm dịch mũi họng: Đặt bệnh nhân ngồi (2 tay đặt lên đùi, mặt

ngửa một góc 30
o
). Cầm tăm bông vô trùng đưa vào mũi của bệnh nhân đến vùng tỵ
hầu, xoay nhẹ, lấy ra. Làm tương tự với lỗ mũi bên kia.
+ Bệnh phẩm nước tiểu: Dùng sonde vô trùng đưa vào đường tiết niệu của
bệnh nhân hoặc có thể lấy trực tiếp bằng cách bỏ nước tiểu đầu, lấy nước tiểu giữa
dòng cho vào ống vô trùng.
Đối với mẫu lấy từ môi trường:
- Mẫu nước: (lấy mẫu nước máy chưa sử dụng): Lấy vào lọ thuỷ tinh nút mài
vô khuẩn, trước khi lấy mẫu phải đốt vòi bằng ngọn lửa đèn cồn, vặn cho vòi nước
chảy 3 - 5 phút. Lấy xong đốt miệng lọ để sát khuẩn và đậy nút ngay.

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

22
- Mẫu không khí:
+ Đặt các đĩa môi trường cách sàn nhà 20cm (thường đặt giữa phòng hay các
góc tường).
+ Mở nắp đĩa thạch để khoảng 10 phút rồi đóng nắp hộp lồng lại đem nuôi cấy.
+ Mẫu từ các mặt phẳng dụng cụ y tế đang sử dụng: (lấy ở đầu ống hút dịch,
dao kéo, bông, gạc vô trùng): Dùng tăm bông vô khuẩn đã được làm ướt bằng nước
muối sinh lý quệt vào bề mặt các dụng cụ nghi ngờ có nhiều vi khuẩn [15].
2.3.2.2. Kỹ thuật phân lập
Nhuộm soi sơ bộ
Sau khi lấy được bệnh phẩm, đem nhuộm soi để quan sát hình thể, tính chất
bắt màu, kích thước và cách sắp xếp của vi khuẩn. Thông qua kết quả nhuộm soi sơ
bộ có thể định hướng cho việc nuôi cấy.
Phương pháp nhuộm: Sử dụng kỹ thuật nhuộm Gram
+ Soi dưới kính hiển vi quang học ở vật kính dầu với độ phóng đại 100.
+ Nhận định kết quả:

 Cầu khuẩn Gram dương bắt màu tím.
 Trực khuẩn Gram âm bắt màu đỏ, hình que.
Kỹ thuật nuôi cấy
- Sau khi lấy bệnh phẩm, tùy theo từng loại bệnh phẩm mà tiến hành nuôi
cấy trên các môi trường thích hợp. Tất cả các kỹ thuật nuôi cấy phải được thực hiện
trong box cấy vô trùng.
+ Bệnh phẩm là nước tiểu, mủ, mẫu nước, mẫu lấy từ mặt phẳng các dụng cụ
y tế: Nuôi cấy trên môi trường thạch máu.
+ Bệnh phẩm là dịch mũi họng: Nuôi cấy trên môi trường thạch máu và
thạch chocolate sau đó để tủ ấm CO
2
(5 - 7%).
* Tiến hành nuôi cấy:
- Đối với bệnh phẩm mủ, dịch mũi họng, mẫu lấy từ mặt phẳng các dụng cụ
y tế ta có quy trình nuôi cấy như sau:
+ Đánh dấu bệnh phẩm và số mẫu vào mặt sau hộp thạch những thông tin
trùng khớp nhau.

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

23
+ Tay trái cầm đĩa môi trường, khử khuẩn nơi định mở trên ngọn lửa đèn
cồn, dùng ngón cái và ngón giữa tay trái đẩy nắp hộp lồng lên.
+ Tay phải cầm que cấy lấy một một quai bệnh phẩm, ria cấy trên bề mặt
môi trường theo kỹ thuật cấy 3 vùng.
+ Đậy nắp hộp lồng, khử trùng que cấy.
+ Nuôi cấy trong tủ ấm trong 18 - 24 giờ, nhiệt độ 37
0
C.
- Đối với bệnh phẩm nước tiểu, trước khi nuôi cấy phải tiến hành pha loãng

100 lần trong nước muối sinh lý, cách làm như sau:
+ Lấy pipet vạch chuẩn hút ra 0,5ml nước tiểu cho vào ống nghiệm 1 (chứa
4,5ml nước muối sinh lý) tạo thành nước tiểu pha loãng 10
-1
, tiếp tục dùng pipet hút
ra 0,5ml dung dịch ở ống nghiệm 1 vừa pha cho vào ống nghiệm 2 (chứa 4,5ml
nước muối sinh lý) sẽ thu được nước tiểu pha loãng 10
-2
.
- Cách cấy nước tiểu:
+ Lấy pipet Pasteur hơ trên ngọn lửa đèn cồn, bẻ cong đầu que cấy tạo thành
góc 90
0
C.
+ Dùng pipet vạch chuẩn lấy ra một giọt bệnh phẩm đã pha loãng 10
-2
cho
vào môi trường nuôi cấy.
+ Dùng phần đầu của pipet Pasteur, dàn bệnh phẩm trên bề mặt môi trường.
+ Nuôi cấy trong tủ ấm 37
0
C từ 18 - 24 giờ.
- Cách cấy mẫu nước:
+ Nhỏ một giọt nước vào môi trường nuôi cấy.
+ Dùng tăm bông vô trùng dàn đều trên bề mặt môi trường.
+ Nuôi cấy trong tủ ấm 37
0
C trong 18 - 24 giờ.
Kỹ thuật cấy chuyển
Bệnh phẩm sau khi nuôi cấy ở nhiệt độ và thời gian thích hợp, dựa vào đặc

điểm hình thái khuẩn lạc của P.aeruginosa, ta chọn những khuẩn lạc có dạng R,
mùi thơm để cấy chuyển sang môi trường thạch thường nhằm mục đích thuần khiết
vi khuẩn. Cách cấy chuyển như sau:

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

24
+ Dùng que cấy lấy một khuẩn lạc nghi ngờ, ria cấy trên môi trường
thạch thường.
+ Nuôi cấy trong tủ ấm 37
0
C trong 18 - 24 giờ.
Sau khi khuẩn lạc đã được thuần nhất trên môi trường thạch thường ta đem
nhuộm vi khuẩn theo kỹ thuật nhuộm Gram nhằm kiểm tra hình thể và so sánh với
kết quả khi nhuộm soi sơ bộ, tiếp tục tiến hành xác định tính chất hóa sinh của vi
khuẩn này.
Kỹ thuật xác định tính chất hóa sinh của P.aeruginosa
- Bộ kít chạy tính chất sinh vật hoá học của P.aeruginosa bao gồm có 10 ống
chứa các loại môi trường (hình 2.1 phụ lục ảnh):
+ Oxidase (+). + Ống 1: Môi trường Xitrat Simmon.
+ Ống 2: Môi trường Kligler. + Ống 3: Môi trường Manitol
+ Ống 4: Môi trường thạch mềm. + Ống 5: Môi trường Urê indol.
+ Ống 6 và 7: Môi trường Clarklubs. + Ống 8: Môi trường LDC
+ Ống 9: Môi trường ADH + Ống 10: Môi trường ODC.
* Cách thử phản ứng oxidase:
+ Nhỏ vài giọt thuốc thử lên miếng giấy lọc, dùng que cấy gỗ hoặc tre lấy
khuẩn lạc và miết lên vùng giấy lọc vừa nhỏ thuốc thử. Kết quả oxidase dương tính
nếu vùng phết vi khuẩn chuyển màu tím sẫm trên giấy lọc sau vài giây, nếu không
có hiện tượng là phản ứng âm tính.
* Cách cấy vi khuẩn vào các ống:

- Đối với ống 1 và 2 chứa môi trường thạch nghiêng ta có cách cấy như sau:
+ Dùng que cấy lấy một ít khuẩn lạc trong đĩa thạch cho vào ống thạch
nghiêng, kéo từ đáy ống lên phần trên của mặt thạch nghiêng, vừa kéo vừa đưa que
cấy sang ngang theo những vạch chữ chi và tránh ria sát vào thành ống. Ở ống 2,
phần thạch đứng ta dùng que cấy lấy khuẩn lạc chọc thẳng xuống rồi rút que cấy lên
sau đó ria cấy trên bề mặt môi trường thạch nghiêng.