nghiên cứu tách dòng và đọc trình tự gen cry1ab, cry1ac mã hóa protein tinh thể diệt côn trùng bộ cánh vảy từ các chủng bacillus thuringiensis phân lập từ một số mẫu đất thuộc tỉnh thái nguyên

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC
==========






TRƯƠNG PHÚC HƯNG



NGHIÊN CỨU TÁCH DÒNG GEN cry1Ab,
cry1Ac MÃ HÓA PROTEIN DIỆT CÔN TRÙNG
BỌ CÁNH VẢY TỪ CÁC CHỦNG Bacillus
thuringiensis PHÂN LẬP TỪ MỘT SỐ MẪU ĐẤT
THUỘC TỈNH THÁI NGUYÊN





Chuyên ngành: Công nghệ Sinh học
Mã số: 60.42.80

LUẬN VĂN THẠC SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC








Thái Nguyên - 2010

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

1
MỞ ĐẦU
1. Đặt vấn đề
Thái Nguyên là một tỉnh miền núi trung du, nằm trong vùng trung du
và miền núi Bắc Bộ, có diện tích tự nhiên là 3.562,82 km
2
. Với địa hình thấp
dần từ núi cao xuống núi thấp, trung du, đồng bằng theo hướng Bắc – Nam
làm cho khí hậu Thái Nguyên chia thành ba vùng rõ rệt trong mùa đông: vùng
lạnh, vùng lạnh vừa, vùng ấm và hai mùa rõ rệt mùa mưa và mùa khô. Do ảnh
hưởng của địa hình, đất đai ở Thái Nguyên được chia thành ba loại chính,
trong đó, đất núi chiếm diện tích lớn nhất (48,4%) hình thành do sự phong hoá
trên các đá Macma, đá biến chất và trầm tích, độ cao trên 200m, tạo điều kiện
cho phát triển lâm nghiệp, trồng rừng, cây đặc sản….đất đồi chiềm 31,4% chủ
yếu hình thành trên cát kết, bột kết phiến sét và một phần phù sa cổ kiến tạo,
độ cao từ 150 – 200m, phù hợp với cây ăn quả lâu năm, cây công nghiệp và

đất ruộng chỉ chiếm 14,4%. Thái Nguyên còn có một diện tích lớn đất chưa
sử dụng. Kết cấu của đất, điều kiện khí hậu và đặc điểm về địa hình đã tạo ra
cho Thái Nguyên sự đa dạng về thực vật, động vật, cũng như các loài vi sinh
vậtt rong đó có vi khuẩn Bacillus thuringiensis[23].
B. thuringiensis là vi khuẩn gram dương, mang các gen cry sinh tổng
hợp bào tử và protein tinh thể độc tố có hiệu quả diệt đối với nhiều loài côn
trùng thuộc các bộ cánh vảy, cánh cứng và hai cánh. Trong những năm gần
đây các chủng Bt đã được các nhà khoa học phân lập với số lượng rất phong
phú [3]. Tuy nhiên, mỗi chủng chỉ chứa một số nhóm gen cry gây độc với một
số loài côn trùng nhất định. Vì vậy việc sàng lọc các chủng B. thuringiensis
có chứa gen cry mong muốn, tạo dòng và xác định trình tự gen độc tố đó là
vấn đề rất cần thiết, nó làm cơ sở cho các nghiên cứu đi sâu tiếp theo đối với
những gen cry này như: nhằm tạo ra các chủng B. thuringiensis tái tổ hợp mới

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

2
có phổ diệt sâu rộng, hoạt lực diệt sâu cao hơn đối với nhiều loài côn trùng
quan trọng; việc biến nạp các gen độc tố cry thích hợp vào từng loại cây trồng
để bảo vệ chúng trước sự tấn công của côn trùng. Protein tinh thể độc cry1Ab,
cry1Ac là một trong nhiều protein có hoạt tính cao chống lại côn trùng bộ
cánh vảy. Xuất phát từ mục đích này, chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài:
“Nghiên cứu Tách dòng và đọc trình tự gen cry1Ab, cry1Ac mã hóa
protein tinh thể diệt côn trùng bộ cánh vảy phân lập từ một số mẫu đất
thuộc tỉnh Thái Nguyên”.
2. Mục tiêu của đề tài
- Sàng lọc được các chủng Bacillus thuringiensis có hoạt tính diệt côn
trùng bộ cánh vẩy.
- Tách dòng và đọc trình tự được các chủng Bt nghiên cứu mang gen
cry1Ab và gen cry1Ac.

3. Nhiệm vụ của đề tài
- Thu thập các chủng Bt đã được phân lập chưa qua tuyển chọn từ đất Thái
Nguyên;
- Phân loại các chủng Bt var kurstaki bằng phương pháp huyết thanh;
- Phát hiện gen cry1Ab và gen cry1Ac bằng phương pháp PCR;
- Sàng lọc các chủng Bt var kurstaki có hoạt tính diệt sâu tơ;
- Tách dòng gen cry1Ab và gen cry1Ac;
- Xác định trình tự đoạn gen cry1Ab và đoạn gen cry1Ac đã được tách
dòng từ các chủng Bt nghiên cứu và so sánh với trình tự gen ở Ngân hàng Gen
quốc tế.


Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

3
CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Lƣợc sử nghiên cứu và ứng dụng của vi khuẩn Bacillus thuringiensis
1.1.1. Lịch sử nghiên cứu và ứng dụng Bacillus thuringiensis (Bt) trên thế giới
Năm 1901, nhà khoa học Nhật Bản Sigetane Ishiwata đã phát hiện ra
một loại vi khuẩn gây bệnh sotto ở trên tằm và ông đặt tên là Bacillus sotto.
Năm 1911, nhà khoa học Đức E. Berline cũng đã phân lập được một loại vi
khuẩn tương tự từ xác ấu trùng bướm phấn Địa Trung Hải, Anagasta
kaenniella. Mãi đến năm 1915, vi khuẩn này mới chính thức được mang tên
Bacillus thuringiensis do vi khuẩn này được phân lập từ vùng Thuringen của
Đức. Đến năm 1930, Bt đã được thử nghiệm chống sâu đục thân ở Châu Âu.
Năm 1938, chế phẩm Bt đã được sản xuất lần đầu tiên để diệt sâu hại lúa mỳ
tại Pháp. Năm 1953, Hannay và Fitzjame đã phát hiện ra thể vùi và công bố
tinh thể có bản chất protein. Năm 1956, Angus đã chứng minh hoạt tính diệt
sâu là do tinh thể tách ra từ tế bào và bào tử. Năm 1957, công ty Sandoz
(Thụy Sỹ) đã sản xuất ra một số lượng lớn thuốc trừ sâu Thuricide từ chủng

Bt. var. kurstaki. Đến năm 1962, de Barjac và Bonnfoi đã đưa ra một phương
pháp phân loại mới cho các chủng Bt và Bacillus sphaericus (Bs) bằng
phương pháp huyết thanh. Vào những năm 1960 – 1976, nhiều chủng Bt có
hoạt tính diệt sâu cao đã được phân lập và ứng dụng. Năm 1977, Goldberg và
Margarit đã phát hiện ra Bt var. isralensis diệt ấu trùng muỗi và ruồi thuộc bộ
hai cánh. Năm 1981, Schnepf và Whiteley đã lần đầu tiên phân lập và tách
dòng gen độc tố mã hoá protein tinh thể diệt sâu của chủng Bt. var kurstaki
HD-1 gọi là gen cry1 và biểu hiện ở E. coli. Từ đó, một số lượng lớn các gen
đã được tách dòng và đọc trình tự. Năm 1983, Krieg và cộng sự đã phân lập
ra loài phụ Bt var. tenebrionit diệt bọ cánh cứng hại lá khoai tây vùng
Colorado, Hoa Kỳ từ sâu tenebrio molitar. Sau đó, công ty Mycogen phát

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

4
hiện ra một chủng tương tự Bt. var. tenebrionit tên là Bt. var. sandiego và đã
tổng hợp được chuỗi gen độc tố của chúng. Năm 1985, gen cry của Bt đã
được chuyển vào cây trồng để diệt sâu. Năm 1987, phát hiện ra Bt diệt giun
tròn thực vật. Năm 1991, phát hiện ra Bt diệt ve bét, mạt thuộc bộ Trematoda.
Năm 1995, cây chuyển gen thương phẩm đầu tiên đã được đưa và sản xuất.
Năm 2003, saikai và cộng sự đã công bố protein tinh thể của Bt diệt tế bào
ung thư. Năm 2005, Ohba đã phát hiện ra protein của 4 dưới loài Bt phân lập
ở Việt Nam có khả năng chống tế bào ung thư cổ tử cung của người [3].
1.1.2. Lịch sử nghiên cứu và ứng dụng Bacillus thuringiensis tại Việt Nam
Ở Việt Nam thuốc trừ sâu sinh học Bt được ứng dụng đầu tiên tại Viện
Bảo vệ Thực vật năm 1971. Nguyễn Văn Cảm và cs, đã khảo nghiệm 5 loại
thuốc trừ sâu sinh học Bt nhập nội từ Liên Xô, Trung Quốc đã cho kết quả
rất khả quan. Tuy nhiên, những nghiên cứu, sản xuất và ứng dụng Bt đầu tiên
được Nguyễn Công Bình và cs thực hiện lần đầu tiên vào năm 1973 tại Viện
Sinh vật, Viện Khoa học (nay là Viện Khoa học và Công nghệ). Có thể chia

lịch sử 30 năm phát triển Bt của thành 3 thời kỳ như sau:
1.1.2.1. Thời kỳ mở đầu nghiên cứu
Nguyễn Công Bình, Phạm Bá Nhạ, Ngô Đình Bính là những người đầu
tiên mở đường nghiên cứu Bt tại Việt Nam. Năm 1973, Viện Sinh vật đã tiến
hành sản xuất Bt bằng phương pháp thủ công và bán công nghiệp trong phòng
thí nghiệm. Năm 1973-1976, Bt đã được sản xuất chủ yếu trên môi trường đặc
với giá thể là agar tự chế tạo từ rong câu và các nguyên liệu khác như: bã khô
lạc, bột đậu tương, bột cá, các chủng Bt được sử dụng để sản xuất ở thời kỳ
này do Nguyễn Công Bình mang từ Trung Quốc về có loài phụ Bacillus
thuringiensis var thuringiensis, B. thuringiensis var kurstaki. Các chế phẩm
này đã được sử dụng cho vùng rau ngoại thành Hà Nội và đã thu được các kết

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

5
quả tốt đẹp. Năm 1975, chế phẩm Bt đã được sản xuất theo phương pháp lên
men chìm trong nồi lên men tự tạo tại Phòng Sinh học thực nghiệm thuộc
phân viện Viện Khoa học đóng tại thành phố Hồ Chí Minh. Năm 1982, Viện
Công nghệ thực phẩm cũng sản xuất chế phẩm Bt theo phương pháp lên men
chìm với dung tích nồi lên men là 5m
3
. Từ năm 1984-1993, việc sản xuất chế
phẩm Bt đã bị giảm sút vì các chế phẩm Bt sản xuất ra có chất lượng không
cao nên tốc độ tiêu thụ giảm. Nhìn chung, trong thời kỳ này đã bắt đầu sản
xuất và áp dụng thành công chế phẩm Bt đã khiến cho các nghiên cứu Bt mở
đầu khá thuận lợi và tốt đẹp.
1.1.2.2. Thời kỳ sản xuất và ứng dụng (1984-1994)
Các chế phẩm Bt sản xuất theo phương pháp dịch thể được áp dụng rộng
rãi, có hiệu quả phòng trừ rất rõ rệt, hơn nữa giá bán không cao (khoảng 6000
đồng/lít) nên phù hợp với thu nhập của nông dân. Việc sản xuất chế phẩm Bt

theo phương pháp lên men hở không cần vô trùng đã được một số đơn vị
thuộc các trường đại học đề xuất nhưng đã không thu đươc kết quả tốt.
1.1.2.3. Thời kỳ nghiên cứu cơ bản, ứng dụng và phát triển (1994-nay)
Cuối thời kỳ sản xuất và ứng dụng 1984-1993, chế phẩm Bt kém chất lượng
không tiêu thụ được. Sản xuất và ứng dụng Bt bước vào thời kỳ thoái trào, các nhà
nghiên cứu lại phải quay lại nghiên cứu cơ bản để phục vụ cho xây dựng công
nghệ sản xuất và cơ sở ứng dụng. Do vậy, khoảng 10 năm trở lại đây, các nhà
khoa học đã chuyển việc nghiêm cứu Bt sang hướng mới là tìm ra các chủng Bt có
phổ diệt sâu rộng, hoạt tính diệt sâu cao để phục hồi lại việc sản xuất thuốc trừ sâu
Bt và ứng dụng công nghệ chuyển gen Bt phục vụ sản xuất.
Các chủng Bt phân lâp tại Việt Nam rất đa dạng về thành phần loài và đa
dạng về gen. Năm 1998, có 34 chủng chuẩn mang kháng nguyên tiêm mao H
và đã chế tạo được 34 bộ sinh phẩm (kit) phục vụ cho phân loại Bt bằng

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

6
phương pháp huyết thanh. Bằng phương pháp PCR với hỗn hợp các cặp mồi
đặc hiệu cho 7 gen thuộc nhóm gen cry typ 1 cho thấy có 102 chủng Bt trong
tổng số 115 chủng có chứa 311 gen cry1 (chiếm 88.7%), đáng chú ý là các
chủng chứa 5 gen cry1Aa, cry1Ab, cry1Ac, cry1C và cry1D - chiếm 6,8% [1].
Trên cơ sở phát hiện, tách dòng và đọc trình tự gen có trong các chủng Bt
phân lập tại Việt Nam, Ngô Đình Bính và cs đã tách dòng và biểu hiện gen
mã hóa tổng hợp protein Cry1C và Cry1D diệt sâu khoang trong E. coli từ các
chủng Bt aizaiwai phân lập từ các mẫu đất của Hà Nội và Hà Tĩnh, các
protein tái tổ hợp thu được đã cho hiệu quả diệt sâu cao hơn so với đôi chứng.
Năm 2000, Võ Thị Thứ và cs đã tách dòng và biểu hiện gen mã hóa protein
cry4A diệt ấu trùng muỗi. Năm 2003, Lê Thị Thu Hiền đã thiết kế thành công
vectơ chuyển gen cry1A vào cây bông [1].
Ở Việt Nam, những nghiên cứu về lĩnh vực chuyển gen kháng côn trùng

vào cây trồng để tạo ra các cây có khả năng kháng các sâu bệnh mới đã được
bắt đầu từ cuối thế kỷ 20. Trong đó, đã có rất nhiều nghiên cứu chuyển gen
cry1A kháng sâu vào cây trồng thông qua vi khuẩn Agrobacterium
fumefaciens để tạo ra các giống cây trồng mới có khả năng kháng sâu như:
cây đậu xanh, cây cải bông [4.5,6,9,10]. Năm 2003, Phan Đình Pháp và cs
đã chuyển gen cry1B vào cây lúa thông qua phương pháp sử dụng súng bắn
gen, đến năm 2005, gen kháng sâu trên được chuyển vào cây cà tím thông qua
vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens [11].
1.2. Đại cƣơng về vi khuẩn Bacillus thuringiensis
1.2.1 Đặc điểm hình thái
Theo các tài liệu về phân loại vi khuẩn gây bệnh côn trùng của Sneath
(1986) Wistreich và Lechtman (1988), Syahly (1991) thì vi khuẩn Bt được
xếp vào nhóm I, chi Bacillus, họ Bacillaceae, nghành Firmicutes [3].

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

7
Bt thuộc chi Bacillus là vi khuẩn đất, hình que, gram dương, hô hấp hiếu
khí hoặc kỵ khí không bắt buộc, kích thước tế bào từ 3 – 6 µl, có phủ tiêm
mao không dày, chuyển động được. Các loài thuộc chi Bacillus có khả năng
hình thành bào tử khi gặp những điều kiện bất lợi của môi trường, bào tử có
dạng hình trứng với kích thước từ 1,5 - 2 µl và có thể nảy mầm thành tế bào
sinh dưỡng khi gặp điều kiện thuận lợi. Bào tử là dạng sống tiềm ẩn của vi
khuẩn có khả năng chịu nhiệt, bức xạ, hoá chất, áp suất thẩm thấu cao. Màng
ngoài nằm ở ngoài cùng đó là phần sót lại của tế bào mẹ, chiếm khoảng 2 –
10% khối lượng khô của bào tử. Thành phần chủ yếu là lipoprotein, cũng có
một lượng nhỏ axit amin, có tính thẩm thấu kém. Lớp áo bào tử có cấu tạo bởi
3 – 15 lớp, chủ yếu là protein sừng. Áo bào tử có sức đề kháng cao với
lizozim, proteinaza, các chất hoạt động bề mặt, có tính thẩm thấu kém đối với
các cation. Dưới áo bào tử là vỏ bào tử. Vỏ bào tử chứa một lượng lớn

peptidoglucan đặc biệt, ít liên kết chéo, ngoài ra còn có 7 – 10% (tính theo
khối lượng khô của bào tử) chất dipicolinat canxi (DPA- Ca) không chứa axit
teicoic. Áp suất thẩm thấu của lớp vỏ bào tử cao tới 20atm, lượng chứa nước
là 70%. Dưới lớp vỏ bào tử là lõi bào tử còn gọi là thể chất nguyên sinh cấu
tạo bởi 4 thành phần: thành bào tử, màng bào tử, bào tử chất và vùng nhân.
Đặc biệt trong quá trình hình thành bào tử vi khuẩn Bt có thể sinh ra
những tinh thể mang tính độc đối với côn trùng. Tinh thể là một loại protein
có kích thước khoảng 0,6 x 0,02 μm có thể chiếm 25% trọng lượng khô của tế
bào và có hình dạng rất đa dạng: hình tháp, hình ovan, hình lập phương hoặc
có hình dạng không xác định … Khi ở trong tế bào sinh dưỡng thì bào tử và
tinh thể thường nằm kề nhau, khi tế bào tan thì bào tử và tinh thể cùng thoát
ra ngoài [3,14].
Khi nhuộm tế bào Bt bằng thuốc nhuộm fushin và quan sát dưới kính
hiển vi ta thấy tinh thể Bt bắt màu hồng sẫm còn bào tử thì bắt màu hồng nhạt
(hình 1.1) [3,6,7].

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

8









Bt có đặc điểm hình thái sinh lý, sinh hoá rất giống với các nhóm trực
khuẩn sinh bào tử B. cereus, B. mycoides và B. anthracis tuy nhiên Bt có khả

năng sinh tinh thể còn loài khác thì không [4].
1.2.2 Đặc điểm sinh hoá
Bt không lên men sinh axit với arabinoza, xiloza và manitol nhưng tạo
axít trong môi trường có glucoza, có khả năng thuỷ phân tinh bột, khử nitrat
thành nitrit, có phản ứng với lòng đỏ trứng gà, phát triển được trong môi
trường thạch kị khí có chứa 1% lizozim. Bt có khả năng sinh trưởng và phát
triển ở nhiệt độ 15 – 45
0
C, nhiệt độ tối ưu là 28 – 30
0
C, pH = 7. Bt không có
khả năng khử amin của phenilalanin, không sử dụng axít axetic, không khử
muối sunfit.
1.2.3. Tính chất nuôi cấy
Tính chất nuôi cấy là đặc tính vốn có của vi sinh vật, là một trong những
tiêu chuẩn để định loại vi sinh vật. Tính chất nuôi cấy của các dưới loài Bt


Hình 1.1: Hình thái bào tử và tinh thể của một số chủng Bacillus thuringiensis
(A: Kính hiển Vi quang học; B: Kính hiển vi điện tử quét)

A
B

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

9
khác nhau là khác nhau, đồng thời phụ thuộc vào thành phần môi trường, thời
gian và nhiệt độ nuôi cấy.
Khuẩn lạc của dưới loài Bt var . kurstaki nuôi cấy trên môi trường MPA

ở 30
0
C trong 72 giờ đa số có hình tròn, màu trắng sữa có mép nhăn đường
kính có thể đạt tới 8 – 10mm. Trong khi đó khuẩn lạc loài phụ berlinner có
dạng thảm, với các sợi hình phóng xạ, đường kính khoảng 10mm; màu vàng
nhạt và trơn ướt, viền nhăn thành hình vải thô mở rộng ra xung quanh nên
được gọi là dạng phóng xạ nhăn. Nếu nuôi cấy có bổ sung 2% gluco, nuôi ở
30
0
C trong 24 giờ có thể thấy các điểm khuẩn lạc nhỏ màu vàng trên bề mặt,
sau 42 giờ thành hình vành khăn tròn dày, đường kính 3mm, giữa có một
vành tròn tương đối sâu, bề mặt trắng tối, hơi ánh quang, dạng hạt thô khô,
sau 72 giờ đường kính có thể đạt 2cm. Một số chủng Bt xuất hiện khuẩn lạc
trơn nhẵn [3,4].
1.2.4. Phƣơng pháp phân loại Bacillus thuringiensis
Có nhiều phương pháp phân loại Bt khác nhau. Khóa phân loại đầu tiên
được thiết lập dựa trên đặc điểm hình thái và đặc điểm sinh hoá (Heimpel và
Angus, 1958). Tuy nhiên phân loại theo phương pháp này không phân biệt
được các chủng Bt một cách rõ ràng bởi vì Bt có các đặc điểm hình thái, sinh
lý sinh hoá rât giống các đại diện trong nhóm trực khuẩn sinh bào tử Bacillus
cereus, B. thuringiensis, B. mycoides, B. anthacis. Mới đây phát hiện thêm 2
loài là B. weihenstephanensis và B. pseudomycoides [3,4,14].
Ngoài ra, người ta con phân loại vi khuẩn Bt theo typ huyết thanh kháng
protein tinh thể, typ huyết thanh kháng nguyên – O, theo loại hình enzym
lipaza, dựa trên plasmit và phân loại theo nguồn bệnh. Nhưng trong cùng một
chủng có sự tồn tại của các typ gen ngoại độc tố khác nhau (Sanchis và cộng

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

10

sự, 1988) đã ngăn chặn việc sử dụng các đặc điểm này là cơ sở cho khoá phân
loại các chủng B t [3,14].
Cho đến nay, khoá phân loại vi khuẩn Bt theo phương pháp huyết thanh
được de Barjac và Bonnefoi đề nghị vào năm 1962, sau đó được Lauren và
Thyery cải tiến năm 1996, được sử dụng phổ biến và là phương pháp đáng tin
cậy được trung tâm quốc tế Bt đặt tại viện Pasteur, Paris khuyến cáo sử dụng
cho tất cả các phòng thí nghiệm nghiên cứu Bt trên thế giới từ năm 1982 [2,3].
Nguyên lí: Khi kháng nguyên lông roi kết hợp với kháng thể xảy ra phản
ứng ngưng kết. Kết quả của phản ứng là tạo cặn lắng màu trắng xuống đáy
ống nghiệm có thể quan sát bằng mắt thường. Dưới kính hiển vi đối pha hoặc
kính hiển vi quang học có thể quan sát thấy các tế bào bị cố định lại không
chuyển động được. Đến năm 2003, người ta đã phát hiện được 69 typ huyết
thanh bao gồm 82 thứ huyết thanh khác của Bt [3,14].


Tế bào vi khuẩn với
kháng nguyên bề
mặt
Phân tử kháng thể
với 2 vị trí liên kết
đặc hiệu.
Phản ứng ngưng kết.
Hình 1.2. Phản ứng ngưng kết của vi khuẩn Bt với kháng nguyên lông roi H

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

11
1.2.5. Đặc điểm loài phụ Bacillus thuringiensis var. kurstaki
Bacillus thuringiensis var. kurstaki được phát hiện lần đầu tiên năm
1901, tuy vậy tiềm năng thương mại của nó đã bị lãng quên cho đến mãi năm

1951. Tuy nhiên, trong các thập kỷ gần đây, B. thuringiensis var. kurstaki đã
trở thành phương tiện chủ yếu để kiểm soát sâu hại cây vân sam tại Canada.
Đến năm 1986, việc sử dụng Bt. var. kurstaki tăng một cách đáng kể, khoảng
74% rừng được phun đối với sâu hại cây vân sam. Ở các nước khác, Bt. var.
kurstaki được sử dụng để trừ sâu bướm, bướm đêm, sâu thuốc lá và đặc biệt là
sâu tơ hại bắp cải, sinh sản nhanh, thời gian sống ngắn nhưng mức độ phá
hoại cao.
Bacillus thuringiensis var. kurstaki là một trong số 82 dưới loài của vi
khuẩn B. thuringiensis và chiếm tỉ lệ cao nhất. Theo các tài liệu công bố, thì
trong số 83,5% số chủng kiểm tra ngưng kết với các typ huyết thanh đã có thì
Bacillis thuringiensis var. kurstaki ngưng kết với typ H
3a,3b,3c
chiếm 27,6%,
sau là B. thuringiensis var. azawai ngưng kết với typ H
7
chiếm 15%, B.
thuringiensis var. morrisoni ngưng kết với typ H
8a,8b
chiếm 13,8%,…Bacillus
thuringiensis var. kurstaki sinh tinh thể hình lưỡng tháp, hình lập phương và
hình cầu trong đó hình lưỡng tháp là chủ yếu cà có hoạt tính với côn trùng bộ
cánh vẩy (Lepidoptera), và một số côn trùng bộ hai cánh (Diptera). Các tinh
thể có trọng lương phân tử 130 – 140kDa được mã hóa bởi 130 gen cry1 khác
nhau từ cry1A – cry1F. Dưới đây là bảng phân loại độc tố Cry1 ở Bacillus
thuringiensis var. kurstaki và côn trùng [3].

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

12
Bảng 1. Phân loại độc tố Cry1 ở Bacillus thuringiensis var. kurstaki và côn

trùng đích
Độc tố
Trọng lƣợng
phân tử (kDa)
Côn trùng đích
Cry1Aa
132,2
Mandacasexta, Bomby mori, Pieris brassiace,
Plutella xylostella, Ostri nianubilalis
Cry1Ab
131
Heliothis vires cens, Mandacasexta, Pieris
brassiace
Cry1Ac
133,3
Tricho plusiani, Ostrinia nianubilalis,
Heliothis virescens, Manduca sexta, Pieris
brassiace
Cry1B
138
Pieris brassiace
Cry1C
134,8
Spodoptera littoralis, Pieris brassiace,
Spodoptera exigua, Mamestra brassicae
Cry1D
132,5
Manduca sexta, Spodoptera exgua
Cry1E
130

Manduca sexta, Spodoptera exgua,
Spodoptera littoralis
Cry1F
133,6
Ostrinia nianubilalis, Heliothis virescens,
Spodoptera exgua
1.2.6. Hệ thống di truyền của vi khuẩn
1.2.6.1. Hệ gen của vi khuẩn Bt
Kích thước hệ gen của vi khuẩn Bt vào khoảng 2,4 – 5,7 triệu bp .Thể
nhân (Nuclear body) ở vi khuẩn là dạng nhân nguyên thuỷ, chưa có màng
nhân nên không có hình dạng nhất định, và vì vậy được gọi là vùng nhân. Khi

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

13
nhuộm màu tế bào bằng thuốc nhuộm Feulgen có thể thấy nhân hiện màu tím.
Đó là một nhiễm sắc thể duy nhất dạng vòng chứa một sợi ADN xoắn kép.
Thể nhân chứa đựng thông tin di truyền của vi khuẩn Bt. Hầu hết các chủng
Bt phân lập mang các nhân tố di truyền ngoài NST, các nhân tố di truyền này
có thể đóng vòng hoặc không đóng vòng.
1.2.6.2. Phân loại gen độc tố diệt côn trùng của Bacillus thuringiensis
Năm 1982, Held và cộng sự đã lần đầu tiên sử dụng chữ viết tắt cry từ
chữ Crytal có nghĩa là tinh thể để biểu diễn gen tổng hợp protein tinh thể diệt
sâu. Các chủng Bt sinh tổng hợp 3 dạng độc tố đó là: Độc tố Cry (dạng chủ
yếu – tinh thể độc) được mã hóa bởi các gen cry khác nhau và độc tố Cyt (độc
tố phân huỷ tế bào) do gen cyt mã hoá, độc tố này làm tăng khả năng diệt côn
trùng của độc tố Cry và độc tố Vip (vegetative insecticidal protein) do gen vip
mã hoá tổng hợp. Gen này không xếp vào họ gen cry vì không sinh tinh thể.
Các chủng Bt khác nhau có hoạt tính diệt côn trùng khác nhau. Nhiều
nghiên cứu đã cho thấy rằng hoạt tính và phổ tác dụng diệt côn trùng được

quyết định bởi cấu trúc protein tinh thể [3].
1.2.6.3. Vị trí của các gen mã hoá protein tinh thể diệt côn trùng trong tế bào
Từ những năm đầu thập kỷ 80, nhiều nhà nhiên cứu tập trung vào sự
tồn tại của các gen ICPs (insecticidal crytal protein) ở các loài phụ Bt khác
nhau. Một số nghiên cứu về mối tương quan về sự có mặt của plasmid và khả
năng hình thành tinh thể diệt côn trùng. Các phương pháp xử lý plasmid, tiếp
hợp và các thí nghiệm tách dòng đã chứng minh rằng các gen mã hoá protein
diệt côn trùng thường nằm trên các plasmid có hệ số copy thấp. Tuy nhiên, có
những công bố về sự tồn tại của gen mã hoá protein tinh thể diệt sâu trong
nhiễm sắc thể của một số dưới loài như: kustaki HD1 entomocidus, aizawai
7.92, dendrolimus và wuhanensis. Carlton và Gonzalez đã tiến hành cuộc điều

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

14
tra về sự có mặt của plasmid trong hầu hết các chủng Bt. Những nghiên cứu
của họ trên 21 loài phụ Bt cho thấy số plasmid dao động từ 2 đến 12 trong các
chủng nghiên cứu. Các thí nghiệm lai gen đã cung cấp bằng chứng về sự tồn
tại của các gen tổng hợp nhiều loại độc tố trong một tế bào Bt. Ví dụ các
plasmid trong Bt var aizawai và kurstaki HD1 có 5 gen mã hóa protein diệt
côn trùng nằm nhiều vị trí khác nhau trong tế bào [4,21].
Sau những nghiên cứu về xác định vị trí của các gen độc tố trong tế bào
vi khuẩn, rất nhiều nhóm nghiên cứu đã tách dòng gen ICP của một số dưới
loài Bt. Năm 1981, Schnepf và Whitelay công bố đã tách dòng và biểu hiện
gen cry từ Bt. var kustaki HD1 trong chế phẩm Dipel. Họ đã biểu hiện được
gen trong E.coli và chỉ ra rằng chủng này có hoạt lực đối với ấu trùng
Manduca sexta. Tiếp theo công bố này, hàng loạt công bố về gen mã hoá cho
tiền độc tố (protoxin), đã được tách và đọc trình tự. Các gen này tổng hợp
protein diệt côn trùng bộ cánh vảy, hai cánh và cánh cứng. Hiện nay có tới
hơn 300 gen đã được tách dòng và đăng kí trên ngân hàng dữ liệu gen (Gene

Database) [7].
1.2.6.4. Đặc điểm riêng của một số nhóm gen và độc tố của chúng
Nhóm gen cry1: gồm trên 130 gen thuộc các nhóm gen cry1A-cry1L
mã hoá cho các protein có khối lượng 130kDa, tích luỹ thể vùi dạng hình tháp
và thường chỉ có hoạt tính chống lại các loài thuộc bộ cánh vảy, hai cánh, điển
hình là ấu trùng bướm ngài, côn trùng keo, côn trùng tơ Nhóm gen này được
phân thành các nhóm phụ sau: cry1A, cry1B, cry1C, cry1D, cry1E …. Trong
đó gen cry1A được chia làm 3 gen cry khác nhau : cry1Aa, cry1Ab, cry1Ac
với hơn 80% các axit amin tương đồng.
Nhóm gen cry2: Mã hóa tổng hợp protein có trọng lượng phân tử
khoảng 71 kDa, tạo thể vùi hình lập phương trong đó bao gồm cry2A, cry2B

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

15
và cry2C, cả ba gen này đều mã hoá tổng hợp protein có trên dưới 633 axit
amin. Có độc tính đối với côn trùng bộ cánh vảy (Heliothis virecens và
Lymantri adipans), bộ 2 cánh (Aedes aegypti). Riêng gen cry2B và cry2C
tổng hợp protein chỉ gây độc cho bộ côn trùng cánh vẩy.
Nhóm gen cry3: Gồm 16 gen thuộc các nhóm cry3A-cry3C mã hoá cho
các protein có khối lượng khoảng 73kDa tạo tinh thể hình lưỡng tháp, hình
lập phươn, có hoạt tính chống lại các loài thuộc bộ cánh cứng.
Nhóm gen cry4: Gồm 8 gen thuộc nhóm cry4A - cry4B mã hoá cho cả
2 loại protein tinh thể có khối lượng 70kDa và 130kDa tạo tinh thể hình cầu và
hình lập phương, có hoạt tính đối với các loài thuộc bộ 2 cánh. Độc tính của
protein nhóm 4 tăng mạnh khi chúng tạo phức với protein 27kDa do gen cyt
mã hoá.
Nhóm gen cry5: Mã hoá cho protein có khối lượng 81kDa, gây độc
với côn trùng thuộc bộ cánh vảy và cánh cứng [20].
Nhóm gen mã hoá cho độc tố Cyt: Nhóm gen cyt bao gồm 2 lớp cyt1

và cyt2 mã hoá tổng hợp protein 27kDa, là thành phần chính của tinh thể,
protein này có tác dụng tiêu hủy tế bào động vật không xương sống.
Nhóm gen cyt thông thường tồn tại ở các chủng Bt chứa nhóm gen cry4.
Nhóm gen cyt mã hoá protein có trọng lượng khoảng 27KDa và có trong thể
vùi (chiếm khoảng 40 – 50% tinh thể). Tinh thể độc này thường có tác dụng
yếu với côn trùng thuộc bộ 2 cánh và giun tròn thuộc bộ thân mềm.
Nhóm gen mã hoá cho độc tố Vip: Gần đây người ta đã phát hiện ra
một số loại protein tiết ra môi trường nuôi cấy Bt trong pha sinh trưởng, có
một độc lực lớn đối với côn trùng. Protein này được gọi là Vip (vegetative
insecticidal protein) do gen vip mã hoá tổng hợp. Gen này không xếp vào họ
gen cry vì không sinh tinh thể.

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

16
1.2.6.5. Đặc điểm về gen cry1Ab, cry1Ac
Gen cry1Ab kích thước gen 3468 bp mã hóa tổng hợp protein tinh thể độc
tố Cry1Ab với trọng lượng phân tử 131kDa, có hoạt tính độc với côn trùng
cánh vẩy, và có trong các dưới loài Bacillus thuringiensis var. kurstaki, var.
berliner, var. aizawai [40].

Gen cry1Ac có kích thước 3537 bp mã hóa tinh thể độc tố có trọng
lượng phân tử 133,3 kDa diệt côn trùng cánh vẩy. Nhóm dưới loài B.
thuringiensis var. kurstaki, var. enyae có sinh tinh thể hình thoi chứa gen
cry1Ac [17].
Khi phân tích vùng 2 của độc tố Cry1Ac và Cry1Ab, người ta nhận thấy
chúng có cấu trúc bậc 1 gần giống nhau. Ngoài ra, trong nghiên cứu khả năng
tổ chức các thụ thể trên màng tế bào ruột côn trùng thì vùng 2 của độc tố
Cry1Ac có khả năng liên kế t cả 3 loại thụ thể có khối lượng phân tử khác
nhau [17].

A
B
Hình 1.3. A: Cấu trúc không gian của độc tố cry1Ab
B: Cấu trúc không gian của độc tố cry1Ac

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

17
1.3. Các loại độc tố của Bt
Bt có 4 loại độc tố: ba ngoại độc tố và một nội độc tố.
* Ngoại độc tố α
Ngoại độc tố α có bản chất là một enzym gọi là photpholipase hoặc
leucithinase có hoạt tính với một vài loài ong cắn lá. Độc tố này có khối
lượng phân tử thấp, không bền với nhiệt. Tác dụng độc của ngoại độc tố có
liên quan tới sự phân hủy photpholipit ở mô của côn trùng. Nghiên cứu này
được phát hiện bởi Toumanoff năm 1953.
* Ngoại độc tố β
Ngoại độc tố β có trọng lượng phân tử thấp 707 – 850 kDa, là độc tố bền
nhiệt, tan trong nước. Ngoại độc tố β có tác dụng kìm hãm nucleaza và ARN
– polymeaza dẫn tới cản trở việc tổng hợp ARNt. Ngoại độc tố β có phổ hoạt

tính rộng, có hoạt tính với côn trùng thuộc bộ cánh vảy, côn trùng thuộc bộ
cánh cứng và côn trùng thuộc bộ hai cánh. Qua nghiên cứu Brian Federici và
Dongwu cũng nhận thấy rằng chế phẩm Bt nếu chỉ sử dụng ngoại độc tố β thì
hiệu quả diệt côn trùng chỉ đạt 20% trong khi đó nếu bổ sung độc tố γ thì hiệu
quả diệt côn trùng sẽ tăng lên tới 75%.
* Ngoại độc tố γ
Ngoại độc tố có γ trọng lượng phân tử thấp, mẫn cảm với nhiệt độ, ánh
sáng và không khí, có khả năng tan trong nước. Độc tố này thuộc nhóm
photpholipase, có tác dụng lên photpholipit và giải phóng ra axit béo, rất mẫn
cảm với nhiệt độ, ở nhiệt độ từ 60
0
C trở nên trong vòng từ 10 – 15 phút đã bị
vô hoạt.

* Nội độc tố δ

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

18
Nội độc tố δ có tác dụng diệt côn trùng mạnh nhất. Nó có bản chất là một
protein gồm 1180 axit amin, các axit amin chủ yếu là glutamic, asparaginic,
chiếm trên 20% tổng số axit amin trong phân tử protein, đây cũng là một
nguyên nhân gây ra điểm đẳng điện thấp. Lượng xistin nhỏ hơn 20% tổng số
axit amin quy định sự không hòa tan của tinh thể, ngoài ra còn có các axit
amin: acginic, treonin, lơxin, izolơxin.
Ngoài protein tinh thể còn chứa các thành phần khác như: hydratcacbon,
tuy nhiên cũng có thể hydratcacbon chỉ là thành phần phụ được pha tạp trong
quá trình hình thành bào tử. Xét về thành phần hóa học thì nội độc tố chứa
chủ yếu các nguyên tố C, H, O, N, S. Ngoài ra còn có Ca, Mg, Si, Fe và một
lượng nhỏ Ni, Ti, Zn, Al, Cu, Mn. Tuy nhiên, nguyên tố P hầu như không có.

Nội độc tố δ có đặc điểm không hòa tan trong các dung môi hữu cơ, chỉ
tan trong môi trường có pH kiềm, không tan trong nước, rất bền nhiệt. Khi
đun nóng ở 65
0
C trong một giờ không bị mất hoạt tính, chỉ khi đun ở 100
0
C
trong 30 – 40 phút thì tinh thể bị mất tính độc.
1.4. Đặc điểm của protein tinh thể độc
1.4.1. Cấu trúc của protein tinh thể Cry
Cấu trúc của protein tinh thể đã được làm sáng tỏ nhờ kỹ thuật nghiên
cứu tinh thể bằng tia X với những nghiên cứu đầu tiên về cấu trúc Cry3A và
Cry1Aa, sau đó được mở rộng cho các độc tố khác. Các protein tinh thể có
cấu trúc chung gồm 3 vùng riêng biệt:

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

19

Hình 1.4. Mô hình cấu trúc chung của một protein độc tố Cry
Vùng 1 gồm 1 bó 7 chuỗi , trong đó chuỗi -5 nằm ở trung tâm được
bao quanh bởi 6 chuỗi còn lại. 6 chuỗi  này có tính lưỡng cực và đủ dài để
bắc cầu xuyên qua lớp kị nước dầy 30 Å của màng kép và tạo nên kênh trên
màng. Để tạo được lỗ rò xuyên qua màng tế bào, những chuỗi  bên ngoài
phải biến đổi đảo ngược để mặt kị nước của nó tiếp xúc lớp màng
photpholipid trong khi mặt ưa nước kết hợp với vùng 2 tạo ra một lỗ rò không
còn tính đặc hiệu. Một số nghiên cứu gần đây phát hiện ra những đoạn
oligomer rất quan trọng trong hoạt động của -endotoxin. Khi bị mất Glu-129,
Arg-131, Asp-136 của chuỗi -4 thì Cry1Aa không còn độc tính với côn
trùng, trong khi mất Arg-127 và Asn-138 thì độc tính không hề bị ảnh hưởng.

Vùng 2 gồm 3 tấm  đối song song quấn quanh một lõi kị nước. Nhiều
nghiên cứu cho rằng vùng 2 đóng vai trò quan trong trọng việc gắn kết với thụ
thể. Có một sự tương đồng lớn giữa cấu trúc 3 tấm  này với 3 loại thụ thể
glycoprotein ở nhiều loài côn trùng (Amino peptidase N, Cadherin - like

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

20
protein và Anionic glycoconjugates). Những kết quả trên gợi ý rằng tất cả các
móc (loop) của vùng 2 có thể tham gia gắn vào các thụ thể khác nhau, tương
tự như vị trí liên kết kháng nguyên - kháng thể. Khi phân tích vùng 2 của độc
tố Cry1Ac và Cry1Ab, người ta thấy rằng chúng có cấu trúc bậc 1 gần giống
nhau nhưng vùng 2 này lại có thể gắn với các thụ thể khác nhau. Ngoài ra,
trong nghiên cứu khả năng tổ chức các thụ thể trên màng tế bào ruột côn trùng
thì vùng 2 của Cry1Ac có khả năng điều khiển cả 3 loại thụ thể có khối lượng
phân tử khác nhau (110kDa, 130kDa và 170kDa).
Vùng 3 gồm 2 tấm  xoắn lại, nằm ở đầu C của phân tử độc tố, cấu
trúc của nó có thể bảo vệ độc tố Bt tránh khỏi sự phân giải quá mạnh của
proteaza ruột giữa côn trùng. Vùng 3 có thể còn tham gia vào quá trình
nhận diện thụ thể và điều khiển kênh ion. Chức năng của vùng 3 còn đang
được nghiên cứu thêm.
Những nghiên cứu gần đây cho biết trình tự axit amin bao từ cuối vùng 2
đến đầu vùng 3 liên quan chặt chẽ đến tính gắn của tinh thể độc vào niêm mạc
ruột côn trùng. Khi trình tự này biến đổi làm mất đi tính gắn đó côn trùng có
hiện tượng kháng thuốc. Vì thế vùng 2 và 3 được coi là vùng quyết định đến
tính kháng thuốc của côn trùng [3].
1.4.2. Cơ chế tác động của protein tinh thể diệt côn trùng
Các chủng Bt khác nhau có hoạt tính diệt côn trùng khác nhau. Khả năng diệt
côn trùng của các loài Bt chỉ thể hiện khi tinh thể độc được côn trùng tiêu hoá.
Khi côn trùng ăn phải tinh thể độc và nuốt vào ruột, tinh thể sẽ được hoà

tan và thuỷ phân các tiền độc tố 130kDa và 70kDa thành δ – endotoxin nhờ
pH kiềm cao và hệ enzym proteaza ở trong ruột ấu trùng. Độc tố này bám
dính lên tế bào thượng bì của ruột tạo nên lỗ thủng để cho ion và nước chảy
vào làm cho tế bào căng lên và vỡ ra dẫn đến tế bào bị phân hủy làm cho côn

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

21
trùng ngừng ăn, liệt ruột và chết. Tuỳ theo loại côn trùng mà có ít nhất 3 cơ
chế gây độc đó là:
* Côn trùng sau khi ăn phải tinh thể độc của Bt thì sau 5 – 20 phút ruột sẽ
bị tê liệt, pH trong máu và bạch huyết tăng lên từ 1 – 1,5 đơn vị, pH ruột giữa
hạ xuống do chất kiềm của ruột thấm vào máu, các tế bào biểu mô của ruột
phá huỷ dẫn đến cơ thể bị phá huỷ trong sau 1 giờ.
* Sau khi côn trùng ăn phải tinh thể độc thì nó ngừng ăn, ruột bị tê liệt
nhưng pH trong máu và bạch huyết không tăng. Côn trùng sẽ chết sau 2 – 4
ngày mặc dù không bị tê liệt toàn thân.
* Đặc biệt tinh thể độc nhất thiết phải đi kèm với bào tử thì mới gây
chết cho côn trùng. Côn trùng sẽ chết sau 2 – 4 ngày mà không có hiện
tượng liệt [3,4].
* Độc tố đã được hoạt hoá bám vào các phân tử cảm thụ đặc biệt nằm
trên màng vi thể của tế bào thành ruột sâu. Sự gắn kết này ở ruột làm thay
đổi gradien điện hoá tạo thành các lỗ rò. Do đó phá huỷ cân bằng áp suất
thẩm thấu của màng tế bào, làm cho tế bào bị phồng lên và bị phân huỷ
dẫn đến sâu chết [17].
Đặc điểm quan trọng nhất trong cơ chế tác động của độc tố lên côn trùng
là sự gắn kết của độc tố với thụ thể và hình thành lỗ rò (kênh ion). Sự gắn kết
độc tố với thụ thể của tế bào ruột sâu là quá trình phức tạp. Đó là sự gắn kết
của độc tố với thụ thể (phân tử cảm thụ) nằm trên màng vi thể của ruột tế bào
sâu. Quá trình này gồm 2 giai đoạn – giai đoạn gắn kết bền vững và không

bền vững. Các nhà khoa học đã tìm ra vai trò của vùng I, vùng II, vùng III
trong quá trình gắn kết.
* Chức năng hình thành kênh ion
Cấu trúc của độc tố bao gồm vùng I với bộ bó 7 chuỗi xoắn alpha. Vùng
này có chức năng bám vào màng ruột côn trùng và hình thành các lỗ rò (kênh

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

22
ion). Hill và cộng sự cho rằng kênh ion giống như lỗ rò đại phân tử, có tính
chất như một kênh không chọn lọc, các ion Na
+
và K
+
có thể đi qua [4].
Như vậy, khả năng gây độc của nội độc tố ọ phụ thuộc vào thành phần
tiền độc tố cũng như quan hệ của nội độc tố với những điểm nhận của tế bào
thượng bì ruột. Tương ứng với mỗi họ protein mang tính độc sẽ có một họ các
điểm nhận của các giống sâu mẫn cảm [3].

1.4.3. Các yếu tố ảnh hƣởng đến việc hình thành protein tinh thể độc
Tất cả các yếu tố ảnh hưởng tới quá trình sinh trưởng và phát triển của
Bt đều ảnh hưởng đến quá trình hình thành tinh thể độc.
Vi khuẩn Bt sinh trưởng bình thường ở khoảng nhiệt độ 28 – 32, nhiệt
độ tối thích là 30
0
C. Nếu nuôi cấy ở nhiệt độ 15
0
C trở xuống thì bào tử không
được tạo thành còn tinh thể vẫn được tạo thành. pH tối ưu cho sinh trưởng là

Hình 1.5. Cơ chế tác động của protein tinh thể diệt côn trùng

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

23
7. pH quá cao (>12) hoặc quá thấp (<3,3) đều làm biến tính tinh thể và sự
phát triển của Bt.
Một số nguồn dinh dưỡng có ảnh hưởng tới quá trình hình thành tinh
thể độc như nguồn C, N, P. Pepton có hiệu quả rõ rệt khi cho vào môi trường
với nồng độ 0,3 – 0,5%.
Nồng độ oxy có ảnh hưởng quan trọng đối với sự hình thành bào tử và
tinh thể độc ở vi khuẩn Bt. Nồng độ oxy đưa vào môi trường phải thích hợp
theo từng giai đoạn, nếu ở giai đoạn đầu của sinh trưởng mà thiếu oxy thì sự
tích luỹ sinh khối sẽ giảm mạnh, còn trong giai đoạn bào tử, tinh thể, nếu thừa
oxy thì tinh thể hình thành sẽ bị giảm đi, lượng ngoại độc tố tăng lên mạnh
mặc dù số lượng bào tử không thay đổi.
Quá trình hình thành bào tử đòi hỏi sự tổng hợp một loại proteaza ngoại
bào. Ở những chủng đột biến do không tổng hợp được enzym này nên cũng sẽ
không sinh ra được bào tử và tinh thể. Như vậy, sự tạo thành bào tử và tinh

thể có liên quan đến sự chuyển hoá phần protein của tế bào sinh dưỡng.
Một số axitamin có tác dụng ức chế sinh trưởng của vi khuẩn cũng như
sự tạo thành tinh thể, như lơxin, izo lơxin. Tuy nhiên khi có valin trong môi
trường thì tác dụng này mất đi.
Những nhân tố ảnh hưởng tới sự trao đổi axit axetic cũng làm ức chế
việc tạo thành bào tử và tinh thể.
Chất kháng sinh Erytromycin ở nồng độ thấp chưa đủ để ức chế sự sinh
trưởng của Bt nhưng nó lại cản trở sự hình thành bào tử. Sự có mặt của chất
kháng sinh này cũng làm thể mang bào tử không bị phân giải và tinh thể sẽ bị
giữ lại trong phần còn lại của thành tế bào.


Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

24
1.5. Đại cƣơng về côn trùng thử nghiệm
Sâu là một trong những dịch hại chủ yếu đối với nền sản xuất nông
nghiệp. Chúng phá hoại tất cả các bộ phận của cây: lá, hoa, quả, thân làm cho
cây ngừng sinh trưởng hoặc kém phát triển dẫn tới cây bị chết. Nước ta là một
nước nhiệt đới gió mùa nên độ ẩm và điều kiện rất thích hợp cho đa số các
loài côn trùng phát triển mạnh mẽ, trong số đó có sâu tơ (Plutella xylostela).
Sâu tơ thuộc bộ cánh vảy (Lepidoptera), họ ngài rau (Plutellidae) hay
còn gọi là sâu bay, sâu đu, sâu nhảy dù.
Đặc điểm gây hại: Sâu tơ có thể phá hoại tới 39 loài rau khác nhau trong
họ hoa thập tự, đặc biệt gây hại cho cải xanh, cải bắp, su hào, lạc, các cây họ
cà như khoai tây, cà chua . . . Sâu non tuổi 1 khi ăn đục một lỗ nhỏ ở mặt dưới
lá, chui đầu vào ăn nhu mô lá để chừa lại biểu bì. Sâu tuổi 2 gặm ăn mặt dưới
lá để lại lớp biểu bì trên lá tạo thành những đốm trong mờ. Cuối tuổi 2 trở đi
sâu gặm thủng và tạo thành các lỗ thủng. Khi số lượng sâu nhiều rau bị hại
nghiêm trọng. Ví dụ như: Cải bắp bị hại thường không cuốn bắp, su hào bị hại

nặng củ không lớn được và nhanh chóng bị hoá gỗ [5,25].









A
B
Hình 1.6. A: Sâu tơ (Plutella xylostela). B: Rau cải bắp bị sâu hại