serminar phương pháp western blot

KHOA KHOA HỌC NÔNG NGHIỆP
TRƯỜNG ĐẠI HỌC CỬU LONG
LỚP: CÔNG NGHỆ SINH HỌC
GVHD : Ts. Bùi Chí Bảo
NHÓM 5
HỌ VÀ TÊN MSSV
NGUYỄN THỊ HẰNG 10.033.014
HUỲNH TRÚC LINH 10.033.025
NGUYỄN THỊ NHUNG 10.033036
LA PHƯƠNG THÙY 10.033.043
DƯƠNG THỦY TIÊN 10.033.044
DƯƠNG MINH TRIỀU 10.033.048
KHÁI NIỆM
KHÁI NIỆM
I
KẾT LUẬN
KẾT LUẬN
V
QUI TRÌNH
QUI TRÌNH
II
Nội dung
Nội dung
1
Chuẩn bị m uẫ
2
Chạy điện di 1 chiều với SDS page
3
Chuyển protein từ gel đến màng
5
Phát hiện và phân tích hình ảnh

4
Lai với antibody
HỆ THỐNG V3 WESTERN WORKFLOW
TM

HỆ THỐNG V3 WESTERN WORKFLOW
TM



III
ỨNG DỤNG
ỨNG DỤNG
IV
•
Western blot là kĩ thuật xét nghiệm protein trên polyacrylamide
gel chuyển đến môi trường bền vững hơn và cố định
•
Là kỹ thuật lai giữa protein với protein(giữa kháng nguyên với
kháng thể) protein kháng nguyên được phát hiện qua phản ứng
tạo màu hoặc phát huỳnh quang
Western blot bằng cách sử dụng
một kháng thể nhận ra các protein
được sửa đổi với lipoic acid.
Mẫu có thể được lấy từ mô thực vậtđộng vật, bằng cách cắt ra thành
nhiều mảnh nhỏ. Chúng ta cho thêm cát và dung dich đệm để ly trích
( thể tích tùy vào số lượng mẫu).
1. Chuẩn bị mẫu
* Lysis buffer chứa:


Sodium hydroxide (NaOH): giúp phá vỡ các thành tế bào

Sodium Dodecyl Sulfate (SDS): hòa tan màng tế bào

Tris, pH 7.5
→ nó sẽ phá vỡ các liên kết hydro giữa các base
DNA, SDS cũng làm biến tính phần lớn các protein
trong các tế bào, giúp tách các protein từ các plasmid
sau trong tiến trình.
Thêm các loại chất tẩy rửa, muối và các dung dịch đệm có thể được
sử dụng để ly giải tế bào và hòa tan protein.
II. Qui trình
Thêm các loại chất tẩy rửa, muối và các dung dịch đệm có thể được
sử dụng để ly giải tế bào và hòa tan protein.Chất ức chế Protease và
phosphatase được thêm vào để ngăn chặn sự tiêu hóa của mẫu bởi các
enzyme của riêng mình. Chuẩn bị mô thường được thực hiện ở nhiệt
độ lạnh để tránh làm biến tính protein và suy thoái. Và một sự kết hợp
của kỹ thuật sinh hóa và cơ khí - bao gồm các loại lọc và ly tâm.
1. Chuẩn bị mẫu
a. lysis bộ đệm
Để chuẩn bị mẫu để chạy trên gel, các tế bào và mô cần phải được ly
giải để giải phóng protein quan tâm.
b. Chất ức chế protease và phosphatase
Ngay sau khi ly giải xảy ra, dephosphorylation phân giải protein,
và biến tính bắt đầu. Những biến cố này có thể bị chậm lại rất nhiều
nếu mẫu được lưu giữ trên băng hoặc ở 4°C ở tất cả các thời gian
và chất ức chế thích hợp được thêm tươi để lysis đệm.
1. Chuẩn bị mẫu
Phổ biến nhất của điện di gel sử dụng gel

polyacrylamide và bộ đệm được nạp với SDS.
SDS (sodium dodecylsulfate): là một chất
khử amionic gây biến tính protein bằng cách
bao quanh bộ khung polypeptide khiến các
phân tử duỗi thẳng ra
Hỗn hợp protein được hòa tan
trong dung dịch sodium dodecyl
sulfate (SDS), một chất tẩy mang
điện tích âm sẽ phá tất cả các nối
không cộng hóa trị của protein
ban đầu
2.Chạy điện di 1 chiều
Điện tích âm có được do gắn với SDS lớn hơn
rất nhiều điện tích của bản thân protein ban đầu;
vì thế điện tích ban đầu của protein không ảnh
hưởng đáng kể đến điện tích của phức hợp. Phức
hợp SDS-protein sau đó sẽ là mẫu để chạy điện
di. Sau đó các mẫu được nạp vào các giếng trong
gel.
2.Chạy điện di 1 chiều
Khi điện di kết thúc, những
protein trên gel sẽ được nhìn
thấy là một dãy các băng bằng
cách nhuộm với bạc hay một
chất nhuộm màu như
Coomassie blue.
Độ phân giài của SDS- Page là rất rất lớn, các phức hợp được tách thành
hàng trăm vết băng trên gel.
2.Chạy điện di 1 chiều
3. Chuyển protein từ gel đến màng

Để các protein có thể vào để phát hiện kháng thể, các protein được
chuyển từ trong gel lên một màng nitrocellulosehoặc
polyvinylidene difluoride (PVDF ).
Phương pháp chính để chuyển các protein và sử dụng một dòng
điện để kéo protein gel vào PVDF hoặc màng nitrocellulose
Các protein di chuyển từ bên trong gel lên
màng. Một phương pháp chuyển bao gồm
việc đặt một màng trên gel, và một chồng
giấy lọc. Ngăn toàn bộ được đặt trong một
dung dịch đệm nó di chuyển lên giấy bằng
cách mao dẫn, đưa các protein với nó
protein trên màng
nitrocellulose hoặc
PVDF
Trong thực tế phương pháp này không được sử dụng vì nó mất quá
nhiều thời gian; electroblotting được ưa thích.kết quả của hai quá
trình "thấm", các protein được tiếp xúc trên bề mặt một lớp mỏng để
phát hiện. Cả hai màng tế bào được lựa chọn cho các thuộc tính cụ
thể không protein ràng buộc(tức là liên kết tất cả các protein tốt như
nhau).
Protein ràng buộc dựa trên tương tác kỵ nước, cũng như tính tương
tác giữa các màng tế bào và protein. Màng nitrocellulose rẻ hơn so
với PVDF, nhưng mỏng manh hơn và không đứng lên cũng
probings lặp đi lặp lại.
3. Chuyển protein từ gel đến màng
Tính đồng nhất và hiệu quả tổng thể của chuyển protein từ gel
màng có thể được kiểm tra bằng cách nhuộm màng với
coomassise Brilliant Blue hoặc S thuốc nhuộm ponceau. Ponceau
S là phổ biến hơn của hai, do độ nhạy cao hơn và độ hòa tan
nước, sau này làm cho nó dễ dàng hơn để sau đó destain và thăm

dò màng
3. Chuyển protein từ gel đến màng
1. Các protein được chuyển sang màng lai nitrocellulose, giữ nguyên vị
trí như đã phân tách trên gel.Rửa màng lai từ 5-10 phút trong dung
dịch TBS.
2. Ủ trong dung dịch khóa.
3. Sau rửa màng lai 2 lần TBS, 5-10 min cho mỗi lần rửa.
4. Ủ màng lai đã cố định protein trong 1-2 giờ với một kháng thể sơ
cấp (primary antibody) với sự kích động nhẹ. Kháng thể sơ cấp là
một kháng thể đặc hiệu, sẽ bám vào protein và tạo thành một phức
hợp protein-kháng thể đối với protein quan tâm.
5. Sau rửa màng lai 2-6 lần với TTBS, 5-10 min cho mỗi lần rửa.
6. Tiếp theo ủ màng lai với một kháng thể thứ cấp (secondary antibody)
có enzyme (alkalin phosphatase hoặc horseradish peroxidase) đi kèm
trong 1 tiếng có sự kích động nhẹ
4
Lai với antibody
7.Sau rửa màng lai 3-6 lần với TTBS, 5-10 min cho mỗi lần rửa.
8.Sau rửa màng lai lần cuối với TBS.
9.Tiếp tục ủ màng lai trong một hỗn hợp phản ứng đặc hiệu với
enzyme. Nếu mọi việc đều diễn ra một cách chính xác sẽ phát
hiện thấy các băng ở bất kỳ nơi nào có mặt phức hợp protein-
kháng thể sơ cấp-kháng thể thứ cấp-enzyme hay nói cách khác là
ở bất kỳ nơi nào có mặt protein quan tâm
9. Ðặt một phim nhạy cảm với tia X lên màng lai để phát hiện các
điểm sáng phát ra do enzyme
Phương pháp phát hiện đo màu phụ thuộc vào ủ màng lai với
một chất nền có kh năng ả phản ứng với các enzyme
(như peroxidase ) được ràng buộc với các kháng thể thứ cấp.
đó màng.

5
Phát hiện và phân tích hình ảnh
Phát hiện bằng đo màu
phản ứng này diễn ra bằng cách chuyển đổi
thuốc nhuộm hòa tan thành một dạng không
hòa tan của một màu sắc khác tủa thành các
vết ngay bên cạnh các enzyme và qua xuất
hiện vết trên màng
Phát triển của blot sau đó dừng lại bằng cách rửa đi những
thuốc nhuộm hòa tan. Hàm lượng protein được đánh giá thông
qua densitometry (cường độ vết là) hoặc quang phổ.
phát hiện bằng huỳnh quang

Các đầu dò gắn huỳnh quang được kích thích bởi ánh sáng
và sự phát xạ kích thích sau đó được phát hiện bởi một
photosensor như CCD máy ảnh được trang bị với các bộ lọc
khí thải thích hợp chụp một hình ảnh kỹ thuật số và cho
phép phân tích dữ liệu xa hơn như phân tích trọng lượng
phân tử s l ng phân t .ố ượ ử Huỳnh quang được coi là một
trong những phương pháp tốt nhất để định lượng, nhưng ít
nhạy cảm hơn chemiluminescence
Phương pháp phát hiện Chemiluminescent phụ thuộc vào ủ
màng lai với một chất nền sẽ luminesce khi tiếp xúc
với reporter trên kháng thể thứ cấp. Ánh sáng sau đó
được phát hiện bởi phim ảnh, và gần đây hơn bởi máy
ảnh CCD chụp một hình ảnh kỹ thuật số. Những hình ảnh được
phân tích bởi densitometry, đánh giá số lượng tương đối của
nhuộm protein và định lượng các kết quả về mật độ quang học.
Mới hơn phần mềm cho phép phân tích dữ liệu xa hơn như
phân tích trọng lượng phân tử nếu các tiêu chuẩn thích hợp

được sử dụng.
Phát hiện bằng phương pháp Chemiluminescent
Hệ thống máy chạy western blot của Biorad:
V3 Western Workflow™
Các quy trình làm việc V3 đầy đủ kết hợp kỹ thuật truyền thống
với công cụ sáng tạo, chẳng hạn như TGX Stain ™ đúc sẵn gel,
Trans-Blot ® Turbo hệ thống ™, và ChemiDoc ™ MP màn hình,
để nhanh chóng kiểm tra kết quả điện di và chất lượng chuyển
giao trước khi đến western blotting, đơn giản hóa phân tích, định
lượng protein để có được kết quả nhanh hơn.
Bio-Rad's V3 Western Workflow là một
phương pháp gồm năm bước để đơn
giản quy trình western blotting.
- Mini-PROTEAN
®
TGX Stain-Free™ precast
gels and Criterion™ TGX Stain-Free™ precast gels tách
protein cao với thời gian chạy nhanh và sử dụng dung dịch
đệm Tris_ glycine để chạy.
TGX Stain-Free™ precast gels có chứa một công nghệ độc
đáo được xây dựng vào hóa học gel cho phép nhanh
chóng, chất lượng cao, tách biệt protein trong thời gian ít nhất
là 15 phút.
1. Tách biệt Protein
2.Hình tượng hóa các protein
- Tách Protein ra có thể hình dung và xác
nhận bằng cách sử
dụng công nghệ miễn phí vết, covalently liên
kết với protein,
sau 1 phút kích hoạt trên

một MP ChemiDoc màn hình.
Điều này cho phép hình dung ngay
được protein trên gel toàn bộ mà không
cần nhuộm. Stain-công nghệ là một giải pháp
thay thế tiết kiệm thời
gian để nhuộm Coomassie truyền thống,
cung cấp một quy trình làm việc sắp xếp hợp lý.
- Trans-Blot Turbo hệ thống là một protein bộ máy
chuyển giao nhanh chóng có thể làm giảm các bước
chuyển giao ít nhất là 3 phút, trong khi duy
trì chuyển protein cao hiệu quả trên một loạt
các khối lượng phân tử.
- ChemiDoc MP màn
hinh kết hợp vớicông nghệ bẩn miễn
phí cho phép xác minh ngay lập
tức chuyểnprotein.
3. Chuyển protein
4.Xác minh chuyển giao protein
Bình thường hóa cho protein tổng số, tước và reprobing
là không còn cần thiết. Phần mềm hình ảnh phòng thí
nghiệm cho kết quả định lượng thay vì bình thường hóa tương
đối.
5.Validate và quantitate
Các màn
hinh ChemiDoc MP và hình
ảnh phòng thí nghiệm phần
mềm ™ có thể được sử dụng
để xác nhận dữ liệu phương
Tây thấm qua bình thường
hóa protein tổng số kết hợp với

protein vệ sinh.
IV. ỨNG DỤNG CỦA KỸ THUẬT WESTERN BLOT

Xác định sự hoạt động của gen thông qua sự có
mặt của protein trong mô.

Đánh giá mức độ hoạt động mạnh yếu của gen
mục tiêu

Xác định độ lớn của gen mục tiêu.

Nhận dạng protein mục tiêu.

Phân tích cây trồng chuyển gen.

Đánh giá tính chuyên biệt của antibody.

Phân tích bệnh do vi khuẩn và virus gây ra.

Phân tích sự phát triển của thực vật.