Nghiên cứu thu nhận hợp chất thuộc nhóm STILBENE có hoạt tính kháng oxi hóa từ rễ tơ cây đậu phộng ( arachis hypogaea l )

LỜI CÁM ƠN
Trong quá trình thực hiện luận văn thạc sĩ tôi đã gặp nhiều khó khăn, trở ngại,
đôi lúc tưởng rằng không thể tiếp tục, nhưng may mắn có được sự động viên của ba
mẹ, sự quan tâm, dìu dắt của các anh chị, thầy cô và sự giúp đỡ của bạn bè, em nhỏ
đã cho tôi nguồn sức mạnh to lớn để tiếp tục hoàn thành đề tài của mình. Và sẽ
không có tôi ngày hôm nay nếu không có mọi người luôn bên cạnh, tôi xin gửi đến
tất cả lời cảm ơn chân thành.
Lời cảm ơn đầu tiên tôi xin dành cho ba mẹ - người đã sinh ra và nuôi dạy tôi
nên người. Con cảm ơn ba mẹ vì trong bất kỳ hoàn cảnh nào ba mẹ luôn là chỗ dựa
vững chắc giúp con có đủ nghị lực và sức mạnh để vượt qua khó khăn, trở ngại.
Con xin bày tỏ lòng biết ơn đến PGS.TS. Bùi Văn Lệ, cảm ơn thầy đã truyền
niềm đam mê, nhiệt huyết với khoa học đặc biệt là sinh hóa thực vật thông qua
những bài giảng cho con ở giảng đường đại học. Thầy đã tận tình hư ớng dẫn, tạo
điều kiện thuận lợi để con thực hiện và hoàn thành luận văn này.
Em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới Ths. Quách Ngô Diễm Phương, chị là người
hướng dẫn, cung cấp những kiến thức, kỹ thuật sinh hóa thực vật, đưa ra ý tư ởng,
dẫn dắt và luôn đồng hành cùng em trong suốt quá trình thực hiện đề tài.
Tiếp đến, tôi kính gửi lời cảm ơn đến cô Cung Hoàng Phi Phượng, thầy Kiều
Phương Nam, anh Bùi Xuân Sơn, anh Nguyễn Hữu Hoàng, em Nguyễn Hoài
Nguyên và các em 07CS chuyên ngành Nông nghiệp đã luôn hỗ trợ và chia sẽ với
tôi những lúc khó khăn trong thời gian thực hiện đề tài.
Cuối cùng, tôi cảm ơn các thành viên 05CS Nông nghiệp, cảm ơn FAMI, các
anh chị lớp Hóa Sinh K19 và những người bạn thân đã luôn đ ộng viên và hỗ trợ
Minh; chân thành cảm ơn các thành viên của bộ môn Sinh hóa, bộ môn Di truyền đã
luôn hỗ trợ.
Tp. Hồ Chí Minh, ngày 18 tháng 8 năm 2011
Hoàng Thị Thanh Minh
1

Mở đầu

MỞ ĐẦU
Thực vật là một nguồn tài nguyên vô cùng quý giá cho cuộc sống của con
người. Nó không chỉ là nguồn cung cấp lương thực cho cuộc sống thiết yếu của con
người, thực vật còn là nguồn dược liệu phong phú giúp con người chữa trị bệnh tật,
tăng cường sức khỏe và kéo dài tuổi thọ. Bên cạnh việc sử dụng thảo dược để chữa
bệnh, các nhà khoa học đã tìm nhiều phương pháp tổng hợp các hợp chất có cơ cấu
tương tự các hợp chất có nguồn gốc từ thực vật. Tuy nhiên, các thuốc tổng hợp
thường gây ra môt số tác dụng phụ. Vì vậy, nhu cầu sử dụng thuốc có nguồn gốc từ
thực vật ngày càng gia tăng. Chính vì thế giá trị của các hợp chất thứ cấp là rất cao,
mỗi kg có thể lên đến hàng triệu đô la, chẳng hạn các loại thuốc chống ung thư như
vincristin, vinblastin và taxol.
Trong số những hợp chất quý giá đó, hợp chất nhóm stilbene được biết đến
với nhiều giá trị trong y dược bởi các hoạt tính sinh học như tính kháng oxy hóa,
ngăn ngừa ung thư, ngăn ngừa các bệnh tim mạch, kháng viêm, kéo dài tuổi thọ. Do
đó, nhu cầu sử dụng và thương mại hóa hợp chất nhóm stilbene đặc biệt là
resveratrol tăng lên nhanh chóng, trong khi hàm lượng của nó trong tự nhiên rất
thấp. Vì vậy, nghiên cứu sản xuất resveratrol từ những nguồn thay thế, ổn định, chủ
động và hàm lượng cao là rất cần thiết
.
Rễ tơ được tạo ra do sự chuyển gen sử dụng hệ thống vector tự nhiên từ tác
nhân bệnh – Agrobacterium rhizogenes, vi khuẩn đất gram âm vào tế bào thực vật.
Phương pháp nuôi cấy rễ tơ với những ưu điểm vượt bậc như như phát triển nhanh,
không hướng đất, không phụ thuộc vào chất điều hòa tăng trư ởng ngoại sinh, bền
vững về mặt di truyền và tổng hợp hợp chất thứ cấp với hàm lượng cao hơn hoặc
bằng với cây mẹ, tạo sinh khối lớn. Vì vậy, trong những năm gần đây nuôi cấy rễ tơ
để thu nhận các hợp chất có hoạt tính sinh học có nguồn gốc từ thực vật nhận được
nhiều sự quan tâm của các nhà khoa học.
2

Mở đầu

Dựa trên những cơ sở trên, đề tài “Nghiên cứu thu nhận hợp chất thuộc
nhóm stilbene có hoạt tính kháng oxi hóa từ rễ tơ cây đậu phộng (Arachis hypogaea
L.)” được tiến hành với mục đích nghiên cứu khả năng thu nhận hợp chất stilbene
từ rễ tơ nhằm chủ động cung cấp nguồn dược liệu cho việc sản xuất stilbene tại Việt
Nam. Đề tài thực hiện những nội dung chính như sau:
- Xây dựng quy trình nuôi cấy rễ tơ cây đậu phộng được cảm ứng bởi vi
khuẩn Agrobacterium rhizogenes ATCC 15834.
- Xác định hợp chất thuộc nhóm stilbene và khảo sát hoạt tính kháng oxi
hóa trong các phân đoạn cao được thu nhận từ rễ tơ.
- Thử nghiệm tăng sinh hàm lượng hợp chất nhóm stilbene trong rễ tơ nuôi
cấy bằng phương pháp bổ sung tiền chất và chất cảm ứng.






PHẦN 1
TỔNG QUAN TÀI LIỆU








3

Tổng quan tài liệu

1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Cây đậu phộng
1.1.1. Vị trí phân loại
Lớp : Magnoliopsida
Phân lớp : Rosidae
Bộ : Fabales
Họ : Papillonneceae
Chi : Arachis
Loài : Arachis hypogaea L.
Tên thông thường: đậu phộng, đậu phụng, lạc, đậu nụ.
Tên tiếng Anh: peanut, groundnut.

Hình 1.1. Cây đậu phộng [62]
1.1.2. Nguồn gốc và phân bố
Đậu phộng có nguồn gốc ở vùng nhiệt đới Châu Mỹ (Braxin, Bôlivia,
Paragoay…). Đậu phộng được trồng ở những nước nhiệt đới nóng ẩm, nóng khô
4

Tổng quan tài liệu

đến cận nhiệt đới và cả một số vùng ôn đới ẩm có nhiều mưa, nhất là Ấn Độ, Trung
Quốc, Nigiêria, Xênegan, Hoa Kỳ, Braxin, Thái Lan, Xu Đăng [6, 7, 51]. Ở Việt
Nam có bốn vùng trồng đậu phộng chính là: 1. Vùng trung du Bắc Bộ: đậu phộng
được trồng trên đất bạc màu Hà Bắc, Vĩnh Phú, vụ chính tháng 2 – 4, bị hạn chế về
mưa cuối vụ; 2. Vùng Bắc Trung Bộ: Thanh Hóa, Nghệ An, Hà Tĩnh, trên đ ất cát
ven biển là chính; 3. Vùng Nam Trung Bộ và Tây Nguyên, trên nhiều loại đất cát,
đất đỏ, đất đen; 4. Vùng Đông Nam Bộ (Tây Ninh, Đồng Nai, Sông Bé…) trên
nhiều loại đất: đất đỏ bazan, đất vàng đỏ, đất đen …[6,7]

1.1.3. Đặc điểm hình thái
Đậu phộng là một loài cây thân thảo, sống hàng năm, thân cây khi mọc thẳng,
khi mọc bò sát, dài 0,30 – 0,50 m, có khi tới 0,60 – 0,80 m [1]. Thân phân nhánh từ
gốc có các cành tản ra, đâm rễ ở các mấu. Lá kép lông chim, có 4 lá chét hình trái
xoan ngược, gốc tù, đầu tròn hay lõm, mỏng như màng, đối diện từng đôi một. Hai
lá kèm làm thành bẹ bao quanh thân, hình dải nhọn. Cụm hoa chùm ở nách lá gồm 2
- 4 hoa nhỏ, màu vàng. Hoa tự thụ phấn, cuống hoa dài ra đưa hoa xuống đất và
hình thành quả trong đất. Quả không chia đốt hình trụ thuôn, thon lại giữa các hạt,
có vân mạng. Hạt hình trứng, có rãnh dọc; vỏ lụa màu đỏ, cánh sen hay vàng,
trắng.[7]
 Rễ
Hệ thống rễ sơ khởi sẽ được thay thế bằng các rễ mới 3 ngày sau khi nảy
mầm. Mặc dù chiều dài bộ rễ có thể lên đến 135 cm, chúng thường bị giới hạn trong
vùng 5 đến 35 cm bên dưới mặt đất. Rễ cây đậu phộng luôn cộng sinh với vi khuẩn
Bradyrhizobium trong tự nhiên.[
51]
 Thân
Ban đầu khi mới nảy mầm, thân cây đậu phộng có cấu trúc đặc, nhưng khi
cây tăng trưởng dần, chúng có xu hướng trở nên rỗng. Phần thân chính phát triển từ
chồi đỉnh của trục thượng diệp, chúng có thể mọc thẳng lên trên hay nằm bò trên
đất, có chiều dài từ 12 đến 65 cm.
5

Tổng quan tài liệu

 Lá
Lá mọc xen kẽ gồm những lá kép lông chim mang 2 đôi lá chét, dài 18 – 40
mm, rộng 15 – 25 mm. Lá của loài đậu phộng thân bò có nhiều lông tơ ở mặt dưới
[4].
 Hoa

Cây đậu phộng là loài duy nhất trong số các cây thuần chủng có hoa trên mặt
đất nhưng tạo quả và hạt bên dưới mặt đất [51]. Hoa mọc thành chùm từ 2 đến 6
cái, hoa mọc ở đỉnh, gốc thân hay ở nách lá, có màu vàng. Hoa nở và héo trong
cùng một ngày. Hoa đặc trưng cho phân họ cánh bướm, tràng hoa gồm 5 cánh, ở
trên có một cánh lớn giương lên gọi là cánh cờ, hai bên có hai cánh xòe ra gọi là
cánh bướm, bên dưới có hai cánh ghép lại với nhau thành hình mạn thuyền. Có hai
loại hoa, hoa bất thụ là những hoa lớn, màu vàng có vằn đỏ rất rõ và hoa hữu thụ
nhỏ, mọc ở nách là thấp khi thân đứng hoặc phân phối cách khoảng khi thân bò.
Những hoa hữu thụ này mọc ở đầu những cuống dài, sau khi thụ phấn và thụ tinh
mọc dài nghiêng ra về phía đất và đẩy các bầu nhị cái chui vào trong đất xốp. Các
bầu nhị cái này phình lớn thành quả đậu và đi dần vào sâu trong đất. Khi quả đậu
chín, chúng sẽ nằm sâu 5 – 6 cm dưới mặt đất. [4]
 Quả
Quả là những quả khô, giòn, có hình trụ dài hoặc hình trứng dài từ 2 – 5 cm,
đường kính 1 – 1,5 cm có 10 – 12 đường gân chạy theo chiều dọc và nối liền với
nhau bằng những đường gân ngang tạo thành một mạng lưới chằng chịt giới hạn
những chỗ trũng, bên trong quả có thể có 1 – 5 hạt hình dạng khác nhau. Mỗi cây có
thể có từ 50 – 100 quả, phân bố trên thân theo cách phân bố của hoa [
4]. Hạt được
bọc trong lớp màng mỏng màu trắng hồng hay nâu đỏ, gồm 2 lá mầm hai bên hình
phẳng lồi màu trắng ngà chứa 30 – 50% chất béo, cây mầm nằm giữa 2 lá mầm.
6

Tổng quan tài liệu

1.1.4. Thành phần hóa học
Đậu phộng (Arachis hypogaea L.) là một nguồn nguyên liệu chứa những chất
kháng oxi hóa tự nhiên. Vỏ đậu phộng chứa flavonoid có hoạt tính kháng oxi hóa
như 5,7-dihydroxychromone, eriodictyol, luteolin và dihydroquercetin. Hạt đang
nảy mầm hay thân cây dưới tác động của vi sinh vật đều sinh tổng hợp stilbene, ở

dạng đồng phân cis- hay trans- của dẫn xuất có công thức gần giống với 3,4′,5-
trihydroxy-4-isopentenylstilbene. Trục hạ diệp cây đậu phộng bị nhiễm nấm cũng
chứa dạng đồng phân cis- và trans-3,4′,5-trihydroxystilbene (resveratrol).[13]
Những nghiên cứu gần đây cho thấy cây đậu phộng được trồng trong điều
kiện bình thư ờng, sạch bệnh (không chịu tác động bởi vi sinh vật) cũng sinh tổng
hợp stilbene như piceatannol và resveratrol. Nghiên cứu của Chen và cộng sự
(2001) chứng minh rằng ở rễ cây đậu phộng chứa resveratrol với hàm lượng cao và
đánh giá rễ đậu phộng như là một nguồn nguyên liệu để thu nhận resveratrol. [13]
Cây đậu phộng được trồng chủ yếu để lấy hạt [7]. Thành phần chủ yếu trong
nhân đậu phộng là 40 – 50% chất béo (dầu đậu phộng - Oleum arachidis). Dầu đậu
phộng gồm các glyceride của nhiều acid béo no và không no, với tỷ lệ thay đổi rất
nhiều tùy theo loại đậu phộng: oleic acid (51 – 79%), linoleic acid (7,4 – 26%),
palmitic acid (8,5%), stearic acid (4,5 – 6,2%), hexaconic acid (0,1 – 0,4%), hai
acid thấy trong dầu đậu phộng: có trọng lượng phân tử lớn hơn là arachidic acid
(C
20
) và lignoceric acid (C
24
1
). Hai acid này còn thấy trong bơ cacao, bơ sữa bò.
Trong phần không xà phòng hóa đư ợc ta thấy các sterol và vết vitamin D. Ngoài
những thành phần trên người ta còn thấy trong hạt đậu phộng một chất cầm máu có
tác dụng tốt đối với người máu khó đông. Chất này tan trong nước, có tác dụng trên
trương lực cơ và tác dụng làm có thắt các động mạch. [ ]
7

Tổng quan tài liệu

1.2. Nuôi cấy rễ tơ và phương pháp tăng sinh hợp chất thứ cấp
1.2.1. Giới thiệu về rễ tơ

Rễ tơ được tạo ra do sự chuyển gen sử dụng hệ thống vector tự nhiên từ tác
nhân bệnh – Agrobacterium rhizogenes, vi khuẩn đất gram âm vào tế bào thực vật.
Trong quá trình xâm nhiễm vào mô thực vật bị thương, vi khuẩn này chuyển T-
DNA, một phần của Ri plasmid vào bộ gen tế bào chủ. Những chủng vi khuẩn
thuộc nhóm agropine có hoạt lực mạnh, T-DNA chứa 2 phần riêng rẻ được gọi là
TL-DNA, mang những gen rol cảm ứng cho sự hình thành kiểu hình rễ tơ, và TR-
DNA mang một số gen mã hóa ra enzyme điều hòa sự sinh tổng hợp và xác định sự
cân bằng hormone trong những rễ đã chuyển gen. Sau khi A. rhizogens xâm nhiễm
vào mô, rễ hình thành và phát triển từ vị trí bị thương, được cắt ra, và sau đó chuyển
sang môi trường lỏng lắc để tăng sinh khối. Rễ tơ được đặc trưng bởi sự phát triển
nhanh, không hướng đất, không phụ thuộc vào chất điều hòa tăng trưởng ngoại sinh,
và bền vững về mặt di truyền [25]. Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình tạo rễ tơ: độ
tuổi cây, loại mô, loại cây, chủng vi sinh vật, thời gian đồng nuôi cấy, thời gian
ngâm mẫu [24].
1.2.2. Agrobacterium rhizogenes
Agrobacterium rhizogenes (tên cũ Phytomonas rhizogenes) được định danh
lần đầu tiên cách đây hơn 70 năm (Riker và cộng sự, 1930; Hildebrand, 1934;
White, 1972). Vi khuẩn A. rhizogenes là tác nhân gây bệnh ở thực vật: hội chứng
tạo rễ tơ hay bệnh rễ nhày. A. rhizogenes là vi khuẩn đất hình que, gram âm, thuộc
chi Agrobacterium (Conn 1942). [55
]
Những chủng A. rhizogenes có thể được phân loại theo các phân nhóm dựa
vào dạng opine chúng tổng hợp. Hiện nay, A. rhizogenes được phân biệt gồm dạng
agropine (đại diện là Ri plasmids pRiA4, pRi1855, pRiHRI, pRi15834, và
pRiLBA9402), dạng mannopine (đại điện Ri plasmid, pRi8196), dạng cucumopine
(đại diện Ri plasmid, pRi2659) và mikimopine (đại diện Ri plasmid, pRi1724).
8

Tổng quan tài liệu

Mikimopine và cucumopine là các stereo-isomer, nhưng không tìm th ấy sự tương
đồng giữa các gen sinh tổng hợp opine tại mức độ nucleotide. Trong số các chủng
A. rhizogenes được biết đến, K47, K599, và HRI là các dạng độc tính cao có thể
xâm nhiễm vào một phạm vi rộng các loại thực vật khác nhau. [55]
1.2.3. Ứng dụng của nuôi cấy rễ tơ
Nuôi cấy rễ tơ được ứng dụng trong nhiều lĩnh vực như sản xuất hợp chất thứ
cấp, tạo giống cây trồng mới, mô hình nghiên cứu phytoremediation, tìm hiểu con
đường sinh tổng hợp hợp chất có hoạt tính sinh học, nghiên cứu sinh lý của rễ và
sản xuất protein tái tổ hợp. Trong đó, sản xuất hợp chất thứ cấp từ rễ tơ được tập
trung nghiên cứu nhiều nhất. [42]

Hình 1.2. Một số ứng dụng của rễ tơ [42]
9

Tổng quan tài liệu

1.2.4. Biện pháp tăng sinh hàm lượng hợp chất thứ cấp
1.2.4.1. Bổ sung tiền chất
Dựa trên kiến thức về con đường sinh tổng hợp, vài hợp chất hữu cơ được bổ
sung vào môi trường nuôi cấy để cảm ứng sự tổng hợp hợp chất thứ cấp nhằm tăng
hàm lượng [40]. Sự bổ sung các tiền chất hữu cơ xuất phát từ quan niệm cho rằng
những hợp chất này có thể là chất trung gian hoặc là chất khởi đầu của một con
đường sinh tổng hợp các sản phẩm thứ cấp. Bổ sung vào môi trường nuôi cấy các
tiền chất thích hợp hoặc các hợp chất có liên quan kích thích sự sản xuất các hợp
chất thứ cấp [3]. Sự bổ sung các tiền chất của quá trình sinh tổng hợp các hợp chất
thứ cấp mong muốn vào môi trường nuôi cấy giúp nâng cao hiệu quả sản xuất của
tế bào trong một số trường hợp xác định. Phương pháp này có giá trị cao khi giá
thành của các tiền chất không quá đắt. Các yếu tố như nồng độ và thời gian bổ sung
tiền chất có ảnh hưởng lớn đến việc tăng hàm lượng trong huyền phù tế bào. Bổ
sung loganin, tryptophan và tryptamine đã c ảm ứng sự tổng hợp secologanin và

indole alkaloid trong nuôi cấy huyền phù tế bào Catharanthus roseus. Hàm lượng
paclitaxel trong nuôi cấy huyền phù Taxus cuspidate đã tăng 6 lần bằng cách bổ
sung phenylalanine và những tiền chất khác trong chu trình tổng hợp paclitaxel
(benzoic acid, N-benzoylglycine và serine) [33]. Phenylalanine là một tiền chất để
tổng hợp acid rosmarinic, khi thêm chất này vào dịch nuôi cấy huyền phù tế bào
Salvia officialis thì nó kích thích sự tổng hợp acid rosmarinine cũng như rút ng ắn
thời gian sản xuất [
17]. Trong nuôi cấy huyền phù tế bào Vitis vinifera, bổ sung
phenylalanine 0,2 mM dẫn đến sự tích lũy stilbene nội bào tăng lên đáng kể. Bổ
sung tiền chất là một phương pháp đầy hứa hẹn và có tính khả thi tuy nhiên để ứng
dụng, trước hết cần nghiên cứu cơ chế và cách điều hòa sự sinh tổng hợp hợp chất
thứ cấp.
10

Tổng quan tài liệu

1.2.4.2. Bổ sung tác nhân cảm ứng
Sự cảm ứng là một trong chiến lược thành công nhất để tăng sản xuất hợp
chất thứ cấp. Sự cảm ứng bao gồm việc bổ sung những tác nhân hóa học hay tạo
stress vật lý vào môi trường nuôi cấy để kích thích sản xuất hợp chất thứ cấp, những
chất thường được tổng hợp với hàm lượng thấp hoặc không được tổng hợp. Tác
nhân cảm ứng được định nghĩa là những phân tử kích thích những đáp ứng được
cảm ứng bởi stress hay tính kháng ở thực vật (Van Etten và cộng sự, 1994). Những
tác nhân cảm ứng như jasmonate và dẫn xuất của nó kích thích sự tổng hợp hợp
chất thứ cấp trong cây (Sanz và cộng sự, 2000).
Bên cạnh tác nhân cảm ứng kích thích sản xuất một số hợp chất thứ cấp
mong muốn thì tác nhân cảm ứng cũng hoạt hóa một số gen liên quan tới sự sinh
tổng hợp hợp chất đó. Điều này được chứng minh trong nghiên cứu về sự sinh tổng
hợp nicotine mục tiêu trong tế bào thuốc lá (Breyne và Zabeau, 2001; Goossens và
cộng sự, 2003).

Furanocoumarin là hợp chất phytoalexin có giá trị y dược và công nghiệp, nó
chỉ tồn tại trong 4 họ: Leguminosae, Apiaceae, Umbelliferae và Rutaceae.
Furanocoumarin được tổng hợp từ cây Citrus bergamia nhưng sản lượng không đáp
ứng đủ nhu cầu ngày càng tăng cao của xã hội. Đáp ứng với tác nhân cảm ứng đã
chứng minh rõ ràng trong nuôi cấy tế bào Ruta graveolens khi được bổ sung dịch
môi trường của Rhodoturula rubra đã vô trùng. Sự tích lũy hợp chất này tăng lên là
do sự cảm ứng của những enzyme chuyên biệt trong quá trình sinh tổng hợp nó như
phenylalanine ammonia lyase (PAL), cinnamate-4-hydroxylase (C4H), 4-
coumarate: CoA ligase (4CL), S-adenosyl-L-methionine: bergaptol-O-
methyltransferase (BMT), và S-adenosyl-L-methionine: xanthtoxol-O-
methyltransferase (XMT). [
41]
Tác nhân cảm ứng là tác nhân hóa học hay sinh học hay vật lý, dẫn đến tế
bào đáp ứng về mặt sinh lý, hình thái và tích lũy phytoalexin. Do đó, tác nhân c ảm
11

Tổng quan tài liệu

ứng được sử dụng như một công cụ để tăng sản lượng hợp chất thứ cấp. Về mặt
phân loại, tác nhân cảm ứng được phân chia thành 2 loại: tác nhận cảm ứng sinh
học và tác nhân cảm ứng phi sinh học. Những năm gần đây, khuynh hướng sử dụng
tác nhân cảm ứng phi sinh học ngày càng phổ biến do giá thành thấp hơn tác nhân
cảm ứng sinh học. [61]
1.3. Stilbene và resveratrol
1.3.1. Giới thiệu về hợp chất nhóm stilbene
Stilbene có khung cấu trúc cơ bản gồm 2 vòng thơm, n ối với nhau bởi cầu
nối ethylene (C6-C2-C6) thuộc nhóm hợp chất polyphenol [18,56]. Stilbene gồm
có dạng monomer, oligomer và polimer [56]. Stilbene monomer có khối lượng
phân tử nhỏ (210 – 270 g/mol). Stilbene tồn tại ở dạng đồng phân cis-(E) và trans-
(Z). Stilbene trong tự nhiên đa phần tồn tại ở dạng trans- và nhiều nghiên cứu cho

thấy stilbene dạng trans- thể hiện hoạt tính sinh học cao hơn so với dạng cis- [30].
Stilbene là hợp chất thứ cấp gắn liền với nhiều lợi ích sức khỏe con người như
kháng ung thư, kháng viêm và giảm nguy cơ về bệnh tim mạch [9]. Stilbene là một
nhóm nhỏ của hợp chất nhóm phenylpropanoid được đặc trưng bởi khung 1,2-
diphenylethylene. Hầu hết stilbene thực vật là dẫn xuất từ cấu trúc cơ bản trans-
resveratrol (3,5,4’-trihydroxy-trans-stilbene), mặc dù những cấu trúc khác chỉ được
tìm thấy trong một số họ thực vật đặc thù. Một số loài cây tổng hợp stilbene như
nho, cây thông, đậu phộng và cây lúa miến (Bảng 1.1). 15 năm qua, thực vật chứa
stilbene được quan tâm đặc biệt do hoạt tính sinh học và những ứng dụng trong y
dược của chúng.[
16]
Stilbene là phytoalexin, hợp chất được tổng hợp khi thực vật đáp ứng với sự
xâm hại của nấm mốc, vi khuẩn và tác nhân gây bệnh. Resveratrol là hợp chất phổ
biến nhất của nhóm stilbene. Nó tồn tại ở cả dạng đồng phân cis- và trans- và trong
mô thực vật ở dạng cơ bản như trans-resveratrol-3-O-glucoside được biết như
piceid và polydatin.[18]
12

Tổng quan tài liệu

Sơ đồ 1.1: Con đường sinh tổng hợp stilbene [20]
Con đường sinh tổng hợp stilbene trên chỉ hình thành cấu trúc stilbene cơ
bản. Ngoài ra, còn có một số enzyme khác liên quan với stilbene synthase xúc tác
sự methyl hóa, đường hóa, đồng phân hóa, oligo hóa khung stilbene cơ bản để hình
thành các hợp chất có cấu trúc phức tạp hơn.[16]




Stilbene thực vật có nguồn gốc từ con
đường phenylpropanoid (Sơ đồ 1.1). Tất cả
thực vật bậc cao đều có thể tổng hợp
malonyl-CoA và CoA-ester của dẫn xuất
cinnammic, nhưng chỉ vài loài thực vật có
thể tổng hợp stilbene. Một số enzyme đầu
của con đường phenylpropanoid như
phenylalanine ammonia lyase (PAL),
cinnamate-4-hydroxylase (C4H) và 4-
coumarate: CoA ligase (4CL). Stilbene
synthase (STS) là đặc trưng của thực vật
tổng hợp stilbene và xúc tác sinh tổng hợp
khung stilbene từ ba malonyl-CoA và một
CoA-ester của dẫn xuất cinnamic acid (hầu
hết là cinnamoyl-CoA hay p-coumaroyl-
CoA).

13

Tổng quan tài liệu

Bảng 1.1. Một số stilbene phổ biến ở thực vật [16]
Stilbene Chi R3 R5 R3’ R4’

trans-resveratrol
Vitis
Arachis,
Fallopia

OH

OH

H

OH
trans-piceid Vitis OGlu OH H OH
Pinosylvin Pinus OH OH H
Piceatannol Picea OH OH OH OH
Pinosylvin
monoethylether
Pinus
Alnus
OCH
OH
3

H OH
trans-
pterostilbene
Vitis,
Vaccinium
OCH OCH
3

H
3


OH

Astringin Picea OGlu OH OH OH
Rhapontin Rheum OGlu OH OH
OCH

3

14

Tổng quan tài liệu

1.3.2. Resveratrol
1.3.2.1. Lịch sử nghiên cứu
Resveratrol được xác định lần đầu tiên năm 1940 trong rễ cây Veratrum
grandilorum O. Loes. Đến năm 1963, resveratrol được tìm thấy trong rễ khô của
cây Polygonum cuspidatum (trong tiếng Nhật là Ko-jo-kon) là một loại cây thuốc
cổ truyền chữa viêm da, nhiễm trùng da, mưng mủ, bệnh nấm ngoài da, bệnh tăng

lipid trong máu [9, 11]. Ngày nay, resveratrol được xác định như một phytoalexin
tự nhiên được tổng hợp ở một số cây như nho, đậu phộng, … khi đáp ứng với stress,
vết thương, tia cực tím (UV), sự xâm nhiễm của nấm mốc, vi khuẩn.
Cũng giống như những polyphenolic khác, resveratrol có tác dụng trong việc
chống oxy hóa, nhưng điều khiến người ta chú ý đến nó bởi giả thuyết: resveratrol
là tác nhân chính làm giảm các bệnh về tim mạch ở những người thường xuyên
uống rượu vang ở Pháp, mà người ta hay gọi là “Nghịch lý nư ớc Pháp” (French
paradox) [20]. Kể từ đó, số lượng các nhà khoa học quan tâm, tiến hành các nghiên
cứu và đăng tải những bài báo khoa học về resveratrol không ngừng gia tăng. Các
nghiên cứu sâu thêm về tác dụng, cơ chế tác động và cách thu nhận cũng như gia
tăng hàm lượng của resveratrol trong thực vật vẫn không ngừng được tiến hành.
Các nghiên cứu về resveratrol tăng 40% mỗi năm.[11, 34]






Biểu đồ 1.1: Những nghiên cứu về resveratrol theo thời gian [11]
15

Tổng quan tài liệu

1.3.2.2. Nguồn resveratrol
Nho đỏ hay rượu vang là nguồn resveratrol phổ biến. Resveratrol được xác
định trong nhiều loài thực vật như knotweed Nhật Bản (Polygonum cuspidatum),
đậu phộng, Vaccinum spp. (bao gồm cây việt quất, cây nam việt quất), Reynoutria
japonica và thông Scots. Những loài thực vật khác có chứa resveratrol như giống
Vitis (bao gồm trong lá, thân và vỏ quả nho); giống Morus (bao gồm cây dâu tằm);
giống Veratrum (huệ tây); các cây họ đậu (giống Cassia, Pterolobium

hexapetallum); giống Picea (cây khuynh diệp, vân sam), giống Pinus (thông), giống
Poaceae (các loài cỏ như Festuca, Hordeum, Poa, Stipa), giống Trifolium, giống
Nothofagus, giống Artocarpus, giống Gnetum, Pleuropterus ciliinervis; Bauhinia
racemosa; Paeonia lactiflora; Scilla nervosa; và Tetrastigma hypoglaucum. (hình
1.3) [10]

Hình 1.3. Nguồn resveratrol ở các loài thực vật khác nhau [10]
16

Tổng quan tài liệu

1.3.2.3. Tính chất hóa lý của resveratrol
Resveratrol (3,4’,5-trihydroxystilbene) ở dạng bột màu trắng nhạt, nhiệt độ
nóng chảy 253 – 255
o
C, công thức phân tử là C
14
H
12
O
3
9
và trọng lượng phân tử
228,25 g/mol [ ]. Resveratrol không tan trong nước nhưng tan trong ethanol và
dimethylsulphoxide. Trị số R
f
45
lần lượt là 0,68 trên sắc ký bản mỏng với hệ dung
môi hệ dung môi giải ly chloroform:ethyl acetate:formic acid (5:4:1); 0,11 với hệ
dung môi toluene:methanol (9:1) [ ]; 0,24 với hệ dung môi chloroform:acetic acid

(9:1); 0,36 với hệ dung môi n-hexane:ethyl acetate:methanol (50:50:1)[47]. Cấu
trúc resveratrol gồm 2 vòng phenol đư ợc nối với nhau bởi cầu nối styrene để tạo ra
3,4’,5-trihydroxystilbene. Mặc dù sự hiện diện của nối đôi dẫn đến sự hình thành
đồng phân cis- và trans- của resveratrol nhưng đồng phân trans- là dạng bền hơn.
Phân tích quang phổ trong ethanol, trans-resveratrol hấp thụ cực đại ở bước sóng
308 nm và cis-resveratrol tại bước sóng 288 nm [10].
Trans-resveratrol là dạng thương mại và chuyển hóa thành dạng cis- khi tiếp
xúc với tia UV. Trans-resveratrol bền trong vài tháng khi được bảo vệ khỏi ánh
sáng. Dạng cis cực kỳ nhạy cảm với ánh sáng nhưng có thể bền trong tối ở nhiệt độ
phòng trong ethanol 50% khoảng 35 ngày. pH thấp có thể chuyển hóa cis-
resveratrol thành trans-resveratrol. Phương pháp HPLC (High performance liquid
chromatography) và GC (Gas chromatography) được dùng để phát hiện và định
lượng hàm lượng resveratrol [9].
1.3.2.4. Ứng dụng của resveratrol
- Ứng dụng của trans-resveratrol trong y dược và dinh dưỡng
Trans-resveratrol là hợp chất có lợi cho sức khỏe con người. Trans-
resveratrol gắn liền với sự kiện “French paradox” bởi vì việc tiêu thụ nó hằng ngày
(chẳng hạn như rượu vang đỏ) giúp cơ thể chống lại những bệnh về tim mạch
(Gronbaek và cộng sự; 2000; Jeandet và cộng sự, 1995; Stervbo và cộng sự, 2007).
Rượu vang đỏ chứa từ 0,2 đến 5,8 mg/L (Gu và cộng sự, 1999) phụ thuộc vào loại
17

Tổng quan tài liệu

nho, trong khi đó vang trắng chứa hàm lượng thấp hơn nhiều. Resveratrol có tác
dụng bảo vệ thông qua việc điều hòa sản xuất nitric oxide (Giovannini và cộng sự,
2001), và nó chống sự kết cụm thrombocyte thông qua sự điều hòa tổng hợp
eicosanoid (Olas và cộng sự, 2001). Cùng với rượu vang đỏ, một số thực phẩm khác
cũng chứa nguồn trans-resveratrol như trà Itadori, đậu phộng, bơ đậu phộng và
chocolate (Burns và cộng sự, 2002; Tokusoglu và cộng sự, 2005; Counet và cộng

sự, 2006; Hurst và cộng sự, 2008).[34]
Trans-resveratrol có hoạt tính kháng oxi hóa mạnh, nó làm thay đổi sự oxi
hóa của lipid (Frankel và Waterhouse, 1993; Leighton và cộng sự, 1999). Do hoạt
tính kháng oxi hóa, trans-resveratrol được giả thuyết đóng vai trò quan tr ọng trong
việc ngăn ngừa các bệnh về tim mạch (Bradamante và cộng sự, 2004) và cũng
kháng một số loại ung thư (Aggawal và cộng sự, 2004; Kundu và Surh, 2008). Khả
năng kháng ung thư của trans-resveratrol được tìm ra đ ầu tiên năm 1997 (Jang và
cộng sự, 1997); từ đó rất nhiều công bố về khả năng kháng ung thư của trans-
resveratrol liên quan đến ảnh hưởng nó lên cơ chế tế bào như điều hòa sự phát triển
và tăng sinh tế bào (Roemer và Mahyar-Roemer, 2002; Pervaiz, 2003; Aggarwal và
cộng sự, 2004). Tác động kháng ung thư của trans-resveratrol thể hiện qua khả
năng ức chế sự tăng sinh tế bào và có tác động gây độc tế bào trực tiếp lên khối u.
Hơn thế nữa, trans-resveratrol còn có tác dụng trong điều trị đái tháo đường và
những bệnh suy giảm thần kinh như Alzheimer thông qua sự cảm ứng gen Sirtuin 1.
Ngoài ra, resveratrol cũng góp phần kéo dài tuổi thọ. [34]
- Ứng dụng của trans-resveratrol trong nông nghiệp
Sự ảnh hưởng của trans-resveratrol lên sinh lý thực vật cũng có nhiều ứng
dụng đặc biệt trong nông nghiệp. Trans-resveratrol thể hiện hoạt tính kháng nấm
mốc ((Jeandet và cộng sự, 2002; Adrian và Jeandet, 2006); nó hoạt động như
phytoalexin được tạo ra khi đáp ứng với stress như sự tấn công của tác nhân gây
bệnh, bị thương (Langcake và Pryce, 1976). Trong gỗ, trans-resveratrol được tạo ra
18

Tổng quan tài liệu

và hoạt động như một phytoanticipin (Van Etten và cộng sự, 1994). Bên cạnh đó,
một số thực vật được biến đổi di truyền bằng cách chuyển gen stilbene synthase hay
resveratrol synthase (STS) để tạo trans-resveratrol nhằm đánh giá vai trò c ủa
resveratrol trong việc điều hòa bệnh và tăng cường sức khỏe một số loài thực vật
như thuốc lá, cà chua, khoai tây (Giorcelli và cộng sự, 2004; Halls và Yu, 2008;

Delaunois và cộng sự, 2009). Thực vật chuyển gen tạo resveratrol bằng cách biểu
hiện vượt mức gen STS đã tăng tính kháng của cây khi bị xâm nhiễm bởi nấm mốc
(Thomzik và cộng sự, 1997). [34]
1.4. Tình hình nghiên cứu
1.4.1. Tình hình nghiên cứu trong nước
- Nuôi cấy rễ tơ:
Năm 2009, Nguyễn Thành Hải đã kh ảo sát sự cảm ứng rễ tơ sử dụng
Agrobacterium rhizogenes ATCC 11235 từ các bộ phận khác nhau như trụ hạ diệp,
lá, mô sẹo, trụ thượng diệp cây mãn đình hồng và cây hòe.
- Thu nhận resveratrol:
Nghiên cứu thu nhận resveratrol từ rễ cây đậu phộng thủy canh và nuôi cấy
huyền phù tế bào đậu phộng được thực hiện tại bộ môn Công nghệ sinh học thực
vật và chuyển hóa sinh học, trường Đại học Khoa học Tự nhiên đã thu nhận một số
kết quả khả quan.
1.4.2. Tình hình nghiên cứu ngoài nước
Bên cạnh những nghiên cứu về cơ chế tác dụng của resveratrol, những
nghiên cứu về những phương pháp nhằm chủ động thu nhận hợp chất resveratrol
cũng không ngừng phát triển. Hiện nay, các nghiên cứu thu nhận resveratrol theo 3
hướng chính: nuôi cấy huyền phù tế bào, nuôi cấy rễ tơ, vi sinh vật mang gen STS
tái tổ hợp.
19

Tổng quan tài liệu

Sản xuất resveratrol bằng phương pháp nuôi cấy huyền phù tế bào được thực
hiện chủ yếu trên cây nho (Vitis spp.) và cây đậu phộng (Arachis hypogaea L.). Khi
nuôi cấy huyền phù tế bào không xử lý các tác nhân thì hàm lượng trans-resveratrol
thấp. Do đó, những chiến lược như bổ sung tiền chất, chất cảm ứng, gây stress được
sử dụng để tăng hàm lượng trans-resveratrol. Hàm lượng resveratrol trong nuôi cấy
huyền phù tế bào cây Vitis vinifera cv. Monastrell là 1257 mg/l. [20,34]

Vi sinh vật được sử dụng rộng rãi như là sinh vật mô hình để sản suất nhiều
hợp chất có giá trị. Những gen cần thiết cho quá trình sinh tổng hợp resveratrol
không có trong vi sinh vật. Vì vậy, để sản xuất trans-resveratrol sử dụng vi sinh vật
thì cần phải chuyển những gen cần thiết vào vi khuẩn hoặc nấm mốc và phải bổ
sung coumaric acid, tiền chất của resveratrol vào môi trường nuôi cấy. Hiệu quả của
vi sinh vật tái tổ hợp trong sinh tổng hợp trans-resveratrol phụ thuộc nhiều tác nhân
như loài, chủng và nguồn gốc của gen chuyển, cũng như các thông số như plasmid,
tiền chất bổ sung vào môi trường nuôi cấy. Tuy nhiên, resveratrol tổng hợp từ
phương pháp này vẫn thấp hơn 10 lần so với phương pháp nuôi cấy huyền phù tế
bào Vitis spp. [20]
Phương pháp nuôi cấy rễ tơ được nghiên cứu để sản xuất nhiều hợp chất có
hoạt tính sinh học. Gần đây, các nhà khoa học Mỹ và Hàn Quốc đã sử dụng nuôi
cấy rễ tơ cây đậu phộng cho mục tiêu thu nhận resveratrol. Hàm lượng resveratrol
phụ thuộc vào chủng A. rhizogenes cảm ứng tạo rễ tơ, các tác nhân cảm ứng. Những
kết quả nghiên cứu đó cho thấy nuôi cấy rễ tơ đậu phộng là phương pháp đầy hứa
hẹn để sản xuất resveratrol ở quy mô lớn.






PHẦN 2
VẬT LIỆU - PHƯƠNG
PHÁP



20

Vật liệu – Phương pháp

2. VẬT LIỆU – PHƯƠNG PHÁP
2.1. Vật liệu
2.1.1. Đối tượng
- Hạt cây đậu phộng (Arachis hypogaea L.) được mua ở Viện nghiên cứu dầu
và cây có dầu, quận 1, Tp. Hồ Chí Minh.


Hình 2.1. Hạt đậu phộng (Arachis hypogaea L.) giống VD1
- Chủng vi khuẩn Agrobacterium rhizogenes ATCC 15834 được mua từ ngân
hàng RIKEN-BRC thông qua dự án của MEXT, Nhật Bản.
21

Vật liệu – Phương pháp


Hình 2.2. Khuẩn lạc của vi khuẩn Agrobacterium rhizogenes ATCC
15834
2.1.2. Môi trường nuôi cấy
Môi trường Murashige và Skoog (MS) (phụ lục1): Môi trường muối khoáng đa
lượng và vi lượng MS, bổ sung saccharose dùng để nuôi cấy mô thực vật in vitro.
- Môi trường Nutrient Broth (NB) (phụ lục1): Môi trường NB sử dụng để tăng
sinh vi khuẩn A. rhizogenes ATCC 15834
- Các tác nhân cảm ứng: nhôm clorua, natri acetate, vi khuẩn
- Tiền chất bổ sung: phenylalanine
22

Vật liệu – Phương pháp

2.1.3. Hóa chất sử dụng
2.1.3.1. Hóa chất sử dụng trong thử hoạt tính kháng oxi hóa
- Phương pháp Yen và Duh: Vitamine E (α-tocopherol), Potassium ferricyanide
(K
3
(Fe(CN)
6
)), acid tricloroacetic, NaH
2
PO
4
. 2H
2
O, Na
2
HPO
4
.12H
2
O,
FeCl
- Phương pháp DPPH: 2,2-Diphenyl-1-picrylhydrazyl (DPPH)
3

2.1.3.2. Hóa chất PCR (Polymerase chain reaction)
- Các hóa chất: Dream Taq DNA polymerase, Dream Taq buffer (Fermentas),
dNTPs 2mM (Fermentas), nước siêu sạch.
- Mồi sử dụng:
• Mồi khuếch đại gen rolB
Gen rolB được khuếch đại với cặp mồi rolBF và rolBR. Sản phẩm khuếch

đại được phát hiện và kết quả dương tính sẽ cho một vạch có kích thước 423 bp [22,
37].
Bảng 2.1. Đặc điểm của cặp mồi rolBF và rolBR
Mồi rolBF rolBR
Trình tự 5’-GCT CTT GAC GTG
CTA GAT TT-3’
5’-GAA GGT GCA AGC
TAC CTC TC-3’
Chiều dài (bp) 20 20
Trọng lượng phân tử (g/mol) 6114,0 6102,0
Nhiệt độ nóng chảy (G/C) 53,0 55,3
• Mồi khuếch đại gen rolC