tóm tắt luận án nghiên cứu tạo kháng thể tái tổ hợp đặc hiệu kháng nguyên cyfra21-1 nhằm phát triển kit chẩn đoán ung thư phổi

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM





LÊ ĐÌNH CHẮC



NGHIÊN CỨU TẠO KHÁNG THỂ TÁI TỔ HỢP ĐẶC HIỆU
KHÁNG NGUYÊN CYFRA21-1 NHẰM PHÁT TRIỂN KIT
CHẨN ĐOÁN UNG THƯ PHỔI




Chuyên ngành: Di truyền học
Mã số: 62 42 01 21


TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC







Thái Nguyên – 2013

NHỮNG CÔNG TRÌNH CỦA TÁC GIẢ ĐÃ CÔNG BỐ LIÊN
QUAN ĐẾN ĐỀ TÀI LUẬN ÁN


1. Lê Đình Chắc, Lã Thị Huyền, Lê Quang Huấn (2008) “Tách dòng
và xác định trình tự gen mã hóa kháng nguyên ung thư phổi,
Cyfra21.1”, Tạp chí Sinh học, tập 30 (3), trang 165-168.

2. Lê Đình Chắc, Lê Quang Huấn, Nguyễn Tài Lương (2012)
“Cyfra21.1 – chỉ thị đặc hiệu chẩn đoán ung thư phổi”, Tạp chí Sinh
học, tập 34 (1) trang 123-126.

3. Lê Đình Chắc, Nguyễn Thị Thủy, Lê Quang Huấn (2011) “Kết quả
gây miễn dịch động vật thí nghiệm bằng epitope kháng nguyên
Cyfra21-1”, Tạp chí Khoa học và Công nghệ - Đại học Thái
Nguyên, tập 85 (2) trang 17-19.

4. Lê Đình Chắc, Nguyễn Thị Thu Thủy, Lê Quang Huấn (2010) “Tạo
kháng thể scFv đặc hiệu kháng nguyên Cyfra21-1”, Tạp chí Y học
Việt Nam, tập 372 (2), trang 163-167.

1
MỞ ĐẦU
1. Lý do chọn đề tài
Ung thư phổi (UTP) là một trong những căn bệnh hiểm nghèo do
sự tăng sinh không bình thường của tế bào, thường gặp ở nam giới, chủ
yếu là lứa tuổi 50-70, đặc biệt là những người đã hoặc đang hút thuốc
lá. Đồng thời, UTP cũng là một trong những căn bệnh có tỉ lệ tử vong
lớn thường gặp ở người. Th
ực tế, trong y học đã có rất nhiều phương
pháp được sử dụng để chẩn đoán UTP (sinh thiết phổi, nội soi phổi, thử
đờm chọc nước màng phổi, chụp quang tuyến cắt lớp…) và một số
phương pháp điều trị UTP (hoá trị liệu, phẫu thuật, xạ trị …). Tuy
nhiên, khi phát hiện UTP thì thường đã muộn hoặc quá muộn, vì một số
các căn bệnh khác (viêm phế
quản, viêm phổi, lao,…) cũng có những
triệu chứng tương tự UTP. Do vậy, việc tìm kiếm các phương pháp hữu
hiệu có độ chính xác cao để chẩn đoán sớm được UTP đang là vấn đề
cần thiết và cấp bách của các nhà khoa học trong và ngoài nước. Nghiên
cứu tế bào ung thư cũng như nguồn gốc và sự phát triển của tế bào ung
thư, người ta nhận thấy ung thư có liên quan chặt chẽ vớ
i sự xuất hiện
hàm lượng các kháng nguyên đặc trưng ung thư trong dịch cơ thể. Điều
này đã mở ra hướng nghiên cứu mới trong chẩn đoán, điều trị ung thư

trên thế giới và trong nước.
Một trong những hướng nghiên cứu đó chính là phương pháp sử
dụng các chỉ thị kháng nguyên để xác định, chẩn đoán và định hướng
điều trị ung thư nói chung, UTP nói riêng. Trong thực tế
, nhiều chỉ thị
kháng nguyên được biết đến và có thể sử dụng để phát hiện ung thư
(CEA, NES, CA125, CYFRA21-1, HER-2/neu…), trong đó,
CYFRA21-1 là một chỉ thị điển hình cho UTP dạng không phải tế bào
nhỏ (non small cell lung carcinomar - NSCLC) được đặc trưng bởi sự
tăng hàm lượng nhanh chóng của CYFRA21-1 khi tế bào biểu mô phổi
tăng sinh bất thường. Vì vậy, nếu phát hiện được sự tăng sinh hàm
lượng khác thường của CYFRA21-1 trong dịch cơ
thể sẽ góp phần chẩn
đoán sớm được UTP. Do đó, việc nghiên cứu tạo kháng thể tái tổ hợp
đặc hiệu kháng nguyên UTP CYFRA21-1 là một trong những hướng
nghiên cứu mới để chẩn đoán sớm và định hướng điều trị kịp thời bệnh
UTP dạng NSCLC, góp phần vào những thành tựu đáng kể trong y học
và sinh học. Từ những lý do trên, chúng tôi chọn thực hiện đề tài luận
án
“Nghiên cứu tạo kháng thể tái tổ hợp đặc hiệu kháng nguyên
CYFRA21-1 nhằm phát triển KIT chẩn đoán ung thư phổi”.

2
2. Mục tiêu của đề tài
Tạo được kháng thể scFv kháng kháng nguyên CYFRA21-1 biểu
lộ trên phage để phát triển KIT chẩn đoán sớm UTP dạng NSCLC.
3. Nội dung nghiên cứu
- Tách dòng và xác định trình tự đoạn gen cDNA mã hóa kháng
nguyên CYFRA21-1 từ bệnh phẩm UTP.
- Thu nhận, biểu hiện và tinh sạch kháng nguyên CYFRA21-1.

- Gây miễn dịch trên động vật thí nghiệm bằng kháng nguyên tái
tổ hợp thu nhận được.
- Tạo dòng phage biểu lộ kháng thể scFv kháng CYFRA21-1.
- Sàng lọc kháng thể scFv biểu lộ trên phage.
- Sử dụng kháng thể tái tổ hợp thu được bước đầu tạo KIT chẩn
đoán UTP.
4. Những đóng góp mới của luận án
4.1. Tách dòng thành công đoạn gen mã hoá kháng nguyên UTP
CYFRA21-1 và tạo được kháng thể tái tổ hợp
kháng kháng nguyên
CYFRA21-1 bằng kỹ thuật phage display.
4.2. Tạo được phage mang gen mã hóa kháng thể tái tổ hợp đặc
hiệu kháng nguyên UTP CYFRA21-1.
4.3. Sử dụng kháng thể tái tổ hợp (kháng thể biểu lộ trên phage) để
bước đầu tạo bộ được sinh phẩm định lượng kháng nguyên CYFRA21-
1 trong máu toàn phần bằng kỹ thuật Immuno RT-PCR.

Chương 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Nguồn gốc và đặc điểm ung thư
1.1.1. Nguồn gốc ung thư
Ung thư là mộ
t thuật ngữ dùng để chỉ hơn 200 loại bệnh khác nhau
gây ra bởi sự tăng sinh quá mức của tế bào một cách không bình
thường, sự tăng sinh này không tuân theo mọi cơ chế kiểm soát của cơ
thể. Đây là kết quả của hàng loạt các biến đổi bất thường trong cơ chế
sinh sản của tế bào, thường được bắt đầu bằng những đột biến của gen
tiề
n ung thư và gen áp chế ung thư. Như vậy, sinh ung thư là quá trình
rối loạn tốc độ phân chia tế bào do tổn thương của DNA, do đó ung thư
là một bệnh lý về gen.

1.1.2. Đặc điểm của tế bào ung thư
Đặc điểm quan trọng nhất của tế bào ung thư là tránh được sự chết
theo chương trình, khả năng di căn và không nhạy cảm với các yếu tố

3
chống tăng sinh. Đây là một trong những nguyên nhân mà ung thư trở
nên nguy hiểm hơn các bệnh khác.
1.1.3. Ung thư phổi
UTP thường được gọi là ung thư biểu mô phế quản. Tuỳ thuộc
vào hình dạng tế bào dưới kính hiển vi, UTP được chia làm hai loại
chính: UTP tế bào nhỏ (small cell lung carcinoma - SCLC) chiếm
khoảng 20%, loại ung thư này lây lan nhanh, thời gian tử vong nhanh
và UTP không phải tế bào nhỏ (non small cell lung carcinoma -
NSCLC) chiếm khoảng 80%, loại ung thư này lây lan chậm hơn, thời
gian t
ử vong chậm hơn.
1.2. Kháng nguyên CYFRA21-1
1.2.1. Cytokeratin
Cytokeratin là một trong những tổ chức sợi protein của bộ xương
tế bào có liên quan đến một số quá trình phân chia tế bào. Trong đó,
Cytokeratin19 có quan hệ mật thiết với sự tăng sinh bất thường của tế
bào biểu mô phế quản. Bình thường, hàm lượng mảnh Cytokeratin19
xuất hiện với nồng độ thấp, khi có sự bất thường trong quá trình tăng
sinh tế bào biểu mô phế quả
n, hàm lượng này tăng lên nhanh chóng.
1.2.2. Biểu hiện của Cytokeratin
Trong lúc giải phóng từ các tế bào khối u, có thể nhận ra
Cytokeratin với một số lượng lớn trong dịch cơ thể gồm máu, nước tiểu,
dịch tế bào và dịch màng phổi. Thông thường, trong các cơ thể khỏe
mạnh, nồng độ Cytokeratin lưu thông là rất thấp. Nồng độ tăng một

cách bất thường trong những người có bệnh ung thư biểu mô. Giá tr
ị
của việc nhận biết sự thay đổi về hàm lượng của các mảnh Cytokeratin
trong dịch cơ thể chính là cơ sở cho việc phát hiện sớm và đánh giá
nhanh hiệu quả điều trị đối với các khối u biểu mô ác tính.
1.2.3. Kháng nguyên CYFRA21-1
CYFRA21-1 là một phân đoạn của Cytokeratin19 xuất hiện trong
dịch cơ thể với hàm lượng đặc trưng cho tế bào UTP dạng NSCLC. Do
đó, kháng nguyên CYFRA21-1 được xem nh
ư là một chỉ thị hữu ích
cho UTP dạng NSCLC. Về cấu trúc, gen mã hóa kháng nguyên
CYFRA21-1 nằm trên nhiễm sắc thể số 17 có chiều dài khoảng hơn
1000 bp, gen này hoạt động mạnh khi có sự tăng sinh bất thường của tế
bào biểu mô phổi.
1.3. Kháng thể
1.3.1. Cấu trúc

4
Về cấu trúc, phân tử kháng thể nhìn giống chữ Y được cấu tạo từ 4
chuỗi polypeptide cơ bản, gồm hai chuỗi nặng (H), hai chuỗi nhẹ (L).
Có hai loại chuỗi nhẹ κ (kappa) và λ (lambda), do đó hai chuỗi nhẹ của
mỗi phân tử Ig chỉ có thể cùng là κ hoặc cùng là λ.
1.3.2. Một số kháng thể đang được sử dụng trong nghiên cứu, thực
tiễn hiện nay
1.3.2.1. Kháng thể đơn dòng có ngu
ồn gốc từ chuột
1.3.2.2. Kháng thể lai và kháng thể nhân hóa
1.3.2.3. Kháng thể đơn dòng có nguồn gốc từ người
1.3.2.4. Kháng thể đơn chuỗi
1.3.2.5. Kháng thể phage-scFv

Kháng thể phage-scFv là một thực khuẩn thể hình sợi mang các
mảnh kháng thể ở một đầu của nó, hiện nay thực khuẩn thể được dùng
nhiều nhất để biểu lộ kháng thể là M13. Kháng thể phage-scFv được
tạo ra nhờ công nghệ phage display. Đây là kháng thể hiệ
n nay đang
được sự quan tâm lớn của các nhà khoa học trong và ngoài nước và
cũng là kháng thể có nhiều triển vọng trong ứng dụng chẩn đoán và
điều trị bệnh.
1.3.3. Các nghiên cứu về kháng thể đặc hiệu CYFRA21-1
Trên thế giới
Kháng thể đặc hiệu CYFRA21-1 được biết đến từ những năm cuối
của thế kỷ XX, cho tới nay trên thế giới có rất nhiều các loại kháng thể
đặ
c hiệu CYFRA21-1 đã được tạo ra. Tuy nhiên, trên thế giới đến nay,
một số kháng thể đơn dòng chuột như MABXC42; B974M … đã được
thương mại hóa trên thị trường với giá tương đối cao khoảng từ 480 -
1000 USD/1mg để sử dụng trong nghiên cứu và chẩn đoán sớm UTP
dạng NSCLC. Điều này đẫ gây ảnh hưởng lớn đến quá trình chẩn đoán
và điều trị bệnh.
Tại Việt Nam
Thực tế cho thấy, nghiên cứu tạo kháng thể kháng CYFRA21-1
trong UTP đang được sự quan tâm đặc biệt của các nhà khoa học, đây là
một trong những hướng nghiên cứu mới đáp ứng được nhu cầu chẩn
đoán và điều trị. Các công trình nghiên cứu của Lê Quang Huấn và cộng
sự (2009) cho thấy những ưu điểm của các kháng thể đơn dòng chuột,
kháng thể dạng ghép, kháng thể nhân hóa, … đặc hiệu CYFRA21-1.
Tuy nhiên, đ
ây là vấn đề chưa thực sự được nghiên cứu nhiều ở nước ta.

5

1.4. Công nghệ phage display
Công nghệ phage display cho phép tạo và chọn lọc ra các kháng
thể, các protein, các peptyde kháng lại hầu hết các kháng nguyên đã biết
từ trước đến nay. Đồng thời, kỹ thuật phage display được áp dụng cho
việc chọn lọc kháng thể hoàn toàn in vitro, nhằm tạo được kháng thể
phage-scFv được sử dụng như các công cụ hữu hiệu dùng trong nghiên
cứu, chẩn đoán và tạo thuốc điều trị các căn bệnh hiể
m nghèo.

Chương 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Vật liệu
2.1.1. Mẫu bệnh phẩm
Mẫu huyết thanh, mẫu máu của các bệnh nhân được cung cấp
bởi khoa Ung bướu, bệnh viện Bạch Mai, bệnh viện Trung ương Quân
đội 108.
2.1.2 Sinh phẩm và hóa chất
Sinh phẩm: Các sinh phẩm được sử dụng trong nghiên cứu đều do
các hãng có uy tín trên thế giới (Invitrogen, BioLabs …) cung cấp.
Hóa chất: Hóa chất và enzym dùng để thực hiện đề tài
được cung
cấp bởi các hãng uy tín trên thế giới.
2.1.3. Thiết bị: Thiết bị hiện đại đang được sử dụng tại phòng thí
nghiệm trọng điểm Viện Công nghệ Sinh học-Viện Hàn lâm Khoa học
và Công nghệ Việt Nam.
2.1.4. Phần mềm máy tính
Trong nghiên cứu này, chúng tôi sử dụng các phần mềm máy tính
trong nghiên cứu sinh học phân tử.
2.2. Phương pháp
2.2.1. Các phương pháp thao tác với DNA
Chủ yếu thực hiện theo Sambrook và cộng s

ự (1989), một số
phương pháp được tiến hành theo các KIT và hướng dẫn của nhà sản
xuất.
2.2.1.1. Tách chiết RNA từ bệnh phẩm
2.2.1.2. Phản ứng RT-PCR nhân đoạn gen mã hóa cho CYFRA21-1
2.2.1.3. Phương pháp gắn sản phẩm PCR vào vecter pCR
TM
2.1-TOPO
2.2.1.4. Phương pháp biến nạp plasmid vào tế bào E. coli
2.2.1.5. Phương pháp tách DNA plasmid từ vi khuẩn E. Coli

6
2.2.1.6. Phương pháp điện di DNA trên gel agarose
2.2.1.7. Phương pháp thu đoạn DNA từ gel agarose
2.2.1.8. Phương pháp tich sạch DNA
2.2.1.9. Phương pháp cắt, gắn DNA
2.2.1.10. Phương pháp nhân gen bằng PCR
2.2.1.11. Phương pháp xác định trình tự nucleotide
2.2.2. Các phương pháp thao tác với protein tái tổ hợp
Được sử dụng để biểu hiện gen trong E. coli, điện di protein trên
gel polyacrylamide, tinh sạch protein tái tổ hợp bằng cột ái lực Ni
2+
…
2.2.3. Các kỹ thuật phage display
Được sử dụng để tạo dòng phage biểu lộ kháng thể scFv kháng
kháng nguyên CYFRA21-1 với mục đích định lượng kháng nguyên
CYFRA21-1 trong dịch cơ thể bằng phương pháp phage display
immuno real time-PCR và sản xuất kháng thể scFv tự do.

Chương 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

3.1. Tách dòng và xác định trình tự đoạn gen mã hóa kháng nguyên
CYFRA21-1
3.1.1. Tách RNA tổng số từ máu bệnh nhân ung thư phổi
Mẫu máu của bệnh nhân đã chẩn đoán m
ắc bệnh UTP dạng
NSCLC do bệnh viện Trung ương Quân đội 108 cung cấp được sử dụng
làm nguyên liệu tách chiết RNA tổng số theo KIT tách RNA “S.N.A.P”
của hãng Invitrogen.
Sau khi tách chiết thành công RNA tổng số từ mẫu bệnh phẩm thu
về, chúng tôi tiến hành nhân bản cDNA đoạn gen mã hóa CYFRA21-1
bằng kỹ thuật RT-PCR làm cơ sở cho việc nhân bản đoạn gen mã hóa
kháng nguyên CYFRA21-1.
3.1.2. Nhân bản đoạn gen mã hoá kháng nguyên CYFRA21-1
Trong nghiên cứu này, chúng tôi sử dụng cặp mồi CYFRAF/R
được thiế
t kế cho đoạn gen mã hóa protein CYFRA21-1 để tiến hành
nhân bản cDNA đoạn gen mã hoá CYFRA21-1 từ mRNA có trong
RNA tổng số thu được ở trên thông qua phản ứng RT-PCR, làm cơ sở
cho việc nhân bản đoạn gen mã hóa epitope kháng nguyên CYFRA21-1
để tiếp tục thực hiện các nghiên cứu tiếp theo. Việc nhân bản cDNA
đoạn gen mã hoá CYFRA21-1 được thực hiện theo KIT “RT-PCR one
step” của hãng Invitrogen.

7
Sản phẩm phản ứng RT-PCR được kiểm tra bằng điện di trên gel
agarose 1% (Hình 3.1).

Kết quả điện di trên hình 3.1 cho thấy, trên làn chạy thứ nhất xuất
hiện một băng sáng đậm, so với thang DNA chuẩn thì băng này có kích
thước khoảng trên 400 bp. Kết quả này không mâu thuẫn với tính toán
về độ dài của đoạn gen mã hóa CYFRA21-1. Như vậy, chúng tôi cho
rằng đoạn gen cDNA mã hoá cho kháng nguyên CYFRA21-1 đã được
nhân bản thành công, làm cơ sở cho việc tách dòng và xác định trình
tự đoạn gen cDNA mã hóa CYFRA21-1 để thực hiện các nghiên c
ứu
tiếp theo.
3.1.3. Tách dòng đoạn gen mã hóa kháng nguyên CYFRA21-1
Sau khi nhân bản thành công đoạn gen cDNA mã hóa CYFRA21-
1 bằng phản ứng RT-PCR, để khẳng định kết quả RT-PCR là độ dài của
đoạn gen mã hóa CYFRA21-1, chúng tôi tiến hành tách dòng và xác
định trình tự đoạn gen đã được nhân bản, sau đó so sánh với trình tự gen
mã hóa CYFRA21-1 đã công bố trong Ngân hàng giữ liệu gen Quốc tế.
Quy trình tách dòng được thực hiện bằng cách gắn trực tiếp sản
phẩm phản ứng RT-PCR vào vector tách dòng pCR2.1 (Invitrogen)
Sản phẩm phản ứng RT-PCR được gắn trực tiếp vào vector tách
dòng pCR2.1 (Invitrogen). Sau đó vector tách dòng sẽ được biến nạp
vào vi khuẩn E. coli chủng TOP10. Sản phẩm biến nạp được kiểm tra
gel agarose 1% (Hình 3.2).
Sản phẩm
RT-PCR ≈ 400 b
p

500 bp
250 bp
M 1

Hình 3.1. Hình ảnh điện di sản phẩm RT-PCR trên gel
agarose
Làn chạy số 1: Sản phẩm RT-PCR
Làn chạy M: Thang DNA marker 1 kb

8






Làn chạy M: Marker DNA 1 kb (Fermentas)
Làn chạy số 1, số 2: DNA plasmid chứa đoạn gen mã hóa CYFRA21-1
Trên ảnh điện di (Hình 3.2) cho thấy, các plasmid chứa đoạn gen
mã hóa CYFRA21-1 trên làn chạy số 1 và số 2 của băng điện di đều
tương đối sạch, hàm lượng cao và có kích thước vào khoảng hơn 4,3 kb
so với thang DNA chuẩn. Với kích thước của các plasmid chứa đoạn
gen CYFRA21-1 ở làn chạy số 1 và số 2 cho thấy các plasmid nói trên
có đủ đ
iều kiện đảm bảo cho việc thực hiện các nghiên cứu tiếp theo.
3.1.4. Xác định trình tự đoạn gen cDNA mã hóa CYFRA21-1
Việc xác định trình tự gen tách dòng được tiến hành phản ứng
bằng KIT “Big Dye Terminator sequencing KIT” (ABI, Mỹ), chạy trên
máy ABI PRISM
®
3100-Avant Gentic Analyzer và theo phương pháp
của Sanger và cộng sự (1981), (Hình 3.3).
AATTCGCCCTTGAAGGATGCTGAAGCCTGGTTCACCAGCCGGACTGAAGAATTGAACCGGGAGGTCGCTGGC 72
N S P L K D A E A W F T S R T E E L N R E V A G

CACACGGAGCAGCTCCAGATGAGCAGGTCCGAGGTTACTGACCTGCGGCGCACCCTTCAGGGTCTTGAGATT 144
H T E Q L Q M S R S E V T D L R R T L Q G L E I
GAGCTGCAGTCACAGCTGAGCATGAAAGCTGCCTTGGAAGACACACTGGCAGAAACGGAGGCGCGCTTTGGA 216
E L Q S Q L S M K A A L E D T L A E T E A R F G
GCCCAGCTGGCGCATATCCAGGCGCTGATCAGCGGTATTGAAGCCCAGCTGGGCGATGTGCGAGCTGATAGT 288
A Q L A H I Q A L I S G I E A Q L G D V R A D S
GAGCGGCAGAATCAGGAGTACCAGCGGCTCATGGACATCAAGTCGCGGCTGGAGCAGGAGATTGCCACCTAC 360
E R Q N Q E Y Q R L M D I K S R L E Q E I A T Y
CGCAGCCTGCTCGAGGGACAGGAAGATCACTACAACAATTTGTCTGCCTCCAAGGTCCTCTGAGGCAGCAGG 423
R S
L L E G Q E D H Y N N L S A S K V L *
Hình 3.3. Trình tự nucleotide của đoạn gen cDNA và amino acid
suy diễn mã hóa CYFRA21-1
Hình 3.2. Hình ảnh điện di kiểm tra kết quả tách dòng đoạn
gen mã hóa CYFRA21-1
1 kb
2 kb
4 kb
M 1 2
4,3 kb

9
Với trình tự đoạn gen mã hóa CYFRA21-1 thu được như trên,
chúng tôi tiến hành so sánh với trình tự gen mã hóa CYFRA21-1 đã
công bố trong Ngân hàng dữ liệu Quốc tế trên trang web

bằng phần mềm FASTA để kiểm định sản phẩm
cDNA, kết quả thu được là 100% khi so sánh với trình tự amino acid
trên Ngân hàng dữ liệu quốc tế mang mã số K1C19-HUMAN-P08727.
3.2. Biểu hiện thu kháng nguyên CYFRA21-1

3.2.1. Nhân bản vùng mã hóa epitope kháng nguyên CYFRA21-1
Kết quả nhân bản vùng gen mã hóa quyết định kháng nguyên
CYFRA21-1 được trình bày trên hình 3.4.


Hình 3.4. Hình ảnh điện di kết quả PCR trên gel agarose
Làn chạy M: Thang DNA chuẩn 100 bp.
Làn chạy số 1 và số 2: Sản phẩm PCR.
Kết quả điện di trên gel agarose (Hình 3.4) cho thấy, trên làn chạy
số 1 và 2 có một băng sáng đậm với kích thước khoảng 250 bp. Kích
thước này phù hợp với tính toán về đoạn gen chứa vùng epitope kháng
nguyên CYFRA21-1.
Như vậy, chúng tôi cho rằng đoạn gen mã hóa cho vùng epitope
kháng nguyên CYFRA21-1 đã được nhân bản thành công với cặp mồi
ExpcyF/R.
3.2.2. Tách dòng đoạn gen mã hóa vùng epitope kháng nguyên
CYFRA21-1
Quá trình chọn dòng đoạn gen mã hóa vùng quyết định kháng
nguyên CYFRA21-1 được tiến hành tương tự như phần chọn dòng đoạn
gen mã hóa CYFRA21-1 ở phần 3.1.3.
Kết quả được thể trên hình 3.5.
300 bp
200 bp
Sản phẩm PCR ≈ 250 bp
M 1 2

10
CATATGGGCAGGTCCGAGGTTACTGACCTGCGGCGCACCCTTCAGGGTCTTGAGATTGAGCTGCAGTCACAGCTG 75
H M G R S E V T D L R R T L Q G L E I E L Q S Q L
AGCATGAAAGCTGCCTTGGAAGACACACTGGCAGAAACGGAGGCGCGCTTTGGAGCCCAGCTGGCGCATATCCAG 150

S M K A A L E D T L A E T E A R F G A Q L A H I Q
GCGCTGATCAGCGGTATTGAAGCCCAGCTGGGCGATGTGCGAGCTGATAGTGAGCGGCAGAATCAGGAGTACCAG 225
A L I S G I E A Q L G D V R A D S E R Q N Q E Y Q
CGGCTCATGGACCTCGAGTGA 246
R L M D L E *
Hình 3.5. Trình tự nucleotide của cDNA và amino acid suy diễn mã
hóa vùng quyết định kháng nguyên CYFRA21-1
Với kết quả này, chúng tôi thu được sự tương đồng là 100% khi so
sánh với trình tự amino acid trên Ngân hàng dữ liệu quốc tế mang mã số
K1C19-HUMAN-P08727. Như vậy, việc tách dòng và xác định trình tự
cDNA của đoạn gen mã hóa quyết định kháng nguyên CYFRA21-1 đã
được tiến hành thành công, là cơ sở tốt để thiết kế vector biểu hiện.
3.2.3. Thiết kế vector biểu hiện pET-21a(+)/CYFRA21-1
Gen Cyfra21-1 được chuy
ển từ vector tách dòng sang vector biểu
hiện pET-21a(+) nhờ các enzym cắt hạn chế Nde I và Xho I, enzym nối
là T4-DNA ligase. Vector pET-21a(+) mang đoạn gen mã hóa quyết
định CYFRA21-1 được chuyển vào E. coli DH5α. Sau đó kiểm tra các
DNA plasmid mang đoạn gen mã hóa quyết định CYFRA21-1 bằng các
enzym cắt hạn chế và điện di trên gel agarose (Hình 3.6).

Làn chạy 1-3: DNA plasmit của khuẩn lạc khác nhau đã xử lý
bằng Nde I và Xho I; làn chạy M: thang DNA 1kb
Trên ả
nh điện di (Hình 3.6) cho thấy, ở làn chạy số 1, sản phẩm
PCR xuất hiện một băng đặc hiệu có kích thước khoảng 250 bp. Kích
thước này là hoàn toàn phù hợp với tính toán về kích thước của đoạn
gen Cyfra21-1 với một phần của vector. Tuy nhiên, cần kiểm tra khung
Hình 3.6. Hình ảnh điện di sản phẩm cắt kiểm tra DNA plasmit bằng
Nde I và Xho I
1 2 3 M
250 bp
Sản phẩm cắt

11
đọc và các đột biến có thể xuất hiện trong quá trình thao tác chúng tôi
đã tiến hành xác định trình tự nucleotide gen Cyfra21-1 sau khi gắn vào
vector biểu hiện pET-21a(+). Kết quả xác định trình tự nucleotide (Hình
3.7) đã khẳng định thành công việc thiết kế vector biểu hiện gen
Cyfra21-1.
CATATGGGCAGGTCCGAGGTTACTGACCTGCGGCGCACCCTTCAGGGTCTTGAGATTGAGCTGCAGTCACAGCTG 75
H M G R S E V T D L R R T L Q G L E I E L Q S Q L
AGCATGAAAGCTGCCTTGGAAGACACACTGGCAGAAACGGAGGCGCGCTTTGGAGCCCAGCTGGCGCATATCCAG 150
S M K A A L E D T L A E T E A R F G A Q L A H I Q
GCGCTGATCAGCGGTATTGAAGCCCAGCTGGGCGATGTGCGAGCTGATAGTGAGCGGCAGAATCAGGAGTACCAG 225
A L I S G I E A Q L G D V R A D S E R Q N Q E Y Q
CGGCTCATGGACCTCGAGCAGGAGCACCACCACCACCACCACTGA 270
R L M D L E Q E H H H H H H *

3.2.4. Biểu hiện thu protein CYFRA21-1 tái tổ hợp
Vector biểu hiện pET-21a(+) mang gen mã hoá vùng quyết định
kháng nguyên CYFRA21-1 được biến nạp vào chủng E. coli BL21
(DE3) để biểu hiện. Sau đó, tế bào thu tại các thời điểm khác nhau
được kiểm tra trên gel polyacrylamide theo phương pháp Laemmli
(Hình 3.8).







Từ ảnh điện di (hình 3.8) cho thấy, tất cả các mẫu được cảm ứng
bằng IPTG đều xuất hiện một băng với kích thước khoảng 8 kDa thấp
hơn lysozyme rất đậm so với mẫu M. Để khẳng định băng protein mới
xuất hiện sau khi cảm ứng IPTG là sản phẩm CYFRA21-1, chúng tôi đã
tiến hành tinh sạch bằng sắc ký ái lực trên cột Ni-NTA agarose.
Hình 3.7. Trình tự nucleotide và trình tự amino acid suy diễn của gen
Cyfra 21-1 sau khi gắn vào vector biểu hiện pET-21a(+)
Hình 3.8. Hình ảnh điện di kết quả biểu hiện protein tái tổ hợp
Làn chạy số 1: Mẫu trước khi cảm ứng;
Làn chạy M: lysozyme 14 kDa
Làn chạy số 2, 4, 6, 8: Mẫu trước cảm ứng sau 2giờ, 3giờ, 5giờ, 20giờ
Làn chạy số 3, 5, 7, 9: Mẫu cảm ứng bằng IPTG sau 2 giờ, 3 giờ, 5 giờ, 20 giờ.

1 2 3 4 5 6 7 8 9 M

12
3.2.5. Tinh sạch kháng nguyên CYFRA21-1
Sản phẩm biểu hiện sau khi tinh sạch trên cột Ni-NTA được kiểm
tra bằng điện di trên gel polyacrylamide (Hình 3.9).







Kết quả điện di (Hình 3.9) cho thấy, sản phẩm sau khi tinh sạch
lần thứ hai trên cột Ni-NTA xuất hiện một băng với kích thước phân tử
lớn hơn 8 kDa. Như vậy, sản phẩm được biểu hiện sau khi cảm ứng
bằng IPTG là sản phẩm của gen vùng quyết định kháng nguyên
CYFRA21-1 cần thu nhận.
3.2.6. Kết quả phân tích khối phổ của CYFRA21-1
Protein tái tổ hợp sau khi bi
ểu hiện trong E. coli và tinh sạch trên
cột Ni-NTA, được xử lý bởi trypsin. Theo lý thuyết, trypsin sẽ cắt
protein tại các vị trí sau amino acid Arginine (R) và Lysine (K). Như
vậy, nếu protein nhận được trong thí nghiệm biểu hiện ở trên thật sự là
đoạn quyết định kháng nguyên CYFRA21-1 thì khi xử lý với Trypsin
nhận được 9 mảnh peptide với trình tự tương ứng sau:
MGR/ SEVTDLR/ R/ TLQGLEIELQSQLSMK/
AMINOACIDLEDTLAETEAR/ FGAQLAHIQALISGIEAQLGDVR/
ADSER/ QNQEYQR/ LMDLEHHHHHH
Kết quả sau khi phân tích khối phổ được thể hiện trên hình 3.10 và
bảng 3.1.
Hình 3.9. Hình ảnh điện di protein sau tinh sạch trên cột Ni-NTA

Làn chạy số 1, 2: sản phẩm trước khi tinh sạch
Làn chạy số 3. Sản phẩm được tinh sạch trên cột Ni-NTA lần thứ nhất
Làn chạy số 4. Sản phẩm được tinh sạch trên cột Ni-NTA lần thứ hai
Làn chạy M. Chỉ thị phân tử protein

13






















Kết quả thực nhận được sau khi phân tích khối phổ hình 3.10,
bảng 3.1 cho thấy các mảnh phân tử (các đoạn peptide) được nhận diện

trùng lặp hoàn toàn với tính toán lý thuyết.
Như vậy, sản phẩm gen tái tổ hợp được biểu hiện và tinh sạch
chính là epitope kháng nguyên CYFRA21-1.
Bảng 3.1. Kết quả thực tế nhận được sau khi phân tích khối phổ
Vị trí vắt
Tên enzyme
sử dụng
Trình tự peptide nhận được thực tế Chiều dài
Khối lượng
peptide [Da]
3 Trypsin MGR 3 362.447
10 Trypsin SEVTDLR 7 818.882
11 Trypsin R 1 174.203
27 Trypsin TLQGLEIELQSQLSMK 16 1818.115
40 Trypsin AALEDTLAETEAR 13 1389.482
63 Trypsin
FGAQLAHIQALISGIEAQLG
DVR
23 2407.755
68 Trypsin ADSER 5 576.564
75 Trypsin QNQEYQR 7 964.990
86 LMDLEHHHHHH 11 1442.577
Hình 3.10. Kết quả phân tích khối phổ của sản phẩm gen
biểu hiện trong E. coli sau khi cảm ứng với IPTG

14
3.3. Gây miễn dịch gà bằng kháng nguyên CYFRA21-1
Quy trình gây miễn dịch ở gà được tiến hành theo phương pháp
của Nader S. và William A.F., (1998) với kháng nguyên tái tổ hợp
CYFRA21-1. Kết quả được trình bày trên bảng 3.2, hình 3.11; bảng 3.3,

hình 3.12.
Bảng 3.2. Kết quả đáp ứng miễn dịch ở gà sau khi gây miễn dịch
lần thứ 3
Giá trị hấp thụ OD
Nồng 450nm
độ huyết thanh

Gà 1

Gà 2 Gà 3 Gà 4

PBS

A 2,015 1,35 1,461 0,484 0,044
B 0,913 0,705 0,789 0,531 0,046
C 0,525 0,247 0,544 0,228 0,046
D 0,168 0,081 0,226 0,097 0,045

Gà 1, gà 2 và gà 3: Đã gây miễn dịch lần thứ 3 được kiểm tra đáp ứng
miến dịch bằng độ hấp thụ bước sóng 450 nm.
Gà 4: Không gây miễn dich với kháng nguyên CYFRA21-1.
PBS 5: Cột không có huyết thanh gà.
A: huyết thanh không pha loãng, B: huyết thanh pha loãng 10 lần
C: huyết thanh pha loãng 100 lần, D: huyết thanh pha loãng 1000 lần.




Hình 3.11. Kết quả xác định đáp ứng miễn dịch của gà bằng
ELISA sau khi gây miễn dịch lần thứ 3

15
Bảng 3.3. Kết quả xác định đáp ứng miễn dịch của gà bằng ELISA
trước khi lấy tuỷ xương và lách

Giá trị hấp thụ OD
Nồng 450nm
độ huyết thanh

Gà 1

Gà 2 Gà 3 Gà 4

PBS

C 2,714 2,029 2,133 0,5 0,059
D 0,433 0,438 0,544 0,162 0,057

Gà 1, gà 2 và gà 3: Đã gây miễn dịch lần thứ 4, được kiểm tra đáp
ứng miễn dịch bằng độ hấp thụ bước sóng 450 nm, trước khi lấy tuỷ
xương và lách để tách RNA.
Gà 4: Không gây miễn dịch với epitope kháng nguyên CYFRA21-1.
PBS 5: Cột không có huyết thanh gà, C: Huyết thanh của gà pha
loãng 100 lần, D: Huyết thanh của gà pha loãng 1000 lần.





Kết quả ở các bảng 3.2 và hình 3.11; bảng 3.3 và hình 3.12 cho

thấy các gà sau khi gây miễn dịch với epitope kháng nguyên
CYFRA21-1 có sự đáp ứng miễn dịch tốt, đặc biệt sau lần gây miễn
dịch thứ 4, làm cơ sở tin cậy cho các nghiên cứu tiếp theo.
3.4. Thu nhận kháng thể đặc hiệu kháng nguyên CYFRA21-1
3.4.1. Tách chiết RNA tổng số từ tủy xương và lách của gà đã gây
miễn dịch
Việc tách chiết RNA từ tủy xương và lách củ
a gà đã gây miễn dịch
được thực hiện tương tự như tách chiết RNA từ bệnh phẩm (mục 3.1.1).
Sau đó, chúng tôi tiến hành nhân bản đoạn gen mã hóa kháng thể
của gà kháng CYFRA21-1.
Hình 3.12. Kết quả xác định đáp ứng miễn dịch của gà bằng
ELISA trước khi lấy tuỷ xương và lách

16
3.4.2. Nhân bản đoạn gen mã hóa vùng biến đổi của kháng thể gà
đặc hiệu epitope kháng nguyên CYFRA21-1
Kết quả nhân bản các đoạn gen cDNA mã hoá vùng biến đổi của
kháng thể gà đặc hiệu epitope kháng nguyên tái tổ hợp CYFRA21-1
bằng kỹ thuật RT-PCR được trình bày trên hình 3.13.







Từ kết quả trên hình 3.13 cho thấy, làn chạy số 1 và làn chạy số 2
đều có các băng sáng đậm thể hiện gen mã hóa vùng biến đổi chuỗi
nặng (V

H
) và chuỗi nhẹ (V
L
) đã được nhân bản thành công làm cơ sở để
ghép nối V
H
với V
L
tạo scFv. Kết quả nối ghép gen mã hóa vùng biến
đổi V
H
với V
L
được thể hiện trên hình 3.14.

Hình 3.14. Hình ảnh điện di sản phẩm PCR nối ghép V
H
-V
L

tạo scFv
Làn chạy M. Chỉ thị phân tử 100 bp, làn chạy 1. Sản phẩm PCR
Kết quả PCR trên hình 3.14 cho thấy, sản phẩm ghép nối V
H
và V
L

đã được tiến hành thành công.
Sản phẩm RT-PCR
M 1 2

Hình 3.13. Hình ảnh điện di kiểm tra sản phẩm RT-PCR

Làn chạy M: Chỉ thị phân tử DNA 1 kb (Fermentas)
Làn chạy số 1: Gen mã hóa vùng biến đổi chuỗi nặng (V
H
)
Làn chạy số 2: Gen mã hóa vùng biến đổi chuỗi nhẹ (V
L
)
250 bp
500 bp
Sản phẩm
PCR nối ghép V
H
-V
L
700 bp

800 b
p

1 M

17
3.4.3. Quy trình tạo dòng phage biểu hiện kháng thể scFv (kháng
thể phage)
Trong nghiên cứu này, chúng tôi sử dụng kỹ thuật phage-display
để tạo kháng thể phage-scFv theo phương pháp của tiến sĩ Griffith và
cộng sự 1991.
Cụ thể:

- Thu nhận ngẫu nhiên 24 dòng (khuẩn lạc) tế bào E. coli TG1 từ
các đĩa biến nạp ở trên và nuôi trong 100 µl môi trường 2xTY (gồm 16g
Typtone, 10g Yeast Extract và 5g NaCl trong 1 lit nước) chứa 100
µg/ml ampicillin và 1% glucose. Nuôi lắc ở 37
o
C qua đêm, sau đó bổ
sung 100 ml môi trường 2xTY chứa 100 µg/ml Ampicillin và 1%
glucose và nuôi cho tới khi đạt OD
600
= 0,5 (khoảng 2 giờ).
- Gây nhiễm các tế bào E. coli trong dịch nuôi cấy với helper
phage M13-K07 (BioLab) theo tỷ lệ 1:20 (số tế bào vi khuẩn: số hạt
helper phage, với ước lượng 1 OD
600
= 8 x 10
8
tế bào/ml).
- Tiếp tục nuôi không lắc trong bể nước ở 37
o
C với thời gian
khoảng 30 phút. Ly tâm 3.300 x g trong 10 phút. Cặn ly tâm được hòa
trong 50 ml môi trường 2xTY chứa 100 µg/ml Ampicillin và 25 µg/ml
Kanamycin và nuôi ủ lắc qua đêm ở 37
o
C. Ly tâm 10.800 x g trong 10
phút hoặc 3.300 x g trong 30 phút. Thêm 1/5 thể tích PEG/NaCl (20%
Polyethylene glycol 6.000 và 2,5 M NaCl) vào phần dịch ly tâm. Trộn
đều và để tủa ở 4
o
C, thời gian 1 giờ. Ly tâm 10 800 g trong 10 phút

hoặc 3.300 x g trong 30 phút. Loại bỏ dịch ly tâm, ly tâm nhanh và loại
bỏ hoàn toàn dịch ly tâm.
- Hòa cặn ly tâm trong 2 ml PBS và ly tâm 11.600 g trong 10 phút
để loại bỏ hoàn toàn xác tế bào. Dịch ly tâm thu được là dịch phage biểu
lộ scFv trên bề mặt. Tuy nhiên, để thu nhận kháng thể phage đặc hiệu
có khả năng nhận biết và gắn kết với quyết định kháng nguyên, cần tiến
hành kiểm tra bằng kỹ thuật ELISA.
3.4.4. Kết quả chọn dòng kháng thể phage - scFv
đặc hiệu kháng
nguyên CYFRA21-1
Để thu được kháng thể từ thư viện phage-scFv gắn đặc hiệu với
kháng nguyên CYFRA21-1, chúng tôi sử dụng kỹ thuật ELISA tiến
hành sàng lọc 4 vòng để xác định ái lực riêng của từng dòng với kháng
nguyên CYFRA21-1.
Kết quả sàng lọc một số dòng tế bào biểu lộ kháng thể phage được
trình bày trên hình 3.15 và bảng 3.4.

18
Bảng 3.4. Kết quả sàng lọc để lựa chọn các dòng biểu lộ kháng
thể đặc hiệu quyết định kháng nguyên CYFRA21-1
Các dòng biểu
hiện kháng thể
OD (450-650)
Các dòng biểu
hiện kháng thể
OD (450-650)
Clone1 0.073 Clone13 0.078
Clone2 0.065 Clone14 0.147
Clone3 0.142 Clone15 0.066
Clone4 0.061 Clone16 0.063

Clone5 0.068 Clone17 0.055
Clone6 0.070 Clone18 0.079
Clone7 0.096 Clone19 0.085
Clone8 0.073 Clone20 0.073
Clone9 0.075 Clone21 0.063
Clone10 0.211 Clone22 0.127
Clone11 0.053 Clone23 0.058
Clone12 0.089 Clone24 0.083



Hình 3.15. Kết quả chọn các dòng mang kháng thể đặc hiệu
kháng nguyên CYFRA21-1 bằng kỹ thuật ELISA

19
Kết quả ở bảng 3.4 và hình 3.15 cho thấy, dòng mang kháng thể số
10 (clone 10) có ái lực cao nhất trong số các dòng đã sàng lọc. Vì vậy,
dòng số 10 được chọn lựa cho việc xác định trình tự và tiến hành các thí
nghiệm tiếp theo.
3.4.5. Xác định trình tự gen mã hóa kháng thể đặc hiệu epitope của
CYFRA21-1
Việc xác định trình tự gen được tiến hành tương tự phần 3.1.4. Kết
quả xác định trình tự nucleotide của gen mã hóa scFv kháng thể đặc
hiệu epitope kháng nguyên CYFRA21-1 được trình bày trên hình 3.16
GGTGTCAGCGAACCCGGGAGAACCGTCGAGATCACCTGCTCCGGGGGTGGTAGCAGCAAC 60
G V S E P G R T V E I T C S G G G S S N
TACTATGGCTGGTACCAGCAGAAGGCACCTGGCAGTGCCCCTGTCAGTCTGATCTATGCT 120
Y Y G W Y Q Q K A P G S A P V S L I Y A
AACACCAACAGACCCTCAAACATCCCTTCACGATTCTCCGGTTCTGGATCCGGCTCCACA 180
N T N R P S N I P S R F S G S G S G S T

AACACATTAACCATCACTGGGGTCCAAGCCGACGACGAGGCTGTCTATTTCTGTGGGAGT 240
N T L T I T G V Q A D D E A V Y F C G S
GGAGACGGCAGTTATTCTGGTATATTTGGGGCCGGGACAACCCCGACCGTCCTAGGTCAG 300
G D G S Y S G I F G A G T T P T V L G Q
TCCTCTAGATCTTCCGCCGTGACGTTGGACGAGTCCGGGGGCGGCCTCCAGACGCCCAGA 360
S S R S S A V T L D E S G G G L Q T P R
GGAGCGCTCAGCCTCGTCTGCAAGGCCTCCGGGTTCACCTTCAGTGACCGTGGCATGTTC 420
G A L S L V C K A S G F T F S D R G M F
TGGGTGCGACAGGCGCCCGGCAAGGGGCTGGAGTTCGTCGCTGAAATTACCAAGGATGGT 480
W V R Q A P G K G L E F V A E I T K D G
GGTGGCACATGGTACGGGTCGGCGGTGAAGGGCCGTGCCACCATCTCGAGGGACAACGGG 540
G G T W Y G S A V K G R A T I S R D N G
CAGAGCACAGTGAGGCTGCAGCTGAACAACCTCAGGGCTGAGGACACCGGCATCTACTGC 600
Q S T V R L Q L N N L R A E D T G I Y C
TGCGCCAAACCTGCTGGTTATTGTTGGTATGGTGATTGTGGTGGTTGGATCGACGCATGG 660
C A K P A G Y C W Y G D C G G W I D A W
GGCCACGGGACCGAAGTCATCGTCTCCTCCACTAGTGGCCAGGCCAGACCAGATCCTCAT 720
G H G T E V I V S S T S G Q A R P D P H
Hình 3.16. Trình tự nucleotde và trình tự amino acid suy diễn của
scFv kháng thể đặc hiệu epitope kháng nguyên Cyfra 21-1

Để kiểm tra khả năng nhận biết và liên kết với kháng nguyên tự
nhiên của dòng phage số 10, chúng tôi tiến hành thử nghiệm trên mẫu
huyết thanh của bệnh nhân đã được chẩn đoán là ung thư phổi. Kết quả
bằng kỹ thuật ELISA được thể hiện trên hình 3.17.


20

Hình 3.17. Kết quả đánh giá liên kết của dòng phage 10 với huyết
thanh UTP và huyết thanh bình thường
1: Huyết thanh bệnh nhân UTP.
2: Huyết thanh người bình thường.
3: Giếng phủ PBS.
Kết quả ELISA trên hình 3.17 có thể khẳng định, kháng thể phage
mà chúng tôi nhận được có khả năng nhận biết và liên kết đặc hiệu với
kháng nguyên CYFRA21-1 trong tự nhiên.
3.5. Sử dụng kháng thể phage-scFv kháng CYFRA21-1 thu được để
định lượng kháng nguyên CYFRA21-1
KIT định lượng kháng nguyên CYFRA21-1 trong ung thư phổi
được thực hiện gồm:
1. Tạo các phage biểu lộ scFv của kháng thể đặc hiệu CYFRA21-1.
2. Gắn kháng thể đặc hiệu CYFRA21-1 lên các giếng khay thử.
3. Bổ sung các phage biểu lộ scFv đặc hiệu CYFRA21-1 để tạo
phức hợp kháng thể-kháng nguyên-scFv trên phage.
4. Thủy giải các DNA-phage để làm khuôn để định lượng bằng
real-time PCR
Để tiến hành phân tích định lượng kháng nguyên CYFRA21-1
trong các mẫu mà chúng tôi thu về, trong nghiên cứu này, chúng tôi sử
dụ
ng probe N
o
115 của Hãng Roche để thực hiện Real-time PCR và cặp
mồi đặc hiệu. Để sử dụng để khuếch đại đoạn DNA mã hóa cho scFv đã
gắn trong hệ gen của phage hình 3.18.

21

Sau khi xây dựng đường cong chuẩn, chúng tôi tiến hành thử
nghiệm định lượng kháng nguyên CYFRA21-1 trên các mẫu huyết
thanh (HT) bệnh nhân đã được xác định là ung thư phổi và mẫu HT của
người bình thường. Kết quả định lượng CYFRA21-1 được trình bày
trên hình 3.19





Hình 3.18. Sơ đồ mồi, mẫu dò và đoạn DNA được khuếch đại
trong phản ứng định lượng kháng nguyên CYFRA 21-1
Hình 3.19. Kết quả định lượng CYFRA21-1
trong các mẫu huyết thanh

22
Từ kết quả hình 3.19 cho thấy các mẫu HT1, HT2, HT3, HT4 của
bệnh nhân đã mắc UTP dạng NSCLC đều có lượng kháng nguyên
CYFRA21-1 cao hơn ngưỡng (3,3 ng/ml) rất nhiều. Trong khi đó mẫu
huyết thanh HT5 (mẫu huyết thanh của người khỏe không bị bệnh) có
lượng kháng nguyên CYFRA21-1 rất thấp (dưới ngưỡng); từ đó cho
thấy, việc sử dụng KIT định lượng kháng nguyên mà chúng tôi đề xuất
để định lượng kháng nguyên CYFRA21-1 trong ung thư phổi đạt kế
t
quả tốt.
3.6. Kết quả định lượng CYFRA21-1 trong các mẫu bệnh phẩm do
bệnh viện Bạch Mai cung cấp
Các mẫu bệnh phẩm (HT, KN) sau khi thu về đều được pha loãng

100 lần trước khi chạy Real-time PCR. Kết quả xác định hàm lượng
CYFRA21-1 trong các mẫu HT và KN được trình bày trên hình 3.20 và
bảng 3.5.





Hình 3.20. Kết quả định lượng kháng nguyên CYFRA21-1 trong các
mẫu bệnh phẩm do bệnh viện Bạch Mai cung cấp

23



Mẫu Giá trị C
p
Nồng độ
CYFRA21-1 (ng/ml)
HT1 35,56 10,7
HT2 35,92 8,10
HT3 38,41 3,50
HT4 36,49 5,10
HT5 36,07 7,20
HT6 >40,00 <0,26
HT7 >40,00 <0,26
HT8 37,38 2,70
HT9 35,14 15,00
HT10 36,88 2,20
HT11 35,20 14,10

HT12 36,20 6,50
PBS >40,00 <0,26
KN1 35,82 8,70
KN2 >40,00 <0,26
KN3 36,06 7,30
KN4 36,83 3,90
KN5 36,22 6,40
H
2
O _ _


Từ kết quả ở hình 3.20 và bảng 3.5, chúng tôi có nhận thấy mẫu
HT9, mẫu HT11 đều có hàm lượng kháng nguyên CYFRA21-1 lớn nhất
và cao hơn khá nhiều so với mức cho phép (3,3 ng/ml) lưu thông trong
máu. Do đó, chúng tôi cho rằng mẫu HT9 và HT11 có biểu biện của
bệnh UTP ở giai đoạn sớm. Các mẫu HT1, HT2, HT4, HT5, HT10,
HT12, KN1, KN3, KN5 đều có hàm lượng CYFRA21-1 cao hơn mức
ngưỡng cho phép (3,3 ng/ml) nên cần được theo dõi kỹ, về lý thuyết,
các mẫu HT và KN này đã cho thấy nguy cơ bị UTP dạ
ng NSCLC là rất
lớn, tuy nhiên để xác định được chính xác hơn nữa thì cần phải có sự
theo dõi tiếp theo để có được kết luận chính xác nhất. Các mẫu khác
Bảng 3.5. Kết quả định lượng kháng nguyên CYFRA21-1
trong các mẫu bệnh phẩm phân tích