Tiểu luận sản xuất kháng sinh ryfamicin B words

Bài tập vi sinh 2 GVHD: Phạm Thị Hương
BÀI TẬP TÌM HIỂU VỀ KHÁNG SINH RIFAMYCIN B

Contents

Giới thiệu
Trong năm 1995, riêng thị trường tư bản tiêu thụ 20000 tấn kháng sinh, [9] với
nhu cầu và xu thế phát triển thì con số này đang tiếp tục tăng trưởng, điều đó cho
thấy vai trò quan trọng của sản xuất kháng sinh trong y tế, nông nghiệp và đời
sống.
Kể từ khi Penicillin được Alexander Fleming phát hiện (1929), và được chứng
minh có tác dụng chữa bệnh (1941), đến ngày nay, kháng sinh trở thành một dược
phẩm thần kỳ sớm chiếm vị trí hàng đầu trong lĩnh vực thuốc men thế giới. [4]
Bên cạnh chất kháng sinh penicillin đầu đàn được sản xuất từ nấm, nhiều kháng
sinh khác cũng được nghiên cứu và tổng hợp như: Cefaclor, Cephalexin (thuộc
nhóm β lactam), Azithromycin, Roxrithromycin, rovamycin (thuộc nhóm
macrolid), [1] Rifamycin…
Trong bài này chúng ta sẽ tìm hiểu tổng quan về kháng sinh, và quan trọng hơn
là khám phá những kiến thức để hiểu về Rifamycin (được biết đến với khả năng
điều trị bệnh lao) như: cơ chế sinh tổng hợp, cơ chế tác động đến vi sinh vật gây
hại, quy trình sản xuất trong công nghiệp và sử dụng gen hemoglobin từ vi khuẩn
Vitreosicilla stercoraria để nâng cao quá trình sản xuất rifamycin B.
Nhóm 9 Page 1
Bài tập vi sinh 2 GVHD: Phạm Thị Hương
Phần 1: VÀI NÉT VỀ KHÁNG SINH
 Khái niệm kháng sinh:
Kháng sinh hay còn gọi là trụ sinh là những chất có khả năng tiêu diệt vi khuẩn
hay kìm hãm sự phát triển của vi khuẩn một cách đặc hiệu. Nó có tác dụng lên vi
khuẩn cấp độ phân tử, thường là một vị trí quan trọng của vi khuẩn hay một phản
ứng trong quá trình phát triển của vi khuẩn. [7]
 Cơ chế sinh tổng hợp chất kháng sinh ở vi sinh vật:

Đây là một trong những vấn đề lý thú với nhiều giả thuyết khác nhau được đưa
ra để lý giải vì sao vi sinh vật lại tổng hợp kháng sinh. Điều hiển nhiên là kháng
sinh được chính vi sinh vật tổng hợp ra, song chúng không có vai trò rõ rệt nào
đối với sự phát triển sinh lý bình thường của chủng sinh ra nó. [9] Bên cạnh đó,
khả năng sinh tổng hợp các chất kháng sinh không phân bố đồng đều, mà tập
trung chủ yếu vào nhóm hẹp các vi sinh vật. [9]
Nhiều ly giải được đưa ra nào là: kháng sinh là một cách thức để dự trữ thức ăn,
một thành phần của vỏ bào tử hay chỉ là một sản phẩm dư thừa… các cơ chế sinh
tổng hợp này rất phức tạp và có nhiều điểm chưa được làm sáng tỏ. Trong số này
có 2 lý giải được ủng hộ nhiều nhất:
- Việc tổng hợp các chất kháng sinh nhằm tạo ra ưu thế phát triển cạnh tranh
có lợi cho chủng kháng sinh. [9] Các minh chứng cho giả thuyết này là các
vi sinh vật sinh kháng sinh thường gặp phổ biến ở trong đất và phần lớn là
sinh vật hoại sinh sống quanh rễ thực vật – môi trường này có nhiều chất
dinh dưỡng, nên để tạo ra tính cạnh tranh sinh tồn, buộc trong quá trình tiến
hóa kháng sinh được chọn lọc. Nhưng có một điểm bất lợi, giả thuyết mâu
thuẩn với quy luật chuỗi thức ăn, có một số trường hợp các vi sinh vật
kháng sinh kiềm hãm hay tiêu diệt nhiều động vật nguyên sinh.
- Chất kháng sinh kiềm hãm sự nảy mầm của bào tử cho đến khi gặp điều
kiện môi trường thuật lợi. Vì hầu như các sinh vật sinh kháng sinh đều có
bào tử và kháng sinh được tổng hợp ra ngay trong gia đoạn tạo bào tử của vi
sinh vật. Bên cạnh đó cũng đã phát hiện một số kháng sinh ức chế nảy mầm
bào tử của chính nó sinh ra. Hai quá trình tạo bào tử và sinh kháng sinh độc
lập với nhau nhưng có thể được kiểm sát một cách chặt chẽ bởi sinh vật chủ.
Tuy vậy, chưa logic ở chỗ một số vi sinh vật mất khả năng sinh kháng sinh
mà vẫn tạo được kháng thể và ngược lại.
Phần 2: TÌM HIỂU VỀ RIFAMYCIN
 Lịch sử phát triển:
Rifamycin là sản phẩm bật hai, ngày nay được biết đến với tính y dược chữa trị
bệnh phong, lao và các bệnh nhiễm trùng do các vi khuẩn này gây ra. Và nó được

tổng hợp đầu tiên năm 1957 từ quá trình lên men Streptomyces mediterranei trong
Nhóm 9 Page 2
Bài tập vi sinh 2 GVHD: Phạm Thị Hương
phòng thí nghiệm Gruppo Lepetit SpA ở Milan bởi Piero Sensi, Maria Teresa Timbal
và nhà khoa học người Israel Pinhas Margalith. [2] Sau đó , 7 refamycin đã được tìm
ra và được đặt tên là B, C, D, E, S và SV.
Vào năm 1969, nó đã được đổi tên thành Nocardia mediterranei khi Thiemann
nhận thấy thành tế bào của nó điển hình cho loại vi khuẩn Nocardia. Sau đó, 1986, vi
khuẩn lại được lấy tên Amycolapsis mediterranei do nhà khoa học Lechvalier nhận ra
thành tế bào của chúng thiếu axit mycolic. Năm 2004, dựa trên rRNA 16S, Bala et al
đổi tên lại thành Amycolatopsis rifamycinica. [2] Nhưng 1960 đã được nhiều người
công nhận về khả năng chửa bệnh lao của chủng rifamycin.
 Phân loại về Streptomyces mediterranei
Lĩnh giới: Bacteria
Giới: Eubacteria
Ngành: Actinobacteria
Bộ: Actinomycetales
Họ: Streptomycetaceae
Chi: streptomyces
Loài: Streptomyces mediterranei
S.mediterranei là vi khuẩn Gram dương, khuẩn lạc hình phóng xạ (actino-) nhưng
khuẩn thể có dạng sợi, phân nhánh như nấm (myces). [3]
 Cơ chế sinh tổng hợp rifamycin.
Trong bài này chúng ta chỉ tìm hiểu về sản phẩm rifamycin B, nên cơ chế này sẽ
giúp hiểu hơn cách thức một rifamycin được tổng hợp. Cụ thể được trình bày qua các
sơ đồ Hình 1, 2, 3. Cơ chế tổng hợp này thông qua hai con đường tổng hợp khác
nhau, rifamycin là một polyketide được lắp ráp từ một đơn vị vòng thơm, AHBA (3-
amino-5-hydroxybenzoic acid), thông qua việc kéo dài chuỗi bằng 2 đơn vị acetate
và 8 propionate. AHBA lại có nguồn gốc từ còn đường shikimate. [2, 5]
Nhóm 9 Page 3

Bài tập vi sinh 2 GVHD: Phạm Thị Hương
Hình 1 : Con đường sinh tổng hợp đơn vị khỏi đầu Rifamycin Polyketide, 3-
amino-5-hydroxybenzoic acid (AHBA). [5]
Nhóm 9 Page 4
Bài tập vi sinh 2 GVHD: Phạm Thị Hương
Hình 2: Con đường sinh tổng hợp rifamycin và xây dựng hay đề xuất vai trò của đơn gen
sinh tổng hợp rif [5]
Cả hai quá trình được các cụm rif chịu trách nhiệm sinh tổng hợp rifamycin. Nó
chứa các gen từ rifG qua đến rif, được biểu hiện để sinh tổng hợp AHBA. RifK, rifL,
rifM và rifN được hoạt động như các transaminase để hình thành nên các tiền thân
kanosamine AHBA. “RifH” mã hóa aminoDAHP sythase xúc tác sự ngưng tụ giữa 1-
deoxy-1-imino-d-erythrose-4-phosphate và phosphoenolpyruvate. Từ rifA qua rife
mã hóa cho một module I polyketide sythase, với các module tải là non-ribosomal
peptide synthase. Trong đó, rifE lắp rắp một undecaketide thẳng, được theo sau bởi
riff, mã hóa một synthase amide và làm cho undecaketide được phóng thích tạo thành
cấu trúc macrolactam. Hơn nữa, cụm rif chứa nhiều protein điều hòa và các gen lặng
glycosylating. Other types of genes seem to perform post-synthase modifications of
the original polyketide. [2](dịch không hiểu)
Nhóm 9 Page 5
Bài tập vi sinh 2 GVHD: Phạm Thị Hương
Hình 3: Cụm gen sinh tổng hợp rif và đoạn (sườn or chầu) gen mã hóa protein ribosome,
tiểu đơn vị β, β’ của RNA polymerase phụ vào DNA.[5]
 Cơ chế tác động của rifamycin đến vi sinh vật
Hình 4: Cơ chế tác động của kháng sinh[3]
Rifamycin B là chất kháng sinh nhẹ, tiền chất để tổng hợp các kháng sinh khác có
tác dụng lâm sàng. Trong hình 4, trình bày tất cả các cơ chế tác dụng của các loại
kháng sinh, nhưng chúng ta chỉ quan tâm tới cơ chế tác động đến quá trình phiên mã
của rifamycin.
Nhóm 9 Page 6
Bài tập vi sinh 2 GVHD: Phạm Thị Hương

Hoạt động kháng khuẩn của rifamycin là kết quả ức chế tổng hợp RNA từ DNA
[5] thông qua việc nó có ái lực cao với RNA polymerase. Ái lực này khác nhau giữa
prokaryotes và eukaryotic, sẽ tương tác mạnh hơn với RNA polymerase phiên mã
DNA của prokaryotes. Đây cũng là cơ chế chung cho tất cả các hoạt động kháng
khuẩn của rifamycin. Dựa trên dữ liệu cấu trúc tinh thể của kháng sinh liên kết với
RNA polymerase chỉ ra rằng rifamycin chặn quá trình sinh tổng hợp bằng cách đụng
độ không gian với sự phát triển các oligonucleotide. [2] Kháng sinh gây trở ngại
trong giai đoạn đầu tổng hợp kháng sinh.[5] Nếu các chuỗi oligoribonucleotide được
tổng hợp dài hơn, vượt giai đoạn đầu thì giảm tương tác của rifamycin.
Phần 3: QUY TRÌNH SẢN XUẤT RIFAMYCIN TRONG CÔNG NGHIỆP
 Sơ đồ công nghệ:
Hình 5: Quy trình sản xuất rifamycin[8]
Nhóm 9 Page 7
Bài tập vi sinh 2 GVHD: Phạm Thị Hương
Quá trình sản xuất rifamycin trong lên men được chia làm 2 giai đoạn chính:
- Lên men.
- Xử lý dịch lên men và tinh chế thu Rifamycin B.
 Chọn giống.
Đây là giai đoạn quyết định tới chất lượng của sản phẩm và năng suất sinh học
trong quy trình sản xuất nên việc chọn chủng vi sinh vật đặc biệt quan trọng. Trong
quy trình này, với yếu tố trên, người ta đã tiến hành gây đột biến Streptomyces
mediterranei và phân lập ra S.mediterranei XC 9-25 dùng để sản xuất rifamycin B.
Quá trình gây đột biến và phân lập như sau:

1
Sau 14 ngày, ở 28°C

Hình 6: Sơ đồ gây đột biến và phân lập Streptomyces mediterranei
Tiêu chí để chọn khuẩn lạc đạt yêu cầu sau khi nuôi cấy trên môi trường agar
Bennett là dự trên hình thái của chúng vì có sự tương quan giữa hình thái khuẩn lạc

và khả năng sinh rifamycin B, sẽ có 6 khuẩn lạc khác nhau, trong đó hiệu suất sản
xuất rifamycin cao nhất đạt được khi sử dụng khuẩn lạc có màu đỏ cam, hình hoa
hồng trống ở giữa và đường kính dài 2-3mm.
Nhóm 9 Page 8
Bào tử
Xử lý với
N-methyl-N’-nitroso-N-introguanidine
Cm 1mg/ml, pH 9.0, 28°C, 60ph
Bào tử đột biến
Rửa, nuôi trên
mt agar Bennett
Chọn khuẩn lạc sống, sx R
B nuôi trên mt lỏng
Bài tập vi sinh 2 GVHD: Phạm Thị Hương
Hình 7: Các dạng khuẩn lạc
 Môi trường nuôi cấy:
Sau khi người ta phân lập được giống mới thì phải tối ưu hóa môi trường sống của
vi sinh vật để hiệu suất tạo ra rifamycin là cao nhất.
 Hóa chất và nguyên liệu sử dụng:
• Glucoso (ADWIC, gypt)
• KNO3 (ADWIC, Egypt)
• (E.Merck, Darmstadt, Germany)
• (E.Merck, Darmstadt, Germany)
• (E.Merck, Darmstadt, Germany)
• Chất chiết nấm men
• Cao thịt
• Tinh chất malt
• Agar
• Tinh bột
• Peptone

• Bột đậu nành
• Bột yến mạch
• Bột cá
• Nước cất
 Môi trường lên men: 12% glucose, 2% bột đậu nành, 1% peptone, 0,5% bột cá,
0,8% , 0,05%, 0,0001% , 0,5% . [3]
 Quá trình nhân giống:[3]
Mục đích của giai đoạn này là tạo ra một số lượng đủ lớn vi khuẩn cung cấp cho
quá tình lên men.
 Cấy giống trên thạch nghiêng:
- Tỉ lệ thành phần cho 11 môi trường: 4g chất chiết nấm men, 4g tinh chất
mạch nha, 4g glucose, 20g bột yến mạch, 20g agar, nước cất cho đủ 1l.
- Thời gian ủ: 7-8 ngày
- Nhiệt độ: 28Š C
- Độ ẩm tương đối: 40%-50%
Nhóm 9 Page 9
Bài tập vi sinh 2 GVHD: Phạm Thị Hương
Hình 8: Cấy giống trên thạch nghiên
 Cấy khuẩn lạc mọc trên môi trường thạch sang môi trường lỏng:
- Cấy giống vào erlen dung tích 250ml chứa 25ml môi trường.
- Thành phần môi trường: 2% tinh bột, 1,5% glucose, 1% peptone, 0,05% , 0,03% ,
0,3% .
- Các erlen được đặt trên Rotary Shaker với tốc độ quay 220 rpm.
- Thời gian nuôi cấy: 48h
- Nhiệt độ: 28 ŠC
- Tỷ lệ giống cấy vào môi trường là 10% (v/v)
Để lên men 30 môi trường cần có 120 erlen. Khi nhận giống cho các mẻ lên
men tiếp theo ta có thể lấy 2ml canh trường của các erlen này cho vào erlen
mới có thành phần giống như erlen đã lên men, bỏ qua giai đoạn cấy giống
trên thạch nghiêng.

Hình 9: Rotary Shaker
 Thiết bị:
 Thiết bị tiệt trùng:
Nhóm 9 Page 10
Bài tập vi sinh 2 GVHD: Phạm Thị Hương
Mục đích để chuẩn bị môi trường vô khuẩn cho quá trình lên men.
Thiết bị tiệt trùng liên tục YHC-20 được chọn trong quy trình công nghệ, thiết
bị này có khả năng thu hồi nhiệt đến 77%, thiết bị trao đổi nhiệt ở dạng tấm và bộ
giữ nhiệt có kết cấu đặt biệt nên kéo dài quảng đường của dòng môi trường và tăng
cường khả năng khuấy trộn [6]
Hình 10: Thiết bị tiệt trùng liên tục YHC-20
 Thiết bị lên men:
• Mục đích: cung cấp môi trường và điều kiện cho Streptomyces mediterranei
tổng hợp rifamycin B.
• Điều kiện lên men:[8]
- Lên men hiếu khí. Lượng oxy cung cấp chiếm 25% thể tích môi trường lên men.
- pH môi trường trước khi lên men 6.4 – 6.6. pH được ổn định nhờ bổ sung amino
nitrogen( NH
2
-N) liên tục trong suốt quá trình lên men với hàm lượng 8.96 mg/l =>
oxy và ammonia phait tuyệt đối vô trùng.
- Trong quá trình lên men phải bổ sung thêm glucose tối thiểu còn lại trong dịch lên
men là 1- 1.5%
- Nhiệt độ lên men : 28°C
- Thời gian lên men : 9 ngày
- Tốc độ khuấy trộn: 130 rpm
Thiết bị lên men ở đây chúng ta chọn là thiết bị lên men có bộ đảo trộn cơ học
dạng sỏi bọt: dạng thiết bị lên men này được sử dụng rộng rãi cho các quá trình tiệt
trùng để nuôi cấy vi sinh vật- sản sinh ra các chất hoạt hóa sinh học.
Nhóm 9 Page 11

Bài tập vi sinh 2 GVHD: Phạm Thị Hương
Hình 11: Thiết bị lên men với bộ đảo trộn cơ học dạng sỏi bọt khí[4]
 Thiết bị trích ly:[8]
Mục đích: Rifamycin B ra khỏi dịch lên men.
Phương pháp:
Rifamycin B thường được trích ly ra khỏi dịch lên men bằng dung môi
ethylacetate, dịch lên men được điều chỉnh đến pH 2.0 bằng HCL, nhiệt độ 10°C.
Nhằm hạn chế lượng Rifamycin B bị phân hủy, quá trình trích ly được thực
hiện trong thời gian trích ly cần giám sát chặt chẽ các thông số công nghê như:
nhiệt độ pH, độ vô khuẩn… để hạn chế tổn thất do phân hủy Rifamycin B. Dịch
lên men sau khi lọc được bơm trộn đồng thời với dung dịch HCL loãng có bổ
sung them chất chống tạo nhũ và bơm song song cùng với dung môi trích ly vào
trong thiết bị.
Tỉ lệ dịch lọc: dung môi thường chọn trong khoảng 4- 10V dịch lọc/1V dung
môi.
Trong một sso công nghệ, nhằm cải thiện chất lượng sản phẩm, người ta có thể
áp dụng phương pháp trích ly 2 lần dung môi, với lần đầu trích ly Rifamycin B
bằng ethyl acetate; tiếp theo Rifamycin B lại được trích ly ngược sang dung dịch
đệm phosphate, pH 7.38. Sau đó Rifamycin B lại được trích ly sang dung môi lần
thứ 2, với lượng dung môi ít hơn.
Nhóm 9 Page 12
Bài tập vi sinh 2 GVHD: Phạm Thị Hương
Hình 12: Sơ đồ trích ly rifamycin
 Thiết bị chưng cất:
- Mục đích: cô đặc dung dịch sau trích ly, thu hồi dung môi.
- Nguyên tắc: dung môi ethyl acetate bay hơi ở nhiệt độ 77,2ºC, còn Rifamycin B
không bay hơi.
- Phương pháp:
• Chưng cất có hồi lưu sản phẩm đỉnh, cấp nhiệt gián tiếp bằng hơi nước.
• Sử dụng tháp chưng cất nhiều mân.

• Nhập liệu ở giữa tháp.
• Thu sản phẩm đáy có nồng độ Rifamycin B 70%
• Nhiệt độ chưng cất 78°C
Hình 13: Sơ đồ chưng cất
Nhóm 9 Page 13
Bài tập vi sinh 2 GVHD: Phạm Thị Hương
 Tẩy màu:
Mục đích: để tẩy màu và loại bỏ một số tạp chất khác.
Phương pháp: Người ta thường bổ sung trực tiếp chất hấp phụ vào dung môi
chứa Rifamycin B sau trích ly, sử dụng phổ biến nhất là than hoạt tính. Sau đó
than hoạt tính được tách và rửa lại bằng sử dụng thiệt bị lọc hút băng tải hoặc
thiết bị lọc hút kiểu thùng quay. Phần than sau lọc được đưa đi chưng thu hồi
dung môi và xử lý hoàn nguyên, phục vụ cho các mẻ sau.
 Kết tinh:
Mục đích: thu nhận Rifamycin B dưới dạng tinh thể.
Phương pháp:
Việc kết tinh Rifamycin B dưới dạng tinh thể có thể được thực hiện rất đơn
giản bằng cách bổ sung trực tiếp vào dung môi sau khi tẩy màu một lượng nhỏ
kali acetat ( hay natri acetat) tiến hành cô chân không ở nhiệt độ thấp, sau đó
bỏ sung mầm để Rifamycin B tự kết tinh. Có 2 phương pháp bổ sung mầm:
• Mần them vào là bột sản phẩm- phương pháp bỏ bột: dung dung môi là cồn để
khuấy bột để chúng phân bố đều và nhanh trong dung dịch với hàm lượng:
100-150g cho 1 tấn sản phẩm.
• Mầm được chuẩn bị từ trước- phương pháp giống: thực hiện quá trình kết tinh
tạo 1 sản phẩm rồi dung nó làm nhân cho mẻ sau, phương pháp này tương đối
dể thao tác. Lượng giống cần phải them vào là 2% so với khối lượng dung
dịch.
Hình 14: Thiết bị kết tinh
 Lọc, sấy thu Rifamycin B tự nhiên
Mục đích: đuổi hết dung môi trích ly, giảm hàm lượng, hoàn thiện sản

phẩm.
Nhóm 9 Page 14
Bài tập vi sinh 2 GVHD: Phạm Thị Hương
Phương pháp: Khi sản phẩm đã đạt độ tinh sạch theo yêu cầu, thường độ
tinh khiết không dưới 99,5%, chúng được lọc tách tinh thể, tiếp theo rửa và
làm khô sơ bộ bằng dung môi kỵ nước như izopropanol hay butylalcohl; hút
chân không tách dung môi rồi sấy bằng không khí nóng dạng sản phẩm tinh
thể Rifamycin B.
Thiết bị dấy chân không kiểu thùng quay (thích hợp cho dược phẩm)
- Thùng sấy hình trụ ngang có hai vỏ, vỏ ngoài được gia nhiệt bằng
hơi quá nhiệt. thùng sấy được quấy đảo liên tục, nguyên liệu sấy bên
trong luôn được tiếp xúc với bề mặt gia nhiệt.
- Gia nhiệt kiểu gián tiếp nên tránh được ô nhiễm.
- Thiết bị sấy chân không kiểu này hiệu suất tăng nhiều lân so với loại
thông thường.
- Nhiệt độ sấy: 80 Š C
- Độ ẩm sau khi sấy: 3-5%
Hình 12: Máy sấy chân không đảo trộn SZG-0.1
Phần 4: BIỂU HIỆN CỦA GEN HEMOGLO VI KHUẨN TỪ Vitreoscilla strcoraria
ĐỂ LÀM TĂNG SẢN XUẤT Rifamycin B TRONG Amycolatopsis mediterranei [10]
 Đặt vấn đề:
Amycolatopsos meditarranei là một loại vi khuẩn đất sản xuất các chất chuyển
hóa trung gian, bào gồm cả rifamycins_thuốc kháng sinh chủ yếu dùng trong điều
trị bệnh lao, phong và nhiễm trùng mycobacteria khác.
Nhu cầu về thuốc kháng sinh này đang tăng lên hàng năm vì các dẫn xuất
rifamycin cho thấy khả năng tuyệt vời trong việc chống lại các vi sinh vật cơ hội
trong các bệnh liên quan tới AIDS. Tuy nhiên, trong công nghiệp, theo quan sát
thì thấy có một số vấn đề liên quan tới việc gia tăng sản xuất để đáp ứng đủ nhu
cầu. Ví dụ: nhu cầu oxy rất cao trong nuôi cấy, sinh tổng hợp các sản phẩm lên
men chính, rifamycin B,…Khi nuôi cấy đạt đến một giai đoạn của pha tĩnh, xạ

Nhóm 9 Page 15
Bài tập vi sinh 2 GVHD: Phạm Thị Hương
khuẩn này sẽ tạo ra dung dịch có độ nhớt cao, khiến cho độ oxy hòa tan thấp. Ở
giai đoạn này, trao đổi chất thứ cấp bắt đầu buộc quá trình nuôi cấy cần nhiều oxy
hơn.Từ năm 1961, để chống lại hiện tượng này, axit 5,5-diethybarbituric
(barbital) được thêm vào quá trình lên men công nghiệp để tổng hợp ưu tiên đối
với rifamycin B. Năm 2003, phát hiện ra rằng hợp chất này cũng ức chế chuỗi hô
hấp, để lại nhiều oxy trong sinh tổng hợp. Mặt khác, được biết Vitreoscilla
stercoraria có thể phát triển trong môi trường nghèo oxy do thuộc loại vi khuẩn
Hemoglobin. Gen mã hóa cho protein này, (vhb), được nêu rõ trong các vi sinh
vật dạng sợi công nghiệp quan trọng khác. Các nghiên cứu đã chỉ ra rằng biểu
hiện gen hvb có thể cải thiện đáng kể năng suất cephalosporin và erythromycin.
Mục đích trong nghiên cứu này là nhân bản gen vhb từ V.stercoraria trong một
vertor biểu hiện cho A.mediterranei và đánh giá ảnh hưởng khả năng hấp thụ oxy
và sản xuất rifamycin B.
 Vật liệu và phương pháp:
Vi sinh vật A.mediterranei Msb2 đã được sử dụng trong nghiên cứu này.
Msb2 là một dòng đột biến của M18, được cô lập có độ nhạy cao với barbital.
Khuynh hướng này tạo ra sản phẩm rifamycin B gấp 3 lần so với chủng bố mẹ
(M18). Tuy vậy, khi nuôi trong thiết bị lên men hoặc lượng không khí thấp, dòng
này cần barbital để sản xuất chỉ rifamycin B. V.stercoraria (ATCC 15.218) đã
được sử dụng để lấy gen vhb và Saccharopolyspora erythraea (ATCC 11635) để
thu ermP promoter. Escherichia Coli DH5α được sử dụng như một chủng cho
plasmid.
Các chủng A.mediterranei được đông khô và lưu trữ, đông ở nhiệt độ -20 ŠC
hoặc bảo quản trên môi trường agar Bennet. E.coli được bảo quản ở -80 ŠC.
Phương pháp và điều kiện nuôi cấy
Chủng E.coli và thể biến nạp chưa plasmid được phát triển ở 37 ŠC trong môi
trường Luria-Bertani.
A.mediterranei được nuôi trong một hạt bao dinh dưỡng hợp thành từ (g/l):

glucose, 20; bột đậu nành, 20; CaCO
3
, 2,5; MgSO
4
.7H
2
O, 0,4; FeSO
4
.7H
2
O, 0,01;
ZnSO
4
.7H
2
O, 0,05; CoCl
2
.6H
2
O, 0.003. Dịch nuôi cấy để phát triển trong máy lắc
lồng ấp (150rpm) ở 28 ŠC, 48h. Môi trường sản xuất nơi kín gió gồm (g/l):
glucose, 120; bacto-peptone, 10; cao nấm men, 5; sodium 5,5-diethylbarbiturate,
0,7. PH là 7,2 và Erythromycin (10µg/ml) có mặt trong quá trình biến nạp.
………………………
Môi trường Bennet agar bao gồm các chất sau (g/l): glucose, 10; cao thịt, 1;
NZ-amine A, 2; cao nấm men, 1; và agar, 20.
Phương pháp phân tích: tế bào được sinh trưởng trong môi trường sản xuất,
được theo dõi bằng cách xác định khối lượng khô. Lượng rifamycin B nuôi cấy
được sử dụng để xác định thủ tục diễn tả trước đây. (Rifamycin B contents of the
culture were determined using the previously described procedure).

Tách DNA tổng số: Ở quy mô nhỏ để chuẩn bị tách DNA plasmid từ E.coli
thì được thực hiện với bộ Kit plasmid Qiagen (Qiagen, Chatsworth, CA, Mỹ)
Nhóm 9 Page 16
Bài tập vi sinh 2 GVHD: Phạm Thị Hương
hoặc tiến hành theo quy trình chuẩn. Tách quy mô lớn plasmid DNA từ E.coli sẽ
được thực hiện bằng cách sử dụng standard alkaline lysis protocol.
DNA plasmid từ A.mediterranei được thu bằng cách sau. Chủng S699 được
cấy trong 100ml môi trường yeast extract-malt extract (YEME) và được ủ 25 ŠC,
lắc 72h với 250rpm. Nuôi cấy được ly tâm ở 3381×g trong 15 phút ở 4 ŠC. sản
phẩm ly tâm (the pellet) sẽ được rửa một lần, ngâm trong 10ml dịch lysozyme
(10.3% sucrose, 25mM Tris-HCl, pH 8.0, 25mM EDTA, pH8, và 10mg/ml
lysozyme) và ử tại 30 ŠC trong 2h. Lúc đó, thêm 3.5ml dịch SDS (2% SDS và
0.3M NaOH), ử tại 80 ŠC trong 10 phút. Sau đó, mẫu được xử lý theo giao thức
của Morettietal.
DNA tổng số từ Vitreoscilla stercoraria được thu theo cách thức của Holmes
và Quigley mà khong bước đun sôi.
Tách RNA Tách RNA tổng số được thực hiện với bộ Kit RNeasy Mini bằng
cách nghiền lượng sợi nấm (30mg/ml) với nitơ lỏng với cái cối và chày đông khô.
Cẩn thận không để sợi nấm tan cho đến khi nó được cho vào dung dịch đệm ly
của bộ Kit.
Tại thời điểm này giao thức của nhà sản xuất được theo sau. RNA được tách
rửa hai lần trong một thể tích 50 ml (tổng cộng) của RNase free H2O . RNA được
xử lý ô nhiễm DNA bằng cách chiết với axit phenol : chloroform ( 5 : 1 phenol :
CHCl3 , pH 4,7 ) . DNA được giữ lại trong giai đoạn hữu cơ và RNA vẫn còn
trong giai đoạn nước. RNA sau đó đã được phục hồi bởi mưa . Mẫu được
aliquoted và bảo quản ở -80 ° C.
Phản ứng chuỗi polymerase (PCR ) Gen VHB thu được bằng cách khuếch đại
PCR từ V. stercoraria DNA sử dụng oligonucleotide 5'- ATGTTAGACCAGCAA
ACCATT -3 ' như một mồi xuôi và 5'- TAGGATCCATGCCAAGGCACACCTG
AAGA -3' như một mồi ngược lại , trong đó BamHI ( dòng dưới) nằm bên cạnh 5

' của gen. Mặt khác, các PermE promoter được thu thập bằng phương pháp PCR
từ polyspora erythraea DNA Saccharo sử dụng oligonucleotide sau: 5'-
GCGAAGCTTATGCGAGTGTCCGTTCGAGTG -3 ' như một mồi xuôi và 5'-
CGCTGGATCCTACCAACCGGC -3' như một mồi ngược lại.
Đảo ngược sao chép -PCR ( RT-PCR) Theo hướng dẫn của nhà sản xuất , một
bước RT-PCR ( Qiagen ) được thực hiện trong khối lượng phản ứng 50 - ml chứa
1 ml của mẫu RNA , 0,6 ml của mồi về phía trước và ngược lại ( 16 và 17.5 mM )
, 10 ml 5 × Qiagen một bước đệm ( 100 mM Tris -HCl , 500 mM KCl , 12,5 mM
MgCl2 , và độ pH 8.7) , 2 ml của dNTP hỗn hợp ( 10 mM ) , và 2 ml của Qiagen
một bước kết hợp enzyme (reverse transcriptase và HotStart Taq DNA polymer-
ase). Thermocycling được thực hiện như sau: 50 ° C trong 30 phút , 95 ° C trong
15 phút , sau đó 50 chu kỳ ở 94 ° C trong 1 phút , 55 ° C trong 1 phút , và 72 ° C
trong 1,5 phút , tiếp theo là 72 °C trong 10 phút . Sản phẩm khuếch đại được
quan sát thấy sau khi điện trong ethidium bromide dính gel agarose . β - tiểu đơn
vị của RNA polymerase được sử dụng như các gen kiểm soát.
Nhóm 9 Page 17
Bài tập vi sinh 2 GVHD: Phạm Thị Hương
Chuyển đổi và sàng lọc dòng A. mediterranei MSB đã được thực hiện có chức
năng , và chuyển đổi với pUAMSAG1 bởi quá trình bắn gen ( chân 20 inch Hg ,
6 cm khoảng cách mục tiêu , 900 psi , hạt BioRad M5 vonfram ) . Các tế bào
được xử lý được gieo trên đĩa Bennet thạch . Sau khi ủ trong 6 giờ ở 30 ° C , các
tấm được phủ thạch mềm có chứa erythromycin ( 10 mg / ml ) . Biến nạp MSB -
VHB đã được lựa chọn cho khả năng của họ để phát triển trong môi trường này.
Đo sự hấp thu oxy tỷ lệ hấp thu oxy bằng mô hình 5300 Sau đó, các tế bào
được thu hoạch và rửa hai lần bằng cách ly tâm ở 3381 × g trong 10 phút ở 4 ° C.
Về việc tạm dừng kết quả 0,5 ml đã được thêm vào 2,5 ml dung dịch đệm không
khí bão hòa ( 0,1 M glucose và 20 mM đệm phosphate kali , pH 7,2) . Nồng độ
sinh khối đã được tính toán đồng thời tính theo trọng lượng khô . Sự thay đổi
trong nồng độ oxy , của bộ đệm chứa các tế bào , được theo dõi trong 10 phút.
 Kết quả và thảo luận

Nhóm 9 Page 18
Bài tập vi sinh 2 GVHD: Phạm Thị Hương

Hình 4.1: Xây dựng pUAMSAG1. Véc - tơ được xây dựng khi sử dụng các
gen PermE, gen vhb, thuốc kháng sinh ( Kmr ), và êritrômixin ( ermE ) gen đề
kháng, nguồn gốc của pA tái tạo và ColE1 cho trực khuẩn E.coli.
Tổng hợp sinh học Rifamycin B bằng A. mediterranei đòi hỏi khí oxy hòa tan
cao, đặc biệt đưa vào quy trình công nghiệp, nơi thể tích sử dụng có thể độ cao
hơn 120,000 l. Nhiều nỗ lực đã được thực hiện để phát triển một quá trình
chuyển giao oxy tốt hơn , nhưng không có chiến lược đã sử dụng gen hemog-
lobin từ V. stercor aria (hoặc từ một sinh vật khác nhau) trong A. mediterranei .
Vì vậy, với mục tiêu này , các gen VHB được nhân bản vô tính , và pUAMSAG1
vector đã được xây dựng và vector biểu hiện hemoglobin (VHB) được phát triển
một vector plasmid nhân bản với gen đánh dấu hiệu chính kịp thời.
Nhóm 9 Page 19
Bài tập vi sinh 2 GVHD: Phạm Thị Hương
Độ nhạy của A. mediterranei MSB kanamycin và erythromycin đã được thử
nghiệm trong môi trường Bennet . Mặc dù dòng này là nhạy cảm với kanamycin
( 50 mg / ml , đánh dấu kháng ( KMR ) có thể không được sử dụng vì đột biến
kháng thuốc xuất hiện một cách tự nhiên và với tần số cao . Từ MSB cũng nhạy
cảm với erythromycin ( 10 mg / ml ) , nó được chọn là gen đánh dấu .
Trình tự mã hóa gen VHB và promoter PermE đã được tạo ra bằng cách
khuếch đại PCR , sử dụng mồi với BamHI và các HindIII tương ứng . Kết thúc
cùng gen VHB và promoter PermE được ligated và nhân bản trong pULVK2
vector , trong đó có PA - đại diện cho nguồn gốc A. mediterranei và ColE1 E.
coli . Gen erythromycin chịu ( ermE ) từ pIJ4026 được nhân bản vô tính vào
EcoRI độc đáo vào các XbaI để cung cấp cho các pUAMSAG1 plasmid . Kích
thước của sản phẩm khảm này được xác định là khoảng 8,162 kb , tương ứng với
các kích thước dự kiến . Đề án xây dựng pUAMSAG1 plasmid được hiển thị
trong hình 4.1 . Tuy nhiên , A. mediterranei Msb2 không có thể được biến đổi

bởi các thủ tục thông thường. Thậm chí electropora hóa của sợi nấm hoặc
protoplasts đã không mang lại bất kỳ transformant . Chuyển đổi không hiệu quả
này có thể là do đặc thù của dòng Msb2 , như việc chuyển đổi là có thể khi S699
đã được sử dụng . Do đó , nó đã được quyết định chuyển đổi Msb2 bởi một quá
trình bắn gen . Với thủ tục này , Msb2 dòng thành công có thể được chuyển đổi
sang pUAMSAG1 .
Mặc dù pUAMSAG1 không phải là một vector có số lượng bản sao cao , ổn
định tốt đã được quan sát thấy ở cuối mỗi quá trình nuôi cấy trong trường hợp
không có áp lực chọn lọc với erythromycin . Sự ổn định này đã được quan sát
trong suốt quá trình thực thi, bao gồm cả nuôi cấy giống.
Ảnh hưởng của khí thấp Với mục đích để so sánh hiệu suất của các chủng có
gen VHB nhân bản vô tính trong A. mediterranei để sản xuất rifamycin B được
đánh giá. Tuy nhiên, do dòng của cha mẹ (như dòng công nghiệp nhất) yêu cầu
barbital để sản xuất rifamycin B duy nhất, sản xuất của nó được đánh giá có và
không có barbital. Các biến nạp A. mediterranei, MSB chứa pUAMSAG1
(MSB-sag), và dòng với pUAMAE3 (không có biểu hiện băng VHB) đã được
nuôi cấy tại bình lắc dưới khí thấp (như được mô tả trong các tài liệu và phần
phương pháp). Những điều kiện này đã được thử nghiệm và chứng minh để cung
cấp khí thấp ( 3 , 10 ) . Kết quả được so sánh với MSB dòng của cha mẹ ( Hình
2).
Nhóm 9 Page 20
Bài tập vi sinh 2 GVHD: Phạm Thị Hương
Hình 4.2: Kết quả so sánh thời gian sản xuất rifamycin B ( đường thẳng
xuyên suốt ) và tăng trưởng ( đường chấm chấm ) bằng dòng thay đổi ( Msb -
nhăn nheo ). Khung khuôn ( 250 ml ) chứa 70 ml của sản xuất với trung bình
0.7 g ; có barbital (tam giác đóng) và không có barbital ( tam giác mở ) tại 26
C, 200 rpm với kiểm soát của dòng cha mẹ ( Msb ) với barbital ( đóng hình
tròn ) và không có barbital ( hình tròn mở )
Kết quả cho thấy trong điều kiện khí thấp ( 70 ml môi trường sản xuất và 200
rpm) , sản xuất rifamycin B giảm khoảng 50 % liên quan đến sự nuôi cấy trong

điều kiện khí cao ( 25 ml dung dịch trung bình sản xuất , 250 rpm) khi dòng đã
được trồng mà không barbital . Tuy nhiên, khi barbital đã được thêm vào sự nuôi
cấy trong điều kiện khí thấp , sản xuất rifamycin B đã gần như cao như trong các
sự nuôi cấy trong điều kiện khí cao (Hình 2) . Sản xuất rifamycin B của dòng
transformant , MSB - sag , với barbital hầu như là giống nhau so với dòng của
cha mẹ. Tuy nhiên , sản xuất của MSB-sag không giảm mà không cần barbital .
Những kết quả này cho thấy dòng này có thể mất oxy hiệu quả hơn trong điều
kiện khí thấp , giúp đỡ để xác nhận giả thuyết cho rằng barbital độ tăng O2 sẵn
sàng cho rifamycin B sinh tổng hợp bởi giảm đi yêu cầu oxy trong chuỗi hô hấp.
Để xác nhận rằng sản xuất cao hơn của rifamycin B bởi dòng biến đổi là do
khả năng tiêu thụ oxy nhiều hơn, chúng tôi đồng thời so sánh tốc độ của sự hấp
thu oxy giữa các chủng . Các sự nuôi cấy trong môi trường sản xuất đã được thu
hoạch tại 96 h ( trong idiophase ) và sự hấp thu oxy được đo từ các tế bào rửa
sạch của từng dòng . Kết quả cho thấy tỷ lệ hấp thụ oxy của dòng biến đổi
( MSB - võng ) là nhanh hơn so với dòng của cha mẹ ( Hình 3) khoảng 1,5 lần .
Nhóm 9 Page 21
Bài tập vi sinh 2 GVHD: Phạm Thị Hương
Hình 4.3: Đo lường tỉ lệ của hấp thu ô – xi giữa tế bào prepara - tions thu
được từ cha mẹ ( Msb ) và thay đổi dòng ( Msb - nhăn nheo ) chứa gen vhb
nhân bản.
Phát hiện của mRNA của phiên mã ngược ( RT-PCR) để xác nhận rằng sự
hấp thu oxy cao hơn bởi dòng MSB - sag là do sự biểu hiện của gen VHB nhân
bản vô tính , RT-PCR được sử dụng. RNA được chiết xuất từ tế bào idiophase
của giống bố mẹ và chuyển đổi, và RT-PCR các thí nghiệm được thực hiện bằng
cách sử dụng một lớp sơn lót cho một bp 503. Không có bảng trong dòng của cha
mẹ (MSB) được phát hiện (Hình 4, hẻm 1), trong khi dòng biến đổi (MSB-nhóm
SAG) sản xuất rõ ràng đoạn dự kiến, mà tương ứng với VHB RNA (Hình 4, hẻm
2)
Hình 4.4: phân tích RT - PCR. Sự khuếch đại của 503 - kb đoạn từ Axit
ribonuclenic vhb trong idiophase của Msb - dòng nhăn nheo ( hẻm 2 ) và dòng

Msb ( hẻm 1 ). Dãy nuclêôtít của tác nhân ban đầu là ' following' :
RTvhbF, 5 - GCCACTGTTCCTGTATTGAA'GGAGC - 3 ;
RTvhbR, 5 - TTTTGGCCAACAGCCAAACTGCTGC - 3.

Nhóm 9 Page 22
Bài tập vi sinh 2 GVHD: Phạm Thị Hương
Những kết quả này cho thấy VHB biểu hiện cải thiện sự hấp thu oxy và đã ảnh
hưởng đến sản xuất rifamycin B trong điều kiện khí thấp, hoặc từ một góc độ
khác, họ chỉ ra rằng việc chuyển đổi với các gen VHB không cần barbital để tiếp
tục sản xuất theo điều kiện khí thấp.
Tài liệu tham khảo
Thuốc kháng sinh và phân loại các nhóm 
Rifamycin!"#$"#%&! 
'()*!+,+Công nghệ lên men sản xuất kháng sinh - Rifamycin
"""(-(!*!+,+&! 
./0$&1!2&'34!$5/6789!:;!<=!$>;SẢN XUẤT NGUYÊN LIỆU KHÁNG SINH TRONG
NƯỚC&#!0'8< <.?
<!@5A-((.!B!CD E%&!(?FG!%((!!H(&!((EChemical
Reviews,F!'-/&6- D0,,
,I5/./<8JK6L!<;!$D CÁC QUÁ TRÌNH VÀ THIẾT BỊ CÔNG NGHỆ SINH HỌC TRONG CÔNG
NGHIỆP,0<MNOP.HQ08<F<R'6M8S.<OT.
'(U-&#!$Chuyên đề Kháng sinh: Phân loại, cơ chế tác động và nguyên tắc sử dụng
!-&!#!$(!!-!$!$&!(!$
   
+'(U!$-Đề tài Công nghệ lên men Rifamycin--!$!$
-!!&!++  
JK6L!034!$0$&1!6L!'9VW!JK<;D Công nghệ vi sinh, Tập 4_Cơ sở công nghệ sinh
học,0NH592X 
 5I(-A!(YA!9!@F!$-ZF(-[!?-%\/@?/!@Y
H(5!@9-@F!?]\D +EZ*((!H-<$-!5!6( 

(^!((%&!HIG!!F&-((!EJOURNAL OF BIOSCIENCE
AND BIOENGINEERING,6- ,D0_
Nhóm 9 Page 23