Tiểu luận: Sản xuất và thu nhận kháng thể đơn dòng doc

Sản xuất và thu nhận kháng thể đơn dòng

Page1


Trường ĐH Nông Lâm tp Hồ Chí Minh
Bộ môn Công Nghệ Sinh Học
o0o




CHỦ ĐỀ SEMINAR:

SẢN XUẤT VÀ THU NHẬN
KHÁNG THỂ ĐƠN DÒNG



Giáo viên hướng dẫn: Sinh viên thực hiện:
PGS.TS. NGUYỄN NGỌC HẢI NGUYỄN VŨ BẢO
MSSV:06126009



Thành phố Hồ Chí Minh
Tháng 10/2009
Sản xuất và thu nhận kháng thể đơn dòng

Page2


B/ ĐẶT VẤN ĐỀ:

Ngày nay, cùng với sự phát triển của xã hội nói chung và của nền y học nói
riêng đã đem lại nhiều phương pháp mới trong việc phòng ngừa, phát hiện và chữa
trị bệnh cả trên người lẫn trên thú. Có rất nhiều phương pháp mới được nghiên
cứu, thử nghiệm và đã đem lại nhiều ứng dụng to lớn. Một trong những phương
pháp mới xuất hiện trong thời gian gần đây là sử
dụng kháng thể đơn dòng trong
việc chuẩn đoán và điều trị bệnh.
Kháng thể đơn dòng (monoclonal antibodies-mAb) được sử dụng rộng rãi
trong nghiên cứu y sinh học cơ bản, trong chẩn đoán bệnh, và trong điều trị các
bệnh như bệnh nhiễm trùng và ung thư.
Kháng thể đơn dòng là công cụ quan trọng được nhiều nhà nghiên cứu sử
dụng nhiều trong các nghiên cứu của họ và đã mang lại nhiều ti
ến bộ về mặt y tế.
Với vai trò quan trọng như trên và tiềm năng vô cùng to lớn trong việc
chuẩn đoán, điều trị bệnh. Kháng thể đơn dòng cần phải được nghiên cứu nhiều
hơn, sâu hơn để có thể khai thác hết những lợi ích mà nó đem lại. Tuy nhiên, việc
hiểu về kháng thể đơn dòng vẫn còn nhiều hạn chế vì đây là một trong những lĩnh
vực còn khá m
ới mẻ đặc biệt là đối với nước ta. Trong bài viết này, tôi hy vọng sẽ
mang lại cho các bạn một vài thông tin cơ bản về kháng thể đơn dòng, mà cụ thể là
về sản xuất và thu nhận kháng thể đơn dòng. Thông qua bài viết này, tôi hy vọng
sẽ đem lại cho các bạn cái nhìn cơ bản nhất, tổng quát nhất về kháng thể đơn dòng.
Hy vọng rằng bài viết này sẽ là cơ sở, là tiền đề để
từ đó thuận lợi hơn trong những
bước đi tiếp trong việc tìm hiểu, nghiên cứu về kháng thể đơn dòng của các bạn
sau này.

Sản xuất và thu nhận kháng thể đơn dòng

Page3


C/TỔNG QUAN:

C.I/Khái quát về kháng thể đơn dòng:

C.I.1/Kháng thể (antibody) :

Kháng thể là những phân tử
protein được sản xuất bởi những những
tế bào lympho B khi có sự kích ứng
đáp ứng miễn dịch bởi kháng nguyên
trên cơ thể vật chủ .

Có hai loại kháng thể :
- Kháng thể đa dòng: Tập hợp các kháng thể đặc
hiệu với các epitope khác nhau trên một kháng nguyên
cho trước . Trong đáp ứng miễn dịch, cơ thể tổng hợp
nhiều kháng thể tương ứng v
ới các epitope của cùng một
kháng nguyên :đáp ứng như vậy gọi là đa dòng.

- Kháng thể đơn dòng : chỉ nhận biết một epitope trên

một kháng nguyên cho sẵn . Tất cả các kháng thể đơn dòng
cùng một dòng thì giống hệt nhau và được sản xuất bởi cùng
một dòng tương bào.

Các kháng thể có tính kết hợp đặc hiệu với các kháng
nguyên đã kích ứng tạo ra chúng . Đây chính là cơ sở của các phản ứng bảo vệ của
cơ thể chống lại tác nhân gây bệnh và của các kỹ thuật chuẩn đoán miễn dịch . Sự
tạo thành kháng thể phụ thuộc vào bản chất của kháng nguyên (protein,
polysaccharide, … ), phương pháp gây miễn dịch (chất bổ trợ, đường xâm nhập, số
l
ần xâm nhập,… ) và phụ thuộc vào cơ thể vật chủ (tình trạng sức khỏe, tình trạng
miễn dịch, dinh dưỡng, tuổi,… )
Các tế bào lympho B là các tế bào sản xuất kháng thể . Mỗi dòng tế bào
lympho B chỉ có thể sản xuất một loại kháng thể tương ứng với yếu tố kháng
Sản xuất và thu nhận kháng thể đơn dòng

Page4

nguyên mà chúng nhận diện được . Do mỗi kháng nguyên có nhiều yếu tố kháng
nguyên khác nhau nên đáp ứng miễn dịch sẽ tạo thành nhiều loại kháng thể khác
nhau, trong trường hợp này ta có kháng thể đa dòng (polyclonal antibody)
C.I.2/Kháng thể đơn dòng (monoclonal antibody):

Kháng thể đơn dòng (monoclonal antibody – mAb ) là kháng thể được tạo
thành từ những tế bào lympho B có nguồn gốc từ một dòng tế bào lympho B.
Kháng thể đơn dòng được sử dụng rộng rãi trong nghiên cứu y sinh học cơ
bản, trong chẩn đoán bệnh, và trong điều trị các bệnh như bệnh nhiễm trùng và ung
thư.
Sản xuất mAb yêu cầu phải tiến hành gây kích ứng miễn dịch cho thú,
thường là một con chuột, sau đó thu nhậ

n các tế bào sản xuất kháng thể từ lách của
nó và dung hợp các tế bào này với tế bào ung thư (như từ các tế bào u tủy myeloma
) để làm cho chúng trở nên bất tử giống như đặc điểm của các tế bào u tủy, điều
này có nghĩa là chúng sẽ phát triển và phân chia vô hạn định. Một khối các tế bào
hợp nhất được gọi là khối tế bào lai (hybridoma), và các tế bào này sản xuất ra
mAb. Sự phát triể
n của hybridoma bất tử đòi hỏi việc sử dụng động vật. Việc thay
thế không dùng động vật không được phổ biến. Một nhà nghiên cứu, người muốn
nghiên cứu một protein đặc biệt hoặc những phân tử khác, đã chọn một dòng tế bào
hybridoma để sản xuất mAb mà phản ứng một cách mạnh mẽ với protein hoặc
phân tử đó. Các tế bào phải phát triển và nhân lên
để tạo thành một dòng tế bào mà
sẽ sản xuất ra mAb mong muốn . Có hai phương pháp để phát triển các tế bào này:
tiêm chúng vào khoang màng bụng của một con chuột hoặc dùng trong kỹ thuật
nuôi cấy tế bào in vitro. Khi tiêm vào một con chuột, các tế bào hybridoma sẽ nhân
lên và sản xuất ra dịch lỏng (bệnh cổ trướng) ở bụng của nó. Dịch lỏng này có
chứa một nồng độ cao kháng thể. Sản xuất kháng thể bằng phương pháp dịch tràn
ổ
bụng ở chuột thì rẻ tiền, dễ thực hiện, và quen thuộc . Tuy nhiên, nếu tích tụ quá
nhiều dịch lỏng hoặc nếu hybridoma là một bệnh ung thư độc, chuột sẽ trải qua đau
đớn hoặc nguy hiểm. Nếu một quy trình sản xuất gây đau đớn hoặc nguy hiểm với
động vật, thì nên điều chỉnh để tìm kiếm các lựa chọn thay thế. Một trong những
gi
ải pháp thay thế là gia tăng số lượng những tế bào hybridoma trong môi trường
nuôi cấy tế bào. Kĩ thuật này yêu cầu một số kiến thức chuyên môn, những phương
tiện, thiết bị đặc biệt, có thể tốn kém về mặt tiền bạc và mất nhiều thời gian . Hiện
Sản xuất và thu nhận kháng thể đơn dòng

Page5


đã có một số nghiên cứu đáng kể trong kĩ thuật nuôi cấy tế bào in vitro cho sự phát
triển hybridoma, và những phương pháp mới hơn này ít tốn kém hơn, nhanh hơn,
và sản xuất kháng thể ở một nồng độ cao hơn so với những phương pháp trước
đây.
C.II/ Quá trình sản xuất kháng thể đơn dòng:

Quy trình sản xuất kháng thể được tóm tắt ở sơ đồ bên dưới :

C.II.1/ Sự hình thành tế bào lai hybridoma:
( Dòng tế bào bất tử sản xuất kháng
thể đơn dòng )
Sự sản xuất kháng thể đơn dòng bao gồm: phương pháp in vivo, in vitro
hoặc kết hợp cả hai phương pháp .
Trước khi sản xuất kháng thể bằng phương pháp in vivo hoặc in vitro, những
tế bào lai mà sẽ làm nhiệm vụ sản xuất kháng thể được tạo ra
Các bước sản xuất những tế bào lai này được mô tả ở sơ đồ bên dưới . S
ản
xuất kháng thể đơn dòng-những tế bào sản xuất được sử dụng đối với động vật,
thường sử dụng chuột. Phương pháp này cung cấp một dòng tế bào có khả năng
sản xuất một loại kháng thể trong một giai đoạn dài. Một khối u từ dòng tế bào”bất
tử” thì được gọi là một hybridoma
Không có phương pháp sản xuất tế bào lai hybridima nào mà không sử dụ
ng
động vật. Gần đây, kỹ thuật in vitro cho phép sản xuất những phần kháng thể gắn
Sản xuất và thu nhận kháng thể đơn dòng

Page6

kháng nguyên bên trong tế bào, nhưng kỹ thuật này vẫn đang được thử nghiệm và
kết quả, và chức năng chưa chắc chắn (Frenken và cộng sự 1998). Nó cũng có thể

thay đổi nhiều về mặt di truyền của kháng thể đơn dòng chuột sản xuất với trình tự
gen người, giảm tính sinh miễn dịch của kháng thể đơn dòng đã định trước cho
việc điều trị bệnh trên ng
ười. Trước khi đến phương pháp hybridoma, các nhà
nghiên cứu chỉ có thể sản xuất huyết thanh kháng thể đa dòng. Một số lương lớn
những nhu cầu về động vật được chủng ngừa và không làm bất tử tế bào sản xuất
kháng thể, vì vậy nó yêu cầu phải lặp đi lặp lại trên động vật dùng để thu được
nhiều kháng thể hơn. Phát triển kỹ thuật tế bào lai hybridoma làm giả
m một số
lượng lớn động vật (chuột, thỏ, …) cần thiết để sản suất kháng thể.
Bước 1:
gây miễn dịch trên chuột và lựa chọn những con chuột hiến để sản
xuất tế bào lai hybridoma
Chuột được gây miễn dịch với một kháng nguyên đã được chuẩn bị cho việc
tiêm hoặc nhũ hóa kháng nguyên với tá chất Freund hoặc những tá chất khác hoặc
bằng một miếng mỏng dạng gel đồng nhất có chứa kháng nguyên. Những tế bào
nguyên vẹn, bao gồm cả màng và những vi sinh vật thì thường
được dùng như là
những kháng nguyên. Ở hầu hết tất cả các phòng thí nghiệm, chuột được sử dụng
để sản xuất kháng thể mong muốn. Thường thì, chuột được gây miễn dịch 2-3 tuần
một lần nhưng phương pháp gây miễn dịch biến đổi giữa các nhà nghiên cứu. Khi
hàm lượng kháng thể tạo ra đủ lớn. Chuột đã có đáp ứng miễn dịch mạnh sẽ được
gây mê và thu lấ
y lách để chọn lọc dòng tế bào lympho chuyên biệt dùng cho việc
lai với tế bào ung thư myeloma.
Bước 2:
sự lựa chọn chuột để sản xuất kháng thể
Sau một vài tuần gây miễn dịch, mẫu máu thu được từ chuột để đo lượng
kháng thể huyết thanh. Một vài kỹ thuật nhân đạo được phát triển để thu tập một
thể tích nhỏ máu từ chuột (Loeb and Quimby 1999). Độ chuẩn của kháng thể huyết

thanh được xác định bởi nhiều kỹ thuật khác nhau, như enzyme-linked
immunosorbent assay (ELISA) và phép chẩn đ
oán số lượng DNA trong tế bào(
flow cytometry). Nếu độ chuẩn của kháng thể cao, sự hợp nhất có thể được thực
hiện. Nếu độ chuẩn của kháng thể thấp, chuột có thể tăng lên cho tới khi phản ứng
đủ là được, vì vậy việc xác định mẫu máu được lặp đi lặp lại nhiều lần. Khi độ
chuẩn của kháng thể đủ cao, chuột thường tăng bằ
ng cách tiêm kháng nguyên
không có tá dược trong màng bụng hoặc trong tĩnh mạch (theo tĩnh mạch đuôi) 3
ngày trước khi hợp nhất nhưng 2 tuần sau lần gây miễn dịch đầu tiên. Sau đó,
chuột bị giết và lách của chúng được lấy ra để sản xuất tế bào lai hybridoma bằng
phương pháp in vitro.
Bước 3:
Chuẩn bị tế bào ung thư tủy xương Myeloma
Sự dung hợp những tế bào lách sản xuất kháng thể, mà có thời gian tồn tại
giới hạn, với những tế bào ung thư tủy bất tử (myeloma), kết quả là trong tế bào lai
hybridoma có khả năng phát trển không giới han
Sản xuất và thu nhận kháng thể đơn dòng

Page7

Tế bào ung thư tủy xương myeloma là những tế bào bất tử mà được nuôi cấy với 8-
azaguanine để đảm bảo tính nhạy cảm của chúng với hypoxanthine-aminopterin-
thymidine (HAT) môi trường chọn lọc được dùng sau khi dung hợp tế bào
Một tuần trước khi dung hợp tế bào, những tế bào ung thư tủy xương myeloma
được cho phát triển trong 8-azaguanine. Các tế bào phải có khả năng sống cao và
phát triển nhanh chóng. Môi trường HAT chỉ cho phép những tế dung hợp tồn t
ại
trong một thời gian dài trong môi trường nuôi cấy.
Bước 4:

Sự hợp nhất giữa tế bào ung thư tủy xương myeloma với tế bào lách
của chuột đã được gây miễn dịch:
những tế bào lách đơn từ chuột đã gây miễn dịch được hợp nhất với các tế
bào ung thư tủy xương myeloma đã được chuẩn bị trước đây.
Sự dung hợp được hoàn thành bởi polyethylene glycol, là chất có khả năng
làm tan màng tế bào, tạo
điều kiện cho tế bào lympho sản xuất kháng thể với tế bào
myolema có thể kết hợp lại với nhau và tạo thành tế bào lai hybridoma bất tử. Một
chú ý trong bước thứ 3 này là chỉ có những tế bào dung hợp mới phát triển được
trong môi trường chọn lọc đặc biệt. Những tế bào này sau đó được phân phối tới
đĩa có 96 giếng chứa đựng những tế bào tiếp liệu thu được từ vi
ệc rửa màng bụng
chuột trong nước muối . Tế bào tiếp liệu được tin rằng để cung cấp các yếu tố phát
triển để đẩy mạnh sự phát triển của tế bào lai hybridoma (Quinlan and Kennedy
1994). Việc chuẩn bị thương mại là kết quả từ việc thu gom môi trường giúp cho
phát triển trong nuôi cấy tế bào và chứa đựng các yếu tố phát triển có sẵn để có thể
sử dụng thay cho các tế bào tiếp li
ệu thu được từ chuột. Nó cũng có thể được sử
dụng cho đại thực bào xuất phát từ tủy xương chuột như những tế bào tiếp liệu
(Hoffman and others 1996).
Bước 5:
Tạo dòng dòng tế bào lai hybridoma bằng “pha loãng có giới hạn”
hoặc phát triển và ổn định dòng bằng sản xuất dịch tràn ổ bụng.
Điểm mới ở bước này, một nhóm nhỏ các tế bào lai hybridoma từ đĩa 96
giếng có thể phát triển trong nuôi cấy mô theo sau bởi sự lựa chọn cho việc gắn kết
kháng nguyên hoặc phát triển bằng phương pháp dịch tràn ổ bụng ở chuột với việc
tạ
o dòng ở thời gian trễ hơn. Tạo dòng bằng “ pha loãng có giới hạn” ở thời điểm
đảm bảo phần lớn mỗi giếng chứa tối đa một dòng đơn. Phần lớn các đánh giá là
cần thiết ở giai đoạn này lựa chọn tế bào lai hybridoma có khả năng phát triển

chống lại tất cả các tế bào dung hợp không thành công nhờ vào sự thưa thớt hoặc
không phù hợ
p trong nuôi cấy in vitro ở nồng độ pha loãng cao. Trong một vài
trường hợp, kháng thể tiết ra độc tố để những tế bào yếu ớt được duy trì trong môi
trường in vitro. Việc tối ưu hóa phương pháp dịch tràn ổ bụng ở chuột ở giai đoạn
này có thể cứu vãn tế bào. Ngoài ra , nó cũng trải qua nhiều giai đoạn ngắn của quá
trình phát triển bằng phương pháp dịch tràn ổ bụng chuột sản xu
ất dòng tế bào trễ
hơn in vitro và những giai đoạn của phương pháp in vivo chứng tỏ sức mạnh được
gia tăng (enhanced hardiness) và tối ưu sự sản xuất kháng thể (Ishaque and Al-
Sản xuất và thu nhận kháng thể đơn dòng

Page8

Rubeai 1998). Theo nguyên tắc đã đề ra đã công bố đến các cộng sự nghiên cứu
trong việc sử dụng phương pháp dịch tràn ổ bụng ở chuột trong những cách đó
(Jackson anh Fox 1995).
Việc lựa chọn môi trường phát triển có chứa chất ức chế aminopterin, là trở
ngại trong con đường tổng hợp nhân tạo. Vì vậy, những tế bào phải sử dụng con
đường vòng để tổng hợp acid nucleic, một con đường mà có khuyết
điểm trong
dòng tế bào ung thư tủy xương để những tế bào sản xuất kháng thể đơn dòng bình
thường là dung hợp.
Bởi vì cả tế bào ung thư tủy xương myeloma và tế bào sản xuất kháng thể
đều sẽ không phát triển một mình, chỉ có tế bào lai là có thể phát triển.



Sơ đồ quy trình tạo tế bào lai hybridoma
Sản xuất và thu nhận kháng thể đơn dòng


Page9

C.II.2/ Sản xuất kháng thể đơn dòng bằng phương pháp in vitro:
Một thuận lợi chính trong việc sử dụng kháng thể đơn dòng hơn là huyết
thanh miễn dịch đa dòng là những tiềm năng sẵn có gồm: hầu hết số lượng lớn các
kháng thể đơn dòng đặc hiệu đối với một epitope riêng biệt (một phần của phân tử
antigen mà có nhiệm vụ tương tác đặc hiệu giữa kháng nguyên và kháng thể).
Thông thường, kháng thể đơn dòng được tìm thấy trong môi trườ
ng phát triển của
nuôi cấy tế bào lai hybridoma bằng phương pháp in vitro hoặc trong dịch tràn ổ
bụng từ chuột được tiêm tế bào lai hybridoma. Kháng thể đơn dòng có thể được
làm tinh khiết từ cả hai nguồn trên nhưng thường sử dụng trong môi trường hoặc
trong dịch tràn ổ bụng. Trong phương pháp in vitro nên sử dụng cho mục đích sản
xuất kháng thể đơn dòng khi việc này là có lý do và thiết thực. Nhiều dụng cụ sẵn
có trên th
ị trường làm phát triển cho sự nuôi cấy in vitro. Những dụng cụ này cần
thiết phải thay đổi để tạo điều kiện thuận lợi cho sự hoạt động của chúng, một số
lượng những người trực tiếp sử dụng máy cần thiết phải được đào tạo, sự phức tạp
trong quy trình hoạt động, nồng độ cuối cùng của kháng thể đạt
được, chi phí, sự
điều tiết thể tích dịch. Chi phí của trang thiết bị nên được xem xét trong giá thành
của phương pháp sản xuất in vitro.
Mỗi dòng tế bào lai hybridoma phản ứng khác nhau đối với môi trường sản
xuất in vitro. Trong phần này mô tả phương pháp sản xuất in vitro có sẵn và thảo
luận về lợi ích và sự hạn chế của mỗi phương pháp .
Sơ đồ tóm tắt các bước trong sản xuất kháng thể đơn dòng b
ằng phương
pháp in vitro:
Sản xuất và thu nhận kháng thể đơn dòng


Page10


C.II.2.1/Phương pháp nuôi cấy khối mô:

Phương pháp đơn giản nhất để tiếp cận sản xuất kháng thể đơn dòng bằng
phương pháp in vitro là gia tăng nuôi cấy tế bào lai hybridoma thành những khối
và làm sạch kháng thể đơn dòng từ môi trường nuôi cấy. Huyết thanh của bò cái
đang mang thai đươc sử dụng trong hầu hết môi trường nuôi cấy mô và có chứa
khoảng 50 µg/ml globulin miễn dịch của bò. Việc sử dụng huyết thanh trong môi
trường nuôi cấy tế bào lai hybridoma có thể giả
i thích cho một lượng lớn globulin
miễn dịch hiện diện trong dịch nuôi cấy (Darby and cộng tác viên 1993). Để tránh
sự gây bẩn với globulin miễn dịch của bò, một vài công ty đã phát triển công thức
môi trường không có huyết thanh để làm nguồn phát triển của dòng tế bào lai
hybridoma (Federspiel và cộng tác viên 1991, Tarleton và Beyer 1991, Velez và
cộng tác viên 1986). Trong hầu hết các trường hợp, tế bào lai hybridoma phát triển
trong 10% huyết thanh thai bê (FCS) có thể thích nghi trong khooảng thời gian bốn
giai đoạn ( 8-12 ngày) để phát triển trong ít hơn 1% FCS hoặ
c trong môi trường
không có FCS. Tuy nhiên, sự thích nghi này có thể kéo dài hơn và trong 3-5%
trường hợp tế bào lai hybrydoma sẽ không bao giờ thích nghi với môi trường FCS
thấp. Sau khi thích nghi, việc nuôi cấy tế bào cho phép nuôi theo thông thường, sử
dụng bình thót cổ nuôi cấy mô dưới điều kiện phát triển chuẩn khoảng 10 ngày.
Sản xuất và thu nhận kháng thể đơn dòng

Page11

Kháng thể đơn dòng sau đó sẽ được thu hoạch từ môi trường. Phương pháp được

đề cập trên đây là sản xuất kháng thể đơn dòng ở nồng độ đặc thù là dưới 20
µg/ml. Những phương pháp mà làm tăng nồng độ bằng cách loại bỏ oxy trong môi
trường có thể gia tăng khả năng phát triển của tế bào và mật độ phát triển tế bào và
vì vậy gia tăng nồng độ kháng thể đơn dòng (Boraston và cộ
ng tác viên 1984,
Miller và cộng tác viên 1987). Một số phương pháp đó sử dụng spinner flasks và
roller bottles để giữ môi trường nuôi cấy trong lưu thông không đổi và vì vậy cho
phép chất dinh dưỡng và chất khí phân phối đều hơn trong môi trường nuôi cấy thể
tích lớn (Reuveny và cộng sự 1986, Tarleton và Beyer 1991). Túi mà không khí có
thể đi qua được, phát triển khá gần đây, gia tăng độ loại bỏ không khí bằng cách
cho phép không khí đi xuyên qua vách của vật chứa môi trường. Tất cả những
phương pháp này có thể
gia tăng căn bản khả năng sản xuất, nhưng nồng độ kháng
thể vẫn giữ nguyên trong tầm vài micrograms mỗi mililit ( Heidel 1997, Peterson
và Peavey 1998, Vachula và cộng sự 1995). Hầu hết ứng dụng của những nghiên
cứu yêu cầu nồng độ kháng thể đơn dòng từ 0,1-10 mg/ml, cao hơn nhiều so với
nồng độ kháng thể đơn dòng trong môi trường nuôi cấy khối mô (Coligan và cộng
sự). Nếu kháng thể không tinh sạch đủ cho ứng dụ
ng của nghiên cứu, phương pháp
lọc theo ngưỡng trọng lượng phân tử thấp dựa vào sự ly tâm hoặc sự ép của không
khí có thể được dùng để gia tăng nồng độ kháng thể đơn dòng. Như một sự lựa
chọn, nuôi cấy mô nổi bề mặt có thể được tinh khiết bằng cách cho đi qua cột ái
lực protein A và protein G, kháng thể đơn dòng sau đó có thể tách rửa từ cột ở một
nồ
ng độ thích hợp cho hầu hết các ứng dụng (Akerstrom và cộng sự 1985, Peterson
và Peavey 1998). Tuy nhiên, globulin của bò hay những globulin miễn dịch khác
hiện diện trong môi trường nuôi cấy sẽ làm bẩn kháng thể đơn dòng được chuẩn bị.
Cả hai bước cô đặc có thể thực hiện trong một ngày hoặc ít hơn với thời gian thực
hiện tối thiểu. Tóm lại, phương pháp nuôi cấy khối mô là một công nghệ tương đối
đơn giản

để thực hiện, có giá thành đầu tư thực hiện tương đối thấp, có thời gian từ
lúc bắt đầu đến khi kết thúc khoảng 3 tuần, điều này gần giống với phương pháp
dịch tràn ổ bụng, và làm cho nó có thể sản xuất số lượng kháng thể đơn dòng có
thể so sánh được với việc sản xuất bằng phương pháp dịch tràn ổ bụng ở chuột.
Điều b
ất lợi trong những phương pháp này là một thể tích lớn môi trường nuôi cấy
mô phải xử lý, nồng độ kháng thể đơn dòng thu được sẽ thấp ( khoảng vài
microgam trong mỗi mililit) và một vài kháng thể đơn dòng bị biến đổi trong suốt
quá trình cô đặc và tinh sạch (Lullau và cộng sự 1996). Trên thực tế, sự chọn lọc
một kháng thể đơn dòng cho thấy độ hoạt động bị giảm sút 42% bằng một hoặc
m
ột nồng độ chuẩn
Sản xuất và thu nhận kháng thể đơn dòng

Page12

khác hoặc một quy trình tinh khiết khác (Underwood và Bean 1985)

Trên đây là những hình ảnh về: spinner flasks


Trên đây là những hình ảnh về : roller
bottles


Trên đây là những hình ảnh về flasks

C.II.2.2/ Những hệ thống màng nền bán thấm:

Như đã đề cập ở trên, sự phát triển của tế bào lai hybridoma với mật độ cao

hơn trong quá trình nuôi cấy, kết quả là tạo ra một lượng lớn kháng thể đơn dòng
có thể thu được từ môi trường nuôi cấy. việc sử dụng những rào cản, hoặc là
hollow fiber (tạm dịch là màng sợi rỗng) hoặc là một màng với một ngưỡng trọng
lượng phân tử thấp (10.000-30.000 kD), được thự
c hiện trong một vài thiết bị cho
Sản xuất và thu nhận kháng thể đơn dòng

Page13

phép tế bào phát triển ở một mật độ cao (Evans và Miller 1988, Falkenberg và
cộng sự 1995, Jackson và cộng sự 1996). Những thiết bị này được gọi là hệ thống
màng nền bán thấm. Mục đích của những hệ thống này là cô lập các tế bào và
kháng thể đơn dòng trong một ngăn nhỏ phân cách bởi một rào cản từ một ngăn
lớn hơn có chứa môi trường nuôi cấy. Sự nuôi cấy có thể bổ sung nhiề
u yếu tố để
làm tối ưu hóa sự phát triển của tế bào lai hybridoma (Jaspert và cộng sự 1995 ).
Chất dinh dưỡng và phế phẩm của tế bào khuếch tán dễ dàng từ bên này sang bên
kia rào cản và đạt trạng thái cân bằng với một thể tích lớn, nhưng tế bào và kháng
thể đơn dòng được giữ lại trong một thể tích nhỏ hơn (1-15 ml trong hệ thống
màng đặc thù hoặc cuộn sợi rỗng nhỏ (small hollow-fiber cartridge). Việ
c sử dụng
cạn kiệt môi trường trong bể chứa lớn lớn có thể được thay thế mà không làm hư
hại đến những tế bào hoặc kháng thể đơn dòng, cũng như vậy, các tế bào và kháng
thể đơn dòng có thể được thu hoạch độc lập trong môi trường phát triển. Sự phân
tách tế bào thành các ngăn nhỏ phân cách nhau bằng màng khiến cho nó có thể đạt
được nồng độ kháng thể đơn dòng có thể so sánh với nông
độ kháng thể đơn dòng
trong phương pháp dịch tràn ổ bụng ở chuột. Hai hệ thống màng nền bán thấm sẵn
có là: mini- PERM (Unisyn Technologies, Hopkinton, MA) và CELLine (Integra
Bioscience, Ijamsville, MD). Celline có hình dạng và được sử dụng tương tự như

đối với một T Flask chuẩn nhưng phân tách thành hai ngăn bởi một màng bán thấm
và một màng mà chất khí có thể thấm qua được với mặt sát bên dưới của nó đến
ngăn tế bào. Mini-PERM có dạng tương tự nhưng nó có hình trụ và trở
thành một
đơn vị vận động mà chức năng là làm lăn fermentor liên tục để cho phép sự phân
phối của chất khí và chất dinh dưỡng. Gía bắt đầu cho việc khởi công những đơn vị
này khoảng 300$-800$ và đòi hỏi phải có tủ ấm CO
2
. Thuận lợi của hệ thống màng
nền bán thấm là thu được nồng độ cao của kháng thể có thể được sản xuất trong thể
tích tương đối thấp và huyết thanh thai bê có thể hiện diện trong môi trường cung
cấp trao đổi chéo không quan trọng bằng globulin miễn dịch ở bò trong ngăn tế
bào. Một điểm bất lợi là kháng thể đơn dòng có thể bị nhiểm bẩn bởi những sản
phẩm tế bào chết. Điều cản trở trong kĩ thuật là nhỏ hơn phương pháp nuôi cấy
khối mô nhưng sẽ không có vấn đề gì trong phòng thí nghiệm mà đã làm nuôi cấy
mô. Toàn bộ kháng thể đơn dòng được sản xuất ra từ hệ thống màng nằm trong
tầm từ 10-160 mg theo như các tài liệu của Unisyn.
Trong bioreactor có màng sợi rỗng, môi trường tiếp tục được bơm qua một
vòng bao gồm một cuộn sợ
i rỗng (a hollow-fiber cartridge), hệ thống ống mà các
chất khí có thể thấm qua được để thêm oxy vào trong môi trường, và nguồn cung
cấp môi trường. Cuộn sợi rỗng (The hollow-fiber cartridge) bao gồm nhiều thớ sợi
chạy xuyên suốt buồng mà có chứa những tế bào lai hybridoma phát triển ở một
mật độ cao. Những sợi này có tính bán thấm và có vai trò tương tự như hệ thống
màng nền. bioreactor với những sợi rỗng (the hollow-fiber bioreactor) được tạo ra
để mang lạ
i kết quả tống số lên tới 500 mg kháng thể đơn dòng hoặc nhiều hơn
Sản xuất và thu nhận kháng thể đơn dòng

Page14


nữa. Việc khởi công kiểu hệ thống này thường tiêu tốn hơn 1200 $. Vì những lý
do đó, bioreactor với hệ thống sợi rỗng (hollow-fiber bioreactor ), chỉ được dùng
nếu người ta cần một số lượng lớn kháng thể đơn dòng. Reactor với hệ sợi rỗng
(The hollow-fiber reactor) được sử dụng thành công trong nhiều phòng thí nghiệm
độc lập ( Jackson và cộng sự 1996, Knazek và cộng sự 1972, Peterson và Peavey
1998). Nếu các nhà nghiên cứu không thể đầu tư thời gian ho
ặc những chi phí lớn,
một vài cơ quan nòng cót về thiết bị chức năng, chính phủ, các phòng thí nghiệm
có hợp đồng thương mại sản xuất kháng thể đơn dòng từ tế bào lai hybridoma. Ví
dụ như: các phòng thí nghiệm có hợp đồng thương mại điển hình tiêu tốn 11$/mg
để sản xuất 1.000 mg với những reactor với hệ sợi rỗng(hollow-fiber reactors)
(Chandler, 1998).
Gần đây, một vài hội thảo, diễn đàn, và m
ột số công bố đã thảo luận về việc
sử dụng của một số phương pháp thay thế để thay thế chuột để sản xuất kháng thể
đơn dòng (Center for Alternatives to Animal
Testing và OPRR/NIH 1997,
Marx và cộng sự 1997, de Geus và Hendriksen, eds 1998). Những kết luận của họ
cho rằng những phương pháp thay thế có thể cung cấp một cách đầy đủ bằng việc
tạo ra hầu hết các kháng thể đơn dòng cần thiế
t bởi những tổ chức nghiên cứu.
Những phương pháp in vitro trong sản xuất kháng thể đơn dòng thích hợp trong
nhiều tình huống, và nó đáp ứng cho các nhà nghiên cứu để đưa ra biện hộ có tính
khoa học cho việc sử dụng phương pháp dịch tràn ổ bụng ở chuột. Nó là cơ sỏ của
IACUC để đánh giá biện hộ của các nhà nghiên cứu và để tán thành hoặc phản đối
việc sử dụng phươ
ng pháp dịch tràn ổ bụng ở chuột.

Trên đây là những hình ảnh về hollow fiber

C.II.3/ Sản xuất kháng thể đơn dòng bằng phương pháp in vivo:
(phương
pháp dịch tràn ổ bụng)
Sản xuất và thu nhận kháng thể đơn dòng

Page15

C.II.3.1/Lý do sử dụng phương pháp in vivo:
Mặc dù kĩ thuật in vitro có thể được sử dụng nhiều hơn 90% trong sản xuất
kháng thể đơn dòng, nhưng phải thừa nhận rằng trong một số trường hợp phương
pháp in vitro sẽ không có hiệu quả. Bởi vì đặc điểm của tế bào lai hybridoma thay
đổi và nhu cầu sản xuất kháng thể đơn dòng thì đa dạng, kỹ thuật in vitro không
thích hợp trong hầu hết các trường hợp, và việc s
ử dụng chúng có thể là trở ngại
trong nghiên cứu, đặc biệt là nếu một số lượng lớn kháng thể đơn dòng được tách
được hiệu quả hoặc đặc biệt trong điều trị bệnh. Trong một số trường hợp, sản xuất
kháng thể đơn dòng bằng phương pháp in vitro không đáp ứng những mục đích
khoa học của công trình nghiên cứu. Cụ thể như sau:
* Một số
dòng tế bào lai hybridoma không thích ứng tốt trong điều kiện in
vitro
* Kháng thể đơn dòng từ dịch tràn ổ bụng chuột có thể cần thiết cho những
thí nghiệm mà kháng thể đơn dòng được sử dụng trên chuột
* Dòng tế bào lai hybridoma chuột cống không tạo ra bệnh cổ trướng một
cách có hiệu quả ở chuột cống, thường kém thích ứng trong điều kiện in vitro,
nhưng thường tạo ra bệnh cổ tr
ướng trong chuột nhắt không có khả năng miễn
dịch.
* Giai đoạn làm tinh khiết có thể gây ra sự biến tính protein và làm suy giảm
sự hoạt động của kháng thể.

* Những điều kiện không có huyết thanh hoặc có huyết thanh ở nồng độ
thấp không thể cung cấp đủ lượng kháng thể đơn dòng cho một số mục đích , như
đánh giá những vacxin mới trong việc chống lại những sinh v
ật lây nhiễm.
* Phương pháp nuôi cấy đôi khi mang lại những tập hợp mAb IgG mà được
glycozyl ở những vị trí khác nhau từ những thu hoạch từ dịch tràn ổ bụng ở chuột,
do đó ảnh hưởng đến khả năng kháng nguyên – ràng buộc và các chức năng sinh
học quan trọng.
* Khi những tế bào lai hybridoma sản xuất mAb có chứa các tác nhân lây
nhiễm, như nấm men hay nấm, những tế bào thường phải thông qua con chuột.
C.II.3.2/ S
ản xuất kháng thể đơn dòng bằng phương pháp in vivo:
Để sản xuất kháng thể đơn dòng bằng phương pháp dịch tràn ồ bụng, chuột
sẽ được tiêm dòng tế bào lympho chuyên biệt vào trong cơ thể chúng .
Tuy nhiên, để gia tăng đáp ứng sản xuất kháng thể, chuột được kích hoạt
bằng hai mũi tiêm đầu tiên có chứa pristane vào xoang bụng, cách nhau một tuần .
Pristane có tác dụng gây nên phản ứng viêm hạt và tác động đến quá trình tích dịch
ổ bụng . Liều thích hợp của pristane là khoảng từ 0,1-0,5 ml. Hai tu
ần sau khi
chuột được tiêm pristane, tiếp tục tiêm vào xoang bụng chuột khoảng 10
6
tế bào lai
hybridoma . Việc tiêm tế bào lai hybridoma vào xoang bụng chuột sẽ gây nên các
cục bướu và kích thích tiết dịch tràn ổ bụng làm cho bụng chuột phình to lên . Sau
khi bị tiêm tế bào lai hybridoma, chuột chỉ có thể sống được nhiều nhất là 20 ngày
Sản xuất và thu nhận kháng thể đơn dòng

Page16

. Dịch tràn ổ bụng sẽ thu được bằng phương pháp chọc dò vào khoảng 2 tuần sau

khi chuột được tiêm tế bào lai hybridoma . Lượng dịch tràn ổ bụng thu được trên
mỗi chuột vào khoảng 10 ml . Hàm lương kháng thể thu được trong phương pháp
dịch tràn ổ bụng rất cao, khoảng từ 2-10 mg kháng thể / ml dich tràn
Sơ đồ tóm tắt sản xuất kháng thể đơn dòng bằng phương pháp dịch tràn ổ
bụng ở chuột:

Một số hình ảnh về phương pháp chọc dò:

C.III/Sự thuận lợi và khó khăn của phương pháp in vitro và in vivo:

Sản xuất và thu nhận kháng thể đơn dòng

Page17

Những thuận lợi và khó khăn của phương pháp in vitro và phương pháp dịch
tràn ổ bụng ở chuột trong việc sản xuất mAb được nêu bật trong phần này. Cần lưu
ý rằng có khả năng là phương pháp in vitro sẽ đáp ứng hơn 90% tổng nhu cầu cho
mAb. Một số thuận lợi và bất lợi có liên quan tới vấn đề về sự bảo vệ động vật.
những người khác đề c
ập đến nền kinh tế sản xuất mAb. Như đã lưu ý dưới đây
thuộc phần có tiêu đề “ phương pháp in vivo và in vitro cho việc sản xuất thương
mại mAb”, trong phương pháp in vitro có thể chi phí từ ½ đến 6 lần phương pháp
dịch tràn ổ bụng ở chuột. Một số yếu tố là nguyên nhân của việc sản xuất in vitro
trở nên tốn kém là phí lao động và thiết bị mà thường do các tế bào lai hybridoma
sản xuất quá ít mAb trong ph
ương pháp in vitro. Nếu các nhà nghiên cứu phải sử
dụng một vài loại môi trường hoặc những dụng cụ khác nhau, như thỉnh thoảng
diễn ra, chi phí lao động tăng và nghiên cứu bị trì hoãn (Moro và cộng sự 1994;
Stoll và cộng sự 1996; Butler và Huzel 1995)
C.III.1/Những thuận lợi và khó khăn của phương pháp in vitro:

C.III.1.1/Những thuận lợi của phương pháp in vitro:

- Phương pháp in vitro giảm việc sử dụng chuột ở giai đoạn sản xuất kháng
thể (như có thể sử dụng chuột như một nguồn của những tế bào tiếp liệu khi việc
sản xuất kháng thể đang được tiến hành)
- Những phương pháp in vitro thường là những phương pháp được lựa chọn
cho cho sự sản xuất ở quy mô lớn của nghành công nghiệp dượ
c phẩm bởi vì dễ
dàng trong nuôi cấy tạo ra sản phẩm so với việc sử dụng động vật và bởi vì những
cân nhắc về kinh tế.
- Phương pháp in vitro tránh được nhu cầu để trải qua quy trình động vật để
sản xuất kháng thể đơn dòng
- Phương pháp in vitro tránh được hoặc làm giảm sự cần thiết về kinh
nghiệm của nhân viên phòng thí nghiệm trong việc thao tác với động vật.
- Phương pháp in vitro sử
dụng hệ thống màng nền bán thấm sản xuất mAb
có nồng độ thường cao như trong phương pháp dich tràn ổ bụng và tránh được sự
tạp nhiễm từ cơ thể chuột
C.III.1.2/ Khó khăn của phương pháp in vitro:

- Một số tế bào lai hybridoma không phát triển tốt trong môi trường nuôi cấy
hoặc bị mất trong môi trường nuôi cấy.
- Phương pháp in vitro thường yêu cầu việc sử dụng FCS (huyết thanh thai
bê). Việc sử dụng phương pháp in vitro để sản xuất kháng thể đơn dòng thường
yêu cầu sử dụng FCS, là một mối quan tâm từ quan điểm chăm sóc động vật.
- Giảm ái lực miễn dịch, thay đổi chức năng sinh h
ọc của kháng thể.
- Nói chung, nuôi cấy nổi bề mặt chứa đựng ít hơn mAb ( 0,002-0.01) mỗi
mililit của môi trường so với phương pháp dịch tràn ổ bụng ở chuột. Lưu ý rằng hệ

thống màng nền bán thấm đã được phát triển để có thể sản xuất ra nồng độ kháng
thể đơn dòng có thể so sánh với nồng độ quan sát trong dịch tràn ổ bụng chuột.
Sản xuất và thu nhận kháng thể đơn dòng

Page18

- Trong phương pháp nuôi cấy khối mô, nồng độ mAb có xu hướng thấp ở
bề mặt. Những bước cô đặc cần thiế này có thể làm thay đổi ái lực kháng thể, làm
biến tính kháng thể , tăng thời gian và chi phí. Nồng độ thích hợp của mAb có thể
thu được trong hệ thống màng nền bán thấm.
- Hầu hết các lô mAb sản xuất bởi phương pháp in vitro có sử dụng màng
nền bị ô nhiễm với những tế bào lai hybridoma chế
t và sản phẩm của tế bào lai
hybridoma chết. Vì vậy, yêu cầu phải làm sạch sớm.
- mAb sản xuất bằng phương pháp in vitro có thể sản xuất ra kháng thể có
ràng buộc ái lực kém hơn so vói kháng thể thu được bằng phương pháp dịch tràn ổ
bụng.
- Phương pháp nuôi cấy in vitro thường tốn kém hơn phương pháp dịch tràn
ổ bụng ở quy mô sản xuất mAb nhỏ hoặc trung bình ( Hendriksen và de Leeuw
1998; Jackson và cộng sự 1996; Peterson Peavey 1998; Marx 1998; Lipman 1997)
- Số lượng củ
a mAb được sản xuất bằng phương pháp in vitro bị giới hạn
bởi số lượng của thiết bị mà nó được thực hiện có sẵn.
- The Food and Drug Administration (FDA) ước tính rằng để chứng minh sự
tương đương của một mAb sản xuất bằng phương pháp in vitro đối với một mAb
trước đây sản xuất bằng phương pháp dịch tràn ổ bụng ở chuột sẽ tốn kém khoảng
bảo trợ là 2-10 triệu đô la (Stein 1998; Maxim 1998).
- Yêu cầu cao về trang thiết bị và trình độ chuyên môn, khó triển khai rộng
rãi.
C.III.2/ Thuận lợi và khó khăn của phương pháp in vivo:

C.III.2.1/ Thuân lợi của phương pháp in vivo:

- Phương pháp dịch tràn ổ bụng ở chuột thường sản xuất mAb ở một nồng
độ rất cao mà thường không yêu cầu các thủ tục cô đặc thêm nữa mà có thể gây
biến tính kháng thể và làm giảm hiệu quả.
- Nồng độ cao của mAb mong muốn trong dịch tràn ổ bụng ở chuột có thể
tránh được những ảnh hưởng của chất gây ô nhiễm trong dịch nuôi cấy in vitro khi
số lượng tươ
ng đương của mAb được sử dụng.
- Phương pháp dịch tràn ổ bụng ở chuột tránh được sự cần thiết phải thuần
hóa kháng thể sản xuất bởi phương pháp nuôi cấy mô.
- Đơn giản, dễ triển khai rộng rãi.
C.III.2.2/ Khó khăn của phương pháp in vivo:

- Phương pháp dịch tràn ổ bụng ở chuột kéo theo việc tiếp tục sử dụng chuột
và yêu cầu phải theo dõi hằng ngày
- mAb sản xuất bằng phương pháp in vivo có thể chứa nhiều protein chuột
và nhựng chất gây ô nhiễm khác mà yêu cầu phải được làm sạch
- Phương pháp dịch tràn ổ bụng ở chuột có thể tốn kém nếu đòi hỏi sử dụng
chuột suy giảm miễn dịch
Sản xuất và thu nhận kháng thể đơn dòng

Page19

- Phương pháp in vivo có thể là nguyên nhân gây đau đớn và nguy hại đến
chuột.
C.IV./ Thu nhận kháng thể đơn dòng:

Việc thu hoạch kháng thể đơn dòng có thể được thực hiện theo nhiều kỹ

thuật khác nhau tùy thuộc vào mục đích sử dụng và bản chất của kháng thể . Một
số kỹ thuật cơ bản sau thường được sử dụng trong thu hoạch kháng thể đơn dòng :
- Ngưng tụ bằng ammonium sulfat nồng độ 50%
- Sắc ký trao đổi ion
- Sắc ký lọc gel
- Sắc ký ái lực
Tùy theo yêu cầu sử d
ụng, kháng thể đơn dòng có thể được thu nhận ở tình
trạng không cần tinh khiết bằng các phương pháp ly tâm phân đoạn . Trong trường
hợp cần kháng thể tinh khiết hơn có thể sử dụng các phương pháp sắc ký cột ái lực
với protein A, protein G Tuy nhiên trong mọi trường hợp thì vẫn khó tránh khỏi
sự tạp nhiễm của kháng thể bò hoặc kháng thể khác hiện diện trong môi trường
nuôi cấy .
Cần lưu ý rằng kháng thể
đơn dòng rất dễ bị biến tính vì thế nên sử dụng các
phương pháp ít ảnh hưởng nhất đến chất lượng của kháng thể đơn dòng . Khi trong
các nghiên cứu không yêu cầu quá cao về sự tinh khiết của kháng thể đơn dòng mà
yêu cầu về tính ái lực và hoạt tính sinh học quan trọng hơn thì phương pháp dịch
tràn ổ bụng sản xuất kháng thể đơn dòng có nhiều ưu điểm hơn.
C.V/Sản xuấ
t kháng thể đơn dòng ở quy mô lớn:
Khoảng 25,000 mAb được liệt kê trong danh ba của Linscott (1998-1999).
Hầu hết được sản xuất ở những số lượng nhỏ (ít hơn 0.1g) cho những mục đích
nghiên cứu liên quan (de Geus và Hendriksen 1998). Tuy nhiên, một số đã thu
được thanh công trong thương mại và vì vậy đòi hỏi một quy mô sản xuất khác
nhau. Về mặt thương mại xem xét quy mô sản xuất từ 0.1-10 g là nhỏ, 10-100 g là
vừa, và hơn 100g là lớn. Sự sản xuất ở quy mô thương m
ại nói chung thực hiện sản
xuất mAb cho ba muc đích: chuẩn đoán, điều trị , và nghiên cứu, phát triển các tác
nhân điều trị bệnh mới.

*Sản xuất kháng thể đơn dòng cho mục đích chuẩn đoán và điều trị:

Một lượng kháng thể đơn dòng cần thiết và tầm quan trọng của một vài yếu
tố như chi phí, thời gian quay vòng, và tuân thủ các quy định phụ thuộc vào mục
đích này. Nghành công nghiệp chuẩn đoán đầy cạnh tranh liên quan tới chi phí,
thời gian quay vòng, và những yêu cầu về quản lý. Sự sản xuất mAb của nghành
công nghiệp chuẩn đoán thường ở quy mô nhỏ hoặc trung bình và rất hiếm khi ở
quy mô lớn. Nghành công nghiệp
điều trị ít liên quan nhiều hơn nghành công
nghiệp chuẩn đoán với chi phí và thời gian quay vòng, và quy mô sản xuất của nó
là từ trung bình cho tới lớn. Nghành công nghiệp điều trị thì quy định rất cao và
nhạy cảm với cấu trúc quy định và chi phí pháp lý rất cao của một vài thay đổi về
Sản xuất và thu nhận kháng thể đơn dòng

Page20

thủ tục. Nghành công nghiệp công nghệ sinh học mà phát triển các tác nhân trị
bệnh sản xuất mAb ở quy mô nhỏ đến trung bình. Nó ít liên quan với chi phí sản
xuất hơn so với nghành công nghiệp chuẩn đoán và liên quan nhiều hơn đến
nghành công nghiệp điều trị, nhưng thời gian quay vòng là rất quan trọng. Vì vậy,
nó đòi hỏi phải quay vòng nhanh chóng .
Việc sản xuất mAb thương mại yêu cầu nhiều hơn những mẻ nuôi cấy lớ
n
hoặc sản xuất ở một số lượng lớn chuột. Nó đòi hỏi một sự nỗ lực đáng kể ở giai
đoạn chuẩn bị sản xuất để đảm bảo rằng các dòng tế bào được ổn định, có thể sản
xuất thương mại số lượng thích hợp một kháng thể ổn định, và có thể sản xuất một
sả
n phẩm không bị nhiễm bẩn. Sản xuất thương mại cũng bao gồm việc xây dựng
một cơ sở chất lượng cao cho việc sản xuất in vivo và in vitro và chế biến kháng
thể. Có một nhu cầu cho việc kiểm soát chất lượng và các bộ phận đảm bảo chất

lượng để đáp ứng được các yêu cầu thực tiễn sản xuất tốt để yêu cầu cho sản xuấ
t
thương mại. Việc sản xuất lô thử nghiệm là cần thiết để đảm bảo sản phẩm trước
khi sản xuất.
D/ KẾT LUẬN:

Kháng thể đơn dòng (mAb) là thuốc thử quan trọng được sử dụng trong nghiên cứu
y sinh, trong chẩn đoán bệnh và trong điều trị một số bệnh như bệnh nhiễm trùng
và ung thư. Kháng thể đơn dòng được sản xuất bởi dòng tế bào hoặc dòng vô tính
thu được từ động vật đã được gây kích ứng miễn dịch với yếu tố kháng nguyên
đang nghiên cứu. Để sản xuất được kháng th
ể đơn dòng mong muốn, các tế bào
phải được phát triển bằng một trong hai cách sau: Bằng cách tiêm vào xoang bụng
của một con chuột thích hợp được chuẩn bị hoặc nuôi cấy mô tế bào trong các bình
thoát cổ. Xa hơn nữa là xử lý dịch tràn ổ bụng của chuột và nuôi cấy mô nổi bề mặt
có thể cần thiết để thu được kháng thể đơn dòng độ tinh khiết và nồng độ theo yêu
cầu. Phương pháp sử d
ụng chuột thường quen thuộc, được hiểu rõ, và phổ biến
rộng rãi trong nhiều phòng thí nghiệm; Nhưng những con chuột yêu cầu giám sát
cẩn thận để giảm đến mức tối thiểu sự tổn thương và sự nguy hại đến chuột do một
số dòng tế bào gây ra bằng cách tích tụ quá mức dịch lỏng (dịch tràn ổ bụng ) ở ổ
bụng hoặc sự xâm phạm của nộ
i tạng. Phương pháp nuôi cấy mô sẽ được chấp
nhận rộng rãi nếu nó quen thuộc và phổ biến rộng rãi như phương pháp sử dụng
chuột và nếu nó có thể sản xuất một lượng kháng thể cần thiết với mọi dòng tế bào,
nhưng phương pháp nuôi cấy này rất đắt, tốn thời gian, và thường không có khả
năng sản xuất một lượng kháng thể cần thiết mà không có những k
ĩ năng đáng kể
về thao tác. Tuy nhiên, phương pháp nuôi cấy ngày nay đang ngày càng trở nên rẻ
hơn, quen thuộc hơn, và rộng rãi hơn

E/TÀI LIỆU THAM KHẢO:

- Công nghệ sinh học trong thú y – PGS.TS. Nguyễn Ngọc Hải – Nhà xuất
bản Nông Nghiệp
Sản xuất và thu nhận kháng thể đơn dòng

Page21

- Công nghệ sinh học trong chăn nuôi gia súc – PGS.TS. Trần Thị Dân –
Nhà xuất bản Nông Nghiệp
- Monoclonal antibody production – A report of the committee on methods
of producing monoclonal antibodies Institute for Laboratory Animal Research
Natinal Research Council
- www.google.com.vn