Tiểu luận sản xuất Phân bón vi sinh từ nấm trichoderma words

Bài tập nhóm vi sinh 2 GVHD: Phạm Thị Hương
SẢN XUẤT PHÂN BÓN VI SINH TỪ NẤM
TRICHODERMA
1. Giới thiệu
1.1 Lịch sử ra đời của sản phẩm:
Trong tự nhiên, đất chứa nhiều vi sinh vật sống chung với nhau. Trong thời gian gần đây,
người ta thường bàn nhiều đến Trichoderma và các công dụng của nó trong lĩnh vực phân
bón vi sinh. Tuy nhiên Trichoderma không phải mới được phát hiện và ứng dụng gần đây
mà khoảng 200 năm về trước, Trichoderma được phát hiện đầu tiên bởi Persoon vào năm
1794, vào thời điểm đầu tiên này ông đã mô tả được 3 loài: Trichoderma caesium Pers.
T.nigrescens Pers, T.viride var. viride Pers. Cho đến năm 1801 Persoon và Gray đã mô tả
chi tiết thêm 4 loài nấm Trichoderma đó là: T. aureum Pers (1796), T. laeve Pers (1796),
T. dubium Pers (1801), T. fuliginoides Pers (1801). Trong suốt 2 thế kỹ tiếp theo đến năm
1999 các nhà khoa học trên thế giới đã phát hiện thêm khoảng 90 loài. Từ năm 2000 trở
lại đây đã phát hiện thêm khoảng 50 loài mới. Cho đến hiện nay (2013) đã có trên 150
loài nấm Trichoderma được mô tả.
Nhờ những công trình đó mà nhiều phòng thí nghiệm trên thế giới đã nghiên cứu và
khám phá ra hệ thống phân giải cellulose của Trichoderma. Và những ứng dụng về phân
giải cellulose của chúng. Một phát hiện quan trọng trong nghiên cứu về Trichoderma là
khả năng kích thích tăng trưởng cho cây trồng và khả năng đối kháng với các loài nấm
bệnh giúp Trichoderma được dùng như là tác nhân kiểm soát sinh học trong nông nghiệp.
Ngày nay, lĩnh vực này đã trở thành hướng nghiên cứu của nhiều nhà khoa học trên thế
giới.[2],[3]
1.2 Giới thiệu chung về sản phẩm phân bón vi sinh từ nấm Tricoderma và cơ chất mà
chúng sử dụng:
Trichoderma vừa có khả năng phân hủy cellulose vừa có khả năng đối kháng lại các loài
nấm gây bệnh ở thực vật nên việc dùng Trichoderma trong phân bón là lựa chọn tốt vừa
bảo vệ được cây trồng, tăng thêm thu nhập, giảm chi phí đầu tư và bảo vệ môi trường.
Đề tài sản xuất phân bón vi sinh từ nấm Ttrichoderma Trang 1
Bài tập nhóm vi sinh 2 GVHD: Phạm Thị Hương
Cellulose là chất hữu cơ được tổng hợp nhiều nhất trên thế giới hiện nay, có khoảng từ 60

đến 90 tỷ tấn. Ở cấp độ sinh quyển, hàng tỷ tấn cellulose được tạo ra mỗi năm cần phải
được phân hủy, nếu không chúng sẽ tích tụ lại và gây nguy hiểm cho hệ sinh thái. Điều
không may là cellulose lại "kháng" lại mạnh mẽ với các enzyme phân hủy chúng nhưng
may mắn là Trichoderma lại có khả năng phân hủy cellulose mạnh mẽ.
Trong các hệ sinh thái tự nhiên như trong rừng, các loài nấm thường kết hợp với các vi
khuẩn phân hủy cellulose thành các đơn phân (monomer) rất dể hấp thu đối với các sinh
vật khác. Tuy nhiên trong các hệ sinh thái nhân tạo như các vườn, trang trại, đồn điền,
ruộng lúa, các sinh vật phân hủy cellulose trên không tồn tại hoặc rất ít, do đó sẽ không
diễn ra quá trình phân hủy cellulose (cũng như các chất cao phân tử khác) một cách dể
dàng và nhanh chóng như trong các hệ sinh thái rừng tự nhiên. Vì vậy, chúng ta cần phải
bổ sung thêm các loài có khả năng phân hủy cellulose mạnh như Trichoderma, xạ khuẩn
vào trong các nguyên liệu chứa cellulose để việc phân hủy được nhanh chóng và triệt để
hơn. Vì việc phân hủy cellulose diễn ra chậm sẽ dẫn đến cây trồng bị ngộ độc nếu không
"xử lý" các chất hữu cơ này. Tập quán canh tác hiện nay thường đốt bỏ các chất cellulose
này đi và dùng phân hóa học để "bổ sung" cho những thứ lấy từ đất vừa bị đốt đi, cả 2
việc trên đều có ảnh hưởng xấu đến môi trường sống của chúng ta. Nếu đốt bỏ rơm rạ
trên mỗi ha ruộng lúa đồng nghĩa với việc đốt bỏ hơn 28 triệu đồng cho mỗi ha cho mỗi
vụ. Nếu tận dụng phế liệu rơm rạ làm phân bón, chúng ta không những có thể tiết kiệm
26 triệu đồng cho mỗi ha/vụ mà còn giúp bảo vệ môi trường sống xung quanh ta và cho
thế hệ mai sau.
Ngoài việc giải quyết bài toán kinh tế cũng như ô nhiễm môi trường, Trichoderma còn có
đặc tính kháng các loại nấm, có thể điều trị các bệnh do nấm gây ra ở rể cây như
Pythium, Fusarium, Rhizoctonia; Phytophthor,…
Vì vậy sử dụng phân bón chứa Trichoderma sẽ có những lợi ích sau:
• Tận dụng được phế liệu thực vật làm nguyên liệu sản xuất (phân bón) Bảo vệ rễ cây khỏi
các tác nhân gây bệnh
• Giảm thiểu việc dùng thuốc trừ sâu hóa học để tiêu diệt các nấm gây bệnh Giảm thiểu
dùng phân bón hóa học
Đề tài sản xuất phân bón vi sinh từ nấm Ttrichoderma Trang 2
Bài tập nhóm vi sinh 2 GVHD: Phạm Thị Hương

• Giảm thiểu ô nhiễm môi trường
• Đẩy nhanh quá trình hấp thu chất dinh dưỡng và kích thích tăng trưởng cây trồng
• Không gây hại cho người và vật nuôi
• Có phổ đối kháng rộng trên các loài nấm gây bệnh trên cây trồng
• Sử dụng nhiều cơ chế để kháng lại các vi sinh vật gây bệnh
• Tồn tại lâu dài trong đất nhờ khả năng tự sản sinh ra bào tử [3]
2. Nội dung:
2.1 Tìm hiểu về chủng nấm Trichoderma:
2.1.1 Giới thiệu về chủng nấm Trichoderma:
Trichoderma có những loài như T. harzianum, T. viride, T. koningii, T. hamatum …. Nấm
Trichoderma hiện diện gần như trong tất cả các loại đất và trong một số môi trường sống
khác. Chúng là loại nấm được nuôi cấy thông dụng nhất. Chúng hiện diện với mật độ cao
và phát triển mạnh ở vùng rễ của cây, một số giống có khả năng phát triển ngay trên rễ.
Những giống này có thể được bổ sung vào trong đất hay hạt giống bằng nhiều phương
pháp. Ngay khi chúng tiếp xúc với rễ, chúng phát triển trên bề mặt rễ hay vỏ rễ phụ thuộc
vào từng giống. Vì vậy, khi được dùng trong xử lý hạt giống, những giống thích hợp nhất
sẽ phát triển trên bề mặt rễ ngay cả khi rễ phát triển dài hơn 1m phía dưới mặt đất và
chúng có thể tồn tại, còn hiệu lực cho đến 18 tháng sau khi sử dụng, ví dụ như các loài T.
viren , T. flavofuscum, T. harzianum, T. viride, T. koningii, T.hamatum,… Tuy nhiên,
không có nhiều giống có khả năng này.[4]
Ngoài sự hình thành khuẩn lạc trên rễ, nấm Trichoderma còn tấn công, ký sinh và lấy
chất dinh dưỡng từ các loài nấm khác. Bởi vì nơi Trichoderma phát triển tốt nhất là nơi
có nhiều rễ khỏe mạnh, vì Trichoderma sở hữu nhiều cơ chế cho việc tấn công các loài
nấm gây bệnh cũng như cơ chế cho việc nâng cao sự sinh trưởng và phát triển của cây.
Nhiều phương pháp mới trong kiểm soát sinh học và nâng cao sự sinh trưởng của cây
hiện nay đã được chứng minh rõ ràng. Quá trình này được điều khiển bởi nhiều gen và
sản phẩm từ gen khác nhau. Sau đây là một số cơ chế chủ yếu: Ký sinh nấm, kháng sinh,
cạnh tranh chất dinh dưỡng và không gian; sự chịu đựng các điều kiện bất lợi bằng việc
gia tăng sự phát triển của cây và rễ; làm hòa tan và cô lập chất dinh dưỡng vô cơ, cảm
ứng sự kháng bệnh, bất hoạt enzyme gây bệnh. [4]

Đề tài sản xuất phân bón vi sinh từ nấm Ttrichoderma Trang 3
Bài tập nhóm vi sinh 2 GVHD: Phạm Thị Hương
Hầu hết các giống Trichoderma không sinh sản hữu tính mà thay vào đó là cơ chế sinh
sản vô tính. Tuy nhiên, có một số giống sinh sản hữu tính đã được ghi nhận nhưng những
giống này không thích hợp để sử dụng trong các phương pháp kiểm soát sinh học.
Phương pháp phân loại truyền thống dựa trên sự khác nhau về hình thái, chủ yếu là ở bộ
phận hình thành bào tử vô tính. Gần đây, nhiều phương pháp phân loại dựa trên cấu trúc
phân tử đã được sử dụng.
Bộ gen của nhiều loài Trichoderma đã được giải mã và được công bố công khai từ JGI.
Bộ gen của nấm Trichoderma có khoảng 30-40 Mb, với khoảng 12.000 gen được định
danh.
Nấm Trichoderma phát triển nhanh ở 25-30°C, có một số ít loài Trichoderma tăng trưởng
được ở 45°C.
Khuẩn lạc của nấm Trichoderma có màu trong suốt trên môi trường thạch đường bột ngô
(CMD). Trên môi trường thạch đường khoai tây (PDA) khuẩn lạc có màu trắng, đôi khi
có màu vàng nhạt và có mùi thạch dừa đặc trưng.
Sợi nấm Trichoderma phân nhánh mạnh, thường được hình thành ở dạng gần như vòng
tròn đồng tâm ở phần trục chính gần cực. Các nhánh sợi nấm thường mọc tạo gốc với
trục chính khoảng 90 độ. Phần ngọn sợi nấm thường có dạng như ngọn cây thông hay
kim tự tháp (ví dụ với T. conidiophore). [4, 10]
Hình 2.1: Khuẩn ty và bào tử của nấm Trichoderma
2.2.2 Cơ chế hoạt động của Trichoderma:
Đề tài sản xuất phân bón vi sinh từ nấm Ttrichoderma Trang 4
Bài tập nhóm vi sinh 2 GVHD: Phạm Thị Hương
Cơ chế phân giải Cellulose
Trichoderma tiết ra một lượng lớn các enzyme khác nhau có khả năng phối hợp để phân
hủy tinh thể cellulose. T. reesei sản sinh ra 5 loại enzyme endoglucanase, 2 exoglucanase
và 1 cellobiase (β- glucosidase).

Quá trình phân hủy cellulose được diễn ra qua nhiều bước:

Cellulase liên kết với cellulose thông qua trung tâm liên kết với cellulose trên enzyme
(giai đoạn 1). Enzyme định hướng vị trí liên kết dễ phân giải trên bề mặt cơ chất (giai
đoạn 2). Hình thành phức hệ enzyme - cơ chất ( giai đoạn 3 ). Thủy phân liên kết β-
glycosidic nhờ β- glucosidase là một phần nhỏ trong số các protein ngoại bào do T.reesei
tiết ra. β- glucosidase nội bào hoặc gắn kết với màng tế bào cũng được nhiều tác giả
nghiên cứu. Song mối quan hệ chính xác về gen và sinh hóa giữa các enzyme này chưa
được làm sáng tỏ ( giai đoạn 4 ). Giải hấp của cellulase từ các chất nền hoặc lặp lại bước
4 hoặc 2/3 các bước nếu chỉ có lĩnh vực xúc tác tách ra từ dây chuyền (giai đoạn 5). [5]
Thủy phân cellobiose tạo thành glucose bởi β-glucosidase. Ngoài ra, sản phẩm ức chế và
sự biến đối cơ chất cùng với quá trình thủy phân thì ảnh hưởng tới các bước trên (giai
đoạn 6). [5]
2.2.3 Những cải tiến của chủng Trichoderma:
Đề tài sản xuất phân bón vi sinh từ nấm Ttrichoderma Trang 5
Bài tập nhóm vi sinh 2 GVHD: Phạm Thị Hương
2.2.3.1 Nâng cao khả năng sản xuất cellobiohydrolases ( CBH ) ở chủng T.reesei
2.2.3.1.1 Khuếch đại biểu hiện cbhl bằng cách tăng số bản sao gen cbhl:
Plasmid pALK496 đã được xây dựng và chuyển vào nấm T. reesei ALK02221 để tăng số
lượng bản sao của gen cbhl.
Hình 2.2 Plasmid pALK496 sử dụng cho biến đổi chủng ALK02221 nhằm sản xuất
lượng lớn CBHI [Kelly và Hynes, 1985].
Các chủng biến đối được khảo sát khả năng tống hợp cellulase bằng phương pháp filter
paper-hydrolyzing activity (FPU). So với chủng chủ ALK02221, lượng CBHI tăng 1.5
lần ở chủng ALK03760, 1.4 lần ở chủng ALK03862 và 1.3 lần ở chủng ALK03761 (bảng
2.1). Ngoài ra, những thay đối trong số lượng của CBHII và EGI đã được tìm hiếu, số
lượng CBHII giảm 25% ở chủng ALK03760 và chủng ALK03862, nhưng ở chủng
ALK03761 lượng CBHII đã tăng 15% so với chủng chủ ALK02221. Đáng ngạc nhiên, số
lượng EGI giảm 30% và 40% trong ALK03760 và chủng ALK03862 so với chủng chủ
ALK02221, mặc dù các gen egll được giữ nguyên vẹn trong bộ gen. Mức độ tiết ra các
protein tăng lên so với chủng chủ.[5]
Bảng 2 1: Sản xuất cellulase bởi chủng chủ ẢLK02221 và bởi chủng đã biến đồi

ALK03760, ALK03862, ALK03761.
Đề tài sản xuất phân bón vi sinh từ nấm Ttrichoderma Trang 6
Bài tập nhóm vi sinh 2 GVHD: Phạm Thị Hương
2.2.3.1.2 Khuếch đại biếu hiện cbh2 bằng cách sử dụng promoter mạnh cbhl:
Casset của pALK546 (hình 23) chứa promoter mạnh cbhl biến nạp vào chủng ALK02221
nhằm điều khiển biểu hiện cbh2 bằng promoter cbhl. Chủng biến đổi được phân tích bằng
phương pháp Southern Blot nhằm khắng định sự tồn tại của đoạn promoter.[5]
Đề tài sản xuất phân bón vi sinh từ nấm Ttrichoderma Trang 7
Bài tập nhóm vi sinh 2 GVHD: Phạm Thị Hương
ADN toàn phần được phân cắt bởi enzyme cắt giới hạn Xhol. Sản phẩm của quá trình này
được lai với đoạn ADN của pALK 546 được phân cắt bởi EcoRI và BamHI.
Giếng 1 và 6: khối lượng phân tử marker, giếng 2: ALK02221, giếng 3:ALK03798, giếng
4: ALK03799, giếng 5: ALK03873.[5]
Locus của cbhl và cbh2 có kích thước 9.1 kb và 9.8 kb nằm trên cùng một vị trí kích
thước được tìm thấy ở mọi chủng. Vạch có kích thước 4.9 kb tương ứng đoạn gen ble liên
kết với promoter cbhl( ble-cbhl promoter), vạch có kích thước 3.4 kb tương ứng đoạn
cbh2 và đầu 3’ của gen egỉ2, vạch có kích thước 2.3 kb là đoạn 5’ của gen egl2 liên kết
với ble. Kết quả cho thấy chủng ALK03898 và ALK03899 chứa 1 bản sao có nguồn gốc
từ plasmide pALK546 tuy nhiên vị trí chèn của bản sao này chưa được xác định. Một số
nghiên cứu tiếp theo cho thấy chủng ALK03873 chứa 1 bản sao chèn vào vị trí egl2.[4]
Lượng CBHII tăng từ 3- 4 lần khi ta tăng thêm số lượng bản sao gen cbh2 dưới sự điều
khiển của promoter mạnh cbhl. Chủng ALK03798 (chứa EGII) sản xuất lượng lớn CBHII
(gấp 4 lần so với chủng chủ ALK02221). ALK03873 (không chứa EGII) và ALK03799
(chứa EGII) sản xuất lượng CBHII lớn gấp 3 lần so với chủng chủ. Chủng ALK03798 và
ALK03799 sản xuất lượng CBHI khoảng 20% và ALK03873 khoảng 10% so với chủng
chủ. Lượng endoglucanase giảm 20% ở chủng ALK03798 và ALK03799. Như vậy thiếu
gen egl2 trong chủng ALK03873 là nguyên nhân làm giảm lượng endoglucanase.[5]
Đề tài sản xuất phân bón vi sinh từ nấm Ttrichoderma Trang 8
Bài tập nhóm vi sinh 2 GVHD: Phạm Thị Hương
2.2.3.2 Nâng cao khả năng sản xuất endoglucanases ( EG) ở chủng T.reesei bằng

cách sử dụng promoter mạnh:
T.reesei VTT-D-79125 là chủng đột biến sản xuất lượng lớn cellulase gồm EGI/II,
CBHI/II. ALK02698 là chủng sản xuất lượng lớn EGI không chứa gen cbhl- được thay
thế bởi casset biểu hiện egl1. Vì vậy, hai chủng này được sử dụng như thể nhận plasmid
nhằm tạo chủng biến đổi có khả năng sản xuất lượng lớn EGII. Endoglucanase sản xuất
bởi chủng biến đổi EGII liên quan đến số lượng bản sao của casset biểu hiện egl2. Chủng
T.reesei sản xuất lượng lớn EGI/II và không tổng hợp CBHI/II được xây dựng bằng cách
thay cbh2 bằng gen egl2.[5]
Các chủng được biến đổi nhờ vào pALK537 và pALK540. pALK537 gồm promoter cbhl
kich thước 2.2 kb và đoạn Avall của vùng kết thúc cbhl có kích thước 0.7 kb. pALK540
chứa promoter cbhl, nhân tố kết thúc và egl2 như trong pALK537.[5]
Đề tài sản xuất phân bón vi sinh từ nấm Ttrichoderma Trang 9
Bài tập nhóm vi sinh 2 GVHD: Phạm Thị Hương
Hình 2.5: Sơ đồ enzyme cắt giới hạn của plasmid pALK537. egl2 được nối với
promoter cbhl. Đoạn Notl 9.2 kb thì được tách ra từ plasmid để thực hiện biến đổi.
Hình 2.6: Giới hạn của plasmid pALK540. Đoạn Clal-Pvul 11.6 kb thì được tách ra từ
plasmid đế thực hiện biến đối.
Biến đối chủng T.reesei: đế gen egl2 biếu hiện cho lượng lớn EG, promoter mạnh của gen
cbhl được dùng nhằm điều khiển biểu hiện gen egl2. Tương tự như nghiên cứu trình bày
phần trên, các chủng biến đối được phân tích bằng Southern Blot nhằm xác định số lượng
bản sao của egl2.[5]
Đề tài sản xuất phân bón vi sinh từ nấm Ttrichoderma Trang 10
Bài tập nhóm vi sinh 2 GVHD: Phạm Thị Hương
Hình 2.7 Southern blotting của chủng ALK03530 và ALK03574.
Chủng ALK03574 chứa 1 bản sao egll trong pALK537 tại locus cbhl trong khi chủng
ALK03530 chứa 2 bản sao egll tại cùng vị trí. Hơn nữa, lượng EGI, CBHI/II cũng được
phân tích cụ thể.[5]
2.2.3.3 Nâng cao khả năng sản xuất endoglucanases ( EG) ở chủng T.reesei bằng
cách nhân bản và biểu hiện gen khác loài:
Nhân bản gen cellulase từ Melanocarpus albomyces và biểu hiện chúng ở T.reesei do

nhiều nghiên cứu tìm thấy ở M. albomyces có 3 gen hiệu quả sản xuất cellulase đó là
:Cel7A, Cel45A, Cel7B. Nếu những gen này hoạt động dưới sự điều khiển của promoter
mạnh cbhl ở T.reesei biến đổi gen có thể sẽ cho sản lượng endoglucanase cao ở chủng
biến đối. [5]
M.albomyces (ALK0237, CBS685.95) sử dụng như là chủng cho gen cellulase. Chủng
E.coliXL 1-Blue MRA sử dụng như chủng chủ tạo thư viện gen cho M.albomyces.
T.reesei ALK03620 (gen egl2 xóa bỏ) là chủng để biến đổi. T.reesei ALK04072 là chủng
không chứa gen cbhl, egl2 dùng như chủng đối chứng. ADN nhiễm sắc thể của
M.albomyces thì được phân đoạn bởi enzyme cắt giới hạn Sau3A. Đoạn ADN 5- 15 kb
liên kết Lambda DASHRII và được biến nạp vào trong tế bào E.coli XL-Blue MRA. Các
gen cel45A, cel7A, cel7B được khuếch đại bằng PCR. Các primer sử dụng để khuếch đại
gen.[5]
Đề tài sản xuất phân bón vi sinh từ nấm Ttrichoderma Trang 11
Bài tập nhóm vi sinh 2 GVHD: Phạm Thị Hương
Hình 2.8: Các plasmid được sử dụng cho biến đối T.reesei ALK3620 biểu hiện gen
cel45A, cel7A, cel7B ở M.albomyces
2.3 Môi trường nuôi cấy nấm Trichoderma
2.3.1 Thành phần môi trường:
-Nghiên cứu về nấm Trichoderma, người ta biết được các loài có hoạt tính ceululase cao
như T.koningi, T. lignorum và T.viride.
-Môi trường thích hợp để cho T. viride sản sinh ceululase theo Mandels và Sterberg là
thành phần như sau:
(NH
4
)
2
SO
4
, FeSO
4

.7H
2
O, KH
2
PO
4
, MnSO
4
.4H
2
O, URE, ZnSO
4
.7H
2
O, CaCl
2
, COCl
2
,
MgSO
4
.7H
2
O, Ceululase: 0,75-1% , Pepton: 0,075-0,1%, pH lúc đầu: 5,0-6,0.[2]
Trong đó, nguồn ceululase trong môi trường nuôi cấy có ảnh hưởng rõ rệt đến sự hình
thành cellulase. Nhiều nghiên cứu cho biết cellulase là nguồn cacbon C thích hợp nhất
đối với sự tổng hợp cellulase; Pepton làm kích thích việc tạo thành cellulase.[2]
Nitrat là nguồn nitơ thích hợp đối với việc tổng hợp cellulase. Tuy nhiên muối Amon có
thể làm ức chế sự tổng hợp của cellulase (nguyên nhân do làm giảm pH của môi trường
dẫn đến việc làm bất hoạt cellulase hoặc làm cố định enzym lại trong sợi nấm).

T. viride có thể tổng hợp cellulase rất tốt khi nuôi cấy trên hổn hợp cám tiểu mạch: mùn
cưa (tỷ lệ 2:1) đã được axit hóa và làm ẩm.
-Môi trường nuôi nấm Trichoderma thông dụng là: KH
2
PO
4
: 0,2%, (NH
4
)2SO
4
: 0,14%,
URE: 0,03%, MgSO
4
.7H
2
O: 0,03%, CaCl
2
: 0,03%, FeSO
4
.7H
2
O: 5mg/l, MnSO
4
.H
2
O:
1,56 mg/l, ZnSO
4
.7H
2

O: 1,4 mg/l, CoCl
2
: 2mg/l,0020, Pepton: 0,1% [2]
Đề tài sản xuất phân bón vi sinh từ nấm Ttrichoderma Trang 12
Bài tập nhóm vi sinh 2 GVHD: Phạm Thị Hương
2.3.2 Ảnh hưởng của thành phần môi trường lên hình thái của Trichoderma và khả
năng sản xuất enzyme cellulase:
Qua việc nghiên cứu chủng T. reesei đã xác định hình thái của nấm ảnh hưởng đến khả
năng sản xuất cellulase ở T. reesei nuôi cấy trong môi trường lactose và lactobionic acid
kiểu fed-batch trong bồn bioreactor 7 lít. Khi cho cellulose vào dịch chiết nấm men từ
môi trường nuôi cấy đã cho hiệu suất sản xuất enzyme cao nhất với thế tích enzyme có
hoạt tính 69.8U/L.h, và sinh khối nấm men cực đại là 14.7g/l . Những phát hiện này kèm
theo đặc điểm hình thái của nấm: tổng sợi nấm là 98% tổng diện tích ước lượng, với
chiều dài sợi nấm 10mm, thể tích 45.1 mm
3
, đường kính 7.9mm, số lượng nhánh 9, và số
lượng đỉnh mỗi sợi nấm là 29. Một sự tương quan rõ ràng đã được tìm thấy giữa các sợi
nấm, số lượng đỉnh và khả năng sản xuất enzyme cellulase.[5]
2.2.3 Ảnh hưởng qua lại giữa pH và cơ chất trong môi trưòng nuôi cấy đến khả
năng sản xuất cellulase.
Nghiên cứu được thực hiện trên chủng T.reesei:
Mỗi cơ chất và mỗi vi sinh vật nhất định thích hợp ở 1 pH khác nhau và ảnh hưởng tới
sản lượng của sản phẩm. Theo báo cáo của Andreotti et al thì T.reesei sinh trưởng tốt nhất
trong môi trường nuôi cấy ở pH =5 và hơi chậm ở pH 4.5 và 4. Tuy nhiên, Chahal et ai.
cho thấy rằng T.reesei sản xuất cellulase tối ưu ở pH=6.0.[5]
Với cơ chất là α -cellulose (chứa 99,9% cellulose) thì hoạt tính của T.reesei tối ưu tại pH
5.0. Sản lượng cellulase thấp ở pH 3.0 và 7.0. Tuy nhiên, trong các tài liệu công bố trước
thì pH 3.0, pH 4,0; và pH 5,0 cho sản lượng cellulase cao của nấm T. reesei. Trong một
thử nghiệm khác , khi pH 5,0 ± 0.05, lượng cellulase đạt 4 IU / ml trong vòng 91h. [4]
Với cơ chất là CTMP (chứa 60% cellulose, và phần còn lại là hemicelluloses và lignin)

thì hoạt tính của T.reesei tối ưu ở pH 6.0.
Ta nhận thấy rằng nếu cơ chất cảm ứng chứa nhiều cellulose thì sản lượng đạt tối ưu ở
thời gian ngắn hơn. Và pH tối ưu cũng phụ thuộc cơ chất. Nếu cơ chất alpha cellulose
(chứa 99,9% cellulose) thì pH tối ưu ở 5. Nếu cơ chất là CTMP (chứa 60% cellulose ) thì
pH tối ưu ở 6.[5]
Đề tài sản xuất phân bón vi sinh từ nấm Ttrichoderma Trang 13
Bài tập nhóm vi sinh 2 GVHD: Phạm Thị Hương
Bảng 2.3: Điều kiện nuôi cấy của các chủng T.reesei
Nhận xét: Chủng T. reesei đạt tối ưu trong môi trường cơ chất là glucose. Chủng Rut C30
là chủng thích hợp được với nhiều cơ chất khác nhau (glucose, lactose, mùn cưa ) và
cho năng suất tương đối cao. Do đó, chủng Rut C30 đã được sử dụng khá phổ biến.[5]
2.4 Phương pháp sản xuất:
Quá trình sản xuất phân bón vi sinh từ chủng Trichoderma được tiến hành qua hai giai
đoạn. Giai đoạn 1- Lên men, thu sinh khối Trichoderma. Giai đoạn 2- Sử dụng sinh khối
tạo phân vi sinh từ nguồn phế phẩm nông nghiệp bao gồm rơm, rạ.
2.4.1 Lên men, thu sinh khối Trichoderma:
Quy trình sản xuất sinh khối Trichoderma:
Đề tài sản xuất phân bón vi sinh từ nấm Ttrichoderma Trang 14
Bài tập nhóm vi sinh 2 GVHD: Phạm Thị Hương
Mục đích của quá trình sản xuất sinh khối chủng Trichoderma là tạo ra một khối
lượng lớn nấm Trichoderma để bổ sung vào phế thải nông nghiệp phân giải
cellulose. Để thu được sinh khối lớn, cần phải tính toán, lựa chọn thiết bị, nguồn
nguyên liệu, môi trường thích hợp, bên cạnh đó cần chú ý đến các khâu vô trùng
cũng như việc điều chỉnh các biến nhiệt độ, pH, áp suất, lượng oxy đưa vào,…[1]
Phương pháp lên men:
Có 3 loại lên men: Lên men bề mặt, lên men bán rắn, lên men chìm.
Lên men chìm là phương pháp được phổ biến rộng nhất trong quy trình lên men
công nghiệp, vì có thể kiểm soát được toàn bộ các khâu trong quá trình một cách
dễ dàng. Nuôi cấy chìm hay nuôi cấy bề sâu dùng môi trường dịch thể. Chủng vi
sinh vật cấy vào môi trường được phân tán khắp mọi điểm và chung quanh bề mặt

tế bào được tiếp xúc với dịch dinh dưỡng. Đặc điểm này đòi hỏi trong suốt quá
trình nuôi cấy phải khuấy và cung cấp ôxy bằng cách sục khí liên tục. [6]
Ưu điểm [1],[6]:
- Tốn ít mặt bằng trong xây dựng và lắp đặt dây chuyền.
- Chi phí điện năng, nhân lực và các khoản phụ cho một đơn vị sản phẩm thấp.
- Dễ tổ chức được xí nghiệp có sản lượng lớn.
Đề tài sản xuất phân bón vi sinh từ nấm Ttrichoderma Trang 15
Bài tập nhóm vi sinh 2 GVHD: Phạm Thị Hương
- Các thiết bị lên men chìm dễ cơ khí hoá, tự động hoá.
Nhược điểm: [1], [6]
- Đòi hỏi trang bị kĩ thuật cao, dễ bị nhiễm trùng toàn bộ. Vì vậy, những thiết bị
lên men chìm cần phải chế tạo đặc biệt cẩn thận, chịu áp lực cao, đòi hỏi kín và
làm việc với điều kiện vô trùng tuyệt đối (trong nuôi cấy bề mặt có thể loại bỏ
phần đã nhiễm trùng, các phần khác vẫn còn dùng được).
- Trong lên men chìm cần phải khuấy và sục khí liên tục vì vi sinh vật chỉ sử dụng
được ôxy hoà tan trong môi trường. Khí được nén qua một hệ thống lọc sạch tạp
trùng, hệ thống này tương đối phức tạp và dễ gây nhiễm cho môi trường nuôi cấy.
Xử lí sinh khối:
Nấm Trichoderma khi đưa phế phẩm nông nghiệp thường ở dạng bột. Đây là dạng
dễ bảo quản, thời gian bảo quản được lâu hơn vì vậy sau quá trình lên men ta cần
xử lý lọc, ly tâm để làm giảm tỉ lệ nước trong sinh khối đến mức tối đa, sau đó sấy
khô ở nhiệt độ 35˚C.[1]
2.3.2 Sử dụng sinh khối tạo phân vi sinh từ nguồn phế phẩm nông nghiệp bao gồm
rơm, rạ:
Quy trình sản xuất [4]:
Đề tài sản xuất phân bón vi sinh từ nấm Ttrichoderma Trang 16
Bài tập nhóm vi sinh 2 GVHD: Phạm Thị Hương
a, Cơ chất [8]:
Dùng cho sản xuất 1 tấn phân hữu cơ vi sinh
- Phế phẩm nông nghiệp: trấu rơm, thân cây đậu, bí, lạc 2,5-3 m

- Than bùn (nếu có) hoặc bùn ao phơi khô 200 kg
- Dịch thải hầm Biogas (hoặc nước phân, nước thường) 200-500 lít
- Chế phẩm sinh học 0,5 kg
- Chất xúc tác sinh học BICAT 0,5 lít
+Than bùn được tạo thành từ xác các loài thực vật khác nhau. Xác thực vật được tích tụ
lại, được đất vùi lấp và chịu tác động của điều kiện ngập nước trong nhiều năm. Với điều
kiện phân huỷ yếm khí các xác thực vật được chuyển thành than bùn.
Trong than bùn có hàm lượng chất vô cơ là 18 – 24% (N, PO, KO), phần còn lại là các
chất hữu cơ tăng chất hữu cơ cho đất.
Trong than bùn có axit humic, có tác dụng kích thích tăng trưởng của cây. Hàm lượng
đạm tổng số trong than bùn cao hơn trong phân chuồng gấp 2 – 7lần. [ 7]
Đề tài sản xuất phân bón vi sinh từ nấm Ttrichoderma Trang 17
Bài tập nhóm vi sinh 2 GVHD: Phạm Thị Hương
+Bả thải khí sinh học là một loại phân hữu cơ nên nó không những có những đặc tính của
loại phân hữu cơ truyền thống mà còn có nhiều ưu điểm khác do kết quả của quá trình
phân hủy kỵ khí. Trong quá trình này các chất dinh dưỡng về cơ bản được bảo tồn trong
bả thải ngoại trừ một số các nguyên tố như carbon, hydro và oxy được chuyển hóa thành
khí methan và dioxyt carbon. Một số chất dinh dưỡng dễ hoà tan vẫn còn lại trong bả thải
lỏng, đồng thời một số chất thải rắn hữu cơ và vô cơ trong bã thải đã phân hủy hấp thụ
được một lượng lớn các chất dinh dưỡng hữu ích. Vì vậy, các chất dinh dưỡng có trong
bã thải khí sinh học cao hơn so với phân chuồng và phân ủ theo phương pháp thông
thường, ngoài các nguyên tố dinh dưỡng như N, P, K bã thải khí sinh học còn chứa nhiều
chất hữu cơ và các nguyên liệu cần thiết cho cây trồng như là các axit Humic, Cellulose,
Hemicellulose, lignin nên nó có tác dụng cải tạo đất tốt. [9]
+Chất xúc tác sinh học có bản chất là protein, xúc tác làm tăng nhanh tốc độ phản ứng,
làm giảm năng lượng hoạt hóa giúp phản ứng thực hiện hoàn toàn ở điều kiện nhiệt độ và
áp xuất không cao và nhờ đó mà tránh được việc tiêu diệt các vi sinh vật có lợi, tăng
nhanh quá trình phân hủy các hợp chất hữu cơ, rút ngắn thời gian ủ.
Ngoài ra chất xúc tác sinh học còn có tính chọn lọc, hướng quá trình đi vào phản ứng
chính, giảm tốc độ phản ứng phụ làm tăng hiệu suất sản phẩm.

 Nâng cao hiệu quả:
Ta có thể khuấy chế phẩm sinh học trong nước rỉ đường chảy loãng ( 0,5-1 lít đường
chảy/ 100 lít nước + 1-2kg ure) để khoảng 24h phối hợp sục khí để tăng khối vi sinh rồi
sau đó dùng nước này phun đều lên đống ủ.
Nếu không có nước gỉ mật hoặc mật mía thì có thể dùng các phụ phẩm vỏ quả chín, quả
chuối chín nẫu ngâm vào nước thay thế, ngâm trước khi ủ phân 2-3 ngày.
Rắc thêm vào đó vài nắm cám gạo hoặc bột sắn làm dinh dưỡng ban đầu cho vi sinh vật
hoạt động(2-3kg). [9]
Đề tài sản xuất phân bón vi sinh từ nấm Ttrichoderma Trang 18
Bài tập nhóm vi sinh 2 GVHD: Phạm Thị Hương
Thêm vôi vào đông ủ giúp chất hữu cơ phân hủy nhanh hơn, làm giảm ngộ độc hữu cơ ở
đất, giữ chất mùn (từ sự phân hủy chất hữu cơ) không bị rửa trôi và giảm được mùi hôi
và các khí gây ô nhiễm môi trường thoát ra khi dở đống ủ. [9]
Ngoài ra sử dụng các nguồn cơ chất mới như phân thỏ, nước thải thủy sản, …
b, Tiến hành
- Bước 1: Chọn nơi ủ.
Địa điểm ủ nên thuận tiện cho việc ủ và vận chuyển sử dụng. Nền chỗ ủ bằng đất nện
hoặc lát gạch hoặc láng xi măng, nền nên bằng phẳng hoặc hơi dốc. Nếu nền bằng phẳng
nên tạo rãnh xung quanh và hố gom nhỏ để tránh nước ủ phân chảy ra ngoài khi tưới quá
ẩm. Có thể ủ trong nhà kho, chuồng nuôi không còn sử dụng để tận dụng mái che. Nếu ủ
trong kho phải có thoát nước. Để ủ 1 tấn phân ủ cần diện tích nền khoảng 3 m
2
.
- Bước 2: Chuẩn bị nguyên liệu: như trên
- Bước 3: Chuẩn bị dụng cụ.
Bình tưới ô doa (loại bình dùng để tưới rau), cào, cuốc, xẻng, rành. Vật liệu để che đậy,
làm mái: Có thể dùng các loại vật liệu sẵn có như bạt, bao tải, nilon che đậy và các loại
lá để làm mái tránh mưa, ánh nắng và giữ nhiệt cho đống ủ
- Bước 4: Tiến hành ủ.
Các chế phẩm nông nghiệp: rơm rạ, bèo tây, và cỏ phải được băm nhỏ, chặt khúc với độ

dài không quá 10-15cm, phơi khô. Các thành phần nguyên liệu trên được phối trộn ơ
dạng khô 1 cách kĩ càng rải xuống dưới cùng, rộng mỗi chiều khoảng 1,5 m, dày 0,3-0,4
m (chiếm 20 % tổng lượng phế phụ phẩm); Sau đó rải đều lên một lớp than bùn (chiếm
30 % tổng lượng phân chuồng để ủ) hoặc nước phân đặc. Tiếp tục rải các loại phế phụ
phẩm, chế phẩm sinh học lên trên với một lớp dày 40 cm, rồi lại rải một lớp than bùn lên
rồi tưới các phụ phẩm, chế phẩm sinh học lên. Cứ tiếp tục từng lớp như vậy cho đến khi
hoàn thành sẽ được đống phân ủ cao khoảng 1,5m.
Lưu ý: Nếu nguyên liệu ủ khô nhiều thì sau mỗi lớp ủ cần tưới thêm nước, lượng nước
(kể cả nước dùng hòa chế phẩm) khoảng 1 nửa ô doa đến 2 ô doa tùy thuộc vào nguyên
liệu khô nhiều hay ít.[8]
Đề tài sản xuất phân bón vi sinh từ nấm Ttrichoderma Trang 19
Bài tập nhóm vi sinh 2 GVHD: Phạm Thị Hương
- Bước 5: Che đậy đống ủ.[8]
Sau khi ủ xong, ta che đậy đống ủ bằng bạt, bao tải dứa hoặc nilon. Để đảm bảo tốt hơn
và tránh ánh sáng chiếu trực tiếp đống ủ nên che thêm tấm che bằng lá hoặc mái lợp. Vào
mùa đông, cần phải che đậy kỹ để nhiệt độ đống ủ được duy trì ở mức 40 - 50
o
C.
- Bước 6: Đảo đống ủ và bảo quản.
+ Sau khi ủ vài ngày nhiệt độ đống ủ tăng lên cao khoảng 40-50
o
C. Nhiệt độ này sẽ làm
cho nguyên liệu bị khô và không khí (oxy) cần cho hoạt động của vi sinh vật ít dần. Vì
vậy, cứ khoảng 7-10 ngày tiến hành kiểm tra, đảo trộn và nếu nguyên liệu khô thì bổ sung
nước (khoảng vài ô doa), nếu quá ướt dùng cây hoặc cào khêu cho đống phân thoáng khí
thoát hơi nhanh.
Cách kiểm tra nhiệt độ đống ủ: Sau ủ khoảng 7-10 ngày, dùng gậy tre vót nhọn chọc vào
giữa đống phân ủ, khoảng 10 phút sau rút ra, cầm vào gậy tre thấy nóng tay là được. Nếu
không đủ nóng có thể là do nguyên liệu đem ủ quá khô hoặc quá ướt.
Cách kiểm tra độ ẩm đống ủ: Nếu thấy nước ngấm đều trong rác thải, phế thải và khi cầm

thấy mềm là đạt độ ẩm cần thiết. Với than bùn, mùn cưa, mùn mía nếu bóp chặt thấy
nước rịn qua kẽ tay là đạt ẩm khoảng 50 %, nếu nước chảy ra là quá ẩm, xòe tay ra thấy
vỡ là quá khô.
+ Sau ủ 15-20 ngày nên đảo đống phân ủ. Đối với các loại nguyên liệu khó phân hủy như
thân cây ngô, rơm rạ cứ sau 20 ngày đảo 1 lần.
c. Cách dùng:
Thời gian ủ dài hay ngắn tuỳ theo loại nguyên liệu và mùa vụ, kéo dài từ 1-4 tháng. Khi
kiểm tra thấy đống phân màu nâu đen, tơi xốp, có mùi chua nồng của dấm, thọc tay vào
đống phân thấy ấm vừa tay là phân đã hoai mục (chín hoặc ngẫu), hoàn toàn có thể đem
sử dụng. Phân dùng không hết nên đánh đống lại, che đậy cẩn thận hoặc đóng bao để
dùng về sau. Phân ủ xong sử dụng tốt nhất trong vòng 1 năm và hiệu quả sử dụng đạt cao
nhất trong một tháng khi phân ngẫu.
Phân ủ chủ yếu dùng để bón lót cho các loại cây trồng, có thể sử dụng bón thúc đối với
các loại rau và hoa. Cách bón tương tự như bón phân hữu cơ truyền thống khác. [8], [9].
Đề tài sản xuất phân bón vi sinh từ nấm Ttrichoderma Trang 20
Bài tập nhóm vi sinh 2 GVHD: Phạm Thị Hương
3. HƯỚNG PHÁT TRIỂN
Hiện nay, có nhiều trung tâm nghiên cứu tại việt nam đã sản xuất thành công chế phẩm
sinh học Trichoderma phục vụ cho mục đích thương mại hóa. Sản phẩm mua bán trên thị
trường đa dạng và phong phú, nhưng giá của sản phẩm vẫn còn khá cao.
Một sản phẩm [10]
Để giúp Tricoderma đến tay người nông dân ,cần phải làm chủ được quy trình công nghệ
sản xuất chế phẩm sinh học này, cải tiến cả về giống lẫn quy trình sản xuất để giảm giá
thành, nâng cao hiệu suất.
Đa số việc tạo phân vi sinh loại này đều dựa trên nguồn nguyên liệu tại mỗi địa phương,
tức là có sự phân bố rải rác nguyên liệu, ví dụ các vùng sản xuất nông nghiệp như đồng
bằng Sông Hồng hay đồng bằng sông Cửu Long thì lượng rơm rạ thì có lượng khá lớn, có
thể tập trung sản xuất, còn dọc ven biển các tỉnh miền trung thì có những diện tích sản
xuất trung bình và nhỏ. Từ đó có thể thấy, việc chuyển giao công nghệ cho người nông
dân tự làm chủ để thực hiện sản xuất phân với quy mô trung bình và nhỏ là thích hợp

nhất.[10]
Tài liệu tham khảo:
Đề tài sản xuất phân bón vi sinh từ nấm Ttrichoderma Trang 21
Bài tập nhóm vi sinh 2 GVHD: Phạm Thị Hương
[1] PGS. TSHK. Lê Văn Hoàng (2004), Các quá trình và thiết bị công nghệ sinh
học trong công nghiệp, Nhà xuất bản khoa học và kỹ thuật.
[2] />[3] />ng-dng-vi-nm-trichoderma.html
[4] />[5] />cellulase-va-mot-so-phuong-phap-nang-cao-kha-nang-phan-huy-10604/
[6] />[7] />Source=/tonghop&Category=C%C3%A1c+l%C4%A9nh+v%E1%BB%B1c+kh
%C3%A1c&ItemID=5&Mode=1
[8] />mo-ho-gia-dinh-9889/
[9] />nam-trichoderma-spp-40702/
[10] />trichoderma/trichoderma-bima.html
Đề tài sản xuất phân bón vi sinh từ nấm Ttrichoderma Trang 22