Một số đặc điểm hình thái noãn và kết quả thụ tinh trong ống nghiệm

ĐẠI HỌC QUỐC GIA THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN


NGUYỄN THỊ PHƯƠNG DUNG



KHẢO SÁT MỐI LIÊN HỆ GIỮA
MỘT SỐ ĐẶC ĐIỂM HÌNH THÁI NOÃN
VÀ KẾT QUẢ THỤ TINH TRONG ỐNG NGHIỆM

Chuyên ngành: Sinh lý Động vật
Mã số: 604230

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC


NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:
PGS.TS. NGUYỄN TƯỜNG ANH




TP. HỒ CHÍ MINH - NĂM 2011
LỜI CẢM ƠN


Để thực hiện luận văn tốt nghiệp này, tôi đã nhận được nhiều quan tâm và
ủng hộ nhiệt tình từ nhiều người. Nhân đây tôi xin cảm ơn đến:

Ba, Mẹ đã sinh thành và nuôi dưỡng con, luôn là nguồn động viên, là điểm
tựa cho con trên mỗi bước đường. Anh Hai và em Duy cùng những người thân
trong gia đình đã luôn quan tâm, yêu thương và tạo điều kiện tốt nhất cho tôi trong
học tập và cuộc sống.
Thầy- PGS.TS. Nguyễn Tường Anh đã nhiệt tình hướng dẫn và động viên tôi
trong suốt quá trình thực hiện luận văn.
Các thầy cô trong khoa Sinh học-bộ môn Sau đại học, Đại học Khoa học Tự
nhiên Thành phố Hồ Chí Minh cùng các thầy cô thỉnh giảng khác đã giảng dạy,
cung cấp cho tôi những kiến thức mới và phương pháp học tập, nghiên cứu khoa
học.
Ban lãnh đạo Đơn vị hỗ trợ sinh sản Bệnh viện An Sinh thành phố Hồ Chí
Minh đã tạo điều kiện thuận lợi cho tôi thực hiện luận văn tại Đơn vị.
Các anh/chị và các bạn đồng nghiệp công tác tại Đơn vị hỗ trợ sinh sản,
bệnh viện An Sinh thành phố Hồ Chí Minh, đặc biệt là chị Thu Lan, đã tạo điều kiện
thuận lợi, giúp đỡ và động viên tôi trong quá trình công tác, học tập và thực hiện
luận văn.
Các anh/chị và các bạn trong tập thể lớp Sinh lý Động vật khóa 18 đã giúp
đỡ tôi trong suốt quá trình học tập.
Thành phố Hồ Chí Minh, tháng 11 năm 2011
Nguyễn Thị Phương Dung
-i-



DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT
Từ viết tắt
Thuật ngữ tiếng Anh
Dịch nghĩa tiếng Việt
BP
Brown particle

Th ht nâu
CLG
Centrally located granule
Ht thô tp trung  gia noãn
G
Gap
Khong gia
GRAN
Granularity
 ht
GV
Germinal vesicle
Túi mm
GVBD
Germinal Vesicle Breakdown
Tan bin túi mm
HCG
Human chorionic gonadotropin
m 

ICSI
Intracytoplasmic Sperm Injection


INC
Inclusion
Th vùi
IVF
In vitro fertilization


LH
Luteinizing Hormone
Hormon hoàng th hóa
M
Mitosis
Nguyên phân
MI
Metaphase I
K gia gim phân I
MII
Metaphase II
K gia gim phân II
PB
Polar body
Th cc
PVP
Polyvinyl Pyrrolidone

PVS
Perivitelline Space
Khong không quanh noãn
S
Synthesis
n tng hp
SER
Smooth Endoplasma Reticulum
Th i ni ch
VAC
Vacuole
Không bào

WHO
World Health Organization
T chc y t th gii
Z
Zygote

ZP
Zona Pellucida


MC LC
Trang
DANH MC T VIT TT i
DANH MC BNG ii
DANH MC HÌNH iii
M U 1
- TNG QUAN
1.1. S hình thành và phát trin ci in vivo 3
1.2. S ng thành ca noãn 4
1.3. Thin vitro fertilization) 7
1.3.1  7
1.3.2 K thu 7
1.3.3 t quin vitro 9
1.3.4 t qu phôi in vitro 12
 12
1.3.4.2 Tiêu chun phân ct 15
1.4.  16
1.4.1 Vai trò cng noãn 16
1.4.2 Các yu t ng noãn 16
ong -ZP) 17

-PVS) 18
1 20
 21
 23
- VT LI
2.1. Vt liu 29
ng nghiên cu 29
2.1.2 Dng c - Thit b - Hóa cht 30
2.1.2.1 Dng c 30
2.1.2.2 Thit b 32
2.1.2.3 Hóa cht 33
 33
n b tinh trùng (theo WHO2010) 35
 35
) 35
) 35
) 40
2.2.6 Kim tra kt qu th tinh () 40
2.2.7 Kim tra phôi và chn phôi chuyn () 41
2.2.8. Chuyn phôi 42
 lý s liu 42
- KT QU VÀ BIN LUN
3.1. ng ca hình thái màng trong sut n kt qu ICSI 43
3.2 ng ca hình thái th cc th nhn kt qu ICSI 46
3.3 ng cn kt qu ICSI 49
3.4 ng cn kt qu ICSI 51
 ht (granularity) và màu s 51
3.4.2 Th ht nâu (brown particle-BP) 54
3.4.3 Không bào (Vacuole) 56
i ni choth endoplasma reticulum-SER) 59

3.4.5 Th vùi (inclusion) 62
a chng chung ca noãn và kt qu ICSI 64
a chng chung ca noãn và kt qu thai 66
- KT LU NGH
4.1. KT LUN 69
 NGH 71
TÀI LIU THAM KHO 72
PH LC 77
-ii-



DANH MỤC BẢNG

Trang
Bảng. 2.1 Danh sách dng c ng và x lý tinh trùng 30
Bảng. 2.2 Danh sách dng c tìm và x lý noãn 31
Bảng. 2.3 Danh sách dng c s dng trong ICSI và thao tác trên phôi 31
Bảng. 2.4 Danh sách thit b s dng 32
Bảng. 2.5 ng s dng 33
Bảng. 2.6 Tiêu chun phân loi chng chung ca noãn 40
Bảng. 2.7 Tiêu chun phân loi chng phôi ngày 2 ti IVFAS 41
Bảng. 3.1 m các chu k u tr TTON trong nghiên cu 43
Bảng. 3.2. Kt qu ICSI gia các nhóm noãn theo phân loi hình thái ZP 44
Bảng. 3.3 Kt qu ICSI ca các nhóm noãn theo hình thái th cc th nht 46
Bảng. 3.4. Kt qu ICSI theo các nhóm hình thái khoang quanh noãn 49
Bảng. 3.5. Kt qu sau ICSI gia các nhóm phân loi noãn
 ht và màu s 52
Bảng. 3.6. Kt qu sau ICSI gim
th ht nâu trong  54

Bảng. 3.7. Kt qu sau ICSI gia các nhóm noãn dm không bào 56
Bảng. 3.8. Kt qu ICSI gii ni ch 59
Bảng. 3.9. Kt qu sau ICSI gim th vùi 62
Bảng. 3.10. Kt qu sau ICSI theo chng ca noãn 64
Bảng. 3.11 m chu k u tr theo kt qu thai 67


-iii-



DANH MỤC HÌNH
Trang
Hình.1.1 Quá trình phân chia gim phân to noãn 4
Hình.1.2 ng thành v nhân ca noãn 5
Hình.1.3 Quá trình th tinh t  TTON c n 8
Hình.1.4 K thu 9
Hình.1.5 Noãn th ng 9
Hình. 1.6 Phân loi hp t theo tiêu chun ca Scott và cng s 11
Hình.1.7 Hình thái ta hp t theo mô t ca Tesarik, Greco và Garello 12
Hình.1.8 n phát trin ca phôi in vitro theo thi gian 14
Hình.1.9 Cu trúc phôi nang 15
Hình.1.10  cc th nht 21
Hình. 1.11 V trí khác nhau ca thoi vô sc trong noãn 22
Hình.1.12 Noãn có th ht phân tán và t 23
Hình.1.13 Noãn có ht nâu trong t bào cht vi m khác nhau 25
Hình.1.14 S hin din ca th vùi  noãn 25
Hình.1.15 S hin din ca không bào  noãn 26
Hình.1.16 S hin din ca SER  noãn 27
Hình. 2.1  quy trình th tinh ng nghim ti IVFAS 34

Hình. 2.2 Tiêu chun phân loi hình thái ZP ca noãn (200X) 36
Hình. 2.3 Tiêu chun phân loi hình thái khoang quanh noãn (200X) 36
Hình. 2.4 Tiêu chun phân loi hình thái th cc th nht (200X) 37
Hình. 2.5 Tiêu chun phân loi hình thái th ht nâu
) 37
-iv-



Hình. 2.6 Tiêu chun phân lo m) 38
Hình. 2.7 Tiêu chun phân loi s xut hin th vùi  noãn (200X) 38
Hình. 2.8 Tiêu chun phân loi s xut hin th ni ch noãn (200X) 39
Hình. 2.9 Tiêu chun phân loi s xut hin không bào  noãn (200X) 39
Hình. 2.10 Chng phôi ngày 2 42
Hình. 3.1 T l phân loi hình thái ZP  noãn trong nghiên cu 44
Hình. 3.2 Kt qu sau ICSI gia các nhóm noãn theo hình thái ZP 45
Hình. 3.3 T l hình thái th cc th nht  noãn trong nghiên cu 47
Hình. 3.4 Kt qu sau ICSI gia các nhóm noãn theo hình thái th cc th nht 47
Hình. 3.5 Phân b t l hình thái PVS  noãn trong nghiên cu 50
Hình. 3.6 Kt qu sau ICSI gia các nhóm hình thái PVS ca noãn 50
Hình. 3.7 Phân b t l phân loi noãn v  ht và màu s52
Hình. 3.8 Kt qu sau ICSI gia các nhóm noãn da theo hình thái ht
và màu s 53
Hình. 3.9 Phân b t l hình thái th ht nâu  noãn trong nghiên cu 55
Hình. 3.10 Kt qu sau ICSI gim th ht nâu
 55
Hình. 3.11 Phân b t l hình thái không bào  noãn trong nghiên cu 57
Hình. 3.12 Kt qu sau ICSI gia các nhóm noãn dm không bào 57
Hình. 3.13 Phân b t l hình thái SER  noãn trong nghiên cu 60
Hình. 3.14 Kt qu sau ICSI gia các nhóm noãn da vào hình thái SER 60

Hình. 3.15 Phân b t l noãn xut hin th vùi 62
Hình. 3.16 Kt qu sau ICSI gim th vùi 63
Hình. 3.17 Phân b t l cht ng noãn trong nghiên cu 65
Hình. 3.18 Kt qu sau ICSI theo chng noãn 65



MỞ ĐẦU
-1- Mở đầu

Nguyễn Thị Phương Dung

MỞ ĐẦU
Th tinh trong ng nghi  n mnh m và rng rãi
trong hn hai thp k qua. Cùng vi tin trình phát trin, có nhiu phác  kích
thích bung trng hiu qu hn, ci thin t l th tinh cng nh k thut nuôi cy
phôi. Nh , bnh nhân có c nhiu phôi cht ng tt hn. Tuy nhiên, t l
làm t ca tng phôi n l vn còn thp nên bnh nhâng c chuyn nhiu
hn mt phôi trong các chu k th tinh ng nghim. Nhm nâng cao t l thai và
hn ch a thai thì cn gim s ng phôi chuyn mà vn m bo phôi chuyn có
kh nng làm t. Do , vic chn phôi tim n chuyn tr thành mt trong
nhng thách thc góp phn quan trng vào kt qu ca chu k th tinh trong ng
nghim.
n gn , ti hu ht các trung tâm th tinh trong ng nghim thì
vic chn phôi chuyn vn da trên yu t hình thái phôi vào ngày chuyn phôi.
Tuy nhiên, có nhiu nghiên cu  m rng phm vi  giá nhm chn phôi có
cht ng tt hn. Các nghiên cu tp trung vào vic tìm mi tng quan gia cht
ng phôi và hình thái hp t cng nh noãn, kt qu là vn còn nhiu tranh cãi.
Riêng ti Vit Nam, nghiên cu v hình thái noãn, hp t và mi liên h ca chúng
vi cht ng phôi trong các chu k h tr sinh sn vn còn hn ch. Trên c s

, chúng tôi tin hàn tài nghiên cu “KHẢO SÁT MỐI LIÊN HỆ GIỮA
MỘT SỐ ĐẶC ĐIỂM HÌNH THÁI NOÃN VÀ KẾT QUẢ THỤ TINH
TRONG ỐNG NGHIỆM”
-2- Mở đầu

Nguyễn Thị Phương Dung

 MỤC TIÊU ĐỀ TÀI
X   ng ca  m hình thái th cc, khoang quanh noãn,
màng trong sut và các yu t trong t bào cht n kt qu iu tr th tinh trong
ng nghim.
 NỘI DUNG NGHIÊN CỨU
Khng ca các yu t n:
 T l th tinh.
 T l to hp t tt.
 T l phân chia to phôi.
 T l to phôi tt.
 Kt qu thai sau chuyn phôi ti.
Chúng tôi hy vng kt qu ca nghiên cu này s cung cp d liu cho vic
chn phôi chuyn trong các chu k th tinh ng nghim hiu qu hn.

Chương 1

TỔNG QUAN
TÀI LIỆU

- 3- Tổng quan tài liệu
Nguyễn Thị Phương Dung

1.1. S hình thành và phát trin ca noãn i in vivo

Sự phát triển của noãn bao gồm sự hình thành, lớn lên và trưởng thành của noãn.
Quá trình này bắt đầu từ khoảng tuần thứ tư của thai và chấm dứt vào tuổi mãn kinh
của phụ nữ, có 4 giai đoạn:
 Nguồn gốc ngoài cơ quan sinh dục của tế bào mầm nguyên thủy và sự di
chuyển của các tế bào mầm vào cơ quan sinh dục.
 Sự gia tăng số lượng các tế bào mầm bằng nguyên phân.
 Sự giảm vật chất di truyền bằng giảm phân.
 Sự trưởng thành về cấu trúc và chức năng của noãn.
Ở người, các tế bào mầm nguyên thủy được định hình vào tuần thứ 4 của bào
thai trong túi noãn hoàng. Từ tuần thứ 4 đến 6, các tế bào mầm nguyên thủy di
chuyển vào gờ sinh dục, nơi hình thành cơ quan sinh dục sau này. Trên đường di
chuyển, các tế bào mầm tiếp tục phân chia nguyên nhiễm để gia tăng nhanh về số
lượng. Các tế bào mầm đang phân chia nguyên nhiễm tại cơ quan sinh dục được
gọi là noãn nguyên bào (oogonium). Các noãn nguyên bào chứa 2n nhiễm sắc thể.
Quá trình phân chia nguyên nhiễm của noãn nguyên bào kéo dài từ tháng thứ 2 đến
tháng thứ 5 của phôi thai. Trong thời gian này, số lượng tế bào mầm tăng lên đến 7
triệu, sau đó số lượng này giảm một cách nhanh chóng đến còn 2 triệu lúc sinh do
quá trình thoái hóa của các noãn nguyên bào và sự chấm dứt phân chia gián phân
của các tế bào mầm [2].
Vào tháng thứ 3 đến tháng thứ 5 của phôi thai, quá trình phân bào giảm
nhiễm đã bắt đầu để tạo ra các noãn có n nhiễm sắc thể (NST) để khi kết hợp với
tinh trùng sẽ hình thành hợp tử chứa 2n nhiễm sắc thể. Quá trình giảm phân tế bào
mầm diễn ra không liên tục, bao gồm hai pha: giảm phân I và giảm phân II. Có 2
giai đoạn tạm dừng (block) xảy ra trong quá trình giảm phân của tế bào mầm: lần
thứ nhất khi tế bào mầm bước vào kỳ trước (prophase) của giảm phân I, tế bào
mầm lúc này được gọi là noãn sơ cấp ở giai đoạn túi mầm (germinal vesicle-GV).
- 4- Tổng quan tài liệu
Nguyễn Thị Phương Dung

Đến khi sinh, buồng trứng của bé gái chỉ chứa các noãn phát triển ở giai đoạn GV.

Các noãn chỉ vượt qua được giai đoạn này khi có sự xuất hiện của đỉnh LH
(Luteinizing Hormone), bắt đầu vào tuổi dậy thì. Tuy nhiên, chỉ vài giờ sau đỉnh
LH, noãn bước vào lần tạm dừng thứ hai khi ở kỳ giữa (metaphase) của giảm phân
II (MII). Noãn trưởng thành và phóng noãn ở giai đoạn MII. Noãn chỉ vượt qua
được giai đoạn MII khi có sự xâm nhập của tinh trùng và tiếp tục phát triển thành
hợp tử [2].

Hình.1.1. Quá trình phân chia giảm phân tạo noãn
Nguồn: Sardul S. Guraya, 2008
1.2. S ng thành ca noãn
Khi có sự xuất hiện của đỉnh LH, noãn ở giai đoạn túi mầm hiện diện trong
nang trước phóng noãn sẽ trải qua quá trình trưởng thành về nhân và tế bào chất.
- 5- Tổng quan tài liệu
Nguyễn Thị Phương Dung

ng thành v nhân
Trưởng thành về nhân là những thay đổi về nhân, xảy ra trong suốt quá trình
giảm phân tái diễn (resumption of meiosis) của noãn để tạo nên giao tử chứa bộ
nhiễm sắc thể đơn bội. Noãn bị tạm dừng phát triển ở kỳ trước I (prophase I), có sự
hiện diện của túi mầm (Germinal Vesicle – GV), sẽ bắt đầu chuyển sang giai đoạn
tiêu biến túi mầm (Germinal Vesicle Break Down- GVBD) sau đỉnh LH. Trong giai
đoạn GVBD, màng nhân biến mất, sợi nhiễm sắc thể nén chặt, các cặp nhiễm sắc
thể tương đồng sắp xếp trên mặt phẳng thoi vô sắc ở kỳ giữa của giảm phân I
(metaphase I - MI). Trong suốt kỳ sau (anaphase) và kỳ cuối (telophase) của giảm
phân I, các cặp nhiễm sắc thể tương đồng phân chia đồng đều và noãn dừng lại ở kỳ
giữa II (metaphase II - MII), có sự xuất hiện của thể cực thứ nhất (first polar body-
PB1). Quá trình giảm phân của noãn hoàn tất khi xảy ra hiện tượng thụ tinh, có sự
xuất hiện của thể cực thứ hai (second polar body-PB2). Ở người, noãn GV qua giai
đoạn GVBD khoảng 15 giờ sau đỉnh LH, MI khoảng 20 giờ sau đỉnh LH và MII
khoảng 35 giờ sau đỉnh LH. Do đó, ở người sự phóng noãn xảy ra trong vòng 34-38

giờ sau đỉnh LH [2].

Hình.1.2. Các giai đoạn trưởng thành về nhân của noãn
A. Noãn chưa trưởng thành, ở giai đoạn túi mầm (noãn GV)
B. Noãn ở giai đoạn túi mầm tan biến (noãn GVBD)
C. Noãn ở kỳ giữa II (noãn MII)
g: germinal vesicle (túi mầm); p: perivitelline space (khoảng không quanh noãn); z:
zona pellucida (màng trong suốt); f: first polar body (thể cực thứ nhất)
(Nguồn Veeck LL. An atlas human gametes and conceptuces.
New York: Partheno Publishing, 1999.)
- 6- Tổng quan tài liệu
Nguyễn Thị Phương Dung

S tng thành v t bào cht
Quá trình trưởng thành về tế bào chất diễn ra ngay sau đỉnh LH, đồng thời với
sự trưởng thành về nhân. Tuy nhiên, sự biểu hiện về mặt hình thái trong quá trình
trưởng thành về tế bào chất không rõ nét như quá trình trưởng thành về nhân.
Trong quá trình này, tế bào chất có nhiều biến đổi cần thiết để chuẩn bị cho quá
trình thụ tinh và phát triển phôi về sau.
Về siêu cấu trúc, trong tế bào chất diễn ra sự sắp xếp các bào quan cùng với sự
di chuyển của hệ thống lưới nội chất, ty thể, thể hạt vỏ hướng ra vùng vỏ noãn. Bộ
máy Golgi biến mất nên khả năng tổng hợp protein mới ở noãn trưởng thành giảm
đáng kể. Đồng thời, sợi nhiễm sắc thể cũng di chuyển về vùng thể hạt vỏ, noãn trở
nên bất đối xứng. Bộ khung tế bào (cytoskeleton) bị biến đổi, vỏ actin của sợi thoi
vô sắc của noãn ở giai đoạn MII dày hơn. Vi sợi trên màng tế bào chất cũng tiêu
giảm, hạn chế khả năng tinh trùng đi vào vùng thoi vô sắc để cản trở quá trình giảm
phân bình thường [26].
Về mặt phân tử, quá trình trưởng thành về tế bào chất còn là sự tích lũy ARN
thông tin, cần thiết để dịch mã, tổng hợp protein. Ví dụ như tích lũy các ARN thông
tin mã hóa protein đóng vai trò là yếu tố nội mô (tissue plasminogen factor), Mos và

thụ thể inositol triphosphate loại I (IP3R-I). Mos hoạt hóa các protein trong chu
trình tế bào, cần thiết trong quá trình trưởng thành về nhân. Nghiên cứu gần đây
chứng minh rằng ở noãn chuột trưởng thành tăng protein IP3R-I, có vai trò quan
trọng trong hoạt hóa noãn, biểu hiện các kênh Ca
2+
[26].
Cơ chế phân tử của việc tích lũy các ARN thông tin là sự gắn kết phân tử
adenyl trong tế bào chất vào vùng trình tự không mã hóa ở đầu 3’ của ARN thông
tin. Quá trình này giúp ARN thông tin liên kết với chuỗi ribosome để dịch mã và
tăng mức biến đổi sau dịch mã của các protein ở tế bào chất diễn ra trong suốt quá
trình trưởng thành của noãn. Chẳng hạn như các vi ống trải qua nhiều thay đổi về
acetyl hóa trong quá trình noãn chuyển từ trạng thái MI sang MII. Ngoài ra, sự
phosphoryl hóa và dephosphoryl hóa các protein trong tế bào chất giữ vai trò điều
- 7- Tổng quan tài liệu
Nguyễn Thị Phương Dung

hòa chu trình tế bào cũng rất cần thiết để hoàn tất quá trình trưởng thành về tế bào
chất [26].
1.3. Thin vitro fertilization)
Thụ tinh trong ống nghiệm là quá trình cho noãn và tinh trùng kết hợp với nhau
ngoài cơ thể để tạo thành hợp tử và phát triển thành phôi. Phôi được nuôi cấy trong
điều kiện phòng thí nghiệm từ 2 đến 5 ngày rồi chuyển vào tử cung của người phụ
nữ. Tỷ lệ thành công trung bình của kỹ thuật này thay đổi từ 30-40% [3] .
1.3.1 
Vào ngày 25/7/1978, Louise Brown là em bé đầu tiên ra đời nhờ kỹ thuật thụ
tinh trong ống trên người. Hai bác sỹ phụ khoa Patrick Steptoe và Robert Edwards
đã thực hiện thành công trường hợp đầu tiên này. Sau đó, đến năm 1992 báo cáo
đầu tiên về trường hợp có thai từ thụ tinh trong ống nghiệm bằng kỹ thuật tiêm tinh
trùng vào bào tương noãn (ICSI- intracytoplasmic sperm injection) (Palermo và
cộng sự, 1992). Từ đó, ICSI đã thực sự tạo nên một cuộc cách mạng trong điều trị

vô sinh. Cho đến nay, đã có trên 3 triệu trẻ em ra đời từ kỹ thuật thụ tinh trong ống
nghiệm trên toàn thế giới. Theo ước tính, 1% số trẻ em ra đời ở châu Âu nhờ kỹ
thuật thụ tinh trong ống nghiệm [13].
Riêng tại Việt Nam, thụ tinh trong ống nghiệm được thực hiện đầu tiên vào
năm 1997 tại bệnh viện Từ Dũ. Sau đó, 3 em bé đầu tiên đã chào đời vào năm 1998.
Cho đến nay, đã có gần 10 nghìn em bé được ra đời từ thụ tinh trong ống nghiệm tại
Việt Nam [3].
1.3.2. K thut t
Có hai kỹ thuật cơ bản trong thụ tinh trong ống nghiệm hiện nay là IVF cổ
điển và ICSI. IVF cổ điển là kỹ thuật được giáo sư Robert Edwards và cộng sự thực
hiện thành công đầu tiên khi thụ tinh ống nghiệm, em bé ra đời vào năm 1978.
- 8- Tổng quan tài liệu
Nguyễn Thị Phương Dung

Trong kỹ thuật này, tinh trùng tốt được chọn lọc để tiếp xúc với noãn trong môi
trường nuôi cấy, quá trình thụ tinh diễn ra tương tự như trong cơ thể.
A
B
Hình.1.3. Quá trình thụ tinh tự nhiên trong cơ thể (A) và thụ tinh trong ống
nghiệm cổ điển (B)
Kỹ thuật ICSI thành công đầu tiên trên người vào năm 1992 đã tạo nên tiến
bộ vượt bậc của lĩnh vực thụ tinh trong ống nghiệm (TTTON). Với sự hỗ trợ của hệ
thống vi thao tác, một tinh trùng được chọn, được tiêm vào bào tương noãn. Kỹ
thuật này vượt qua trở ngại về khả năng tinh trùng xâm nhập và thụ tinh với noãn,
- 9- Tổng quan tài liệu
Nguyễn Thị Phương Dung

chỉ cần một tinh trùng sống có bộ nhân nguyên vẹn được tiêm vào noãn là đã có khả
năng thụ tinh. Chính vì vậy, ICSI có thể được sử dụng cho hầu hết các trường hợp
điều trị vô sinh do vợ, do chồng hoặc chưa rõ nguyên nhân. Nhờ tính ưu việt này mà

ngày nay ICSI được áp dụng trong hầu hết các trường hợp thụ tinh trong ống
nghiệm.






Hình. 1.4. Kỹ thuật tiêm tinh trùng vào bào tương noãn (ICSI)
Nguồn: ART Cosulting
1.3.3. kt qu in vitro
Việc đánh giá kết quả thụ tinh thường được tiến hành vào thời điểm 16 đến 18
giờ sau IVF hoặc ICSI. Kết quả thụ tinh cung cấp thông tin về tình trạng thụ tinh
của noãn cũng như chất lượng của hợp tử hình thành, cơ sở cho việc chọn phôi tốt
để chuyển vào tử cung. Noãn được thụ tinh bình thường có 2 nhân nguyên và 2 thể
cực vào thời điểm kiểm tra. Vì vậy, việc đánh giá kết quả thụ tinh thường căn cứ
vào các yếu tố về nhân nguyên và thể cực [10]

Hình.1.5. Noãn thụ tinh bình thường sau ICSI
Nguồn:
- 10- Tổng quan tài liệu
Nguyễn Thị Phương Dung

Vào năm 1990, Van Blerkom là người đầu tiên phát hiện mối tương quan giữa
sự cân xứng về vị trí, kích thước các nhân nguyên cũng như số lượng và vị trí phân
bố của các tiểu hạch (nucleoli) với tỷ lệ mang thai. Sau đó, trong hai nghiên cứu độc
lập của các tác giả Terasik và Greco (1999); Scott và cộng sự (2000) đã tập trung
phân tích sự phân bố của tiểu hạch trong nhân nguyên ở các hợp tử tao nên phôi
được chuyển trong các chu kỳ có thai và không có thai. Kết quả cho thấy ở 100%
các phôi làm tổ đều có đặc điểm là số lượng tiểu hạch ở hai nhân nguyên không

khác biệt quá 3 và tiểu hạch phân bố cân xứng ở hai nhân nguyên. Đồng thời, chu
kỳ có chuyển ít nhất một phôi có đặc điểm như trên thì tỷ lệ thai đạt 50% (22/44) so
với kết quả 9% (2/23) ở các chu kỳ chuyển phôi hoàn toàn không có đặc điểm tốt
như đã đề cập [10]. Từ đó, có nhiều nỗ lực trong chuẩn hoá các chỉ tiêu đánh giá
phôi giai đoạn nhân nguyên. Trong đó, tiêu chuẩn do Scott và cộng sự (2000) đề
xuất được áp dụng rộng rãi nhất. Đã có nhiều báo cáo chứng tỏ tính hữu ích của tiêu
chuẩn này trong việc chọn phôi có chất lượng tốt, tỷ lệ làm tổ cao sau chuyển phôi
(Magdalana và cs., 2007) [21]. Nhìn chung, các tiêu chuẩn đánh giá nhân nguyên
dựa trên các thông số sau:
 Kích thước và sự cân xứng của nhân nguyên.
 Số lượng, kích thước, sự cân xứng và vị trí của của các tiểu hạch trong nhân
nguyên.
Scott và cộng sự đã phân loại hợp tử thành 4 nhóm dựa trên hình thái nhân
nguyên tương ứng với chất lượng của chúng như sau:
 Z1 – Kích thước hai nhân nguyên bằng nhau. Số lượng, kích thước các tiểu
hạch bằng nhau ở hai nhân nguyên. Các tiểu hạch xếp thẳng hàng tại vị trí
tiếp giáp giữa hai nhân nguyên. Số lượng các tiểu hạch trong mỗi nhân
nguyên dao động trong khoảng từ 3 đến 7.
 Z2 - Kích thước hai nhân nguyên bằng nhau. Số lượng, kích thước các tiểu
hạch bằng nhau ở hai nhân nguyên. Các tiểu hạch phân bố rải rác ở cả hai
- 11- Tổng quan tài liệu
Nguyễn Thị Phương Dung

nhân nguyên. Số lượng các tiểu hạch ở mỗi nhân nguyên dao động trong
khoảng từ 3 đến 7.
 Z3 - Kích thước hai nhân nguyên bằng nhau. Số lượng và kích thước các tiểu
hạch bằng nhau nhưng các tiểu hạch ở một trong hai nhân nguyên sắp xếp tại
vùng tiếp giáp hai nhân nguyên còn ở nhân nguyên còn lại thì tiểu hạch phân
bố rải rác. Hoặc các tiểu hạch trong hai nhân nguyên không cân bằng nhau
về số lượng và kích thước. Số lượng các tiểu hạch ở mỗi nhân nguyên dao

động trong khoảng từ 3 đến 7.
 Z4 – Kích thước các nhân nguyên không bằng nhau hoặc các nhân nguyên
phân tán, không tiếp xúc với nhau.


Hình. 1.6. Phân loại hợp tử theo tiêu chuẩn của Scott và cộng sự, 2000
(A: Z1; B: Z2; C: Z3; D: Z4)
Nguồn: M. Depa-Martynów và cộng sự (2007)
Bên cạnh đó, số lượng, vị trí và hình thái của thể cực cũng là vấn đề đáng
quan tâm vào thời điểm đánh giá kết quả thụ tinh. Hợp tử bình thường có hai thể
cực tròn, đều và không phân mảnh. Bởi vì noãn bị phân cực, vị trí đúng của thể cực
thứ hai nằm trên trục của hai nhân nguyên. Đồng thời, sự tái phân bố các bào quan
ảnh hưởng đến sự phân chia của hợp tử về sau. Các thể hạt và vòng sáng quanh
nhân nguyên là dấu hiệu của sự phân cực trong hợp tử. Bất thường về vị trí các nhân
nguyên và thể cực gây ảnh hưởng đến sự phân chia của phôi, thường tạo phôi bào
không đều hoặc quá trình phân chia phôi bào chậm [10].
- 12- Tổng quan tài liệu
Nguyễn Thị Phương Dung

1.3.4. t qu phôi in vitro
Việc đánh giá phôi nhằm lựa chọn phôi tốt, có tiềm năng phát triển và làm tổ
cao. Đây là mục tiêu quan trọng trong các chu kỳ điều trị bằng thụ tinh trong ống
nghiệm. Đặc biệt, việc giảm số lượng phôi chuyển, thậm chí một phôi, trong một
chu kỳ nhằm giảm đa thai đang trở thành xu hướng thì việc chọn phôi tốt càng có ý
nghĩa hơn. Nhằm chọn được phôi tốt để chuyển, các chuyên viên phôi học cần dựa
trên các tiêu chuẩn đánh giá chất lượng phôi qua các giai đoạn phát triển của phôi
trước làm tổ.
1.3.4.1 
Sau khi thụ tinh, hợp tử bắt đầu quá trình phân chia để tạo các tế bào nhỏ gọi
là phôi bào. Sự phát triển phôi in vitro diễn ra qua các giai đoạn tương tự in vivo.

Tuy nhiên, sự phân chia của phôi in vitro chậm hơn in vivo. Quá trình phát triển của
phôi giai đoạn trước làm tổ diễn ra tuần tự, qua giai đoạn phôi phân cắt (cleaving
embryo) và phôi nang (blastocyst embryo).
n phôi phân ct
Sự phân cắt của phôi thực chất là quá trình nguyên phân liên tiếp của hợp tử
để tạo nhiều phôi bào (blastomere). Trong quá trình phân chia, kích thước phôi bào

(i) Số hạch nhân trong cả hai nhân
nguyên không không khác biệt quá 3
(ii) Các hạch nhân luôn phân cực hoặc
không phân cực ở cả hai nhân nguyên
nhưng không bao giờ phân cực ở một
nhân nguyên này và không ở nhân
nguyên còn lại
(iii) Góc ß tạo giữa trục hai nhân
nguyên và thể cực thứ hai phải nhỏ hơn
50°
Hình.1.7. Hình thái tối ưu của hợp tử có khả năng sống cao theo mô tả của
Tesarik và Greco (1999), Garello và cs. (1999), Scott và Smith (1998)
- 13- Tổng quan tài liệu
Nguyễn Thị Phương Dung

giảm nhưng kích thước của phôi không đổi. Khối phôi bào mới tạo thành có kích
thước bằng với hợp tử ban đầu và được màng trong suốt bao bọc. Trong giai đoạn
này, chu trình tế bào chỉ có pha S và M mà hầu như không có pha G1 và G2.
Sau khi noãn được thụ tinh khoảng 16 giờ sẽ xuất hiện 2 nhân nguyên, ở một
số bệnh nhân có thể xuất hiện sớm 12- 14 giờ hoặc muộn hơn 20- 22 giờ. Mỗi nhân
nguyên chứa bộ NST đơn bội, 1 của bố và 1 của mẹ. Sau đó, hai nhân nguyên hòa
hợp, hợp tử bắt đầu tiến trình phân cắt đầu tiên tạo phôi 2 tế bào. Trong lần phân cắt
đầu tiên, hợp tử sử dụng trung thể của tinh trùng nhân đôi và tạo thoi vô sắc, nhiễm

sắc thể kép tách nhau ở tâm động và phân ly về hai cực, hợp tử phân cắt hình thành
hai nguyên bào phôi có kích thước tương đương nhau.
Các lần phân cắt tiếp theo thường không đồng thời và không cân đối. Do đó,
trong thực tế ta có thể thấy phôi có số phôi bào lẻ và các phôi bào có thể có kích
thước không đồng đều nhau. Ở giai đoạn này, ta có thể đã nhìn thấy các biểu hiện
của phôi kém chất lượng như phân mảnh tế bào chất (fragmentation), phôi bào đa
nhân (multinucleation). Thời gian trung bình cho một lần phân chia của phôi bào là
24 giờ, tương ứng với khoảng cách giữa các lần đánh giá phôi trong quá trình nuôi
cấy in vitro. Tiến trình phát triển phôi in vitro qua các giai đoạn theo thời gian (time
line) thể hiện ở Hình. 1.8.
Khi phôi đạt đến 32 tế bào, phôi giống như quả dâu nên được gọi là phôi dâu
(morula). Phôi dâu có kích thước bằng hợp tử ban đầu. Các phôi bào bắt đầu phân
tách trong giai đoạn phôi dâu tạo thành các nguyên bào phôi (embryoblast) và các
nguyên bào nuôi (trophoblast). Các phôi bào có hướng phát triển khác nhau sẽ được
phân tách dần trong suốt quá trình phân cắt của phôi dâu. Trong quá trình này có sự
tái sắp xếp của các tế bào lớp ngoài và lớp trong, kết quả dẫn đến sự hình thành
khối tế bào ở trung tâm của phôi, sau này sẽ trở thành mầm phôi, và lớp tế bào ở
phía ngoài là nguồn gốc của lá nuôi phôi nên được gọi là nguyên bào nuôi.

- 14- Tổng quan tài liệu
Nguyễn Thị Phương Dung

Giai n phôi nang (blastocyst)
Phôi nang hình thành vào khoảng ngày thứ 5- 6 sau thụ tinh. Lúc này phôi có
khoảng 60 tế bào. Đầu tiên, ở giữa khối tế bào phôi dâu xuất hiện khoang chứa dịch.
Dịch do bơm Na
+
/K
+
- ATP hoạt động, bơm Na

+
từ trong khối nguyên bào phôi ra
khoảng gian bào, làm tăng áp lực thủy tĩnh ở khoảng gian bào, kéo nước ra gian
bào, hình thành khối dịch giữa khối tế bào lớp trong. Khoang chứa dịch tăng nhanh
về thể tích hình thành một khoang rộng trong phôi gọi là khoang phôi nang
(blastocyst cavity). Cuối giai đoạn này, khoang phôi nang chiếm gần hết thể tích
phôi. Phôi lúc này được gọi là phôi nang (blastocyst) [10].

Hình.1.8. Các giai đoạn phát triển của phôi in vitro theo thời gian
Theo Veeck và Zaninovic, 2003
- 15- Tổng quan tài liệu
Nguyễn Thị Phương Dung


Hình.1.9. Cấu trúc phôi nang
Khối tế bào lớp ngoài biến đổi cấu trúc thành lớp biểu mô đơn bao bọc bên
ngoài, phân biệt và tách ra khỏi đám tế bào lớp trong. Đây là nguồn gốc của lá nuôi
phôi. Khối tế bào lớp trong tập trung thành một khối đặc, phân bố lệch về một phía
của khoang phôi tạo mầm phôi (inner cell mass). Mỗi tế bào lớp trong được gọi là
nguyên bào phôi (embryoblast), sau này biệt hoá thành các mô, cơ quan cấu trúc cơ
thể. Sự tăng dần thể tích của khoang phôi nang làm màng ZP mỏng lại. Tới ngày
thứ 7, 8 phôi nang thoát màng sẵn sàng làm tổ trong nội mạc tử cung. Những phôi
không thể thoát màng sẽ thoái hóa.
1.3.4.2. Tiêu chu  n phân ct
Hầu hết các trung tâm hỗ trợ sinh sản thường tiến hành chuyển phôi vào giai
đoạn phôi phân cắt (ngày 2 hoặc ngày 3) để hạn chế nguy cơ ngưng phát triển của
phôi do nuôi cấy dài ngày. Hiện tại, có nhiều hệ thống đánh giá chất lượng phôi giai
đoạn phân cắt. Tuy nhiên, nguyên tắc chung để đánh giá chất lượng phôi phân cắt là
dựa trên tốc độ phân chia của phôi, độ đồng đều của các phôi bào và độ phân mảnh
tế bào chất. Phôi tốt là phôi có tốc độ phân chia phù hợp, phôi bào đồng đều, có ít

hoặc không phân mảnh. Cụ thể, các phôi tốt có 4 đến 6 phôi bào vào ngày 2 và ít
nhất 7 phôi bào vào ngày 3 sau thụ tinh, các phôi bào đều, đơn nhân, độ phân mảnh
không quá 10% thể tích phôi. Do đó, phôi thường được đánh giá vào thời điểm 42-
44 giờ (ngày 2) hoặc 66-68 giờ (ngày 3) sau ICSI. Phôi được phân loại thành các
nhóm dựa trên các thông số về hình thái (số phôi bào, độ đồng đều giữa các phôi
bào, độ phân mảnh của tế bào chất) vào thời điểm đánh giá [32].