xây dưng quy trình phân loại nấm candida

XÂY DƯNG QUY TRÌNH PHÂN LOẠI NẤM CANDIDA
XÂY DƯNG QUY TRÌNH PHÂN LOẠI NẤM CANDIDA
I. Đặt vấn đề
I. Đặt vấn đề
Từ thời Hypocrate và Galen đã đề cập trong y văn thế giới. Frank (1792)
Từ thời Hypocrate và Galen đã đề cập trong y văn thế giới. Frank (1792)


mô tả lâm sàng bệnh. Wilkinson (1894) căn nguyên do nấm. Lodder và Kreger-
mô tả lâm sàng bệnh. Wilkinson (1894) căn nguyên do nấm. Lodder và Kreger-
van-Rij (1952) phân loại 164 loài nấm men. Năm 1984 Kreger-van-Rij 196
van-Rij (1952) phân loại 164 loài nấm men. Năm 1984 Kreger-van-Rij 196


loài.Thế giới đã sử dụng nhiều kỹ thuật trong định loại nấm men, tính đến nay
loài.Thế giới đã sử dụng nhiều kỹ thuật trong định loại nấm men, tính đến nay


phân lập hơn 300
phân lập hơn 300


loài nấm
loài nấm
Candida.
Candida.
Điều đó chứng tỏ tỷ lệ nhiễm nấm ngày
Điều đó chứng tỏ tỷ lệ nhiễm nấm ngày


càng cao. Đặc biệt trước sự gia tăng của các bệnh suy giảm miễn dịch, trong đó

càng cao. Đặc biệt trước sự gia tăng của các bệnh suy giảm miễn dịch, trong đó


có đại dịch HIV/AIDS và nhiều nguyên nhân khác như: thuốc ức chế miễn dịch,
có đại dịch HIV/AIDS và nhiều nguyên nhân khác như: thuốc ức chế miễn dịch,


dùng corticoid kéo dài, thừa cân béo phì…
dùng corticoid kéo dài, thừa cân béo phì…
Hơn nữa, Việt Nam nằm trong vùng khí hậu nhiệt đới, có nhiệt độ và độ
Hơn nữa, Việt Nam nằm trong vùng khí hậu nhiệt đới, có nhiệt độ và độ


ẩm cao là điều kiện thuận lợi cho vi nấm phát triển, lan truyền và dễ dàng gây
ẩm cao là điều kiện thuận lợi cho vi nấm phát triển, lan truyền và dễ dàng gây


bệnh ở người.
bệnh ở người.
Tại phòng xét nghiệm Nấm Bệnh viện Da liễu TW năm 2010 số lượt bệnh
Tại phòng xét nghiệm Nấm Bệnh viện Da liễu TW năm 2010 số lượt bệnh


nhân đến xét nghiệm nấm khoảng 25.000.000 lượt, trong đó số ca xét nghiệm
nhân đến xét nghiệm nấm khoảng 25.000.000 lượt, trong đó số ca xét nghiệm


dương tính là 11.900.000. Tỷ lệ nhiễm nấm do chủng
dương tính là 11.900.000. Tỷ lệ nhiễm nấm do chủng
Candida

Candida
gây ra chiếm gần
gây ra chiếm gần


1/3. Đến năm 2011 số lượng bệnh nhân đã tăng lên gấp đôi.
1/3. Đến năm 2011 số lượng bệnh nhân đã tăng lên gấp đôi.
Điều đó cho thấy xét nghiệm tìm nấm có vai trò quan trọng trong việc phục
Điều đó cho thấy xét nghiệm tìm nấm có vai trò quan trọng trong việc phục


vụ bệnh nhân cũng như giúp các bác sỹ lâm sàng chẩn đoán và điều trị hiệu quả
vụ bệnh nhân cũng như giúp các bác sỹ lâm sàng chẩn đoán và điều trị hiệu quả


hơn.
hơn.
Qua từng giai đoạn phát triển kinh tế - xã hội và khoa học kỹ thuật, những
Qua từng giai đoạn phát triển kinh tế - xã hội và khoa học kỹ thuật, những


người làm công tác xét nghiệm luôn có nhiều cải tiến về kỹ thuật xét nghiệm
người làm công tác xét nghiệm luôn có nhiều cải tiến về kỹ thuật xét nghiệm


sao cho phù hợp với từng thời kỳ.
sao cho phù hợp với từng thời kỳ.
Năm 1972 Việt Nam đã áp dụng một số kỹ thuật xác định hình thái và tính
Năm 1972 Việt Nam đã áp dụng một số kỹ thuật xác định hình thái và tính

chất hoá sinh vi nấm như:
chất hoá sinh vi nấm như:
•
•
Khả năng đồng hoá 6 loại đường và lên men đường trong 4 ống pepton
Khả năng đồng hoá 6 loại đường và lên men đường trong 4 ống pepton


lỏng có Brom crezol và ống Durham…
lỏng có Brom crezol và ống Durham…
•
•


Sau đó, năm 1995 đã xuất hiện test mới: Candiselect-4, Lên men đường
Sau đó, năm 1995 đã xuất hiện test mới: Candiselect-4, Lên men đường


test Auxacolor (Bio-rad), API 20…
test Auxacolor (Bio-rad), API 20…
•
•
Gần đây có máy định danh Vitex
Gần đây có máy định danh Vitex
•
•
Năm 2010, BV Nhiệt đới Quốc Gia đã thực hiện: “ Cải tiến quy trình
Năm 2010, BV Nhiệt đới Quốc Gia đã thực hiện: “ Cải tiến quy trình

chẩn đoán nấm
chẩn đoán nấm
Candida
Candida
từ bệnh phẩm bằng bộ tranh mẫu”.(
từ bệnh phẩm bằng bộ tranh mẫu”.(
phụ lục
phụ lục
)
)
→
→
Nhược điểm:
Nhược điểm:
•
•
Nếu định danh bằng máy Vitek
Nếu định danh bằng máy Vitek
→
→
Phụ thuộc vào sự hoạt động của máy
Phụ thuộc vào sự hoạt động của máy


định danh và không phải đơn vị nào cũng có máy định danh. Nhất là các tuyến y
định danh và không phải đơn vị nào cũng có máy định danh. Nhất là các tuyến y


tế cơ sở.

tế cơ sở.
•
•
Nhiều máy chỉ cài đặt một số chủng thường gặp. Mà trên thực tế bệnh
Nhiều máy chỉ cài đặt một số chủng thường gặp. Mà trên thực tế bệnh


nấm chiếm tỷ lệ cao và các chủng nấm gây bệnh ngày càng đa dạng và phức
nấm chiếm tỷ lệ cao và các chủng nấm gây bệnh ngày càng đa dạng và phức


tạp.
tạp.
•
•
Bộ tranh mẫu chỉ chẩn đoán sơ bộ 4-5 chủng nấm
Bộ tranh mẫu chỉ chẩn đoán sơ bộ 4-5 chủng nấm
Candida
Candida
, mà mỗi
, mà mỗi


chủng có 5 ảnh nhưng thực tế chỉ có 2-3 ảnh nêu ra sự khác biệt giữa các loài
chủng có 5 ảnh nhưng thực tế chỉ có 2-3 ảnh nêu ra sự khác biệt giữa các loài


Candida
Candida
về hình thái vi thể. Tuy nhiên, s

về hình thái vi thể. Tuy nhiên, sự
minh chứng đó chưa đủ để định loại
minh chứng đó chưa đủ để định loại


chính xác tên loài Candida gây bệnh.
chính xác tên loài Candida gây bệnh.
•
•


Đặc biệt rất khó hoặc không thể định loại được trong trường hợp mẫu
Đặc biệt rất khó hoặc không thể định loại được trong trường hợp mẫu


bệnh phẩm:
bệnh phẩm:
+ Đồng nhiễm nhiều chủng nấm,
+ Đồng nhiễm nhiều chủng nấm,
+ Nghi nhiễm nấm huyết
+ Nghi nhiễm nấm huyết
+ Mẫu bệnh phẩm không vô khuẩn: Đờm, phân v.v…
+ Mẫu bệnh phẩm không vô khuẩn: Đờm, phân v.v…
•
•


Làm cho người thực hiện thụ động vì lệ thuộc hoàn toàn vào các bức hình
Làm cho người thực hiện thụ động vì lệ thuộc hoàn toàn vào các bức hình

trong bộ tranh mẫu. Đặc biệt họ sẽ rất lúng túng khi gặp chủng nấm cần định
trong bộ tranh mẫu. Đặc biệt họ sẽ rất lúng túng khi gặp chủng nấm cần định


loại mà không có trong bộ tranh mẫu ( Bộ tranh chỉ đinh danh 4-5 loài. Còn
loại mà không có trong bộ tranh mẫu ( Bộ tranh chỉ đinh danh 4-5 loài. Còn


thực tế hơn 300 loài Can
thực tế hơn 300 loài Candida
).
).
•
•
Thao tác phức tạp.
Thao tác phức tạp.
•
•


Tốn kém kinh tế
Tốn kém kinh tế
Vậy để khắc phục một số hạn chế trên, phòng xét nghi
Vậy để khắc phục một số hạn chế trên, phòng xét nghiệm nấm nói riêng và
tập thể khoa xét nghiệm nói chung đang từng bước xây dựng một hệ thống quản
lý chất lượng chung trong phòng thí nghiệm. Hệ thống này cần những thành
phần thiết yếu như: quản lý thiết bị, quản lý nhân sự và kiểm soát quá trình thực
hiện. Mỗi yếu tố trên bao gồm rất nhiều khâu, đặc biệt là khâu kiểm soát chất
lượng xét nghiệm thông qua xây dựng quy trình thường quy chuẩn. và Nó được

coi như là tài liệu hướng dẫn chi tiết giúp ta từng bước thực hiện các thao tác
xét nghiệm (SOPS). Đồng thời, đòi hỏi ngắn gọn, rõ ràng, dễ hiểu và phải cập
nhật thường xuyên ít nhất mỗi năm một lần. Từ đó, nhằm đảm bảo rằng xét
nghiệm do phòng thí nghệm thực hiện là đúng và đáng tin cậy.
Đ
Để thực hiện tốt công việc đó, chúng tôi luôn nhận
được sự quan tâm chỉ
được sự quan tâm chỉ


đạo và tạo
đạo và tạo
nhiều điều kiện thuận lợi của Ban Giám Đốc bệnh viện, Ban Lãnh
nhiều điều kiện thuận lợi của Ban Giám Đốc bệnh viện, Ban Lãnh


đạo khoa Xét nghiệm. Đ
đạo khoa Xét nghiệm. Đ ồng th ời,
kế thừa kinh nghi
kế thừa kinh nghi ệm c ủa
những người đi
những người đi


trước. V
trước. V
à tiếp thu kiến thức m
à tiếp thu kiến thức m ới
cập nhật t
cập nhật t ừ

các chuyên gia Nấm học của
các chuyên gia Nấm học của


CDC.
CDC.
Chúng tôi thấy
Chúng tôi thấy
Cải tiến
Cải tiến
→
→
Xây dựng quy trình phân loại sớm nấm
Xây dựng quy trình phân loại sớm nấm


Candida
Candida


là
là
cần thiết và quan trọng.
cần thiết và quan trọng.
Mục đích kỹ thuật:
Mục đích kỹ thuật:
1.
Xây dựng quy trình phân loại nấm men nhằm rút ngắn thời gian, tiết
Xây dựng quy trình phân loại nấm men nhằm rút ngắn thời gian, tiết

kiệm kinh tế nhưng vẫn chính xác. Từ đó, giúp cho chẩn đoán và điều trị các
kiệm kinh tế nhưng vẫn chính xác. Từ đó, giúp cho chẩn đoán và điều trị các


bệnh lý do nấm Candida
bệnh lý do nấm Candida


gây ra một cách nhanh v
gây ra một cách nhanh v
à hiệu quả.
à hiệu quả.
2. Đánh giá hi
2. Đánh giá hiệu quả quy trình mới và có so sánh với một số quy trình khác
3.
Có thể áp dụng đào tạo và chuyển giao kỹ thuật cho các tuyến y tế cơ sở
Có thể áp dụng đào tạo và chuyển giao kỹ thuật cho các tuyến y tế cơ sở
Yêu cầu:
Yêu cầu:
1.
1.
Quy trình ngắn gọn, dễ hiểu.
Quy trình ngắn gọn, dễ hiểu.
2.
2.
Các thao tác kỹ thuật dễ thực hiện
Các thao tác kỹ thuật dễ thực hiện
3.
3.

Các môi trường được kiểm chuẩn theo hướng dẫn ASM/CDC
Các môi trường được kiểm chuẩn theo hướng dẫn ASM/CDC
II. Tổng quan
II. Tổng quan
1.
1.
Vài nét nấm men ( yeast, levure)
Vài nét nấm men ( yeast, levure)
Tồn tại trạng thái đơn bào, có nhân chuẩn. Hình tròn hoặc hình bầu dục.
Kích thước từ 3 – 10 µm, lớn hơn gấp 10 lần vi khuẩn. Sinh sản vô tính theo
phương thức nảy chồi. Khả năng thích nghi môi trường đường cao
.
. Tồn tại
trong thiên nhiên và trong các môi trường chứa đường như: hoa quả, rau dưa,
mật mía…
Tính chất gây bệnh
Candida thuộc vi hệ tuy nhiên có thể bền vững hoặc thoáng qua. Người ta
có thể tìm thấy Candida ký sinh ở da, họng miệng, đường tiêu hoá và âm đạo…,
mà không gây bệnh. Chúng chỉ gây bệnh khi có yếu tố thuận lợi, đặc biệt khi cơ
thể suy giảm miễn dịch Những loài Candida khác nhau có độc tính khác nhau
nên khả năng gây bệnh cũng khác nhau (Hay gặp nhất là C.albicans).

Candida
có thể gây bệnh ở nhiều cơ quan:
Ở nông trên da, niêm mạc miệng lưỡi, niêm mạc sinh dục nam, nữ và xâm
nhập sâu gây bệnh: Phổi, tim, nhiễm nấm Candida huyết bệnh cảnh lâm sàng
diễn biến nặng nề, nguy kịch, có thể tử vong rất nhanh…
Ngoài ra, còn gặp một số nấm men khác:
Ngoài ra, còn gặp một số nấm men khác:
Cryptococcus, Trichosporon,

Cryptococcus, Trichosporon,


Geotrichum, Rhodotorula, Protheca…
Geotrichum, Rhodotorula, Protheca…
III. Đ
III. Đối tượng và phương pháp nghiên cứu
1. Đ
1. Đối tượng:
- B
- Bệnh phẩm lâm sàng có xét nghiệm trực tiếp dương tính và nghi nhiễm
nấm Candida spp.
- Quy trình định loại s
- Quy trình định loại sớm nấm Candida
- Thời gian: Từ tháng 2 đến tháng 10 năm 2012
2. Vật liệu
- Chủng nấm:
Chủng chuẩn quốc tế có mã số (ATCC: 90028, 66032, 66029, 22019,
MYA-4560, 6258, 201382, 204092) và chủng nấm của bệnh nhân chưa định
danh loài gây bệnh
- Môi trường:
Sabouraud + chloramphenicol, Bột ngô + Tween 80, CHROMO agar
Candida, Auxacolor, Huyết thanh người khoẻ đã loại trừ HbsAg (-), HIV(-) và
không dùng thuốc
kháng nấm trước đó 05 ngày.


2. Phương pháp tiến hành
2. Phương pháp tiến hành

2.1 Xây dựng quy trình định loại sớm
2.1 Xây dựng quy trình định loại sớm
Candida
Candida




Có 3 điểm “mấu chốt” của quy trình là
Có 3 điểm “mấu chốt” của quy trình là
(
(
Phụ lục
Phụ lục
):
):
*
*
Chọn một thử nghiệm “
Chọn một thử nghiệm “
đầu tiên
đầu tiên
” có độ nhạy và độ đặc hiệu cao nhằm
” có độ nhạy và độ đặc hiệu cao nhằm


sàng lọc nhanh
sàng lọc nhanh
Candida albicans

Candida albicans
→
→
Test mầm giá đậu (Germ tube test): Thời gian cho kết quả sơ bộ là 3h và
Test mầm giá đậu (Germ tube test): Thời gian cho kết quả sơ bộ là 3h và


test dương tính gặp
test dương tính gặp
95%
95%
là
là
C.albicans
C.albicans
*
*
Chọn môi trường nuôi cấy vi
Chọn môi trường nuôi cấy vi
thể chọn lọc để quan sát hình thái vi thể đặc
thể chọn lọc để quan sát hình thái vi thể đặc


trưng nấm Candida nhưng phải sẵn có dễ mua, rẻ tiền, tự pha chế môi trường.
trưng nấm Candida nhưng phải sẵn có dễ mua, rẻ tiền, tự pha chế môi trường.
→
→
Thạch Bột ngô + Tween 80: Hạt ngô được coi là “Thực phẩm vàng”
Thạch Bột ngô + Tween 80: Hạt ngô được coi là “Thực phẩm vàng”

bởi: Giàu Vitamin tự nhiên nhóm B (B1, B2,B6, Niacin) khoáng chất cần thiết,
bởi: Giàu Vitamin tự nhiên nhóm B (B1, B2,B6, Niacin) khoáng chất cần thiết,


giàu chất đạm, chất xơ gấp 4-6 lần gạo, mì. Thời gian cho kết quả 02 ngày.
giàu chất đạm, chất xơ gấp 4-6 lần gạo, mì. Thời gian cho kết quả 02 ngày.
*
*
Thay đổi cách cấy trên lam để quan sát rõ ràng và nhiều vị trí hình thái
Thay đổi cách cấy trên lam để quan sát rõ ràng và nhiều vị trí hình thái


Nấm nhưng vẫn tiết kiệm môi trường và thao tác dễ thực hiện.
Nấm nhưng vẫn tiết kiệm môi trường và thao tác dễ thực hiện.
2.2 Kiểm tra độ chuẩn xác môi trường pha chế và thao tác kỹ thuật
2.2 Kiểm tra độ chuẩn xác môi trường pha chế và thao tác kỹ thuật
- Môi trường Bột ngô + Tween 80 và CHROM agar Candida: Lấy chủng
- Môi trường Bột ngô + Tween 80 và CHROM agar Candida: Lấy chủng


nấm men chuẩn CDC (ATCC) cấy kiểm tra môi trường sau khi đổ xong. Nếu
nấm men chuẩn CDC (ATCC) cấy kiểm tra môi trường sau khi đổ xong. Nếu


chủng nấm mọc mang hình thái đặc trưng chủng nấm mẫu → môi trường đó
chủng nấm mọc mang hình thái đặc trưng chủng nấm mẫu → môi trường đó


pha chế chuẩn.

pha chế chuẩn.
- Khi thao tác kỹ thuật phải làm đồng thời cùng lúc với chủng chuẩn
- Khi thao tác kỹ thuật phải làm đồng thời cùng lúc với chủng chuẩn


(ATCC) và mẫu bệnh phẩm cần định loại. Qua đó, vừa làm chứng dương để so
(ATCC) và mẫu bệnh phẩm cần định loại. Qua đó, vừa làm chứng dương để so


sánh vừa kiểm tra độ ổn định và tính chính xác của thao tác kỹ thuật.
sánh vừa kiểm tra độ ổn định và tính chính xác của thao tác kỹ thuật.
Tóm tắt sơ đồ tiếp cận quy trình định danh nấm Candida spp
Tóm tắt sơ đồ tiếp cận quy trình định danh nấm Candida spp
Bệnh phẩm
Xét nghiệm trực tiếp(+)
Sabouraud+Chloramphenicol
24-48h, tº=25-30ºC
Khuẩn lạc thuần

Test mầm giá (3h, tº=37ºC)
(1)
Dương tính Âm tính


95%
95%
C. albicans
C. albicans
Non
Non

. albicans
. albicans




Bột ngô+Tween 80 (48h,
Bột ngô+Tween 80 (48h, tº=25-30ºC
)
)
(2)
(2)


Bào tử màng dày+Giả sợi Các hình thái khác
Bào tử màng dày+Giả sợi Các hình thái khác
(3)
(3)
(97%)
(97%)








CHROM agar Candida
CHROM agar Candida

3. Tóm tắt quy trình xét nghiệm
3. Tóm tắt quy trình xét nghiệm
- Xét nghiệm trực tiếp:
- Xét nghiệm trực tiếp:
•
•


Soi tươi,
Soi tươi,
•
•


Nhuộm Gram,
Nhuộm Gram,
•
•


Dầm mực tàu.
Dầm mực tàu.
- Nuôi cấy:
- Nuôi cấy:
•
•
Sabouraud with chloramphenicol
Sabouraud with chloramphenicol
•
•

Nhiệt độ 25-30ºC,
Nhiệt độ 25-30ºC,
•
•


Thời gian 24-48h .
Thời gian 24-48h .
- Phân loại:
- Phân loại:
•
•
Test ống mầm giá đậu
Test ống mầm giá đậu
•
•
Thử nghiệm tạo bào tử màng dầy ( môi trường Bột ngô),
Thử nghiệm tạo bào tử màng dầy ( môi trường Bột ngô),
•
•
CROMO agar Candida
CROMO agar Candida
•
•
Auxacolor (Bio-rad).
Auxacolor (Bio-rad).

C. krusei
C. krusei
C. tropicalis
C. tropicalis
C. parapsilosis
C. parapsilosis
C. glabrata…
C. glabrata…


C. albicans
C. albicans
Auxacolor
Auxacolor
Auxacolor
3.1 Kỹ thuật xét nghiệm tìm nấm Candida
3.1.1 Dụng cụ, hoá chất
- Kính hiển vi quang học
- Ete, cồn 90°, đèn cồn
- Lam kính, lá kính
- Ống tube thuỷ tinh vô khuẩn
- Que cấy, tăm bông vô khuẩn.
- Bàn phụ khoa
- Mỏ vịt (các kích cỡ)
- Pank, bông thấm nước,
- Găng tay, khẩu trang.
- Thuốc nhuộm Gram, Nacl 9‰, KOH 20%.
- Môi trường Sabouraud +Chloramphenicol+ Actidion
- Huyết thanh thỏ( hoặc người)
- Môi truờng lên men và hấp thu đường.

- Môi trường PCB, KIT Auxacolor hãng Bio-rat
3.1.2 Nội dung xét nghiệm
3.1.2.1 Xét nghiệm trực tiếp
* Lấy bệnh phẩm
Mẫu bệnh phẩm tuỳ thuộc vào vị trí thương tổn. Thông thường bệnh phẩm
xét nghiệm tìm nấm Candida là:
- Lưỡi miệng: Dùng dao cùn lấy giả mạc trắng, và dùng tăm bông ngoáy
họng
- Da, móng và rãnh quanh móng: Dùng dao cùn cạo thương tổn da nhẵn,
cắt khối sừng mủn dưới móng và cạo rãnh quanh móng.
- Bệnh phẩm là máu: phải tiến hành nuôi cấy
- Bệnh phẩm dịch não tuỷ: ly tâm lấy cặn để soi tươi, nhuộm soi, nuôi cấy
- Nếu là dịch âm đạo trong viêm âm hộ - âm đạo nghi do Candida: Mở mỏ
vịt và lấy bệnh phẩm ở cùng đồ sau.
* Làm tiêu bản
- Bệnh phẩm ở da, niêm mạc lưỡi miệng và móng đem nhỏ KOH 20% và
soi kính hiển vi quang học
- Dịch cùng đồ sau tiến hành nhuộm Gram hoặc soi trong Nacl 9‰
- Dịch não tuỷ:
+ Lấy cặn để nhuộm Gram hoặc soi tươi trong Nacl 9‰
+ Dầm trong mực tàu, để yên tĩnh 2-3 phút
- Đờm: phết tiêu bản nhuộm Gram
* Nhận định kết quả
- Trên tiêu bản soi tươi: Sử dụng kính hiển vi quang học vật kính 10, 40:
+ Bào tử nấm men hình tròn hoặc bầu dục, kích thước 3-6- 10µm. Có rất
nhiều tế bào men nẩy chồi, đôi khi thấy hiện tượng giả sợi nấm.
- Trên tiêu bản nhuộm Gram: Sử dụng kính hiển vi quang học vật kính dầu
100
Tế bào nấm men có chồi hoặc không, hình tròn hoặc bầu dục, đôi khi thấy
sợi nấm hoặc giả sợi. Bắt màu Gram dương.

- Trên tiêu bản mực tầu thấy tế bào men nảy chồi hoặc không có vỏ dày,
chiết quang. Hình ảnh đó sơ bộ định hướng tới Cryptococcus.
3.1.2.2 Nuôi cấy, định loại
- Môi trường: Sabouraud, Chloramphenicol (gentamycine), Actidion
- Bệnh phẩm sau khi lấy vô khuẩn, tiến hành cấy vào môi trường trên theo
phương pháp ria cấy hoặc cấy điểm. Bệnh phẩm sau khi lấy phải cấy ngay.
- Ria cấy từ 2-3 ống, t°=25- 30°C hoặc 37°C, thời gian sau 24- 48h.
* Đại thể
- Khuẩn lạc tròn, màu trắng kem, sền sệt, bề mặt trơn nhẵn, có một số
chủng thô ráp, sần sùi. Khi để già tạo tua sợi đâm sâu xuống môi trường thạch
(C.albicans).
* Vi thể
- Thay đổi tuỳ theo loài. Nói chung, nấm men hình cầu, hình tròn hoặc bầu
dục. Kích thước thay đổi. Tất cả đều sinh chồi và bào tử chồi có thể tròn hoặc
thon dài. Thường xuất hiện sợi giả có thể ngắn hoặc dài, đôi khi uốn cong, chia
nhánh. Sợi nấm thật thường dài, có thể xuất hiện bào tử màng dầy ( 95%
C.albicans)
3.1.2.2.1 Chẩn đoán giống
- Dựa vào đại thể (đã nêu trên)
3.1.2.2.2 Chẩn đoán loài
Thử nghiệm tạo ống mầm.( Germ tube test)
Đây là thử nghiệm nhằm chẩn đoán nhanh C.albicans. Tuy nhiên, chỉ mang
tính giả định.
- Chuẩn bị:
+ Môi trường: Huyết thanh ngựa ( hoặc huyết thanh thỏ, người )
+ Kỹ thuật:
• Lấy pipet hút 200 µl huyết thanh cho vào ống tube thuỷ tinh đã hấp vô
khuẩn
• Dùng ăng chữ L lấy một lượng khuẩn lạc nhỏ bằng đầu ăng
• Hoà tan hoàn toàn vào ống tube đã nhỏ sẵn huyết thanh

• Đem ủ ở 37°C, thời gian khoảng 3h
• Lấy một giọt dung dịch đó nhỏ lên lam kính sạch, đậy lá kính đem soi
dưới kính hiển vi quang học.
- Nhận định kết quả: Vật kính 10 nhận định sơ bộ, vật kính 40 khẳng định.
+ Xuất hiện các bào tử nấm men và sợi nấm ngắn nối với nhau, mọc về
một phía của bào tử, trông giống như hiện tượng giá đậu lên mầm và thường
xuất hiện với số lượng nhiều.
Thử nghiệm này dương tính gặp trong 97% các trừơng hợp là
C.albicans.
Chú ý:
- Tốt nhất nên dùng huyết thanh ngựa. Không nên dùng huyết thanh người,
còn nếu dùng huyết thanh người cần chắc chắn không có kháng thể kháng nấm.
- Đọc kết quả trong vòng 3h, không nên để quá lâu hoặc đọc quá sớm. Bởi
có thể gây nhầm lẫn khi nhận định kết quả.
- Thử nghiệm còn cho kết quả âm tính nếu như chỉ thấy toàn tế bào nấm
men
- Bên cạnh đó, thử nghiệm còn cho kết quả dương tính giả khi thấy có sự
giới hạn giữa bào tử nấm men gắn với sợi nấm.
- Bảo quản huyết thanh ở 2- 8°C, nếu cất trữ lâu để dùng dần bảo quản ở
-20°C.
Kỹ thuật cấy trên lam
Mục đích: Quan sát bào tử màng dày và giả sợi
- Môi trường: Tự chuẩn bị môi trường thạch Bột ngô + Tween 80
- Phương pháp cấy trên lam:
+ Đun cách thuỷ ống môi trường đến khi tan chảy hoàn toàn thành dịch
lỏng.
+ Đổ thạch lên lam kính d= 2cm, dùng que cấy “L” lấy một lượng khuẩn
lạc bằng đầu ăng.
+ Cấy thành 1 đường ziczac (6-8 điểm) cách đều nhau giữa miếng thạch
+ Đậy lá kính vô khuẩn

+ Đặt lam kính đó vào hộp lồng có sẵn giá đỡ là que thuỷ tinh hình chữ U
+ Đặt miếng bông tẩm nước cất vào hộp lồng để tạo độ ẩm
+ Ủ trong tủ ấm t°= 25 - 30°C, đọc kết quả sau thời gian 24h-48h
- Nhận định kết quả:
Ta thấy sự phát triển của sợi giả có thể rất mạnh mẽ. Khoảng 95% các
trường hợp sợi giả sinh bào tử màng dày. Đó là những tế bào tròn, thành bào tử
rất dầy, kích thước lớn 10-15 µm, thường sinh ra ở đầu sợi nấm. Đôi khi xuất
hiện ở giữa hoặc cuối sợi nấm.
Hiện tượng sợi giả và bào tử màng dày gặp trong 95% C.albicans
Chú ý:
- Ta có thể sử dụng một trong các môi trường PCB hoặc RAT để tiến hành
phương pháp nuôi cấy trên lam. Tuy nhiên, theo kinh nghiệm chúng tôi thấy để
tạo được nhiều sợi và bào tử màng dày thì nên chọn môi trường Thạch bột ngô
Tween 80. Bởi trong hạt ngô hàm lượng các chất dinh dưỡng và chất xơ gấp 4-6
lần gạo, mì.
- Nếu nấm men không sinh bào tử màng dày và sợi nấm giả có thể cần phải
làm thêm các thử nghiệm khác.
- Không được tiến hành nuôi cấy trên lam nếu nghi ngờ là chủng nấm
lưỡng hình nguy hiểm.
Môi trường CHROM agar Candida
- Môi trường đổi màu: Tự chuẩn bị.
- Cách tiến hành: Ria cấy phân vùng khuẩn lạc nấm men lên đĩa thạch
- Đọc kết quả sau 2 ngày: Nhận định được ngay các loài Candida bởi mỗi
loài cho một màu sắc đặc trưng. Độ nhạy và độ đặc hiệu cao 95%.
Rất hữu ích trong việc phát hiện các chủng nấm đồng nhiễm trên một
mẫu bệnh phẩm.
Lên men đường
+ Auxacolor( Kit Bio-rad): Nhằm đánh giá khả năng sử dụng 13 loại
đường của các chủng nấm men, biểu hiện bằng sự thay đổi màu sắc của chất chỉ
thị pH có trong môi trường thử nghiệm. Thử nghiệm dương tính khi màu

chuyển từ tím sang vàng, còn âm tính cho màu tím.
Ngoài ra, còn phát hiện sự kháng Actidion của nấm men và phát hiện
Enzym
phenoloxydase của C.neoformans. Thử nghiệm cho phép phát hiện 25
chủng nấm men gây bệnh thường gặp.
Một số lưu ý
Một số lưu ý


Bệnh phẩm sau khi lấy phải cấy ngay
Bệnh phẩm sau khi lấy phải cấy ngay


Test ống mầm mang tính giả định nên có thể dương tính giả
Test ống mầm mang tính giả định nên có thể dương tính giả


Bệnh nhân không dùng thuốc kháng nấm trước đó 3 ngày.
Bệnh nhân không dùng thuốc kháng nấm trước đó 3 ngày.
4. K
4. Kết quả và bàn luận
- Tiến hành kiểm định kết quả hai quy trình: “Bộ tranh mẫu” và “Quy trình mới” nhằm
định danh Candida spp bằng cách: Thực hiện đồng thời các thao tác kỹ thuật áp dụng cả 2
quy trình trên đối với 8 chủng nấm mẫu chưa biết trước tên loài nấm, chỉ biết mã số( ATCC:
90028, 66032, 22019,
66029, MYA-4560, 6258, 201382, 204092)→ Bảng 1
- Áp dụng “Quy trình mới” định loại các mẫu bệnh phẩm lâm sàng nghi nhiễm nấm
Candida.
Bên cạnh đó, vẫn đồng thời áp dụng “quy trình mới” với một chủng ATCC nhằm mục
đích tạo chứng dương so sánh và kiểm tra độ chính xác thao tác kỹ thuật.

+ Chúng tôi áp dụng quy trình mới với một số mẫu bệnh phẩm lâm sàng. Thường gặp
một số loài Candida sau: C. albicans, C. glabrata, C. tropicalis, C. krusei,C. parapsilosis, C.
guilliermondii…
Bảng 1: So sánh kết quả định loại 6 chủng nấm Candida & 2 chủng nấm men khác
(ATCC)
Mã số
chủng chuẩn
CDC
(ATCC)
Kết quả quy trình
“ Bộ tranh mẫu”
Kết quả
“quy trình mới”
Ghi chú
90028
C.albicans C.albicans
22019
Không kết luận
được
C. parapsilosis Sơ bộ hình thái
vi thể
66029
Không kết luận
được
C. tropicalis Sơ bộ hình thái
vi thể
MYA-
4560
Không có tranh
mẫu

C. gattii
6258
Không có tranh
mẫu
C. orientalis
66032
Không có tranh
mẫu
C. glabata
201382
Không có tranh
mẫu
T. mucoides
204092
Không có tranh
mẫu
C. neoformans
5. Tính mớí so với các kỹ thuật khác
5.1. Bảng 2: So sánh loại sinh phẩm và giá thành xét nghiệm của các kỹ
thuật
Thử
nghiệm
Sinh phẩm và giá thành
Kỹ thuật khác Kỹ thuật mới
MT nôi cấy Sabouraud 10.000đ/ống/ XN 5.000đ/XN (một đĩa chia làm2)
MT tạo
màu
Candiselect-4: 10.000đ/XN CHROM agar: 3.000đ/XN (chia làm 3)
Mầm giá
đậu

Huyết thanh thỏ: 5.000đ/XN Huyết thanh người: 1.000đ/XN
Cấy trên
lam kính
Bột gạo (RAT/Bio-rad) Bột ngô +Tween 80 (Tự pha chế)
Mua sẵn: 5.000đ/XN Giá thành: 2.000đ/XN
Chuyển
hoá đường
Máy định danh Vitek Auxacolor (Bio-rad)
Giá thành: 120.000đ/ XN Giá thành: 90.000đ
Api.20: 90.000đ
Tổng cộng - Sinh phẩm phải mua nên giá - Chọn sinh phẩm có độ nhạy và độ đặc hiệu
Cao hơn và ko đặc hiệu cao cho kết quả điển hình. Và tự đổ môi
trường nên tiết kiệm kinh tế hơn
- Giá thành: 240.000đ /BN - Giá thành: 100.000đ/BN
(BV thu 120.000đ)) (Khoảng 90% XN giá 10.000. BV thu
120.000đ)
5.2 Bảng 3. So sánh tính hiệu quả giữa các kỹ thuật
5.2 Bảng 3. So sánh tính hiệu quả giữa các kỹ thuật
Đối
Đối


với
với


Các kỹ thuật khác
Các kỹ thuật khác
Kỹ thuật mới
Kỹ thuật mới

Máy Vitek
Máy Vitek
Bộ tranh mẫu
Bộ tranh mẫu
Bện
Bện
h nhân
h nhân
Trả kết quả sau 4
Trả kết quả sau 4


ngày
ngày


7-10 ngày
7-10 ngày 3-5 ngày
Kin
Kin
h tế
h tế
Chi phí cao
Chi phí cao


120.000đ
120.000đ
Chi phí từ 30-150.000đ
Chi phí từ 30-150.000đ

Dao động 10-20-
Dao động 10-20-
100.000đ
100.000đ
Chu
yên môn
- Đơn giản vì máy
cài đặt sẵn
- Không có kinh
nghiệm chẩn đoán.
- MT phải mua sẵn: giá
cao, HSD ngắn
- KTV bị động vì phụ
thuộc bộ tranh mẫu,
- Không đinh danh nếu
chủng nấm không có trong
bộ tranh mẫu
- Không có kinh
nghiệm
- MT tự pha chế & kiểm
chuẩn. Không phải mua sẵn,
nên dễ kiếm, rẻ tiền và chủ
động pha chế.
→ Thực hiên tuyến cơ sở
- Thao tác dễ dàng
- Tích luỹ kinh nghiệm
Nhậ
n định
kết quả
- Đôi khi máy

không thể định danh
được vì có thể Card
định danh chưa cài đặt
chủng nấm đó.
- Mất điện, hoặc
hao mòn máy và
thường xuyên bảo trì,
bảo dưỡng.
- Chẩn đoán mỗi loài
dựa 5 bức tranh. Thực tế chỉ
2-3 bức tranh có ý nghĩa và
chỉ khẳng định mỗi
C.albicans.
- MT Cand iselect-4:
Khẳng định C.albicans(màu
tím). Còn 3 loài khác cho màu
xanh nên chỉ đoán chừng.
- Không thể dựa vào
hình thái phân biệt
C.albicans và C.dubliensis.
Mà chỉ có thể phân biệt
chúng trên PCR
- MT Bột ngô: hình ảnh
vi thể đặc trưng loài, dễ nhận
định kết quả
- MT CHROM –
Candida:
Hiển thị 8 màu sắc khác
nhau đặc trưng từng loài. Rất
dễ nhận biết

Độ nhạy, độ đặc hiệu
95%
- Đặc biệt khi phát hiện
C.krusei báo cáo ngay tình
trạng kháng tự nhiên với
- Chưa định danh một
số loài Candida khác:
C. krusei, C.glabrata
…
Fluconazol
- Định loại hầu hết các
loài Candida.
*
*
Ưu điểm: Quy trình định loại mới
Ưu điểm: Quy trình định loại mới


-
-
Thao tác đơn giản, dễ dàng quan sát nấm phát triển.
Thao tác đơn giản, dễ dàng quan sát nấm phát triển.
-
-
Môi trường tự pha chế, dễ kiếm, cho kết quả nhanh, số lượng nhiều và
Môi trường tự pha chế, dễ kiếm, cho kết quả nhanh, số lượng nhiều và


điển hình (Bột ngô, CHROM agar Candida )
điển hình (Bột ngô, CHROM agar Candida )

-
-
Tiết kiệm kinh tế (10.000đ/xét nghiệm, chiếm 90% BN)
Tiết kiệm kinh tế (10.000đ/xét nghiệm, chiếm 90% BN)
-
-
Rút ngắn thời gian( Trước 10 ngày, nay 5 ngày. Vì lồng ghép các kỹ
Rút ngắn thời gian( Trước 10 ngày, nay 5 ngày. Vì lồng ghép các kỹ


thuật)
thuật)
-
-
Tích luỹ kinh nghiệm
Tích luỹ kinh nghiệm
-
-
Định danh hầu hết các loài nấm Candida gây bệnh. Ngoài ra, định danh
Định danh hầu hết các loài nấm Candida gây bệnh. Ngoài ra, định danh


một số nấm men khác
một số nấm men khác
-
-
Nếu làm thêm kỹ thuật Kháng sinh đồ nấm tiến hành lồng ghép cùng quy
Nếu làm thêm kỹ thuật Kháng sinh đồ nấm tiến hành lồng ghép cùng quy

trình trên nên bệnh nhân vẫn không mất thêm thời gian chờ đợi kết quả.
trình trên nên bệnh nhân vẫn không mất thêm thời gian chờ đợi kết quả.
-
-
Triển khai đào tạo và chuyển giao cho tuyến y tế cơ sở.
Triển khai đào tạo và chuyển giao cho tuyến y tế cơ sở.


5. Kiến nghị
5. Kiến nghị


- Triển khai quy trình định loại
- Triển khai quy trình định loại
Candida
Candida
tại phòng xét nghiệm nấm BV
tại phòng xét nghiệm nấm BV


Da liễu TW.
Da liễu TW.


- Có thể đào tạo và chuyển giao kỹ thuật tuyến y tế cơ sở
- Có thể đào tạo và chuyển giao kỹ thuật tuyến y tế cơ sở


- Tiến hành đánh giá độ nhạy cảm các chủng nấm men với kháng sinh
- Tiến hành đánh giá độ nhạy cảm các chủng nấm men với kháng sinh

chống nấm.
chống nấm.


Tài liệu tham khảo:
Tài liệu tham khảo:
1.
1.
GS Nguyễn Thị Đào(2003),
GS Nguyễn Thị Đào(2003),
Bệnh nấm thường gặp
Bệnh nấm thường gặp
, NXB Từ điển
, NXB Từ điển


Bách Khoa
Bách Khoa
2.
2.
Prof.Dr Victo Silva.V(2011
Prof.Dr Victo Silva.V(2011
), Clinical MYCOLOGY Workshop
), Clinical MYCOLOGY Workshop
, pp
, pp

2-15
2-15
3.
3.
Hèlène Koenig (1995),
Hèlène Koenig (1995),
Guide de MYCOLOGY MEDICALE
Guide de MYCOLOGY MEDICALE
, pp 44-
, pp 44-
58
58


Phụ lục
Nhuôm Gram
Giả sợi và tế bào nấm men
1
Bệnh phẩm
KOH 20%
Ống thạch Sabouraud
Cấy được 1 bệnh nhân/ống
Đĩa thạch Sabouraud
Chia đôi đĩa thạch cấy 2 BN
Test ống mầm giá đậu: dương tính
Đọc 3h, 37ºC
Test ống mầm: Âm tính

CDC/ ASM

Cấy 6 đường trên 1lam kính phủ đầy thạch
Kỹ thuật cấy trên lam
Mục đích: Quan sát hình thái vi thể
đặc trưng cho một số loài Candida
Kỹ thuật cũ
Cấy 3 điểm trên 1 giọt thạch
Kỹ thuật mới
Cấy 3 đường trên miếng thạch d=2cm
C. kru
Kỹ thuật cổ điển
Cắt khối thạch vuông và
cấy 5 điểm
Bào tử màng dày+ giả sợi
Sei

48
Auxacolor 30ºC, 24-48-72h,
Định danh 25 loài nấm men
API Candida 35ºC, 24-48h
Định danh 13 loài nấm men
Đồng hoá đườngLên men đường
Thử nghiệm sinh hoá Nấm men
Kỹ thuật cũ
Kỹ thuật
hiện nay
,
Candiselect-4, đọc sau 48h, 30ºC
- Màu tím: Khẳng định C.albicans
- Màu xanh: Đoán chừng 1 trong 3 loài
C.glabrata, C.tropicalis, C.krusei

Môi trường tạo màu
Mục đích: Chẩn đoán và phát hiện đồng nhiễm nhiều chủng nấm men