BÁO CÁO THỰC TẬP: PHÂN TÍCH TỒN DƯ KHÁNG SINH TRONG THỰC PHẨM

GVHD: ThS. NGUYỄN QUỐC THẮNG
SVTH: PHẠM THỊ NGỌC MINH 10031951
Lớp: DHPT06 Khóa: 2010 - 2014
TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHIỆP TP HỒ CHÍ MINH
KHOA CÔNG NGHỆ HÓA HỌC

BÁO CÁO THỰC TẬP
PHÂN TÍCH TỒN DƯ KHÁNG SINH TRONG
THỰC PHẨM
ĐƠN VỊ THỰC TẬP: TRẠM CHẨN ĐOÁN, XÉT NGHIỆM VÀ ĐIỀU TRỊ - CHI CỤC THÚ Y TP.HCM
NỘI DUNG
GIỚI THIỆU TRẠM CHẨN ĐOÁN XÉT NGHIỆM
VÀ ĐIỀN TRỊ CHI CỤC THÚ Y TP.HCM
CƠ SỞ LÝ THUYẾT
PHÂN TÍCH TỒN DƯ KHÁNG SINH TRONG THỰC PHẨM
3
1
2
1
BÁO CÁO THỰC TẬP
PHÂN TÍCH TỒN DƯ KHÁNG SINH
SVTH: PHẠM THỊ NGỌC MINH – DHPT06
1. GIỚI THIỆU TRẠM CHẨN ĐOÁN, XÉT
NGHIỆM VÀ ĐIỀU TRỊ
Địa chỉ: Số 151 Lý Thường Kiệt, phường 7, quận 11,
Tp.Hồ Chí Minh.
Điện thoại: (08)8551258 – 9555623 – 9555682.
Email:
2
BÁO CÁO THỰC TẬP
PHÂN TÍCH TỒN DƯ KHÁNG SINH

SVTH: PHẠM THỊ NGỌC MINH – DHPT06
1. GIỚI THIỆU TRẠM CHẨN ĐOÁN, XÉT
NGHIỆM VÀ ĐIỀU TRỊ
3
BÁO CÁO THỰC TẬP
PHÂN TÍCH TỒN DƯ KHÁNG SINH
SVTH: PHẠM THỊ NGỌC MINH – DHPT06
1. GIỚI THIỆU TRẠM CHẨN ĐOÁN, XÉT
NGHIỆM VÀ ĐIỀU TRỊ
CHỈ TIÊU
PHÂN TÍCH
Chất lượng thuốc thú y
Kháng sinh
Vitamin
Độc tố vi nấm
Hóa chất cấm
Kháng viêm
4
BÁO CÁO THỰC TẬP
PHÂN TÍCH TỒN DƯ KHÁNG SINH
SVTH: PHẠM THỊ NGỌC MINH – DHPT06
2. CƠ SỞ LÝ THUYẾT
TỔNG QUAN VỀ KHÁNG SINH
2.1.
CƠ SỞ LÝ THUYẾT CỦA PHƯƠNG PHÁP HPLC
2.2.
THIẾT BỊ TRONG HPLC
2.3.
5
BÁO CÁO THỰC TẬP

PHÂN TÍCH TỒN DƯ KHÁNG SINH
SVTH: PHẠM THỊ NGỌC MINH – DHPT06
2.1. TỔNG QUAN VỀ KHÁNG SINH
6
BÁO CÁO THỰC TẬP
PHÂN TÍCH TỒN DƯ KHÁNG SINH
SVTH: PHẠM THỊ NGỌC MINH – DHPT06
2.1. TỔNG QUAN VỀ KHÁNG SINH

Cơ chế tác dụng:
- Ức chế sự tổng hợp thành tế bào.
- Tổn thương màng tế bào.
- Ức chế sự tổng hợp acid nucleic.
- Ức chế sự tổng hợp protein.
7
BÁO CÁO THỰC TẬP
PHÂN TÍCH TỒN DƯ KHÁNG SINH
SVTH: PHẠM THỊ NGỌC MINH – DHPT06
2.1. TỔNG QUAN VỀ KHÁNG SINH

Phân loại:
STT Nhóm kháng sinh chính Ví dụ
1 β- Lactam các Penicilin Peniciline, Methiciline, Ampiciline,
2
β- Lactam các
Cephalosporin
Cefadroxil, Cephalexin, Cefaclor, Cefixime, Ceftriaxone,…
3 Macrolid Erythromycin, Rovamycin, Spiramycin, Azithromycin,…
4 Tetracyclin Tetracyclin, Oxytetracyclin, Doxycyclin, Chlotetracyclin,…
5 Quinolones Norfloxacin, Acid Nalidixic, Lomefloxacin, Ciprofloxacin,

6 Aminosid Amikacin, Tobramycin, Neomycin, Gentamycin,…
7 5 – Nitro - Imidazol Clotrimazole, Metronidazole, Tinidazole, Secnidazole,…
8 Lincosamid Lincomycin, Clindamycin.
9 Sulfamid Sulfachlorpiridazine, Sulfadiazine, Sulfadimethoxine,
8
BÁO CÁO THỰC TẬP
PHÂN TÍCH TỒN DƯ KHÁNG SINH
SVTH: PHẠM THỊ NGỌC MINH – DHPT06
2.1. TỔNG QUAN VỀ KHÁNG SINH
Tiếp xúc môi trường có chứa kháng sinh
Lỗi kỹ thuật khi sử dụng kháng sinh thường xuyên
Ức chế, tiêu diệt vi sinh vật để bảo quản thực phẩm
Bảo quản thực phẩm khi di chuyển đi xa
NGUYÊN
NHÂN
TỒN DƯ
HẬU QUẢ
- Gây rối loạn quá trình tiêu hoá
thức ăn của vi sinh vật.
- Làm giảm hiệu quả điều trị của
kháng sinh.
- Tạo dòng vi khuẩn kháng thuốc.
- Làm tăng nguy cơ lây lan và
bùng nổ dịch bệnh.
- Gây ảnh hưởng xấu đến người
tiêu dùng.
9
CẦN PHẢI XÁC ĐỊNH
LƯỢNG TỒN DƯ KHÁNG
SINH TRONG THỰC

PHẨM
BÁO CÁO THỰC TẬP
PHÂN TÍCH TỒN DƯ KHÁNG SINH
SVTH: PHẠM THỊ NGỌC MINH – DHPT06
2.2. CƠ SỞ LÝ THUYẾT CỦA
PHƯƠNG PHÁP HPLC
HPLC là một phương pháp chia tách trong đó pha động là chất lỏng và pha tĩnh chứa trong
cột là chất rắn đã được phân chia dưới dạng tiểu phân hoặc một chất lỏng phủ lên một chất
mang rắn, hay một chất mang đã được biến bằng liên kết hóa học với các nhóm chức hữu cơ.
Quá trình sắc ký lỏng dựa trên cơ chế hấp phụ, phân bố, trao đổi ion hay phân loại theo kích
cỡ.
Dựa trên ái lực khác nhau giữa các chất với 2 pha luôn tiếp xúc nhưng không trộn lẫn vào
nhau: pha tĩnh (trong cột hiệu năng cao) và pha động (dung môi rửa giải). Tùy theo bản chất
pha tĩnh, chất tan và dung môi mà quá trình rửa giải tách được các chất khi ra khỏi cột sắc ký.
10
BÁO CÁO THỰC TẬP
PHÂN TÍCH TỒN DƯ KHÁNG SINH
SVTH: PHẠM THỊ NGỌC MINH – DHPT06

Phân loại:
STT Phân loại Cơ chế Pha động Pha tĩnh Ứng dụng
1
Sắc ký
hấp phụ
Sắc ký hấp phụ pha
thuận
Dựa trên sự hấp phụ
mạnh yếu giữa chất cần
phân tích với pha tĩnh và
sự rửa giải của pha động

Không phân
cực
Phân cực
Tách các hợp chất
phân cực hoặc không
phân cực có tính chất
gần giống nhau
Sắc ký hấp phụ pha
đảo
Phân cực
Không phân
cực
2
Sắc ký
phân bố
Sắc ký phân bố pha
thường
Dựa trên sự phân bố của
chất cần phân tích với pha
tĩnh
Độ phân cực
thấp
Độ phân cực
cao
Tách các hợp chất từ
không phân cực đến
rất phân cực, hợp
chất ion (M<3000)
Sắc ký phân bố pha
đảo

Độ phân cực
cao
Độ phân cực
thấp
3
Sắc ký
trao đổi
ion
Phân tách dựa trên sự
khác biệt về ion
Dung dịch
đệm trong
nước:
phosphate,
fomate,…
Cột có nhóm
trao đổi ion:
Sulfonate,
tetraalkylamo
nium,…
Phân tích tốt các
cation, anion vô cơ,
hữu cơ trong nước.
4
Sắc ký rây
phân tử
Dựa trên kích thước của
phân tử.
Dung môi hữu
cơ, nước,…

Silicagel
Phân tích polimer,
protein.
2.2. CƠ SỞ LÝ THUYẾT CỦA
PHƯƠNG PHÁP HPLC
11
BÁO CÁO THỰC TẬP
PHÂN TÍCH TỒN DƯ KHÁNG SINH
SVTH: PHẠM THỊ NGỌC MINH – DHPT06
2.3. THIẾT BỊ TRONG HPLC
Trong đó:
1. Bình chứa pha động.
2. Bộ phận khử khí.
3. Bơm cao áp.
4. Bộ phận tiêm mẫu.
5. Cột sắc ký (pha tĩnh).
6. Đầu dò.
7. Hệ thống ghi nhận tín hiệu, xử lý
dữ liệu và điều khiển hệ thống.
8. In dữ liệu.
12
BÁO CÁO THỰC TẬP
PHÂN TÍCH TỒN DƯ KHÁNG SINH
SVTH: PHẠM THỊ NGỌC MINH – DHPT06
3. PHÂN TÍCH TỒN DƯ KHÁNG SINH
TRONG THỰC PHẨM
3.1. XÁC ĐỊNH DƯ LƯỢNG TETRACYCLIN
3.2. XÁC ĐỊNH DƯ LƯỢNG SULFAMID
13
BÁO CÁO THỰC TẬP

PHÂN TÍCH TỒN DƯ KHÁNG SINH
SVTH: PHẠM THỊ NGỌC MINH – DHPT06
- Kích ứng niêm mạc dạ dày, buồn nôn, nôn,…
- Xảy ra hiện tượng giảm nhu động, có cảm giác
no lâu, gây nhiễm trùng đường tiêu hóa,…
- Hỏng men răng, xỉn răng, hủy hoại sự phát triển
xương ở trẻ em.
- Tăng nồng độ ure huyết gây tai biến, hôn mê,…
- Tăng áp lực nội sọ gây tử vong.
Tại sao phải xác
định dư lượng
Tetracyclin?
14
3.1 XÁC ĐỊNH DƯ LƯỢNG TETRACYCLIN
BÁO CÁO THỰC TẬP
PHÂN TÍCH TỒN DƯ KHÁNG SINH
SVTH: PHẠM THỊ NGỌC MINH – DHPT06

Phạm vi áp dụng:
3.1. XÁC ĐỊNH DƯ LƯỢNG TETRACYCLIN
Hiện nay phương pháp này dùng để
xác định dư lượng của bốn hợp chất và
các chất biến dị khác: Oxytetracycline
(OTC) và Epi - Oxytetracycline (epi – OTC)
, Tetracycline ( TC) và Epi - Tetracycline
(Epi – TC), Doxycycline và Epi -
Doxycycline (Epi – DTC) , Epi -
Doxycycline (Epi – DTC). Chúng tồn tại
trong thận và cơ của heo, bò.
15

Tetracycline đã chiết được giữ trên
pha tĩnh C18 và xác định bằng đầu dò UV
tại bước sóng 355 nm. Hàm lượng
Tetracycline được tính bằng phưong pháp
nội suy từ mỗi một đường chuẩn xác định
của bốn hợp chất, có tính đến hiệu suất
thu hồi.

Nguyên tắc:
BÁO CÁO THỰC TẬP
PHÂN TÍCH TỒN DƯ KHÁNG SINH
SVTH: PHẠM THỊ NGỌC MINH – DHPT06
3.1. XÁC ĐỊNH DƯ LƯỢNG TETRACYCLIN

Thuốc thử, hóa chất:
- Acetonitrile.
- Methanol.
- Nước cất.
- Trichloroacetic acid 1g/ml.
- Oxalic acid 0,01M trong methanol.
- Citric acid monohydrate.
- Dinatri photphat rắn.
- Dung dịch Mc.Ilvanine/EDTA
- Dung dịch chuẩn gốc và chuẩn làm việc OTC và CTC; TC và DC; epi-OTC, epi-TC, epi-CTC.
16
BÁO CÁO THỰC TẬP
PHÂN TÍCH TỒN DƯ KHÁNG SINH
SVTH: PHẠM THỊ NGỌC MINH – DHPT06

Thiết bị:

3.1. XÁC ĐỊNH DƯ LƯỢNG TETRACYCLIN
17
Máy lắc Hệ thống bơm hút
chân không
Máy khuấy điện
Máy đo pH Máy đồng nhất Máy li tâm Máy HPLC
BÁO CÁO THỰC TẬP
PHÂN TÍCH TỒN DƯ KHÁNG SINH
SVTH: PHẠM THỊ NGỌC MINH – DHPT06

Cách tiến hành:
3.1. XÁC ĐỊNH DƯ LƯỢNG TETRACYCLIN
18
BÁO CÁO THỰC TẬP
PHÂN TÍCH TỒN DƯ KHÁNG SINH
SVTH: PHẠM THỊ NGỌC MINH – DHPT06

Điều kiện sắc ký:
3.1. XÁC ĐỊNH DƯ LƯỢNG TETRACYCLIN
Chương trình pha động:
- Tốc độ dòng: 0,8 mL/min.
- Bước sóng: 355 nm.
19
Thời gian Acetonitrile
Oxalic acid
0,01 M
0 phút 13 87
15 phút 36 64
BÁO CÁO THỰC TẬP
PHÂN TÍCH TỒN DƯ KHÁNG SINH

SVTH: PHẠM THỊ NGỌC MINH – DHPT06

Tính toán kết quả:
3.1. XÁC ĐỊNH DƯ LƯỢNG TETRACYCLIN
Lập ra đường chuẩn từ kết quả đo được của dung dịch làm việc. Peak tương ứng của
Tetracycline và biến dị của nó sẽ được tính toán theo đường chuẩn, được xác định theo
phương trình đường thẳng:
Trong đó:
y: diện tích peak (tc + biến dị).
x: nồng độ (ng/µL).
a: hệ số góc.
b: tung độ góc.
20
y = ax+ b
Nếu có pha loãng thì phải nhân hệ số pha
loãng để tìm được nồng độ thật có trong mẫu.
BÁO CÁO THỰC TẬP
PHÂN TÍCH TỒN DƯ KHÁNG SINH
SVTH: PHẠM THỊ NGỌC MINH – DHPT06
3.1. XÁC ĐỊNH DƯ LƯỢNG TETRACYCLIN
Sắc ký đồ xác định dư lượng Tetracycline
21
Chuẩn Tetracycline 200 ppb
Mẫu Tetracycline
BÁO CÁO THỰC TẬP
PHÂN TÍCH TỒN DƯ KHÁNG SINH
SVTH: PHẠM THỊ NGỌC MINH – DHPT06

Kết quả phân tích:
3.1. XÁC ĐỊNH DƯ LƯỢNG TETRACYCLIN

0
.
8
1
1
.
2
1
.
4
1
.
6
1
.
8
2
2
.
2
0
5
1
0
1
5
f(x) = 6.05x + 0.05
R² = 1
Đường chuẩn Tetracyclin
Nồng độ (ng/µL)

Diện tích peak
22
Mẫu Tên chất
Diện tích
peak
Nồng độ
(ng/
Giới hạn
(ng/L)
Tetra Meat
02
Oxytetra - -
200
Tetra - -
Chlotetra - -
Doxycycline - -
Tetra Meat
09
Oxytetra 2.12602 41.38455
Tetra - -
Chlotetra - -
Doxycycline - -
Mẫu Tên chất
Diện tích
peak
Tetra Meat
02
Oxytetra - -
200
Tetra - -

Chlotetra - -
Doxycycline - -
Tetra Meat
09
Oxytetra 2.12602 41.38455
Tetra - -
Chlotetra - -
Doxycycline - -
Không vượt ngưỡng giới hạn cho phép.
BÁO CÁO THỰC TẬP
PHÂN TÍCH TỒN DƯ KHÁNG SINH
SVTH: PHẠM THỊ NGỌC MINH – DHPT06
Tại sao phải xác
định dư lượng
Sulfamid?
- Thận: đau bụng thận, sạn thận, tiểu ra
máu.
- Hệ tiêu hóa: buồn nôn, nôn, tiêu chảy.
- Da: các biểu hiện dị ứng từ nhẹ đến nặng.
- Máu: thiếu máu, tan máu, giảm bạch cầu,
giảm tiểu cầu, mất bạch cầu hạt, suy tủy.
- Gan: vàng da, gây độc.
23
3.1. XÁC ĐỊNH DƯ LƯỢNG SULFAMID
BÁO CÁO THỰC TẬP
PHÂN TÍCH TỒN DƯ KHÁNG SINH
SVTH: PHẠM THỊ NGỌC MINH – DHPT06
3.1. XÁC ĐỊNH DƯ LƯỢNG SULFAMID
24


Phạm vi ứng dụng:
Phương pháp này cho phép xác định
hàm lượng tồn dư của Sulfamides có
trong thịt. Giới hạn phát hiện (LOD) trong
mẫu thịt của Sulfadiazine (SDZ),
Sulfametoxypyridazine (SPZ),
Sulfamethoxazole (SMX) tương ứng lần
lượt là: 13 g.kg-1, 10 g.kg-1, 10 g.kg-1.


Nguyên tắc:
Chiết Sulfamides tồn dư trong thịt bằng
Acetonitrile. Lượng dư Sulfamides sẽ
được xác định bằng phương pháp sắc ký
lỏng hiệu năng cao (HPLC), sử dụng đầu
dò UV ở bước sóng 265 nm, cột C18
trong điều kiện thường và pha động là
hỗn hợp đệm KH2PO4 và methanol (tỷ lệ
70:30) với tốc độ dòng là 1ml/min.