bước đầu nghiên cứu chuyển gen adp glucose pyrophosphorylase (agpase) vào giống sắn km 94 và cây thuốc lá k326

1

MỞ ĐẦU

1. Đặt vấn đề
Sắn là cây trồng dễ tính, dễ trồng thích hợp với nhiều chất đất và địa hình
(tận dụng tốt các loại đất nghèo dinh dưỡng và khô hạn), chống được động vật ăn
cỏ do có cyanogen (HCN). Hơn nữa, củ sắn có thể tồn tại trong đất qua nhiều năm
mới thu hoạch nên có thể coi là nguồn lương thực dự trữ. Nông dân trồng sắn hầu
như không phải đầu tư nhiều, hợp khả năng kinh tế với nhiều hộ gia đình nông dân
nghèo, thiếu lao động, tận dụng đất để lấy ngắn nuôi dài, có khả năng sử dụng tốt
các đất đã cạn kiệt, cho năng suất cao và ổn định nên được nó được xem như cây
“xóa đói giảm nghèo” cho nông dân. Sắn rất quan trọng trong sản xuất thức ăn
chăn nuôi gia súc sau lúa và ngô, chế biến lương thực, nhiên liệu sinh học và xuất
khẩu [9].
Hiện nay, tinh bột chế biến từ sắn, thậm chí sắn lát phơi khô, trở thành mặt
hàng mới trong xuất khẩu, đặc biệt sau khi hàng loạt các nhà máy sản xuất nhiên
liệu sinh học trong và ngoài nước được thành lập. Lần đầu tiên sau hàng chục năm,
Bộ Công Thương đã đưa sắn và các sản phẩm chế biến từ sắn vào danh mục các
mặt hàng xuất khẩu chủ lực [1].
Tuy nhiên, cây sắn cũng có một số hạn chế như trồng sắn làm kiệt đất, củ
sắn nghèo đạm và vitamin, có độc tố HCN trong sắn củ tươi, chế biến sắn gây ô
nhiễm môi trường. Một trong những giải pháp phát triển sắn bền vững là áp dụng
giống mới và kỹ thuật canh tác sắn bền vững để đạt năng suất lợi nhuận cao và duy
trì độ phì nhiêu của đất mà không mở rộng diện tích trồng sắn. Mặc dù cây sắn dễ
nhân giống vô tính bằng cành giâm nhưng rất khó khăn trong nhân giống hữu tính.
Việc ứng dụng công nghệ chuyển gen nhằm tạo ra giống sắn có năng suất cao, có
hàm lượng tinh bột cao nhằm đáp giải quyết các vấn đề thực tiễn cũng như khoa
học là hết sức cần thiết, đặc biệt trong sản xuất nhiên liệu sinh học, hàm lượng tinh

2

bột được đánh giá cao hơn năng suất. KM 94 là một trong những giống sắn chủ lực
ở Việt Nam do năng suất và hàm lượng tinh bột ổn định và cao hơn các giống
mới, được lựa chọn làm đối tượng chuyển gen [16].
Thuốc lá là một trong những cây trồng vừa có giá trị về kinh tế vừa là cây
mô hình quan trọng trong nghiên cứu công nghệ sinh học thực vật nên là đối tượng
được sử dụng nhiều nhất trong các nghiên cứu cơ bản và ứng dụng đặc biệt là dùng
làm đối tượng chuyển gen. Gen ADP Glucose pyrophosphorylase (AGPase) qui
định tổng hợp nên enzyme AGPase có vai trò xúc tác cho quá trình tổng hợp tinh
bột cây trồng.
Những lý do trên đây là cơ sở để chúng tôi xây dựng đề tài cho khóa luận
tốt nghiệp là: “Bƣớc đầu nghiên cứu chuyển gen ADP Glucose
pyrophosphorylase (AGPase) vào giống sắn KM 94 và cây thuốc lá K326”.
2. Mục tiêu của đề tài
- Xác định sự có mặt của gen ADP Glucose pyrophosphorylase ở cây thuốc lá
K326.
- Xác định khả năng sống sót của mẫu sắn KM 94 chuyển gen trên môi trường
chọn lọc.
3. Nội dung của đề tài
- Tạo nguyên liệu thực vật cho thí nghiệm chuyển gen, thí nghiệm tái sinh cây:
Nhân nhanh cây sắn KM 94 và cây thuốc lá K326.
- Tiến hành quá trình biến nạp vi khuẩn A. tumefaciens mang gen đích.
- Kiểm tra, xác định hiệu quả chuyển gen ở cây thuốc lá K326.
- Xác định khả năng sống sót của sắn KM 94 chuyển gen trên môi trường chọn lọc.
4. Đối tƣợng và thời gian nghiên cứu
4.1. Đối tƣợng nghiên cứu
Khả năng mang gen AGPase của cây thuốc lá K326 và cây sắn KM 94 chuyển
gen.

3

4.2. Thời gian nghiên cứu
- Tháng 09/ 2013: Sưu tầm, nghiên cứu tài liệu liên quan đến đề tài.
- Tháng 10/2013: Xây dựng đề cương đề tài.
- Tháng 11/2013 đến tháng 01/2014: Chuẩn bị nguyên liệu chuyển gen, thực hiện
quá trình biến nạp và tái sinh cây chuyển gen.
- Tháng 02/2014 đến tháng 03/2014: Kiểm tra, xác định hiệu quả chuyển gen.
- Tháng 04/2014 đến tháng 05/2014: Viết hoàn thiện đề tài và nghiệm thu.
5. Địa điểm và phạm vi nghiên cứu
5.1. Địa điểm nghiên cứu
Phòng thực hành Thực vật-Di truyền-Phương pháp-Vi sinh, Khoa Sinh Hóa –
Trường Đại Học Tây Bắc.
5.2. Phạm vi nghiên cứu
Đánh giá sự có mặt của gen ADP Glucose pyrophosphorylase (AGPase) ở cây
thuốc lá K326 và khả năng sống của mẫu sắn KM 94 chuyển gen.

4

Chƣơng 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1. Sơ lƣợc về cây thuốc lá K326
Cây thuốc lá có tên khoa học là: Nicotinana tabacum , thuộc ngành hạt kín
Angiosper, lớp 2 lá mầm Dicotylndones, phân lớp Asteridae, bộ hoa mõm sói
Scrophulariales, họ cà, chi Nicotiana. Trong chi Nicotiana có 50 - 70 loài, đa số là
dạng cỏ, một số dạng thân đứng, hầu hết là các dạng dại phụ [6]. Là loài bản địa
của vùng nhiệt đới và cân nhiệt đới châu Mỹ, nhưng hiện đã được trồng khắp thế
giới.

Hình 1. Thuốc lá (Nicotinana tabacum)

Trên thế giới cây thuốc lá được trồng chủ yếu ở Châu Á với diện tích canh
tác khoảng 2.500.000ha, Châu Mĩ là 1.600.000ha và Châu Phi khoảng 326.000ha
với nhiều loại thuốc lá khác nhau trong đó giống thuốc lá sợi vàng phổ biến
nhất.Vùng trồng thuốc lá cho chất lượng cao tập trung chủ yếu ở một số bang của
nước Mĩ, Cu Ba, Ấn Độ. Tại Việt Nam cây thuốc lá được canh tác từ Bắc chí Nam,

5

chủ yếu ở các tỉnh Cao Bằng và Lạng Sơn (khu vực phía Bắc), Gia Lai và Đăk Lăk
(khu vực miền Tây nguyên), Đà Nẵng, Ninh Thuận (khu vực miền Trung) và Tây
Ninh (khu vực phía Nam) [13].
Là một trong những cây trồng vừa có giá trị về kinh tế đối với người nông
dân vừa được các nhà sinh học rất quan tâm trong các nghiên cứu thuộc lĩnh vực
công nghệ tế bào thực vật. Có rất nhiều công trình trong và ngoài nước nghiên cứu
chuyển gen vào cây thuốc lá đã thành công. Cây thuốc lá có nhiều ưu điểm như:
Dễ tái sinh, thời gian sinh trưởng ngắn (60 -70 ngày ở vụ đông xuân, 50 - 60 ngày
ở vụ hè thu), hệ số nhân cao, dễ chăm sóc
.
. Đó cũng chính là lí do giải thích vì sao
cây thuốc lá đã được các nhà khoa học sử dụng làm mô hình trong nhiều nghiên
cứu biến nạp gen.
1.2. Sơ lƣợc về cây sắn
1.2.1. Nguồn gốc và phân loại
1.2.1.1. Nguồn gốc
Lịch sử tiến hóa của cây sắn cũng như các cây có củ khác là rất khó xác định
được chính xác nguồn gốc phát sinh. Bởi vì những di chỉ khảo cổ còn lại đối với
các bộ phận của cấy có bột rất hiếm hoi. Qua rất nhiều tranh cãi thì gần đây nhiều
tác giả kết luận rằng : Cây sắn có nguồn gốc phức tạp và có 4 trung tâm phát sinh
là ở Braxin có 2 trung tâm và còn lại là ở Mêhicô và Bolivia. Sắn được trồng cách
đây khoảng 3000 – 7000 năm [8].

1.2.1.2. Phân loại
Sắn hay khoai mì có tên khoa học là Manihot esculenta Crantz. Thuộc ngành
Magnoliophyta, lớp Magnoliopsida, họ Euphorbiaceae, chi Manihot, loài
M.esculenta. Sắn có số lượng nhiễm sắc thể 2n = 36 là loại cây mang lại giá trị
kinh tế cũng như gái trị dinh dưỡng cao.

6

Sắn gồm 2 loại: Sắn đắng và sắn ngọt.
Sắn đắng: là sắn có hàm lượng acid hydrocyanic lớn hơn 50mg/kg sắn tươi.
Sắn ngọt: là sắn có hàm lượng acid hydrocyanic ít hơn 50mg/kg sắn tươi [9].
1.2.1.3. Tính đa dạng và phân bố
Trong chi Manihot có 19 giống và trên 100 loài, trong đó có một số giống
sắn phổ biến ở Việt Nam như: KM 94, KM 140, KM 98-5, KM 98-1, SM 937-26,
KM 419, KM 325 Trong đề tài này chỉ nghiên cứu giống sắn: KM 94

Hình 2. Cây sắn KM 94
*Đặc điểm giống sắn KM 94
KM 94 có tên gốc là KU50 được nhập nội từ CIAT/Thái Lan trong bộ giống
khảo nghiệm Liên Á năm 1990. KM 94 là con lai của tổ hợp lai Rayong1 ×
Rayong 90. Thuộc nhóm sắn đắng, thân xanh, hơi cong ở phần gốc, không phân
nhánh ở đồng bằng nhưng lại phân nhánh cấp một ở những tỉnh miền núi. Giống ít
bị nhiễm bệnh cháy lá, củ đồng đều, thịt củ màu trắng, năng suất củ tươi: 33,0
tấn/ha, hàm lượng tinh bột 28,7%, thời gian thu hoạch 9-11 tháng.

7

Giống sắn KM 94 là giống sắn được trồng phổ biến nhất trên phạm vi toàn quốc.
Điển hình là Tây Ninh và Đồng Nai đã áp dụng giống KM 94 với diện tích hàng
trăm ha/hộ, đạt năng suất trên 30 tấn/ha [8].

1.2.2. Giá trị cây sắn
Cây sắn có giá trị kinh tế lớn về nhiều mặt. Sắn là nguồn lương thực đáng kể
cho con người, là nguồn thức ăn dồi dào cho chăn nuôi, nguồn nguyên liệu cho
công nghiệp. Tất cả các bộ phận của cây sắn đều có thể sử dụng vào mục đích
kinh tế [9].
Thành phần hóa học chính của củ sắn là gluxit, ở củ sắn tươi có tỷ lệ các
chất khoáng và vitamin khá cao đặc biệt lá canxi. Tuy nhiên, sắn có tỷ lệ protein
và lipit thấp, vì vậy khi sử dụng sắn làm lương thực phải bổ sug thêm thức ăn giàu
đạm và lipit mới cung cấp đủ năng lượng cho cơ thể.
Sử dụng sắn làm lương thực: Thực tế ở nhiều vùng trên thế giới đã coi sắn
và các sản phẩm từ sắn là nguồn lương thực chính, đặc biệt là các nước Châu Phi.
Sắn đứng vị trí thư tư trên thế giới về mặt cung cấp năng lượng cho con người.
Trong thập kỉ 20, có khoảng 450-500 triệu người ở 26 nước nhiệt đới sử dụng
nguồn năng lượng tứ sắn tới 300 kcal/ngày.
Từ sau năm 1991, đặc biệt từ năm 1996 đến nay nhờ sự tiến bộ trong công tác
nghiên cứu tuyển chọn giống sắn mới và khuyến nông sắn, với việc giới thiệu
giống sắn mới KM 60, KM 94 vào sản xuất đã tạo ra bước đột phá trong nghề
trồng sắn ở Việt Nam cùng với việc đưa 42 nhà máy chế biến tinh bột sắn vào hoạt
động, đã đánh dấu sự chuyển dịch vị trí cây sắn từ cây lương thực thành cây trồng
hàng hóa.
Sử dụng sắn làm thức ăn gia súc: Bên cạnh sử dụng lương thực và chế biến
tinh bột phục vụ cho các ngành công nghiệp, sắn còn là nguồn thức ăn cho gia súc.

8

Ở nước ta, sắn là nguồn thức ăn quan trọng trong chăn nuôi của các hộ gia
đình. Trong những năm gần đây, bên cạnh phối hợp sắn vào khẩu phần thức ăn hỗn
hợp trong công nghiệp chế biến thức ăn gia súc, việc nghiên cứu ủ chua sắn củ tươi
phục vụ chăn nuôi lợn quy mô gia đình đã được chú ý và đã xây dựng thành quy
trình kỹ thuật đang được nhiều hộ gia đình áp dụng vào chăn nuôi lợn ở khu vực

miền Trung.
Chế biến tinh bột từ củ sắn: Củ sắn là nguyên liệu chế biến tinh bột và tinh
bột biến tính. Trong đó Châu Á là lục địa chế biến và xuất khẩu đứng đầu thế giới.
Sử dụng lá sắn: Lá sắn có chứa nhiều chất dinh dưỡng. Lá sắn ngọt là một
loại rau đối với Châu Phi, lá sắn được bó thành bó bán ở chợ như một loại rau. Ở
Việt Nam, nhân dân ta dùng lá sắn non để luộc ăn hoặc muối chua [8].
1.2.3. Thực trạng phát triển sắn ở Việt Nam
Ở Việt Nam, sắn là cây lương thực, thức ăn gia súc quan trọng sau lúa và
ngô. Năm 2005, cây sắn có diện tích thu hoạch 432 nghìn ha, năng suất 15,35
tấn/ha, sản lượng 6,6 triệu tấn, so với cây lúa có diện tích 7.326 ha, năng suất 4,88
tấn/ha, sản lượng 35,8 triệu tấn, cây ngô có diện tích 995 ha, năng suất 3,51 tấn/ha,
sản lượng gần một triệu tấn (FAO, 2007). Cây sắn là nguồn thu nhập quan trọng
của các hộ nông dân nghèo do sắn dễ trồng, ít kén đất, ít vốn đầu tư, phù hợp sinh
thái và điều kiện kinh tế nông hộ. Sắn chủ yếu dùng để bán (48,6%) kế đến dùng
làm thức ăn gia súc (22,4%), chế biến thủ công (16,8%), chỉ có 12,2% dùng tiêu
thụ tươi [8].
Sắn cũng là cây công nghiệp có giá trị xuất khẩu và tiêu thụ trong nước. Sắn
là nguyên liệu chính để chế biến bột ngọt, bio- ethanol, mì ăn liền, bánh kẹo, siro,
nước giải khát, bao bì, ván ép, phụ gia dược phẩm, màng phủ sinh học và chất giữ
ẩm cho đất. Toàn quốc hiện có trên 60 nhà máy chế biến tinh bột sắn với tổng công
suất khoảng 3,8 triệu tấn củ tươi/năm và nhiều cơ sở chế biến sắn thủ công rãi rác
tại hầu hết các tỉnh trồng sắn. Việt Nam hiện sản xuất mỗi năm khoảng 800.000 –

9

1.200.000 tấn tinh bột sắn, trong đó trên 70% xuất khẩu và gần 30% tiêu thụ trong
nước. Sản phẩm sắn xuất khẩu của Việt Nam chủ yếu là tinh bột, sắn lát và bột sắn.
Thị trường chính là Trung Quốc, Đài Loan, Nhật Bản, Singapo, Hàn Quốc. Đầu tư
nhà máy chế biến bio- etanol là một hướng lớn triển vọng [8].
Sản xuất lương thực là ngành trọng tâm và có thế mạnh của Việt Nam tầm

nhìn đến năm 2020. Chính phủ Việt Nam chủ trương đẩy mạnh sản xuất lúa, ngô
và coi trọng việc sản xuất sắn, khoai lang ở những vùng, những vụ có điều kiện
phát triển. Thị trường xuất khẩu sắn lát và tinh bột sắn Việt Nam dự báo thuận lợi
và có lợi thế cạnh tranh cao do có nhu cầu cao về chế biến bioethanol, bột ngọt,
thức ăn gia súc và những sản phẩm tinh bột biến tính. Diện tích sắn của Việt Nam
dự kiến ổn định khoảng 450 nghìn ha nhưng sẽ tăng năng suất và sản lượng sắn
bằng cách chọn tạo và phát triển các giống sắn tốt có năng suất củ tươi và hàm
lượng tinh bột cao, xây dựng và hoàn thiện quy trình kỹ thuật canh tác sắn bền
vững và thích hợp vùng sinh thái [8].
1.3. Tổng quan tình hình nghiên cứu thuộc lĩnh vực của đề tài ở trong và
ngoài nƣớc
1.3.1. Trên thế giới
Các chương trình nhân giống truyền thống tại Centro Internacional de
Agricultura Tropical (CIAT), Colombia, và Viện Nông nghiệp Nhiệt đới Quốc tế
(IITA), Nigeria, hai Trung tâm CGIAR đã thành công trong việc phát triển và tạo
các giống sắn tăng khả năng kháng bệnh và côn trùng, hàm lượng chất khô và cải
thiện chất lượng sắn ở châu. Lai giống truyền thống khó có khả năng cung cấp giải
pháp toàn diện để cải thiện cây trồng cho phù hợp với nhu cầu của người nông dân
và sản xuất thương mại khác nhau ở vùng nhiệt đới. Việc áp dụng công nghệ biến
đổi gen để đưa những tính trạng nông dân mong muốn vào giống cây trồng tạo ra
dòng ưu tú [21]. Trên thực tế, khả năng chuyển vật liệu di truyền mới vào hệ gen
cây sắn theo cách này là cần thiết. Sau một thời gian phát triển công nghệ trong

10

những năm 1990 đã có tiến bộ đáng kể ở lĩnh vực tạo cây sắn biến đổi gen để tăng
cường giá trị cho người sản xuất và người tiêu dùng. Mọi nỗ lực hướng vào tích
hợp những đặc điểm nông dân mong muốn vào giống cây dành cho thương mại
trong tương lai. Công nghệ biến đổi gen có đầy đủ tiềm năng đưa cây sắn trở thành
cây lương thực và hàng hóa trong thế kỷ 21 [21].

Công nghệ biến đổi gen cho phép những tính trạng có lợi được chuyển từ
một giống sắn này tới giống sắn khác và từ họ hàng hoang dại, vượt qua ranh giới
loài và các vấn đề về thụ phấn chéo và giao phối cận huyết. Ngoài ra, chuyển vật
chất di truyền từ các nguồn ngoại lai như virus cho chiến lược kháng tác nhân gây
bệnh, và gene vi khuẩn kháng sâu có thể được phát triển và triển khai mang lại lợi
nhuận cho nông dân trồng sắn. Công nghệ chuyển gene ở sắn cũng như các loại
cây trồng khác, hệ thống biến đổi gen trong sắn phụ thuộc vào khả năng tạo các tế
bào toàn năng và mô của hệ thống nuôi cấy mô. Đây là mục tiêu cho chuyển gene,
sau khi chọn lọc thành công tái sinh cây chuyển gene hoàn chỉnh. Ở sắn, không hệ
thống tái sinh nào tái sinh được cây từ mô trưởng thành. Tuy nhiên, nghiên cứu
ban đầu đã xác định rằng phôi soma có thể được cảm ứng và cây được tạo ra từ
mẫu lá chưa hoàn chỉnh trên môi trường Murashige và Skoog (1962) bổ sung
auxin. Cây tái sinh theo cách này là dạng vô tính của vật liệu gốc trưởng thành, giữ
nguyên tất cả các tính trạng của các tế bào mầm có được. Những cấu trúc phôi đa
bào và phôi thứ cấp có thể được tạo ra từ các tế bào mầm [19] đã được sử dụng
làm mục tiêu cho chuyển gen khi chương trình kỹ thuật di truyền của sắn được bắt
đầu vào đầu những năm 1990. Sau một thời gian thất bại, đã có bằng chứng cho
việc tạo phôi và thực vật chuyển gen lần đầu tiên được đưa ra vào năm 1994 [20].
Tiếp theo là bước đột phá trong tái sinh cây từ hệ thống phôi, dẫn đến phục hồi xác
nhận cây sắn biến đổi gen biểu hiện uidA và gen chỉ thị luciferine [18].
1.3.2. Tại Việt Nam

11

Nghiên cứu nuôi cấy mô thực vật bắt đầu từ năm 1975. Phòng Công nghệ tế
bào thực vật – Viện Công nghệ sinh học do GS. Lê Trần Bình và PTS. Chu Hoàng
Hà đứng đầu là nhóm nghiên cứu đầu tiên ở Việt Nam đã thành công trong việc
ứng dụng kỹ thuật RNAi trong tạo cây chuyển gen kháng virus. Một trong những
kết quả của đề ta
̀

i cấp Viê
̣
n KH&CN Viê
̣
t Nam đươ
̣
c ti ến ha
̀
nh trong 2 năm 2007-
2008: “Nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật RNA trong tạo giống cây trồng chuyển gen
kháng bệnh virus”. Kĩ thuật chuyển gen vào thực vật đã được một số tác giả
nghiên cứu thành công, cụ thể như:
Năm 2008, Bùi Lan Anh, Nguyễn Phan Cẩm Tú, Trần Nguyên Vũ, Bùi
Văn Lệ thực hiện đề tài “Xây dựng quy trình biến nạp gen bar-gen kháng thuốc
diệt cỏ vào cây khoai mì (Manihot esculenta Crantz) bằng phương pháp bắn gen”.
Năm 2008, Đỗ Tiến Phát và cộng sự tiến hành nghiên cứu đề tài “Đánh giá ảnh
hưởng của thời gian nhiễm khuẩn tới hiệu quả chuyển gen vào cây bông
(Gossypium hirsutum L) thông qua Agrobacterium tumefaciens”.
Năm 2007, Bùi Lan Anh, Nguyễn Phan Cẩm Tú, Trần Nguyên Vũ, Bùi Văn
Lệ của Trường Đại học Khoa Học Tự Nhiên, ĐHQG-HCM đã tiến hành nghiên
cứu đề tài “Xây dựng quy trình biến nạp gen bar-gen kháng thuốc diệt cỏ vào cây
khoai mì (Manihot esculenta Crantz) bằng phương pháp bắn gen” được đăng trên
tạp chí phát triển khoa học và công nghệ, tập 11, số 01, năm 2008.12. Tất cả các
nghiên cứu trên đã tiến hành thành công và được công bố tuy nhiên chưa có công
trình nào nghiên cứu thành công về việc chuyển gen AGPase vào giống sắn.
1.4. Vi khuẩn A. tumefaciens và hiện tƣợng biến nạp gen ở thực vật
1.4.1. Giới thiệu chung về vi khuẩn A. tumefaciens
A.tumefaciens là loài vi khuẩn sống trong đất gây ra bệnh khối u hình chóp ở
các vị trí tổn thương của thực vật hai lá mầm (hình 3). Chỉ rất ít thực vật một lá
mầm thuộc họ Liliaceae và Amaryllidaceae là dễ bị bệnh khối u hình chóp. Sự sinh

trưởng khối u có thể tiếp diễn khi vắng mặt vi khuẩn và mô khối u có thể được sinh

12

trưởng vô trùng bằng nuôi cấy mô trong các môi trường thiếu sự bổ xung auxin và
cytokinine ngoại sinh mà bình thường là cần thiết để xúc tiến sự sinh trưởng của
mô thực vật in vitro. Mô khối u tổng hợp amino acid và các dẫn xuất của đường
được biết chung là opine. Loại opine tổng hợp trong khối u (ví dụ như nopaline,
octopine, agrocinopine, mannopine và agropine) phụ thuộc vào dòng
Agrobacterium khởi đầu sự hình thành khối u. Octopine và nopaline là hai loại
opine có nguồn gốc từ arginine và dễ dàng phát hiện nhất trong mô khối u hình
chóp. Do đó nhiều dòng A. tumefaciens phổ biến được thiết kế theo kiểu octopine
hoặc nopaline [3].
A. tumefaciens có khả năng xâm nhiễm tế bào thực vật bằng cách chuyển
một đoạn ADN của nó vào tế bào thực vật. Khi ADN vi khuẩn được hợp nhất với
nhiễm sắc thể thực vật, nó sẽ tấn công vào hệ thống tổ chức của tế bào một cách có
hiệu quả và sử dụng nó để đảm bảo cho sự sinh sổi của quần thể vi khuẩn [3].
Để khai thác và sử dụng A.tumefaciens như là một vector chuyển gen các
nhà khoa học đã loại bỏ các gen gây khối u và gen mã hóa opine của T-ADN và
thay thế vào đó là các marker chọn lọc, trong khi vẫn duy trì các vùng bờ phải và
bờ trái của T-ADN và các gen vir. Gen chuyển được xen vào giữa các vùng bờ của
T-ADN. Nó sẽ được chuyển vào tế bào và trở nên hợp nhất với nhiễm sắc thể tế
bào thực vật. Phương pháp chuyển gen gián tiếp nhờ A. tumefaciens đã được kiểm
tra đối với sự xâm nhập bền vững, sự biểu hiện và sự di truyền của các gen chuyển
đặc biệt. Tuy nhiên, một vài yếu tố ảnh hưởng đến hiệu quả biến nạp là loại mô
được biến nạp, giai đoạn phát triển của mô, mức khởi đầu của vi khuẩn A.
tumefaciens sử dụng, môi trường để nuôi cấy mô sau khi biến nạp, marker được sử
dụng để chọn lọc thể biến nạp, loại vector sử dụng và kiểu gen của thực vật [3].

13

Hình 3. Khối u trên thân cây gây ra do A. tumefaciens
Chính plasmid đã mang gen gây khối u cho cây được gọi là plasmid Ti
(Tumo inducing plasmid).
1.4.2. Cấu trúc và chức năng của Ti-plasmid
Đó là các vòng DNA tự do sinh sản độc lập. Ở vi khuẩn plasmid liên quan
tới yếu tố giới tính của tế bào, đến khả năng chống chịu các loại kháng sinh,… Đặc
điểm quan trọng của plasmid là chúng có thể liên kết vào nhiễm sắc thể nhưng
cũng có thể tồn tại bên ngoài nhiễm sắc thể một cách độc lập [3].

Hình 4. Ti-Plasmid
Ti-plasmid được tìm thấy trong tất cả các dòng A. tumefaciens gây độc, có
kích thước khoảng 200-250 kb. Chúng được duy trì ổn định trong A. tumefaciens ở

14

nhiệt độ dưới 30
0
C. Bằng phương pháp lai ADN-ADN và lập bản đồ chuỗi kép di
hợp (heteroduplex mapping), người ta đã xác định được Ti-plasmid có 4 vùng
tương đồng. Kết quả phân tích di truyền cho thấy vùng T-ADN (transferred DNA)
và vùng gây độc (virulence) liên quan đến sự hình thành khối u trong khi hai vùng
khác liên quan đến sự tiếp hợp và sự tái bản của plasmid trong A. Tumefaciens [3].
Trong khi hình thành khối u, T-ADN được chuyển vào tế bào thực vật và
hợp nhất với genome nhân. T-ADN ổn định trong genome nhân. Lai Ti-plasmid
với ADN của khối u đã cho thấy T-ADN trong tế bào thực vật là tương ứng song
song với T-ADN trong Ti-plasmid của A. tumefaciens. Kết quả này chứng tỏ
không có sự sắp xếp lại vị trí của T-ADN trong lúc khối u được tạo thành. Một
hoặc nhiều bản sao của T-ADN có thể có mặt ở các đoạn lặp nối tiếp. Chúng cũng

có thể tách ra và liên kết với các vùng khác nhau của ADN thực vật. Vị trí hợp
nhất của T-ADN vào ADN thực vật là tương đồng hoặc không tương đồng [3].
1.4.3. Cấu trúc và chức năng của T-ADN
T-ADN là một đoạn ADN có kích thước 25 kb, trong đó chứa gen mã hóa
cho sinh tổng hợp auxin, cytokinin, opine và các gen gây khối u. Trong Ti-plasmid,
vị trí của T-ADN được giới hạn bằng bờ phải (RB- Right Border) và bờ trái (LB-
Left Border). Ngoài T-ADN, trên Ti-plasmid còn có các vùng ADN mã hóa cho
việc tái sinh plasmid, cho khả năng lấy nhiễm và tiếp hợp (vùng vir), cho việc tiêu
hóa opine.
Trong các vùng ADN của Ti-plasmid, ngoài T-ADN được nghiên cứu nhiều
hơn cả là vùng ADN phụ trách khả năng lây nhiễm còn gọi là vùng vir. Sản phẩm
hoạt động của các gen nằm trong vùng vir dưới tác động kích thích của các hợp
chất phenol tiết ra từ vết thương là một loạt các protein đặc hiệu như virE
2
, virB,
virD, virD
2
,… Các protein này nhận biết các vết thương ở các cây chủ thích hợp
(hầu hết là cây hai lá mầm), kích thích sản sinh ra các đoạn T-ADN, bao bọc che

15

chở các đoạn ADN này và giúp chúng tiếp cận với hệ gen của cây chủ một cách an
toàn [3].
1.4.4. Cơ chế phân tử của việc chuyển gen thông qua A. tumefaciens
Các tế bào cây bị tổn thương sẽ tiết ra các hợp chất hoá học hydroxy-
acetosyringon dẫn dụ vi khuẩn. Dưới tác dụng của chất dẫn dụ, A.tumefaciens nhận
biết rồi bám vào thành tế bào chủ và chuyển T-ADN vào tế bào thực vật. Quá trình
này được sự trợ giúp đặc biệt của các gen vir và RB, LB. Cũng chính các hợp chất
này, với vai trò cảm ứng, giúp cho các gen vùng vir hoạt động và tăng cường biểu

hiện [6].
Sự tiếp xúc của Agrobacterium với các hợp chất giải phóng từ mô thực vật
bị tổn thương đã làm cho vùng vir của Ti-plasmid phiên mã. Trong quá trình này
một chất có hoạt tính hóa học cao và đặc trưng đã được nhận biết là AS. Gen virA
và gen virC được biểu hiện ở vi khuẩn sinh trưởng sinh dưỡng mặc dù gen virC chỉ
được phiên mã ở mức độ thấp. Khi Agrobacterium gặp dịch rỉ của các tế bào thực
vật bị tổn thương, hoặc AS tinh khiết, sản phẩm của gen virA (có thể liên kết với
màng) sẽ nhận diện và tương tác với AS và truyền tín hiệu ngoại bào vào trong tế
bào này làm hoạt hóa sản phẩm của gen virC. Sau đó protein virC đã biến đổi hoạt
hóa làm cho các gen virB, C, D và E không hoạt động và làm tăng cường sự phiên
mã của gen virC [6].
Sự cảm ứng gen vir xảy ra nhờ sự xuất hiện các điểm đứt sợi đơn trong các
trình tự biên 25 bp nằm ở mép của T-ADN và sự xuất hiện phân tử sợi đơn mạch
thẳng tương ứng với T-ADN. Các sản phẩm của operon vir D có hoạt tính
endonuclease [3]. Bằng một cơ chế tương tự sự tiếp hợp của vi khuẩn, T-ADN
được chuyển sang tế bào thực vật và xen một cách ổn định vào ADN nhân (hình
5).

16


Hình 5. Cơ chế biến nạp A.tumefaciens vào tế bào thực vật



1.5. Gen ADP glucose pyrophosphorylase (AGPase)
ADP Glucose pyrophosphorylase (AGPase) có kích thước 1500bp, là gen
quy định việc tổng hợp nên enzyme AGPase có vai trò xúc tác cho quá trình tổng
hợp tinh bột trong cây. Làm tăng tốc độ luân chuyển tinh bột ở cây chuyển gen.
Sự biểu hiện của dạng đột biến G336D (glgC16) của APGase vi khuẩn ở củ

khoai tây làm tăng 36% hoạt tính APGase và tăng tương ứng 35% hàm lượng tinh
bột trong củ. Sự tăng quá trình tạo thành tinh bột trong củ chỉ xảy ra khi gen
glgC16 được biểu hiện ở trong củ (được điều khiển bởi promoter patatin). Ngược
lại, sự biểu hiện của gen glgC16 trong tất cả các mô dẫn tới hiệu suất yếu đi, có thể
do kết quả của phân bố carbohydrate không phù hợp giữa mô đồng hoá và dị hoá.
Hoạt tính APGase cao hơn (200-400%) trong khoai tây chuyển gen biểu hiện gen
glgC16 (dưới sự kiểm soát của promoter patatin), tuy nhiên chúng không làm tăng
năng suất tinh bột. Điều này là do tốc độ luân chuyển tinh bột cao hơn trong củ

17

chuyển gen. Kết quả này cho thấy các mức độ trạng thái ổn định tinh bột trong củ
chuyển gen có thể bị ảnh hưởng bởi nhu cầu nguồn – nơi chứa của các mô khác
cũng như bởi tốc độ tiềm năng của quá trình tổng hợp ADP – glucose.
Uzoma Ihemere và cs giả thiết rằng sự tạo ADP – glucose được tăng cường
bởi APGase vi khuẩn với sự điều hoà allosteric đã được biến đổi có thể làm tăng
quá trình tạo tinh bột trong củ sắn do khả năng tạo sucrose của cây sắn được tăng
cường. Nhóm nhà nghiên cứu này đã tạo ra cây chuyển gen biểu hiện gen glgC
E.coli đã bị biến đổi (G336D). Các cây này có hoạt tính APGase gần như cao gấp
đôi và sinh khối rễ và bộ phận trên mặt đất (thân, lá) lớn gấp 2 lần so với cây
hoang dại. Các nhà nghiên cứu này cho rằng sự tạo thành sinh khối phía trên mặt
đất được tăng cường thể hiện sự giải phóng ức chế ngược ở quang hợp (sự tích luỹ
chất khô), tương tự như khi biểu hiện gen glgC ở củ khoai tây và nội nhũ lúa mì và
nội nhũ lúa [23].
Trong lục lạp xảy ra quá trình quang hợp tổng hợp chất hữu cơ. Sản phẩm đầu tiên
của quá trình quang hợp là một chất hữu cơ có 3 cacbon AlPG (Alđêhit
phôtphogliêric – là một triôzơ-P). Trong chu trình Calvin kết thúc giai đoạn khử
phân tử AlPG được tách ra khỏi chu trình, đó là chất khởi đầu tổng hợp nên
C6H12O6 rồi từ đó tổng hợp nên tinh bột. Glucose -1- phosphat chuyển thành
ADP – glucose sử dụng một gốc phosphat từ phân tử ATP và có sự xúc tác của

ADP glucose pyropgosphorylase ((hình 6).


18


Hình 6. Sơ đồ quá trình tổng hợp tinh bột có sự xúc tác
của enzyme AGPase




19

Chƣơng 2. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Vật liệu
2.1.1. Vật liệu thực vật
Mảnh lá thuốc lá K326.
Đoạn thân non, mảnh lá chưa trưởng thành, mảnh lá mầm sắn KM 94.
2.1.2. Vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens
Agrobacterium tumefaciens thuộc chủng CV58 mang gen ADP glucose
pyrophotphorylase (AGPase).
2.2. Hóa chất, thiết bị và môi trƣờng nuôi cấy
2.2.1. Hóa chất:
+ Yeast extract, beef extract, Bacto pepton, NaCl, NH
4
NO
3
, KNO
3

, CaCl
2
.2H
2
O,
MgSO
4
.7H
2
O, KH
2
PO
4
, KI, H
3
BO
3
,

MnSO
4
.4H
2
O, ZnSO
4
.7H
2
O, CuSO
4
.5H

2
O,
COCl
2
. 6H
2
O, Na
2
MO
4
.2H
2
O, Na
2
EDTA, FeSO
4
.7H
2
O, Nicotinic acid, Pyridoxin
HCl, Thiamin HCl, Glycine.
+ Nguồn cacbon: Đường glucose.
+ Các loại kháng sinh: Kanamycin, rifamycin, cefotaxim.
+ Các chất điều hòa sinh trưởng và các VTM như: BAP, Picloram, VTM C, VTM
mix.
+ Chất làm thay đổi trạng thái môi trường: Agar.
2.2.2. Thiết bị
Buồng cấy vô trùng, phòng nuôi, máy đo pH, máy khuấy từ, cân phân tích,
máy li tâm lạnh, máy lắc ổn nhiệt, nồi khử trùng, tủ sấy, bếp điện, bình nuôi cấy,
bộ dụng cụ cấy, cùng một số thiết bị khác của phòng thực hành Thực vật – Di
truyền, Khoa Sinh Hóa – Trường Đại Học Tây Bắc.

20


2.2.3. Môi trƣờng nuôi cấy
Bảng 1. Thành phần môi trường MS (Murashige và Skoog)
Môi trường
MS
Thành phần
MS I
1650,0mg/l NH
4
NO
3
+ 1900,0mg/l KNO
3
+ 170mg/l KH
2
PO
4
+
370mg/l MgSO
4
.7H
2
O + 440,0mg/l CaCl
2

.2H
2
O
MS II
37,3mg/l Na
2
EDTA + 27,8mg/l FeSO
4
.7H
2
O
MS III
0,83mg/l KI + 0,025mg/l CuSO
4
.5H
2
O + 0,025mg/l COCl
2
.
6H
2
O + 0,25mg/l Na
2
MO
4
.2H
2
O
MS IV
22,3mg/l MnSO

4
.4H
2
O

+ 6,2mg/l H
3
BO
3
+ 8,6mg/l
ZnSO
4
.7H
2
O
MS V
0,025g/l Nicotinic acid + 0,5mg/l Pyridoxin HCl + 0,1mg/l
Thiamin HCl + 2,0mg/l Glycine


Bảng 2. Thành phần của môi trường nuôi cấy
Môi trường
Thành phần
Môi trường
cấy chuyển
Thuốc
lá
MS đặc + Cefotaxim 250mg/l
Sắn
MS đặc

Môi trường
nuôi khuẩn
(YEB)
YEB
lỏng
1g/l Yeast extract + 5g/l beef extract + 5g/l pepton
+ 5g/l NaCl + 5g/l sacarose
YEB
đặc
1g/l Yeast extract + 5g/l beef extract + 5g/l pepton
+ 5g/l NaCl + 5g/l sacarose + 15g/l agar
Môi trường
đồng nuôi
Thuốc
lá
MS đặc + BAP 1mg/l + AS 200mg/l, pH 5,8)

21

cấy
Sắn
MS đặc + picloram 12mg/l + AS 200mg/l, pH 5.8
Môi trường
chọn lọc
Thuốc
lá
MS + BAP 1mg/l + Kanamycin 50mg/l +
Cefotaxim 250mg/l, pH 5,8
Chọn
lọc sắn

MS + Picloram 12mg/ml+ Kanamycin 50mg/l +
Cefotaxim 250mg/l, pH 5,8
Môi trường cảm ứng
thuốc lá
MS đặc + BAP 1mg/l
Môi trường tạo mô sẹo
hay tái sinh
MS bột + Picloram 12mg/l + 1ml/l VTM C + 1ml/l
VTM mix
MS đặc
20ml/l MS I + 10ml/l MS II + 10ml/l MS III
+10ml/l MS IV + 10ml/l MS V + 30g/l đường +
7,5g/l agar, pH 5,8
½ MS lỏng
10ml/l MS I + 5ml/l MS II + 5ml/l MS III +5ml/l
MS IV + 5ml/l MS V + 30g/l đường, pH 5,8, không
bổ sung agar
MS bột
4,3g/l MS bột + 20g/l đường + 1ml/l CuSO
4
0,2µM
+ 7,5g/l Agar, pH 5,8

2.3. Phƣơng pháp nghiên cứu
2.3.1. Phƣơng pháp nuôi cấy in vitro
- Lựa chọn vật liệu chuyển gen: Lá chưa trưởng thành, đoạn thân non, lá mầm sắn
KM 94 và mảnh lá K326.
- Cảm ứng vật liệu chuyển gen trước khi gây nhiễm với vi khuẩn A.tumefaciens
trên môi trường MS bổ sung picloram nồng độ 12mg/l (đối với thuốc lá thì thay
picloram bằng BAP nồng độ 1mg/l trong thời gian 2 ngày.

- Gây nhiễm với vật liệu chuyển gen: Gây nhiễm mô vật liệu với vi khuẩn
Agrobacterium ở mật độ OD = 0,8. Trong khoảng thời gian 30 phút.

22

Đồng nuôi cấy vật liệu và vi khuẩn trong khoảng thời gian 2 ngày.
Loại bỏ vi khuẩn A.tumefaciens sau khi đồng nuôi cấy với vật liệu chuyển gen MS
lỏng bổ sung kháng sinh cefotaxim nồng độ 250mg/l.
Chọn lọc các mẫu nuôi cấy đã gây nhiễm bằng kanamycin nồng độ 50mg/l.
Tái sinh chồi chuyển gen từ phôi soma sau khi chọn lọc bằng kanamycin trên môi
trường MS bổ sung BA với nồng độ 3mg/l.
2.3.1.1. Tạo vật liệu chuyển gen
* Lá chƣa trƣởng thành và đoạn thân non từ 10 – 12 ngày tuổi
+ Cắt các đoạn thân chứa mắt có chiều dài từ 1 – 1,5cm và cắm trên môi trường
MS đặc trong điều kiện thời gian chiếu sáng là 12h/ngày và nhiệt độ là 28 – 29
0
C.
+ Sau 10 – 12 ngày cắt đoạn thân dài 1 – 1,5cm và mảnh lá non chưa trưởng thành
có S=2×2mm ta được vật liệu chuyển gen.
* Lá mầm sắn KM 94
+ Lấy nguyên liệu là đoạn thân non có chiều dài là 1 – 1,5cm và mảnh lá non chưa
trưởng thành có S=2×2mm mang đi tạo mô sẹo trên môi trường MS bột có bổ sung
Picloram nồng độ 12mg/l, VTM C và VTM mix.
+ Sau đó mô sẹo phát triển thành phôi, xuất hiện lá mầm. Cắt lá mầm có
S=2×2mm ta được vật liệu chuyển gen.
* Mảnh lá thuốc lá
- Cắt đoạn thân có mắt cắm vào môi trường MS có bổ sung cefotaxim nồng độ
250mg/l. Sau khoảng 3 tuần cắt các mảnh lá có diện tích 1×1cm để biến nạp.

23

2.3.1.2. Các bƣớc chuyển gen
Quy trình:










Bƣớc 1: Chuẩn bị vật liệu biến nạp và cảm ứng
Vật liệu biến nạp được tạo và đặt lên đĩa petri chứa môi trường cảm ứng có bổ
sung picloram nồng độ 12 mg/l, (đối với thuốc lá thì thay picloram bằng BAP nồng
độ 1mg/l). Dán kín đĩa bằng parafilm và để trong tối 2 ngày.
Bƣớc 2: Biến nạp vi khuẩn mang gen AGPase vào vật liệu
 Nuôi vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens mang gen đích.
- Lấy: 30ml môi trường YEB lỏng có bổ sung 30µl kanamycin nồng độ 50mg/l,
30 µl rifamycin nồng độ 50mg/l và 1 khuẩn lạc sau đó cho vào bình tam giác (V =
50ml) nuôi lắc 120 vòng/phút ở 27
0
C trong vòng 16 giờ.
- Ngày hôm sau nuôi phục hồi bằng cách: Lấy 10ml môi trường YEB lỏng có bổ
sung thêm 15ml dịch nuôi khuẩn ngày hôm trước nuôi lắc từ 2 – 4 giờ đến khi
OD
660
đạt 0,8.

- Đổ dịch khuẩn vào 2 ống li tâm với trọng lượng bằng nhau, li tâm ở mức 5000
vòng trong 15 phút, 4
0
C. Sau li tâm, bỏ pha trên của ống li tâm, giữ lại vi khuẩn ở
phía dưới.
Bƣớc 3: Đồng
nuôi cấy

Bƣớc 2: Biến nạp
vi khuẩn mang
gen AGPase vào
vật liệu

Bƣớc 1: Chuẩn
bị vật liệu biến
nạp và cảm ứng

v
Bƣớc 4: Rửa
khuẩn

Bƣớc 5: Chọn
lọc và tái sinh
cây
Bƣớc 6: Tạo cây
hoàn chỉnh và
xác định hiệu
quả chuyển gen

v

v
v

24

- Hòa tan tủa vi khuẩn bằng ½ MS lỏng có thể tích bằng thể tích pha trên hoặc ít
hơn hoặc nhiều hơn tùy thuộc OD của vi khuẩn có bổ sung AS với nồng độ 200
µl/l.
 Biến nạp
- Gắp mẫu (đoạn thân, mảnh lá, lá mầm) sau khi đã cảm ứng sau đó xếp ra đĩa
petri.
- Đổ dung dịch vi khuẩn (đã được pha loãng trong môi trường ½ MS lỏng có bổ
sung AS với nồng độ 200 µl /l) vào đĩa petri có mẫu. Lắc nhẹ trong 30 phút.
Bƣớc 3: Đồng nuôi cấy
- Gắp mẫu đã biến nạp đặt lên giấy thấm và thấm khô mảnh lá.
- Đặt các mảnh lá đã được thấm khô lên môi trường đồng nuôi cấy (MS đặc có bổ
sung picloram nồng độ 12mg/l và AS nồng độ 200µl/l, pH 5.8). Để trong tối 2
ngày (đối với thuốc lá thì thay picloram bằng BAP nồng độ 1mg/l.
Bƣớc 4: Rửa khuẩn
- Sau quá trình đồng nuôi cấy, gắp mẫu vào bình tam giác để rửa khuẩn. Dung dịch
rửa khuẩn là ½ MS lỏng có bổ sung cefotaxim nồng độ 250 mg/l sau đó đổ dung
dịch rửa khuẩn vào bình chứa mẫu và lắc khoảng 5 phút, chắt nước đổ đi, tiếp tục
rửa lặp lại cho đến khi sạch khuẩn, sau đó gắp mẫu đặt lên giấy thấm để thấm khô.
Bƣớc 5: Chọn lọc và tái sinh cây
- Chuyển mẫu sang đĩa petri chứa môi trường chọn lọc: MS đặc có bổ sung
picloram nồng độ 12mg/l, kanamycin với nồng độ 50mg/l và cefotaxim với nồng
độ 250 mg/l (đối với thuốc lá thì thay picloram bằng BAP nồng độ 1mg/l.
- Sau 3 – 4 tuần xuất hiện các chồi nhỏ từ các mẫu (đối với thuốc lá). Tiến hành
tách các chồi thuốc lá, cấy trên môi trường chọn lọc mới.
Bƣớc 6: Tạo cây hoàn chỉnh và xác định hiệu quả chuyển gen ở thuốc lá K326

- Khi chồi mọc cao khoảng 2 – 3cm tiến hành tách các chồi nhỏ này và chuyển
sang môi trường ra rễ.

25

- Sau 3 tuần các cây in vitro được đưa ra ngoài môi trường. Cây non được chuyển
sang trồng trong bầu.
- Thu mẫu và xác định hiệu quả chuyển gen.

2.3.2. Phân tích sự có mặt của cấu trúc chuyển gen AGPase bằng
phương pháp PCR
Kỹ thuật PCR (Polymerase Chain Reaction - phản ứng chuỗi polymerase)
được Kary B Mullis phát hiện ra năm 1983. Đây là phương pháp trong ống nghiệm
để tổng hợp các trình tự DNA đặc hiệu nhờ enzyme, sử dụng hai mồi
oligonucleotide để khuếch đại vùng DNA quan tâm nằm giữa hai mồi bằng cách
lặp lại nhiều chu kỳ với các bước biến tính hai mạch DNA khuôn bắt cặp các mồi
và kéo dài các sợi. Kĩ thuật PCR đơn giản, dễ thực hiện với hầu hết các phòng thí
nghiệm được trang bị máy PCR. Trong phân tích cây chuyển gen, gen chuyển đã
được biết trình tự vì vậy chỉ cần sử dụng cặp mồi đặc hiệu cho gen đó và tách chiết
DNA từ mẫu thực vật cần xác định làm khuôn là có thể tiến hành PCR. Sử dụng
plasmid mang gen chuyển làm đối chứng, nếu sản phẩm PCR khi điện di có kích
thước đúng như dự kiến và bằng với đối chứng thì mẫu phân tích được gọi là
dương tính [3].
Kỹ thuật PCR (Polymerase Chain Reaction - phản ứng chuỗi polymerase)
dựa trên nguyên tắc bắt cặp đặc hiệu của các đoạn DNA có trình tự bổ sung và
phản ứng kéo dài đoạn trình tự mồi nhờ enzym Taq DNA polymerase để khuếch
đại theo hàm mũ các đoạn DNA quan tâm lên hàng triệu lần [3].
ADN tổng số từ lá thuốc lá được tách chiết và sử dụng làm khuôn mẫu cho
phản ứng PCR với cặp mồi đặc hiệu nhằm xác định sự có mặt của gen chuyển
trong các mẫu thuốc lá. Sản phẩm PCR được điện di kiểm tra trên gel agarose

0,8%.