ĐỒ ÁN CÔNG NGHỆ 1: PHƯƠNG PHÁP WESTERN BLOT

ĐỒ ÁN CÔNG NGHỆ 1 SVTH: TRẦN THỊ YẾN LỚP 10SH
MỤC LỤC
MỞ ĐẦU
CHƯƠNG 1. GIỚI THIỆU PHƯƠNG PHÁP WESTERN BLOT
1.1 Định nghĩa
1.2 Nguyên tắc
1.3 Quy trình thực hiện
1.3.1 Chuẩn bị mẫu
1.3.2 Chạy điện di một chiều với SDS-PAGE
1.3.3 Chuyển protein từ gel lên màng
1.3.4 Lai với antibody
1.3.5 Phát hiện và phân tích hình ảnh
1.4 Ưu, nhược điểm
1.4.1 Ưu điểm
1.4.2 Nhược điểm
1.5 So sánh với phương pháp ELISA
1.6 ứng dụng
CHƯƠNG 2. ỨNG DỤNG
2.1 Tình hình bệnh và tác hại bệnh trên thế giởi và ở Việt Nam
2.1.1 Tình hình nuôi tôm trên thế giới
2.1.2 Tình hình nuôi tôm ở Việt Nam
2.2 Giới thiệu hội chứng Taura- TS
2.2.1 Khái niệm
2.2.2 Đặc điểm cấu trúc và gene của Taura-TS
2.2.3 Biểu hiện bệnh hội chứng Taura ở tôm
2.3 Các phương phápvà kỹ thuật chuẩn đoán virus Taura
2.3.1 Chuẩn đoán dựa vào triệu chứng lâm sàng
2.3.2 Phương pháp miễn dịch
2.3.3 Phương pháp chuẩn đoán bằng mẫu dò gene
2.4 Vật liệu và phương pháp
GVHD: ĐOÀN THỊ HOÀI NAM TRANG: 1

ĐỒ ÁN CÔNG NGHỆ 1 SVTH: TRẦN THỊ YẾN LỚP 10SH
2.4.1 Các dung dịch gốc để nhuộm màu gel
2.4.2 Các dung dịch để thực hiện western Blot
2.4.3 Vật liệu
2.4.3.1 Kháng thể
2.4.3.2 mẫu
2.4.4 Phương pháp
2.5 Kết quả
2.6 Kết luận
GVHD: ĐOÀN THỊ HOÀI NAM TRANG: 2
ĐỒ ÁN CÔNG NGHỆ 1 SVTH: TRẦN THỊ YẾN LỚP 10SH
MỞ ĐẦU
Với những thành công lớn trong công nghệ sinh học trong những năm gần đây, trên thế
giới phương hướng nghiên cứu ứng dụng trong công tác bảo vệ thực vật đã có sự chuyển
hướng rõ rệt. Cùng với những thành công lớn trong công nghệ sinh học, thì các kỹ thuật
về sinh học phân tử ra đời: phương pháp western blot, PCR, Phương pháp western blot
là một kỹ thuật quan trọng được sử dụng trong tế bào và sinh học phân tử. Bằng cách sử
dụng western blot , các nhà nghiên cứu có thể xác định được protein cụ thể trong một hỗn
hợp phức tạp có chứa các protein chiết xuất từ tế bào.
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN VỀ PHƯƠNG PHÁP WESTERN BLOT
1.1 Định nghĩa
Western blot( còn có tên gọi khác là Western blotting hay phương pháp lai thấm
protein) là kỹ thuật phát hiện protein bằng phương pháp điện di trên gel SDS-PAGE
(sodium dodecul sulfate- polyacrylamide gen eletratphoresis), thường thì sử dụng
antibody protein có gắn phóng xạ hoặc gắn huỳnh quang để phát hiện một loại protein
nào đó, được dùng rộng rải trong chuẩn đoán HIV, viêm gan,….
1.2 Nguyên tắc
Trong western blot, một hỗn hợp protein được phân tách bằng điện di trên gel SDS-
polyacrylamide (SDS-PAGE), miếng gel được ngâm với sodium dodecyl sulfate (SDS)-
là một tác nhân biến tính protein. Các vạch protein được chuyển lên màng nitrocellulose

và từng vạch protein được phát hiện bằng cách ngâm màng nitrocellulose với kháng thể
đơn dòng hoặc đa dòng có gắn enzyme hoặc đánh dấu phóng xạ đặc hiệu cho protein
quan tâm. Nếu protein quan tâm được kết hợp bởi kháng thể đánh dấu phóng xạ, vị trí
của nó trên các điểm có thể được phát hiện bằng cách chụp màng lên tấm film X quang.
Gọi là hình X quang.
1.3 Quy trình thực hiện
GVHD: ĐOÀN THỊ HOÀI NAM TRANG: 3
ĐỒ ÁN CÔNG NGHỆ 1 SVTH: TRẦN THỊ YẾN LỚP 10SH
1.3.1 Chuẩn bị mẫu
-Mẫu được lấy từ mô thực vật, hoặc động vật bằng cách cắt ra thành nhiều mảnh
nhỏ.
-Cho thêm các chất tẩy rửa, muổi, dung dịch đệm khác nhau để ly giải tế bào và hòa
tan protein.
- Rửa sạch các tế bào trong bình nuôi cấy mô hoặc bằng cách thêm dung dịch đệm
phosphate buffered saline (PBS) lạnh và lắc nhẹ nhàng.
• Lysis buffer (dùng để chuẩn bị mẫu để chạy trên gel, các tế bào và mô cần phải
được phân giải để giải phóng protein quan tâm) chứa:
Sodium hydroxide(NaOH): phá vỡ thành tế bào.
Sodium dodecyl sulfate(SDS): hòa tan màng tế bào.
Tris, pH 7,5
GVHD: ĐOÀN THỊ HOÀI NAM TRANG: 4
ĐỒ ÁN CÔNG NGHỆ 1 SVTH: TRẦN THỊ YẾN LỚP 10SH
Nó sẽ phá vỡ các liên kết hydro giữa các base DNA, SDS cũng làm
biến tính phần lớn các protein trong các tế bào.
-Ngay sau khi ly giải xảy ra, dephosphoryl phân giải protein, và biến tính bắt đầu.
Để ngăn chặn sự tiêu hóa của mẫu bởi các enzyme của tế bào ta thêm chất ức chế
protease và phosphatase vào dung dịch đệm.
-Chuẩn bị mẫu thường được thực hiện ở nhiệt độ lạnh(C) để tránh làm biến tính
protein và suy thoái.
1.3.2 Chạy điện di 1 chiều

-Chọn một loại gel thích hợp để phát hiện các protein quan tâm. Phổ biến nhất của
điện di gel sử dụng gel polyacrylamide và bộ đếm được nạp với SDS. Nồng độ của
acrylamide trong thường được sử dụng gel thay đổi 7-15%.
+SDS là một chất khử amionic gây biến tình protein bằng cách bao quanh bộ khung
polypeptide khiến các phân tử duỗi thẳng ra.
-Lắp ráp các thiết bị điện và thiết lập gel.
-Lắp đầy cả thùng bên trong và bên ngoài của thiết bị điện với bộ đệm điện di và
rửa sạch mỗi giếng của gel bằng cách ngâm nó nhiều lần với đệm điện.
-Thêm SDS mẫu đệm và điều chỉnh nhiệt độ của mẫu ở 95 ° C trong vòng 3 phút
hoặc ở 75 ° C trong 10 phút để làm biến tính protein.
- Đưa mẫu và đánh dấu vào các giếng của gel SDS-PAGE.
+ Hỗn hợp protein được hòa tan trong dung dịch SDS, một chất tẩy mang điện tích
âm sẽ phá tất cả các nối không cộng hóa trị của protein ban đầu.
+ Điện tích âm có được do gắn với SDS lớn hơn rất nhiều điện tích của protein ban
đầu; vì thế điện tích ban đầu của protein không ảnh hưởng đáng kể đến điện tích của
phức hợp. Phức hợp SDS-protein sau đó sẽ là mẫu để chạy điện di. Sau đó các mẫu được
nạp vào giếng trong gel.
- Chạy các mẫu tại một điện thế không đổi (200 V). Khi điện di kết thúc, những
protein trên gel sẽ được nhìn thấy là một dãy băng bằng cách nhuộm với bạc hay một
chất nhuộm màu như bromophenol blue.
GVHD: ĐOÀN THỊ HOÀI NAM TRANG: 5
ĐỒ ÁN CÔNG NGHỆ 1 SVTH: TRẦN THỊ YẾN LỚP 10SH
- Tháo rời bộ máy điện và đưa gel ra.
+ Độ phân giải của SDS-Page là rất lớn. các phức hợp được tách thành hàng trăm
vết băng trên gel.
1.3.3 Chuyển protein từ gel đến màng
-Mục đích của phương pháp này là để kéo protein từ gel vào PVDF hoặc màng
nitrocellulose
Nguyên tắc:
- Để các protein có thể vào để phát hiện kháng thể, các protein được chuyển từ trong

gel lên màng nitrocellulose hoặc polyvinylidene difluoride( PVDF). Ta chọn màng
nitrocellulose.
- Cắt kính thước màng tế bào vào giấy lọc cho cùng kích thướt với gel
+ Xử lý các gel nhẹ nhàng trong đệm SDS. Không ngâm gel trong bộ đệm khác
như PBS, bởi vì để giữ cho protein điện tích âm.
- Ngâm màng, giấy lọc, và miếng thấm trong bộ đệm western transfer buffer.
GVHD: ĐOÀN THỊ HOÀI NAM TRANG: 6
ĐỒ ÁN CÔNG NGHỆ 1 SVTH: TRẦN THỊ YẾN LỚP 10SH
- Khi lắp ráp các lớp thấm để thực hiện việc chuyển protein, tránh có không khí
hoặc bong bóng ở giữa màng và gel, ta giữ màng và gel ướt cho đến khi phân tích
western blot hoàn thành.
- Thực hiện chuyển protein trên màng trong khoảng 30 phút với cường độ
20mA/cm.
+ Trong thực tế, phương pháp này không được sử dụng phổ biến vì chúng mất
nhiều thời gian; electrblotting được ưa thích hơn. Kết quả của hai quá trình “ thấm” các
protein được tiếp xúc trên bề mặt một lớp mỏng để phát hiện. Cả hai mạng tế bào được
lựa chọn cho các thuộc tính cụ thể không protein ràng buộc( tức là liên kết tất cả các
protein tốt như nhau).
+Protein ràng buộc dựa trên tương tác kỵ nước, cũng như tính tương tác giữa các
màng tế bào và protein. Màng nitrocellulose rẻ hơn so với PVDF, nhưng mỏng manh hơn
và không đứng lên cùng probing lặp đi lặp lại.
+Tính đồng nhất và hiệu quả tổng thể của chuyển protein từ gel màng có thể được
kiểm tra bằng cách nhuộn màng với coomasise Brilliant blue hoặc S thuốc nhuộm
ponceau. Ponceau S phổ biến hơn do độ nhạy cao hơn và độ hòa tan nước, sau này làm
cho nó dể dàng hơn để sau đó destain và thăm dò màng
1.3.4 Lai với antibody
- Các protein được chuyển sang màng lai nitrocellulose, giữ nguyên vị trí như đã
phân tách trên gel. Rửa màng lai 5-10 phút trong dung dịch TTBS.
TTBS là hỗn hợp của Tris-buffered saline và Tween 20 0.05%
 Nếu trong TTBS mà không cho Tween thì kháng thể nó bám

không đặc hiệu mạnh hơn.
 Nếu không có Tween để pha đệm rửa thì có thể thay bằng Triton
X-100
- Ủ trong dung dịch khóa
- Sau đó rửa màng lai 2 lần với TBS, 5-10 phút mỗi lần rửa.
TBS (Tris-buffered saline) là dung dịch đệm dùng để rửa sạch màng
nitrocellulose và duy trì độ pH trong phạm vi tương đối hẹp. Gồm:
50 mM Tris
150 mM NaCl
GVHD: ĐOÀN THỊ HOÀI NAM TRANG: 7
ĐỒ ÁN CÔNG NGHỆ 1 SVTH: TRẦN THỊ YẾN LỚP 10SH
- Ủ màng lai đã cố định protein trong 1- 2 giờ với một kháng thể sơ cấp( primary
antibody) với sự kích động nhẹ. Kháng thể sơ cấp là một kháng thể đặc hiệu sẽ bám vào
protein và tạo thành một phức hợp protein-kháng thể đối với protein quan tâm.
- Rửa màng lai 2- 6 lần với TTBS , 5-10 phút mỗi lần rửa.
- Ủ màng lai lai với một kháng thể thứ cấp( secondary antibody) có enzyme ( alkalin
phosphattase hoặc horseradish peroxidase) đi kèm trong 1 giờ có kích động nhẹ.
- Sau đó rửa màng lai 3-6 lần với TTBS, 5-10 phút cho mỗi lần rửa.
- Rửa màng lai lần cuối với TBS.
- Tiếp tục ủ mạng lai trong 1 hỗn hợp đặc hiệu với enzyme. Nếu mọi việc đều diễn
ra một cách chính xác sẽ phát hiện thấy các băng ở bất kỳ nơi nào có mặt phức protein-
kháng thể sơ cấp-kháng thể thứ cấp-enzyme hay ở bất kỳ nơi nào có mặt protein quan
tâm.
-Đặt một phim nhạy cảm với tia X lên màng lai để phát hiện các điểm sáng phát ra
do enzyme.
1.3.5 Phát hiện và phân tích hình ảnh.
 Phát hiện bằng đo màu
Phương pháp phát hiện đo màu phụ thuộc vào ủ màng lai với một chất nền có khả
năng phản ứng với các enzyme( như pexodase) được ràng buộc với các kháng thể thứ
cấp.

Phản ứng này diễn ra bằng cách chuyển đổi thuốc nhuộm hòa tan thành một dạng
không hòa tan của một màu sắc khác nhau tủa thành các vết ngay bên cạnh các enzyme
và qua xuất hiện vết tren màng.
Phản ứng phát triển của blot sau đó dừng lại bằng cách rửa đi những thuốc nhuộm
hòa tan. Hàm lượng protein được đánh giá thông qua densitometry ( cường độ vết là)
hoặc quang phổ.
 Phát hiện bằng huỳnh quang
Các đầu dò gắn huỳnh quang được kích thích bới ánh sáng và sự phát xạ kích thích
sau đó được phát hiện bởi một photosensor như CCD máy ảnh kỹ thuật số và cho phép
phân tích dữ liệu xa hơn như phân tích trọng lượng phân tử, số lượng phân tử. Huỳnh
GVHD: ĐOÀN THỊ HOÀI NAM TRANG: 8
ĐỒ ÁN CÔNG NGHỆ 1 SVTH: TRẦN THỊ YẾN LỚP 10SH
quang được coi là phương pháp tốt nhất để định lượng, nhưng ít nhạy cảm hơn
Chemiluminescent.
 Phát hiện bằng phương pháp Chemiluminescent
Phương pháp phát hiện Chemiluminescent phụ thuộc vào ủ màng lai với một chất
nền sẽ làm cho luminese tiếp xúc với reporter trên kháng thế sơ cấp. Ánh sang sau đó
được phát hiện bởi phim ảnh, và gần đây hơn bởi máy ảnh CCD chụp một ảnh kỹ thuật
số. Những hình ảnh được phân tích bởi densitometry, đánh giá số lượng tương đối của
nhuộm protein và định lượng các kết quả về mật độ quang học. Mới hơn phần mền cho
phếp phân tích trọng lượng phân tử nếu các tiêu chuẩn thích hợp được sử dụng.
1.4 So sánh với phương pháp ELISA
2.2.1 Phương pháp ELISA ( enzyme linked immunosorbent assay)
Còn được gọi là EIA( enzyme immuno assay)
Nguyên tắc: dựa trên sự kết hợp đặc hiệu giữa kháng nguyên và kháng thể được gắn
với một enzym bằng liên kết đồng hoá trị. Kháng nguyên được gắn với giếng plastic và
kháng thể liên kết với enzyme được gắn với kháng nguyên. Kháng thể không gắn kháng
nguyên sẽ bị rửa trôi đi. Enzyme được giữ lại và vì vậy lượng kháng thể gắn enzyme
được phát hiện bằng cách cho thêm vào một cơ chất(introphenol phosphate) làm thay
đổi màu do hoạt tính của enzyme. Ðộ màu tạo thành là tỉ lệ với lượng enzyme bám ở

giếng plastic, từ đó suy ra lượng kháng thể, sau đó tiếp tục suy ra lượng kháng nguyên.
Quy trình:
GVHD: ĐOÀN THỊ HOÀI NAM TRANG: 9
ĐỒ ÁN CÔNG NGHỆ 1 SVTH: TRẦN THỊ YẾN LỚP 10SH
Phương pháp này được thiết kế cho việc phát hiện và định lượng vật chất như
peptides, protein, antibodies,…
Kỹ thuật ELISA gồm 3 thành phần tham gia phản ứng: kháng nguyên, kháng thể và
chất tạo màu, được thực hiện qua hai bước:
• Phản ứng miễn dịch học: Là sự kết hợp giữa kháng
nguyên và kháng thể.
• Phản ứng hóa học: thông qua hoạt tính xúc tác của
enzyme làm giải phóng oxy nguyên tử [O] từ H
2
O
2
để oxy
hóa cơ chất chỉ thị màu, do đó làm thay đổi màu của hỗn
hợp trong dung dịch thí nghiệm.
Kỹ thuật này khá nhạy cảm và đơn giản, cho phép xác định được kháng nguyên hay
kháng thể ở một nồng độ rất thấp.
2.2.2 So sánh:
Phương pháp Western Blot ELISA
Phát hiện màu
Mẫu dò
-Trích từ protein của tế bào.
-Phức hợp protein-kháng
nguyên sơ cấp-kháng
nguyên thứ cấp.
- Gắn với enzyme hoặc
đánh dấu phóng xạ.

-Chạy trên gel SDS-PAGE.
-Tắc nghẽn với protein dư.
-Kháng thể đối kháng với
protein X được đánh dấu
phóng xạ hay enzyme
-Trích từ kháng nguyên.
-Phức hợp giữa kháng
nguyên-kháng thể.
- Cho thêm chất tạo màu.
-Chạy trên đĩa plastic.
-Tắc nghẽn với kháng
nguyên dư.
-Kháng thể gắn đặc hiệu với
kháng nguyên thông qua
enzyme.
2.3 Ưu, nhược điểm
2.3.1 Ưu điểm
- Cho kết quả nhanh.
- Sinh phẩm dễ bảo quản.
- Có thể làm số lượng hàng loạt hay ít mẫu.
GVHD: ĐOÀN THỊ HOÀI NAM TRANG: 10
ĐỒ ÁN CÔNG NGHỆ 1 SVTH: TRẦN THỊ YẾN LỚP 10SH
- Không đòi hỏi thiết bị đặc biệt, không cần máy móc, dụng cụ đắt tiền.
- Độ đặc hiệu cao. Đọc kết quả bằng mắt thường.
- Có thể thực hiện ở các tuyến cơ sở.
2.3.2 Nhược điểm
- Chỉ xác định được sự có mặt của protein hiện diện nhưng không xác định
được số lượng cụ thể.
- Chi phí giá thành cao do western blot chỉ có thể thực hiện với điều kiện các
kháng thể kháng lại protein quan tâm là có sẵn

- Phương pháp phức tạp cần đòi hỏi nguồn nhân lực có kinh nghiệm và được
đào tạo kỹ lưỡng.
- Tốn nhiều thời gian thí nghiệm như trong bước điện di.
2.4 Ứng dụng
Phương pháp western blot được ứng dụng để:
- Xác định sự hoạt động của gen thông qua sự có mặt của protein trong mô.
- Đánh giá mức độ hoạt động mạnh yếu của gen mục tiêu
- Đánh giá độ lớn của gen mục tiêu
- Định dạng protein mục tiêu
- Phân tích cây trồng chuyển đổi gen
- Đánh giá tính chuyên biệt của antibody
- Phân tích bệnh do vi khuẩn và virus gây ra
- Phân tích sự phát triển của thực vật
Trong y tế. western blot được ứng dụng để:
- Xác định bệnh nhân có kháng thể chống HIV trong mẫu huyết thanh không
- Western blot sử dụng như một thử nghiệm xác minh về nhiễm viêm gan B
CHƯƠNG 3: ỨNG DỤNG
ỨNG DỤNG CỦA WESTERN BLOT TRONG NGHIÊN CỨU ĐẶC TRƯNG
PROTEIN CỦA VIRUS GÂY HỘI CHỨNG ĐỎ ĐUÔI Ở TÔM SÚ( Penaeus
monodon) VÀ TÔM THẺ CHÂN TRẮNG(Penaeus vannamei)
3.1 Tình hình bệnh và tác hại của bệnh trên thế giới và ở Việt Nam
3.1.1 tình hình nuôi tôm trên thế giới
Hiện nay, nghề nuôi tôm đang trên đà phát triển mạnh và trở thành một trong những
ngành đem lại thu nhập lớn cho nền kinh tế quốc dân của một số nước trên thế giới. Tuy
nhiên, nghề nuôi tôm gặp không ít khó khăn do tôm mắc bệnh và gây chết hàng loạt. Một
trong những bệnh nguy hiểm nhất đối với tôm nuôi hiện nay do virus gây nên là Virus
GVHD: ĐOÀN THỊ HOÀI NAM TRANG: 11
ĐỒ ÁN CÔNG NGHỆ 1 SVTH: TRẦN THỊ YẾN LỚP 10SH
hội chứng Taura (TSV).Bệnh xảy ra ở tất cả các nước nuôi tôm và ảnh hưởng phần lớn
đến nghề nuôi tôm công nghiệp trên thế giới (Nguyễn Văn Hảo, 2000). Trong thời gian

qua, Virus hội chứng Taura (TSV) đã bùng phát ở nhiều khu vực nuôi tôm trên thế giới,
đặc biệt là các nước Châu Mỹ- Latinh. Vào tháng 4/2005 virus hội chứng Taura lại gây
dịch lớn tại Châu Mỹ (Infofis, 6/4/2005), khiến sản lượng tôm của Venezuela sụt giảm
khoảng 90%. Và dần dần virus hội chứng Taura cũng đã lây lan sang các nước Châu Á
khi tôm TCT được du nhập và nuôi nhiều như ở Đài Loan, Trung Quốc, Thái Lan. Năm
1999/2000 TSV được phát hiện ở TCT tại Trung Quốc và Đài Loan (Tu et al., 1999; Yu
và Song, 2000) với 19 trường hợp thông báo cho OEI từ Đài Loan vào năm 1999, dẫn
đến 700.000 trường hợp và 200.000 tôm chết vào năm 2000 và dẫn đến 500.000 trường
hợp và 50.000 tôm chết vào năm 2001.
3.1.2 Tình hình nuôi tôm tại Việt Nam
Việt Nam có nhiều điều kiện thuận lợi để phát triển nghề nuôi tôm biển. Sản lượng
tôm xuất khẩu toàn quốc đã từng đạt 40-45 ngàn tấn/năm, chiếm gần 10% sản lượng tôm
Châu Á, mang lại lợi ích đáng kể cho người nuôi tôm (Lý Thị Thanh Loan 2001).
Cùng với sự phát triển của nghề nuôi tôm trên qui mô công nghiệp, “dịch bệnh”
tôm tại Việt Nam cũng đã bắt đầu xuất hiện ngay từ những năm đầu thập niên 90. Năm
2003, bệnh hội chứng Taura đã bùng phát ở tôm thẻ chân trắng, gây ảnh hưởng nghiêm
trọng tại nhiều vùng nuôi như Quảng Ninh, Phú Yên, Bạc Liêu, Cà Mau.
3.2 Giới thiệu về hội chứng Taura-TS
3.2.1 Khái niệm
Tên phổ biến thường gọi là virus gây bệnh hội chứng Taura (TSV). Ngoài ra có một
số tên gọi khác chỉ tác nhân gây bệnh hội chứng Taura như: hội chứng Taura (Taura
Syndrome – TS); bệnh Hội chứng Taura (Taura Syndrome Disease – TSD); bệnh đỏ
đuôi (Red Tail Disease – RTD) (Lightner, 1996).
3.2.2 Đặc điểm cấu trúc và gene của TST
TSV là loại virus RNA có dạng hình khối 20 mặt, đường kính 30 – 32 nm, không có
vỏ envelope được sao chép trong nguyên sinh chất tế bào vật chủ.
Genome của TSV có kích thước khoảng 9 kb, xoắn đơn thẳng, có 10.205
nucleotid, tạo chuỗi poly–A –3’, chứa hai khung đọc mở (Open Reading Frame - ORF)
lớn
3.2.3 Biểu hiện bệnh hội chứng Taura ở tôm

GVHD: ĐOÀN THỊ HOÀI NAM TRANG: 12
ĐỒ ÁN CÔNG NGHỆ 1 SVTH: TRẦN THỊ YẾN LỚP 10SH
Hội chứng Taura được biết là bệnh của tôm thẻ chân trắng ở giai đoạn còn nhỏ, xảy
ra trong khoảng 14 – 40 ngày sau khi thả. Tôm bị hội chứng Taura thường là loại tôm
giống nhỏ, khoảng 0,05 – 5 g, tuy nhiên tôm lớn hơn cũng có thể bị ảnh hưởng. Quá trình
diễn biến của bệnh hội chứng Taura xuất hiện chủ yếu trong giai đoạn của một chu kỳ lột
xác. Biểu hiện bệnh tiến triển theo 2 pha:
Pha tiền cấp tính có biểu hiện:
• Thường thấy tôm chết hoặc hấp hối trong lưới hoặc nằm dưới đáy bể.
• Tôm thường yếu và mất phương hướng khi di chuyển.
• Biểu hiện sự lan tỏa vùng sắc tố đỏ làm cho toàn thân tôm có màu đỏ nhạt,
quạt đuôi và chân bò có màu đỏ rõ rệt và thường chết trong khi lột xác.
• Vỏ mềm, ruột trống rỗng và thường ở giai đoạn muộn của chu kỳ lột xác.
• Là điểm nhạy cảm trong quá trình phát sinh bệnh hội chứng Taura
Pha mãn tính có biểu hiện: biểu hiện kiểu tổn thương của bệnh do vi khuẩn gây ra
như có nhiều điểm bị đen hóa.
3.3 Các phương pháp và kỹ thuật chuẩn đoán virus Taura
3.3.1 Chuẩn đoán dựa vào triệu chứng lâm sàng
Ở thời kì phát bệnh tôm có màu đỏ nhợt nhạt, toàn bộ vỏ thân và ở đuôi có màu đỏ
rõ rệt (bệnh đỏ thân, hồng thể) kèm theo những dấu hiệu tiêu biểu mỏng vỏ, xoang tiêu
hóa rỗng, tôm thường chết nhiều trong thời gian lột xác.
3.3.2 Phương pháp miễn dịch
Có thể sử dụng Monoclonal Antibodies (MAs) để xác định TSV ở những mẫu huyết
và dịch tế bào đồng thể từ tôm. MAs còn có thể áp dụng để kiểm tra những mẫu mô đông
lạnh, hoặc đã cố định. Hiện trên thị trường có sản phẩm của DiagXotics.
3.3.3 Phương pháp chuẩn đoán bằng mẫu dò gen
Nguyên lý của phương pháp là sử dụng một đoạn oligonucleotide (thiết kế trên trình
tự gene đặc hiệu của TSV) gắn với một chất chỉ thị và gọi là mẫu dò (probe). Chất chỉ thị
có thể là enzyme, đồng vị hoặc chất phát huỳnh quang… Sau đó lai probe với DNA –
RNA của virus. Những probe này được tổng hợp trong phòng thí nghiệm hoặc từ những

nguồn thương mại. Phương pháp này có độ chính xác đặc hiệu, độ nhạy lớn hơn những
phương pháp chẩn đoán truyền thống, tế bào học cổ điển.
3.4 Vật liệu và phương pháp
GVHD: ĐOÀN THỊ HOÀI NAM TRANG: 13
ĐỒ ÁN CÔNG NGHỆ 1 SVTH: TRẦN THỊ YẾN LỚP 10SH
Có nhiều phương pháp được sử dụng nhưng ở đây ta chỉ đi sâu vào phương pháp
western blot
3.4.1 Các dung dịch gốc để nhuộm gel
Dung dịch nhuộm (0,025% Coomassie Brillant Blue R250; 40% methanol; 7%
acetic acid)
Dung dịch giải nhuộm I (40% methanol; 7% acetic acid)
Dung dịch giải nhuộm II (5% methanol, 7% acetic acid)
3.4.2 Các dung dịch gốc để thực hiện western blot
Towbin transfer buffer (25mM Tris, 192mM glycine, 20%MeOH, 0,1%SDS)
3.4.3 Vật liệu
3.4.3.1 Kháng thể
Kháng thể sơ cấp: Kháng thể đa dòng tổng hợp kháng với WSSV, IHHNV, MBV,
YHV (được sản tại phòng thí nghiệm Công Nghệ Tế Bào Động Vật – Viện Sinh Học
Nhiệt Đới)
Kháng thể sơ cấp: Kháng thể đa dòng đặc hiệu với RTV (được sản tại phòng thí
nghiệm Công Nghệ Tế Bào Động Vât – Viện Sinh Học Nhiệt Đới)
Kháng thể thứ cấp: IgG kháng huyết thanh thỏ kháng IgY, được đánh dấu enzyme
Peroxidase.
3.4.3.1 Mẫu
• Chuẩn bị mẫu
Protease của tôm cũng như của các loài động vật thuỷ sinh khác là các protease nội
bào, nó tập trung nhiều nhất ở cơ quan tiêu hoá, sau đó đến nội tạng và cơ thịt. Đặc biệt ở
tôm do đặc điểm hệ tiêu hoá nội tạng nằm ở phần đầu nên hệ enzyme sẽ tập trung nhiều
nhất ở phần đầu sau đó đến các cơ quan khác.
Mẫu đầu và nội tạng tôm sú được phân tách từ tôm sú sống, loại 40 - 50 con/kg

được nuôi ở Cần Giờ. Tôm được chở trong thùng sục khí về phòng thí nghiệm, rửa sạch
và giết chết bằng cách trộn với nước đá vụn, tỷ lệ tôm /đá là 1:3, sau đó tách lấy đầu hoặc
nội tạng.
GVHD: ĐOÀN THỊ HOÀI NAM TRANG: 14
ĐỒ ÁN CÔNG NGHỆ 1 SVTH: TRẦN THỊ YẾN LỚP 10SH
Xay đầu tôm trên cối xay thịt, nghiền nhuyễn bằng cối inox với cát thạch anh đã xử
lý và làm sạch. Nội tạng chỉ nghiền. Dùng dung môi (nước cất, dung dịch muối sinh lý,
đệm phosphate, đệm Tris-HCl) với các tỷ lệ khác nhau, khuấy đảo liên tục ở điều kiện
nhiệt độ 0 - 4ºC trong 40 phút để chiết rút enzyme, ly tâm lạnh ở 4°C, tốc độ 6.000
vòng/phút trong 15 phút để loại bỏ phần cặn, thu dịch chiết (DC). Khảo sát ảnh hưởng tỷ
lệ dung môi và loại dung môi chiết với mẫu.
• Mẫu được lấy
Virus gây hội chứng đỏ đuôi thu từ tôm sú (RTV–Pm) được nhân lên trong tế bào
côn trùng Sf9.
Virus gây hội chứng đỏ đuôi thu từ tôm thẻ chân trắng (RTV-Pv) được nhân lên
trong tế bào côn trùng Sf9
Dịch nuôi cấy tế bào côn trùng Sf9.
3.4.4 Phương pháp
3.4.4.1 Phương pháp SDS-PAGE
SDS Polyacrylamide Gel Electrophoresis (SDS–PAGE) là phương pháp điện di
protein đứng, để phân tách được các thành phần protein theo trong lượng phân tử
Chuẩn bị mẫu để điện di:
• Mẫu nhận trực tiếp từ phòng Công Nghệ Tế Bào Động Vật – Viện Sinh
Học Nhiệt Đới.
• Trong một tube Eppendorf, trộn một thể tích (V) mẫu protein với một thể
tích (V) 2X Treatment buffer. Đặt vào nồi đun cách thủy đang sôi để trong
2 phút. Mẫu sau khi chuẩn bị xong nên giữ trong đá bào cho đến khi thực
hiện thí nghiệm.
• Dùng pipette với đầu tip (cone) nhỏ, cho mẫu từ từ vào giếng gel. Luôn
luôn để một giếng chứa thang protein chuẩn.

Thực hiện điện di
• Đậy nắp máng điện di. Nối hai điện cực vào bộ cấp điện.
• Bật điện bộ nguồn. Chỉnh dòng điện 100 mA.
• Quan sát sự di chuyển của vạch màu trong gel điện di, nếu vạch màu chạm
đáy gel, tắt bộ điện nguồn. Quá trình điện di đã hoàn tất.
• Đổ bỏ dung dịch điện di. Gở khuôn gel ra máng. Cẩn thận gở tách gel ra
khỏi khuôn gel để tiến hành nhuộm hay blotting.
3.4.4.2 Phương pháp Western Blot
GVHD: ĐOÀN THỊ HOÀI NAM TRANG: 15
ĐỒ ÁN CÔNG NGHỆ 1 SVTH: TRẦN THỊ YẾN LỚP 10SH
Sau khi thực hiện chuyển protein lên gel SDS ta thực hiện phản ứng gắn protein-
kháng thể bằng phương pháp western blot với những bước như sau:
Tách bỏ phần stacking gel ra khỏi running gel. Ngâm running gel trong Towbin
transfer buffer trong 5 – 15 phút để cân bằng ion.
Ứng với mỗi gel, cắt giấy thấm và màng nitrocellulose cho vừa với cassette.
Làm ướt màng nitrocellulose bằng cách thả dần vào trong khay nước cất trong 2 –
3 phút.
Đặt gel lên màng rồi cho vào giữa hai tờ giấy thấm dày đã cắt ở bước 2. Sau đó
kẹp chúng vào giữa hai tấm bọc nylon mềm (sponge) và kẹp vào cassette. Tất cả các thao
tác này đều phải thực hiện trong một khay chứa Towbin transfer buffer.
Dùng một pipette thủy tinh lăn lên trên để đuổi bỏ bọt khí (nếu có) giữa các lớp.
Cho dung dịch Towbin transfer buffer vào buồng để ngập hai hai lưới điện cực.
Cho cassette đã chuẩn bị ở bước 4 và 5 vào buồng, chú ý đặt mặt có màng nitrocellulose
gần lưới điện cực [+]. Các bước làm được trình bày như hình trên.
Đặt buồng lên trên máy khuấy từ. Nối hệ thống làm lạnh vào buồng. Bật máy
quay từ để làm lạnh dung dịch đệm trong quá trình chuyển band.
Nối buồng với bộ cấp năng. Bật điện bộ cấp năng và điều chỉnh điện thế 50V.
Sau khi hoàn tất chuyển band, chuyển điện thế về zero, tắt nguồn điện.
Tháo cassette và lấy màng ra khỏi hệ thống.
Màng nitrocellulose này sẽ được đưa vào qui trình phát hiện bằng phản ứng

miễn dịch.
Ủ màng trong 100ml dung dịch TTBS hoặc TTBS có chứa 5% skim milk
(blocking buffer) trong 1 giờ ở nhiệt độ phòng hay qua đêm ở 4ºC.
Đổ bỏ dịch này, rửa 3 lần trong 10 phút với TTBS. Tiếp tục ủ màng với TTBS có
pha kháng thể đặc hiệu (primary antibody) ở độ pha loãng 1/5000. Thời gian ủ là 60 phút
ở 37° C.
Rửa màng 3 lần trong 10 phút bằng TTBS
Ủ tiếp màng trong dung dịch TTBS có pha kháng thể cộng hợp ở nồng độ 1/50
000. Thời gian ủ là 60 phút ở 37°C.
GVHD: ĐOÀN THỊ HOÀI NAM TRANG: 16
ĐỒ ÁN CÔNG NGHỆ 1 SVTH: TRẦN THỊ YẾN LỚP 10SH
Rửa màng 3 lần trong 10 phút bằng TTBS. Sau bước này, tiến hành quá trình sinh
màu.
Cho màng vào dung dịch hiện màu (Pha dung dịch hiện màu bằng cách cho 1 mg
DAB vào 4 ml PBS, trộn đều. Lọc qua giấy lọc. Sau đó cho 120 µl dung dịch CoCl2 1%
vào dịch lọc trên. Tiếp tục cho 3µl H2O2 vào dịch mới pha. ). Ủ trong tối trong 5 – 30
phút cho đến khi màu xanh nâu của các band đặc hiệu hiện rõ.
Rửa màng nhiều lần với nước cất. Chụp hình ngay. Nếu muốn lưu lại thì để khô
rồi gói trong giấy bạc.
Mẫu được phân đoạn bằng điện di trên gel
polyacrylamide12.5%
chuyển thấm qua màng
nitrocellulose
Blocking bằng TTBS hoặc TTBS có chứa
5% skim milk
ủ kháng nguyên mục tiêu trên màng
với kháng thể sơ cấp
rửa
ủ với kháng thể thứ cấp có gắn enzyme peroxidase
rửa

hiện màu
chụp hình
3.5 Kết quả
GVHD: ĐOÀN THỊ HOÀI NAM TRANG: 17
ĐỒ ÁN CÔNG NGHỆ 1 SVTH: TRẦN THỊ YẾN LỚP 10SH
Giếng 1: Thang protein chuẩn Low Range.
Giếng 2, 3: dịch siêu ly tâm tế bào nhiễm RTV từ tôm sú thu ở Long An (RTV-
PmLA/SLT)
Giếng 4, 5: dịch tế bào (DTB) Sf9
Giếng 6, 7: DTB nhiễm RTV từ tôm sú thu ở Cần Giờ bị bệnh (RTV-PmCG).
Giếng 8: DTB nhiễm virus thu từ tôm sú Long An bị bệnh RTV (RT-PmLA)
Giếng 9, 10: DTB nhiễm RTV từ tôm thẻ chân trắng (RTV-PvM).
Nhận xét: Kết quả cho thấy một số vạch protein từ gel điện di đã được thể hiện trên
màng lai này. Đó là các protein gắn đặc hiệu với kháng thể. Kết quả xác định được một
số vạch protein từ các mẫu nhiễm virus khác so với mẫu tế bào đối chứng.
Tên mẫu Các vạch protein thu được (kDa)
RTV- >108 52 51 40
GVHD: ĐOÀN THỊ HOÀI NAM TRANG: 18
ĐỒ ÁN CÔNG NGHỆ 1 SVTH: TRẦN THỊ YẾN LỚP 10SH
PmoLA/LT
RTV-PmCG 52 51 40 Có 4 vạch 29, 30-
31, 33 kDa
RTV-PmLA 52 51 40 Có 4 vạch 29, 30-
31, 33 kDa
PRV-PvanM 52 51 40 24 9
vạch
trong
17-
29
kDa

TSV đã công
bố Lightner
(1996),
Bonami(1997)
58 55 52.5 51.5 49 40 36.8 24 23
Kết quả bảng trên cho thấy tất cả các mẫu dịch tế bào nhiễm virus gây bệnh đỏ đuôi
đặc trưng ở cả tôm sú và tôm thẻ chân trắng về cơ bản có các protein giống nhau. Tuy
nhiên RTV từ tôm thẻ có nhiều protein hơn từ tôm sú. Các mẫu tế bào nhiễm RTV có các
protein trùng với TSV đã công bố là 52, 51 và 40 kD. Đây là các protein chính của RTV
ở cả tôm sú và tôm TCT, trong đó có protein 40 kD tương ứng với VP2 (40 kDa) là
protein đặc trưng có thể sử dụng để nhận dạng các chủng TSV (Bonami,1997, Mari,
1998)
RTV-PmoLA/LT: Có 3 protein trọng lượng giống TSV như các tác giả đã công bố.
Ngoài ra còn có thêm 2 protein có trọng lượng >108 kDa.
RTV-PmoLA: Có 3 protein giống TSV như các tác giả đã công bố. Ngoài ra còn
có thêm 4 protein có trọng lượng 29, 30 – 31 và 33 kDa
RTV-PmoCG: Có 3 protein giống TSV như các tác giả đã công bố. Ngoài ra còn
có thêm 4 protein có trọng lượng 29, 30 – 31 và 33 kDa
RTV-PvanM: Có 4 protein giống TSV như các tác giả đã công bố. Ngoài ra còn có
thêm 9 protein có trọng lượng 33, 31, 30, 29, 28, 26, 22, 19 và 17 kD.
Sử dụng RTV ở tôm sú nhân qua tế bào làm kháng nguyên để thu kháng thể đặc
hiệu dùng cho phương pháp Western Blot (Hình 4.2). Kết quả thu được các protein đặc
trưng rất tách biệt ở mẫu RTV từ tôm TCT (RTV-PvM). Kết quả trên cho thấy kháng thể
GVHD: ĐOÀN THỊ HOÀI NAM TRANG: 19
ĐỒ ÁN CÔNG NGHỆ 1 SVTH: TRẦN THỊ YẾN LỚP 10SH
đặc hiệu RTV từ tôm sú đã nhận biết RTV từ tôm TCT. Như vậy có thể giả thiết rằng
RTV ở tôm sú có quan hệ gần với RTV ở tôm thẻ chân trắng.
Để khẳng định lại các protein mà người ta thu được từ kết quả điện di SDS-PAG và
Western blot chính là protein của RTV, người ta tiến hành gây nhiễm trở lại trên tôm thẻ
thịt và tôm sú giống bằng dịch tế bào nhiễm RTV.

3.6 Kết luận
RTV được nhân lên trong tế bào côn trùng Sf9 có nguồn gốc từ tôm sú hay tôm
TCT đều có khả năng gây nhiễm cho tôm sú giống và tôm thẻ thịt ngày tuổi.
RTV của tôm sú và tôm thẻ có các protein đặc trưng giống TSV ở tôm TCT là 52,
51 và 40 kD.
Có thể RTV từ tôm sú là một loại virus mới có liên quan gần với TSV hoặc là TSV
đã biến thể để thích nghi với vật chủ mới là tôm sú
Ngoài ra cần phải sử dụng thêm nhiều phương pháp để đảm bảo kết quả có độ chính xác
cao nhất.
TÀI LIỆU THAM KHẢO
[1] />western-blot-4843/
[2] />tong-quan/thu-nghiem-gan-ket-so-cap-n168/bai-tong-quan/ky-thuat-mien-dich-trong-
chan-doan-va-nghien-cuu-n163/
[3] />[4] />[5] />[6] />[7] />[8] />[9] />blotting#electrophoreticseparationofproteins
GVHD: ĐOÀN THỊ HOÀI NAM TRANG: 20
ĐỒ ÁN CÔNG NGHỆ 1 SVTH: TRẦN THỊ YẾN LỚP 10SH
[10] />duoi-o-tom-su-penaeus-monodon-va-tom-the-chan-trang-penaeus-555/
[11] />tu-noi-tang-va-dau-tom-su-penaeus-monodon-10413/
Ghi chú:
Không cho Tween kháng thể nó bám không đặc hiệu mạnh hơn bạn ạ. Tween dùng trong
các đệm rửa cho Western và ELISA mà
Nếu không có Tween để pha đệm rửa thì có thể thay bằng Triton X-100
Tác nhân gây bệnh:
-Thuộc giống Piconavirus trong họ Picorraviridae.
-Chúng có dạng hình cầu, 20 mặt, đây là loài virus có kích thước khả nhỏ 31 -32mm, acid
Nucleic là ARN.
-Vi khuẩn cũng được xem là tác nhân cơ hội gây bệnh này.
-Virus Taura sống tự do trong nước 14 ngày.
Phương pháp phòng trị:
Đây là bệnh virus nên chưa có thuốc chữa trị hữu hiệu, ngoài áp dụng các biện pháp phòng giống

như bệnh đốm trắng, có thể áp dụng thêm một số biện pháp khác như:
-Cắt giảm 50% thức ăn.
-Nhặt những con chết và hủy ( ở đáy).
Không thay nước vì khi thay nước sẽ tăng nguy cơ nhiễm virus bên ngoài, dễ làm cho tôm lột
xác làm tăng khả năng nhiễm bệnh.
-Bổ sung khoáng vào thức ăn, có thể sử dụng các khoáng khác cho vào nước.
GVHD: ĐOÀN THỊ HOÀI NAM TRANG: 21