Luận văn thạc sĩ sinh học thực nghiệm: Nghiên cứu chủng vi khuẩn cố định đạm nội sinh trong rễ cây ngô

1
LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC THỰC NGHIỆM
“Phân lập, tuyển chọn một số chủng vi khuẩn cố định đạm nội sinh trong rễ
cây ngô tại một số địa điểm của tỉnh Đăk Lăk”.
MỞ ĐẦU
1. Tính cấp thiết của đề tài
Nitơ (N) là nguyên tố dinh dưỡng quan trọng không chỉ với cây trồng mà ngay cả
đối với vi sinh vật. Nguồn dự trữ N trong tự nhiên rất lớn chỉ tính riêng trong không khí
N chiếm khoảng 78,16% thể tích. Người ta ước tính trong bầu không khí bao trùm lên
1ha đất đai chứa khoảng 8 triệu tấn N, lượng N này có thể cung cấp dinh dưỡng cho cây
trồng hàng chục triệu năm nếu như cây trồng đồng hóa được chúng. Trong cơ thể các
loại vi sinh vật chứa khoảng 4,1015 tỷ tấn N. Cây trồng cũng như các loại động vật và
người không có khả năng đồng hóa trực tiếp nguồn N
2
tự do từ không khí (Nester et
al.,2004). Nhưng tất cả nguồn N trên cây trồng đều không tự đồng hóa được mà phải
nhờ vi sinh vật. Hàng năm cây trồng lấy đi từ đất hàng trăm triệu tấn N. Bằng cách bón
phân con người đã trả lại cho đất khoảng hơn 40%, lượng thiếu hụt còn lại cơ bản được
bổ xung bằng Nitơ do hoạt động sống của vi sinh vật. Vì vậy việc nghiên cứu sử dụng
loại đạm sinh học này được xem là một giải pháp quan trọng trong nông nghiệp, đặc biệt
trong sự phát triển để hướng tới một nền nông nghiệp sinh thái bền vững Tuy nhiên tồn
tại một số vi sinh vật có khả năng biến N
2
trong khí quyển thành NH
3
cung cấp đạm cho
cây mà chỉ cần một lượng năng lượng rất ít (3-5kcal/M). Chúng được gọi chung là các vi
sinh vật cố định đạm.
Phân bón vi sinh (Nitragin) ra đời tại Đức năm 1896 do Noble Hiltner sản xuất là
công trình ứng dụng cơ chế cố định đạm sinh học đầu tiên và sau đó đã phát triển mạnh
mẽ ra các nước khác. Phân vi sinh có nhiều ưu điểm so với phân hóa học, ngoài tác dụng

nâng cao năng suất và chất lượng cây trồng, tiết kiệm phân vô cơ, giảm chi phí sản suất
thì phân vi sinh còn góp phần quan trọng trong việc bảo vệ môi trường và phát triển
nông nghiệp bền vững. Ở Việt Nam phân vi sinh đã được nghiên cứu từ những năm
1960. Tuy nhiên tình hình sản xuất phân vi sinh ở nước ta vẫn chưa đáp ứng đủ nhu cầu
thực tiễn sản xuất của nền nông nghiệp, do quy mô sản xuất nhỏ, chất lượng sản phẩm
chưa hoàn thiện và ổn định. Do đó, nghiên cứu để hoàn thiện và nâng cao chất lượng
2
phân vi sinh là việc làm hết sức cần thiết. Trong đó, việc phân lập và tuyển chọn các
chủng vi sinh vật là khâu đầu tiên và quan trọng trong quy trình tạo ra chế phẩm [7].
Trong vài chục năm gần đây ngày càng gia tăng các nghiên cứu vi khuẩn có ích
chúng có thể nội sinh hay ngoại sinh có khả năng cố định N tự do hoặc phân giải các
phosphate khó tan làm tăng năng xuất cây trồng đồng thời hạn chế được những độc tính
của đất khi sử dụng phân bón hoá học…Đặc biệt là các nhóm vi khuẩn khu trú trong
vùng rễ của cây trồng. Nhóm vi sinh vật này gọi là PGPR “Plant Growth Promoting
Rhizobacteria” và có những dòng thể hiện ưu điểm mạnh như  
            
 . Nhóm vi khuẩn này có khả
năng cố định N, tổng hợp nhiều chất kích thích sinh trưởng thực vật IAA, GA
3
… góp
phần nâng cao độ phì nhiêu của đất, kích thích tăng trưởng, tăng năng suất cây trồng,
hạn chế bón phân hóa học và phát triển nền nông nghiệp sinh thái bền vững [38]
Ở Việt Nam đã có một số nghiên cứu, phân lập các chủng vi khuẩn nội sinhtrong
rễ lúa, rễ cây lạc, cây cà phê Tuy nhiên, những nghiên cứu về vi khuẩn cố định đạm
nội sinh trong rễ cây ngô còn rất ít. Đặc biệt, hiện nay chưa có một nghiên cứu nào về
thành phần loài của vi khuẩn cố định đạm nội sinhtrong rễ cây ngô trên địa bàn tỉnh Đăk
Lăk.
Xuất phát từ thực tế đó, chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài: “Phân lập, tuyển
chọn một số chủng vi khuẩn cố định đạm nội sinh trong rễ cây ngô tại một số địa
điểm của tỉnh Đăk Lăk”.

2. Mục tiêu của đề tài
- Phân lập và tuyển chọn được một số chủng vi khuẩn cố định đạm trong rễ cây
ngô ở Đăk Lăk.
- Xây dựng qui trình nhân sinh khối một số chủnng vi khuẩncó hoạt tính cố định
đạm cao làm phân sinh học chuyên dụng cho cây ngô.
3. Ý nghĩa của đề tài
Ý nghĩa khoa học
Xác định được một số chủng vi khuẩncó khả năng cố định đạm, sống nội sinh
trong rễ cây ngô.
Ý nghĩa thực tiễn
3
Kết quả của đề tài là cơ sở cho việc lựa chọn các chủng vi khuẩn sống nội sinh
trong rễ cây ngô có hoạt tính cố định đạm cao để sản xuất phân vi sinh có hiệu quả, nâng
cao độ phì nhiêu của đất, hạn chế bón phân hóa học, tăng năng suất cây ngô và góp phần
phát triển một nền nông nghiệp sinh thái bền vững.
4
PHẦN I. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Giới thiệu về cây ngô
1.1.1. Nguồn gốc và phân loại thực vật
Ngô có tên khoa học là !"# (Zea: Từ Hi Lạp để chỉ cây ngũ cốc và từ
Mays là từ “Mahix” tên gọi cây ngô của người bản địa da đỏ [9]. Cũng có thể Mays là từ
“Maya” tên một bộ tộc da đỏ ở vùng Trung Mỹ - xuất xứ của cây ngô) [17].
Cây ngô thuộc: Ngành : Maopholiophyta
Lớp : Liliopsida
Bộ : Poales
Chi : Zea
Loài : Mays
Bộ nhiễm sắc thể (2n=20).
Có nhiều cách để người ta phân loại ngô, một trong các cách đó là dựa vào cấu
trúc nội nhũ của hạt và hình thái bên ngoài của hạt. Ngô được phân thành các loài phụ:

Ngô đá rắn, ngô răng ngựa, ngô nếp, ngô đường, ngô nổ, ngô bột, ngô nửa răng ngựa. Từ
các loài phụ dựa vào màu hạt và màu lõi ngô được phân chia thành các thứ. Ngoài ra ngô
còn được phân loại theo sinh thái học, nông học, thời gian sinh trưởng và thương phẩm.
Có rất nhiều giả thuyết về nguồn gốc của ngô tại châu Mỹ như ngô là sản phẩm thuần
dưỡng trực tiếp từ cỏ ngô (!"ssp. ) một năm ở Trung Mỹ, có nguồn
gốc từ khu vực thung lũng sông Balsas ở miền nam Mexico. Cũng có giả thuyết khác
cho rằng ngô sinh ra từ quá trình lai ghép giữa ngô đã thuần hóa nhỏ (dạng thay đổi
không đáng kể của ngô dại) với cỏ ngô thuộc đoạn #$. Song điều quan trọng
nhất nó đã hình thành vô số loài phụ, các thứ và nguồn dị hợp thể của cây ngô, các dạng
cây và biến dạng của chúng đã tạo cho nhân loại một loài ngũ cốc có giá trị đứng cạnh
lúa mì và lúa nước .
1.1.2. Đặc điểm hình thái cây ngô [9].
Cơ quan sinh dưỡng của ngô gồm rễ, thân và lá làm nhiệm vụ duy trì đời sống cá
thể.
5
Hình 1.1 Các bộ phận của cây ngô
Rễ ngô: Trong quá trình sinh trưởng phát triển, cây ngô có 3 loại rễ. Đó là: rễ
mầm, rễ đốt và rễ chân kiềng.
Thân ngô: Thân đặc, đường kính thân khoảng 2 – 4cm tùy thuộc vào giống,
mùa vụ và trình độ thâm canh, thân có nhiều lóng. Trong điều kiện bình thường ngô
cao từ 1,8 – 2m, từ khi mọc đến khi cây có 6 – 7 lá thân phát triển chậm, từ lúc 8 – 9
lá đến nhú cờ, nở hoa cây phát triển nhanh và đến khi hoa đực phơi màu, bắp phun
râu cây vẫn tiếp tục lớn. Sau khi thụ phấn thì thân ngừng phát triển.
Lá ngô: Gồm có lá mầm, lá thân, lá ngọn và lá bẹ. Lá được chia thành các bộ
phận như: bẹ lá, phiến lá và thìa lá. Phiến lá rộng và dài, mép lá gợn sóng, có nhiều
lông tơ. Gân lá song song. Lá mang bắp có chiều dài dài nhất.
Hoa ngô: Gồm hoa đực (bông cờ) và hoa cái. Bông cờ có nhiều nhánh, mỗi
nhánh có nhiều hoa xếp thành từng chùm, mỗi chùm có hai hoa, mỗi hoa có 3 nhị
đực, mỗi nhị đực có 1 bao phấn, một bao phấn có hai ô, một ô chứa từ 1000 – 2500
hạt phấn. Hoa cái sinh ra từ nách lá gồm có lõi bắp có nhiều đốt ngắn có lá bao bi,

mỗi hoa cái có một râu. Hoa cái mọc từng đôi trên hoa tự. Mỗi chùm hoa có hai
hàng hoa nhưng hoa thứ hai bị thoái hóa chỉ một hoa hình thành hạt, một đôi chùm
hoa cho hai hàng hạt nên hàng hạt ở trên bắp luôn luôn chẵn.
Bắp ngô: Phát sinh từ mầm nách lá trên thân, số mầm nách lá trên cây
ngô nhiều, nhưng chỉ 1-3 mầm nách trên cùng phát triển thành bắp. Tuỳ thuộc vào
giống, điều kiện sinh thái, chăm bón, mật độ, mùa vụ… mà tỷ lệ cây 2-3 bắp, số hạt trên
bắp, vị trí đóng bắp, thời gian phun râu, trỗ cờ…có khác nhau.
Hạt ngô: Hạt được coi là cơ quan khởi đầu của cây. Thuộc loại quả dĩnh, gồm các
bộ phận chính là vỏ hạt, lớp alơron, phôi và nội nhũ, phía dưới của hạt có gốc hạt là phần
6
dính liền hạt với lõi ngô. Hạt ngô được hình thành gồm các giai đoạn: từ thụ phấn đến
chín sữa là 10 – 15 ngày, từ chín sữa đến chín sáp là 15 – 20 ngày và từ chín sáp đến chín
hoàn toàn là 10 – 15 ngày.
1.1.3. Yêu cầu sinh thái của cây ngô [17],[21]
1.1.3.1. Yêu cầu nhiệt độ
Ngô là cây trồng ưa khí hậu ẩm, nhiệt độ thích hợp vào khoảng 20
0
C - 28
0
C.
Nhiệt độ có thể ảnh hưởng đến thời gian sinh trưởng của cây ngô. Trong cả chu kỳ
sống cũng như trong từng thời kỳ sinh trưởng phát triển của cây ngô cần một lượng
tích nhiệt nhất định. Đủ lượng nhiệt cây mới sinh trưởng phát triển bình thường. Tùy
vào từng giống khác nhau mà cần một lượng nhiệt khác nhau. Giống càng chín
muộn thì cần lượng tích nhiệt càng cao.
1.1.3.2. Yêu cầu về ánh sáng
Ngô là cây có nguồn gốc nhiệt đới thuộc nhóm cây ngày ngắn. Ánh sáng là yếu
tố quan trọng cho sinh trưởng và phát triển của cây ngô, tạo điều kiện thuận lợi cho quá
trình tích luỹ chất dinh dưỡng và ảnh hưởng đến độ dài của quá trình sinh trưởng. Trung
bình cần 12 giờ chiếu sáng/ngày.

Nghiên cứu phản ứng của cây ngô với độ dài ngày cho thấy cây ngô hình
thành các kiểu hình thái khác nhau. D.Azit đã chỉ ra rằng: Các giống ngô ở châu Âu
do kết quả chọn lọc đã hoàn thành được chu kỳ ánh sáng trong điều kiện ngày dài,
loại trừ được yêu cầu ngày ngắn. Cuperman và Razumov cho rằng rút ngắn thời
gian chiếu sáng ban ngày đến 12 giời sẽ thúc đẩy sự trổ cờ và hình thành bắp.
Ánh sáng ảnh hưởng đến sinh trưởng của cây ngô ở hai mặt là số giờ chiếu
sáng và chất lượng ánh sáng. Những tia sáng dài đã kìm hãm sự sinh trưởng của cây
ngô, các tia sáng ngắn lại thúc đẩy sự phát triển. Nghiên cứu của Cuperman đã xác
định thời gian chiếu sáng và chất lượng ánh sáng đã gây ảnh hưởng rất lớn đến sự
phát triển của bắp và bông cờ của cây ngô. Trong điều kiện chiếu sáng bằng ánh
sáng trắng và xanh lam thì sự phát triển của cây diễn ra nhanh nhất. Trong điều kiện
chiếu sáng bằng ánh sáng đỏ thì sự phát triển của bông cờ hầu như không bị ảnh
hưởng nhưng sự hình thành của bắp chậm lại. Ánh sáng lục kìm chế sự sinh trưởng
và phát dục của bắp.
1.1.3.3. Yêu cầu về nước
7
Ngô là cây trồng cạn, bộ rễ ngô phát triển rất mạnh, hút nước khỏe và sử
dụng tiết kiệm nước. Cây ngô sinh trưởng nhanh tạo ra sinh khối lớn. Do vậy cây cần
một lượng nước rất lớn. Trung bình cây ngô trong một chu kỳ sống cần khoảng 200
lít nước để sinh trưởng và phát triển. Ở các thời kì sinh trưởng khác nhau cây ngô
yêu cầu lượng mưa và lượng nước tưới khác nhau. Cây ngô không chịu được úng,
độ ẩm của đất quá cao, lớn hơn 80% có ảnh hưởng xấu đến sinh trưởng phát triển
của cây ngô, đặc biệt là từ lúc cây mọc đến khi cây được 8 lá. Vào giai đoạn này chỉ
cần ngập nước 1 – 2 ngày cây ngô cũng có thể bị chết úng. Ẩm độ thích hợp khoảng
70%.
1.1.3.4. Yêu cầu về đất
Đất rất quan trọng trong sản xuất ngô, đất trồng ngô phải tơi xốp, nhiều mùn,
hàm lượng dinh dưỡng cao, dễ thoát nước, tầng canh tác dày, pH từ 6 – 7, thuận lợi
cho việc tưới nước vào mùa khô và tiêu nước vào mùa mưa. Hầu hết, ngô được trồng
ở trên đất cạn, không ngập nước, đất có thành phần cơ giới nhẹ, đất cát pha, trên các

loại đất vụ trước trồng các cây họ đậu, hoặc các cây phân xanh cải tạo đất.
1.1.3.5. Yêu cầu chế độ không khí trong đất
Để thu hoạch sản lượng ngô cao, ngoài việc cung cấp nước và dinh dưỡng còn
phải chú ý đến chế độ không khí ở trong đất. Chế độ không khí ảnh hưởng gián tiếp
thông qua nhiều khâu khác nhau như là vi sinh vật, quá trình biến đổi hóa học trong đất.
Cây ngô đặc biệt là rễ ngô phát triển tốt trong điều kiện háo khí, nếu đất chặt bí thiếu tơi
xốp thì rễ ngô phát triển kém, ăn nông, rễ ngắn ít lông hút, khả năng hút dinh dưỡng
khoáng và nước kém. Dẫn đến tình trạng cây ngô thiếu dinh dưỡng sẽ sinh trưởng, phát
triển kém.
1.1.4. Vai trò các chất dinh dưỡng với cây ngô [17],[21]
1.1.4.1. Vai trò của đạm
Đạm là yếu tố dinh dưỡng quan trọng nhất, đóng vai trò tạo năng suất và chất
lượng của ngô, 66% đạm được tích luỹ trong hạt. Cây ngô hút đạm tăng dần từ khi
cây có 3 – 4 lá tới trước trổ cờ. Ở nước ta, một số kết quả nghiên cứu cho thấy thời kỳ
hút đạm mạnh nhất là 6 – 12 lá và trước khi trổ cờ, nếu các giai đoạn này mà thiếu
đạm thì năng suất giảm rõ rệt.
8
Triệu chứng thiếu đạm ở ngô: cây thấp, lá nhỏ có màu vàng, các lá già có vệt
xém đỏ, cây sinh trưởng chậm, cằn cỗi, cờ ít, bắp nhỏ, năng suất thấp.
1.1.4.2. Vai trò của lân
Lân có vai trò quan trọng với cây ngô tuy nhiên khả năng hút lân ở giai đoạn
cây non lại rất yếu. Thời kỳ 3 – 4 lá, cây ngô hút không được nhiều lân, đó là thời kỳ
khủng hoảng lân của ngô, nếu thiếu lân trong giai đoạn này sẽ làm giảm năng suất
nghiêm trọng. Cây ngô hút nhiều lân nhất ( khoảng 62% tổng lượng lân yêu cầu) ở
thời kỳ 6 – 12 lá sau đó giảm đi ở các thời kỳ sau.
Triệu chứng thiếu lân của ngô biểu hiện bằng màu huyết dụ trên bẹ lá và gốc
cây, trái cong queo. Trường hợp thiếu nặng lá sẽ chuyển vàng và chết. Hiện tượng
này xảy ra ở lá già trước, sau đó chuyển sang lá non và phổ biến ở ngô vụ đông trong
điều kiện thời tiết khắc nghiệt.
1.1.4.3.Vai trò của kali

Kali có vai trò rất quan trọng tới sự sinh trưởng, phát triển và năng suất của
ngô. Kali tích luỹ nhiều ở thân, lá (khoảng 80%) và tích luỹ trong hạt ít hơn. Cây ngô
hút kali mạnh ngay từ giai đoạn sinh trưởng ban đầu. Từ khi cây mọc tới trổ cờ ngô
đã hút khoảng 70% lượng kali cây cần.
Thiếu kali, protein và sắt sẽ tích tụ gây cản trở quá trình vận chuyển chất hữu
cơ. Thiếu kali là nguyên nhân rễ ngang phát triển mạnh, rễ ăn sâu kém phát triển, do
đó cây dễ đổ. Thiếu kali thể hiện ở các triệu chứng như chuyển nâu và khô dọc theo
mép và chóp lá, bắp nhỏ, nhiều hạt lép ở đầu bắp (bắp đuôi chuột) và năng suất thấp.
1.1.4.4.Vai trò các nguyên tố vi lượng
Đối với cây ngô, các chất vi lượng thường thiếu là kẽm và molypđen. Thiếu
kẽm lá có màu trắng (bệnh bạch tạng), giữa các gân lá có những dải màu vàng sáng,
các lóng ngắn lại. Hiện tượng thiếu kẽm thường xảy ra trên đất kiềm, nghèo mùn,
đất giàu lân dễ tiêu hay bón quá nhiều lân. Thiếu molypđen lá chuyển xanh nhạt, lá
non teo lại và héo, nặng hơn lá ngọn không bung ra được, có nhiều vết xém vàng.
1.1.5.Vai trò cây ngô trong nền kinh tế
Ngô làm lương thực cho con người: Ngô là cây lương thực nuôi sống gần 1/3 dân
số trên toàn thế giới, tất cả các nước trồng ngô nói chung đều ăn ngô ở mức độ khác
nhau. Toàn thế giới sử dụng 21% sản lượng ngô làm lương thực cho người. Các nước ở
9
Trung Mỹ, Nam Á và Châu Phi sử dụng ngô làm lương thực chính. Các nước Đông
Nam Phi sử dụng 85% sản lượng ngô làm lương thực cho người, Tây Trung Phi 80%,
Bắc Phi 42%, Tây Á 27%, Nam Á 75%, Đông Nam Á và Thái Bình Dương 39%, Đông
Á 30%, Trung Mỹ và các vùng Caribe 61% Nếu như ở Châu Âu khẩu phần ăn cơ bản
là: bánh mỳ, khoai tây, sữa; Châu Á: cơm (gạo), cá, rau xanh (canh) thì châu Mỹ La Tinh
là bánh ngô, đậu đỗ và ớt. Vì vậy, trên phạm vi thế giới, ngô vẫn còn là cây lương thực
rất quan trọng, vì ngô rất phong
phú các chất dinh dưỡng hơn lúa mỳ và gạo. Ngô làm thức ăn gia súc: Ngô là thức ăn gia
súc quan trọng nhất hiện nay. Hầu như 70% chất tinh trong thức ăn tổng hợp là từ ngô,
điều đó phổ biến trên toàn thế giới. Ngoài việc cung cấp chất tinh, cây ngô còn là thức ăn
xanh và ủ chua lí tưởng cho đại gia súc. Những năm gần đây cây ngô còn là cây thực

phẩm, người ta dùng bắp ngô bao tử làm rau cao cấp. Sở dĩ, ngô rau được dùng vì nó
sạch và có hàm lượng dinh dưỡng cao. Các thể loại ngô nếp, ngô đường (ngô ngọt) được
dùng làm thức ăn tươi (luộc, nướng) hoặc đóng hộp làm thực phẩm xuất khẩu. Ngô là
nguyên liệu chính cho các nhà máy thức ăn gia súc tổng hợp, ngô còn là nguyên liệu cho
các nhà máy sản xuất rượu, tinh bột, bánh kẹo… Người ta đã sản xuất ra các mặt hàng
khác nhau cho các ngành công nghiệp lương thực - thực phẩm, công nghiệp dược và
công nghiệp nhẹ. Ngô cũng là hàng hoá xuất khẩu. Hàng năm lượng ngô xuất khẩu
khoảng 70 triệu tấn. Đó là nguồn lợi lớn của các nước xuất khẩu. Các nước
xuất khẩu chính là Mỹ, Pháp, Argentina, Trung Quốc, Thái Lan. Các nước nhập chính là
Nhật Bản, Hàn Quốc, Liên Xô cũ, Châu Phi, Mexico… [9]. Ngô vừa là cây lương thực,
vừa là cây thức ăn cho gia súc. Chính vì vậy diện tích trồng ngô trên thế giới tăng không
ngừng. Năm 1979 diện tích trồng ngô chỉ đạt khoảng 127 triệu ha với tổng sản lượng là
475,4 triệu tấn, đến năm 2007 diện tích trồng ngô đạt 145,1 triệu ha với sản lượng 705,3
triệu tấn (theo số liệu thống kê của FAO, 2008). Ở Việt Nam, cây ngô đã được trồng
cách đây khoảng 300 năm và được trồng trên những điều kiện sinh thái khác nhau của cả
nước. ĐăkLak là vùng có sản lượng bắp cao nhất nước đạt 622 nghìn tấn, kế đến là Sơn
La, Đồng Nai với sản lượng lần lượt là 506 và 305,3 nghìn tấn mỗi năm.
10
%& www.asiacreative.vn
Biểu đồ: 1.1 Sản lượng bắp của Việt Nam 2013
Hàm lượng chất dinh dưỡng của ngô tùy thuộc vào từng giống, đặc biệt là các
giống ngô nếp địa phương tuy năng suất không cao nhưng chất lượng của hạt ngô tốt
phù hợp với thị hiếu của người tiêu dùng.
1.2. Tổng quan về vi khuẩn cố định Nitơ (N )
1.2.1. Nitơ và quá trình cố định nitơ
Nitơ phân tử được cấu tạo từ 2 nguyên tử nitơ liên kết với nhau bằng liên kết III
bền vững N ≡ N. Nitơ trong khí quyển tồn tại dưới dạng khí N
2
và chiếm khoảng 79%
thể tích không khí. Mặc dù sống trong "đại dương nitơ" nhưng thực vật nói chung không

có khả năng đồng hóa trực tiếp được. N
2
là phân tử rất khó phản ứng với các phân tử
khác để tạo thành hợp chất. Liên kết N ≡ N có năng lượng liên kết rất lớn nên muốn xảy
ra phản ứng giữa N
2
với các nguyên tố khác thành các hợp chất vô cơ, trong kỹ thuật
người ta phải dùng lượng năng lượng rất cao. Trong khi đó nhóm vi khuẩn cố định nitơ
có thể biến khí nitơ thành hợp chất đạm ở các điều kiện bình thường về nhiệt độ và áp
suất. Vậy cơ chế cố định của nó là như thế nào. Đó là điều các nhà khoa học nghiên cứu
trong lĩnh vực này hết sức quan tâm. Từ trước tới nay có rất nhiều giả thiết về cơ chế của
quá trình cố định đạm sinh học.
Đa số nhà nghiên cứu đều thống nhất cho rằng: Quá trình cố định nitơ sinh học là
một quá trình khử N
2
thành NH
3
dưới tác dụng của enzyme Nitrogenaza sinh ra bởi vi
sinh vật bằng phương trình:
11
Năm 1961 - 1962, người ta đã tách từ ' hai tiểu
phần hoạt hóa H
2
và N
2
. Sau này người ta tìm thấy ở  có các tiểu phần, 1
phần gồm protein và Fe, 1 thành phần gồm protein, Fe, Mo.
Nguồn H
2
để khử N

2
có thể là hydro phân tử (H
2
). Trong trường hợp này thì
dưới tác dụng của enzyme hydrogenase, điện tử được chuyền theo hệ thống.
Nguồn cho điện tử và hydro là acid pyruvic. Đáng chú ý là trong quá trình chuyền
điện tử có sự tham gia tích cực của feredocine (Fd). Fd là cầu nối giữa 2 hệ enzyme
hydrogenase và nitrogenase để cố định N2.
Sự cố định N
2
của vi khuẩn nốt sần có thể xảy ra theo sơ đồ phức tạp hơn. Trong
các nốt sần có một chất có bản chất hem rất giống với hemoglobin trong máu gọi là
leghemoglobin. Nó dễ liên kết với O
2
để biến thành oxyhemoglobin. Leghemoglobin chỉ
12
được tạo nên khi vi khuẩn sống cộng sinh với cây bộ đậu, còn khi nuôi cấy tinh khiết các
Rhizobium sẽ không tạo leghemoglobin và không cố định được N
2
.
Mối quan hệ giữa thực vật và vi khuẩn trong quá trình cố định nitơ cộng sinh có
thể biểu diễn bởi sơ đồ sau:
1.2.2. Vi khuẩn cố định N
Vi sinh vật cố định N có một vai trò quan trọng trong chu trình tuần hoàn N
2
và
cung cấp một lượng N đáng kể cho cây trồng. Theo tính toán của các nhà khoa học, các
nhóm vi sinh vật cố định đạm BNF (Biological nitrogen fixation) có thể cung cấp tới 240
x 10
6

tấn N/năm trên cả hành tinh, gấp 6 lần lượng N mà cả thế giới sản xuất bằng con
đường hóa học.
Vi sinh vật cố định N là các nhóm vi sinh vật có khả năng chuyển hóa khí N
2
dồi
dào trong không khí (79%) thành dạng NH
4
+
cung cấp cho cây. Vi khuẩn cố định N gồm
có hai nhóm lớn:[7].
- Vi khuẩn cố định N tự do gồm:
+ Vi khuẩn cố định N tự do hiếu khí: ()
+ Vi khuẩn cố định N kỵ khí: Vi khuẩn thuộc nhóm '.
- Vi khuẩn cố định N cộng sinh như cộng sinh với rễ cây họ đậu cộng
sinh với rễ lúa )))
1.2.2.1. Vi khuẩn cố định N tự do
1.2.2.2. Vi khuẩn cố định N tự do hiếu khí
Nhóm này gồm hai chi chính là ()[7]
- Beijerinskia sp.
Được phân lập bởi Starkey (1939), là loại có đặc điểm giống với )Tế
bào có hình dạng thay đổi như hình cầu, hình que, hình bầu dục. (là vi khuẩn
13
gram âm, không sinh bào tử. Có khả năng sống tốt trong môi trường axit ( pH=3). Vi
khuẩn có khả năng cố định được 16 - 20 mg N khi đồng hóa hết 1g dinh dưỡng Carbon.
Ngoài khả năng cố định N chúng còn có khả năng tổng hợp các chất kích thích sinh
trưởng cho cây trồng.
- Azotobacter sp.
Là vi khuẩn gram âm, không sinh bào tử có khả năng cố định N tự do. Khi chưa
trưởng thành tế bào thường có hình que, sinh sản bằng cách phân cắt, di chuyển nhờ tiêm
mao. Khi trưởng thành mất khả năng di chuyển, kích thước thu nhỏ thành dạng cầu được

bao bọc bởi một lớp nhầy.
Khuẩn lạc của có dạng cầu lồi, nhẵn bóng, có khi nhăn nheo. Các
nòi phân lập từ tự nhiên có khả năng cố định 10 - 15mg N khi tiêu thụ hết 1g dinh dưỡng
Carbon. Một số nòi tuyển chọn có khả năng cố định tới 30mg/1g dinh dưỡng Carbon.
Trong đất, tập trung ở vùng đất xung quanh rễ cây. Ngoài khả năng
cung cấp dinh dưỡng N cho cây nó còn có khả năng kích thích nảy mầm, kích thích sinh
trưởng. Trong đất, thường phổ biến các nòi sau:
+ Kích thước tế bào 2,0 x 3,1 micromet, có khả năng di
động khi còn non. Khi già hình thành nang xác. Khuẩn lạc có màu nâu
hoặc đen khi về già, không khuếch tán ra môi trường.
+ (Có kích thước 2,4 x 4,6 micromet. Không có khả
năng di động và hình thành nang xác. Khuẩn lạc khi già có màu nâu sáng, sắc tố không
khuếch tán ra môi trưòng nuôi cấy.
+ Tế bào có kích thước 1,5 x 3,4 micromet, có khả năng
di động và hình thành nang xác. Khuẩn lạc màu lục huỳnh quang, sắc tố khuếch tán vào
môi trường.
+ Tế bào có kích thước 2,8 x 3,3 micromet, có khả năng di
động, không hình thành nang xác, khuẩn lạc màu vàng lục huỳnh quang, sắc tố khuếch
tán vào môi trường [7].
1.2.2.3. Vi khuẩn cố định N tự do kỵ khí Clostridium
' được phát hiện lần đầu tiên bởi Vinogradxki (1893). Vi khuẩn
'có kích thước 2,5 – 7,5 x 0,7 – 1,3 micromet, có thể đứng riêng rẽ hoặc kẹp
14
đôi thành chuỗi ngắn. Bào tử hình bầu dục, có khả năng chịu được nhiệt độ cao và khô
hạn. 'có khả năng tích lũy được 10 - 15mg N phân tử khi đồng hóa hết 1g
đường Carbon [7].
1.2.3. Vi khuẩn cố định N cộng sinh
1.2.3.1. Các vi khuẩn sống cộng sinh với cây họ Đậu
Vi khuẩn cố định N cộng sinh với cây họ đậu còn gọi là vi khuẩn nốt sần. Chúng
hình thành các nốt sần với rễ cây họ đậu như cây đậu tương, lạc, điền thanh, muồng, cốt

khí, trinh nữ, chúng sử dụng dinh dưỡng carbon của cây và cố định N không khí để sử
dụng và cung cấp một phần cho cây chủ.
Gồm có: " và [11].
- Rhizobium
Năm 1868, nhà khoa học Hà Lan M.W.Beijrinck đã phân lập được loài vi khuẩn
sống cộng sinh trong nốt sần ở rễ một cây thuộc bộ đậu, ông đã đặt tên là
.
Năm 1889, vi khuẩn này được xếp vào chi ( B.Frank, 1989). Trên
môi trường đặc, chúng có khuẩn lạc trơn bóng, nhầy, khi còn non có khả năng di động
nhờ tiêm mao, khi tế bào già trở nên bất động.
 thuộc loại hảo khí ưa pH trung tính hoặc kiềm ( pH từ 6,5 - 7,5), nhiệt
độ thích hợp 24 – 26
0
C. Chúng xâm nhiễm vào rễ cây bộ đậu thông qua lông hút, đôi khi
qua vết thương ở vỏ rễ. Dưới ảnh hưởng của vi khuẩn, rễ tiết ra enzyme polyalacturonase
phân huỷ thành lông hút tạo điều kiện cho vi khuẩn xâm nhập vào rễ. Theo tính toán của
các nhà khoa học nhóm vi khuẩn này có khả năng cung cấp cho cây 80 -120kg N/ ha.
- Bradyrhizobium
Vi khuẩn hình que, kích thước trung bình 0,5 - 0,9 x 1,2 - 3,0 µm, thường chứa
chất dự trữ PHB. Trên môi trường đặc, khuẩn lạc của chúng có dạng trơn, bóng, nhầy,
không màu.
" là vi khuẩn hiếu khí, tuy nhiên chúng có thể phát triển được
ngay trong trường hợp chỉ có một áp lực oxy rất thấp khoảng 0,001atm. Chúng phát triển
thích hợp ở pH= 6,5 - 7,5. Nhiệt độ phát triển thích hợp là 24 – 26
0
C, nhiệt độ 37
0
C sự
phát triển của chúng bị cản trở một cách rõ rệt.
- Azorhizobium

15
 Là một giống mới được đề nghị với một loài là 
 chính là các vi khuẩn cộng sinh ở rễ và thân của 
- Sinorhizobium
Gồm các vi khuẩn phát triển nhanh, cộng sinh ở nốt rễ cây đậu nành được phân
lập từ Trung Quốc. Giống  gồm có 2 loài là * và
$(.
1.2.3.2. Các vi khuẩn sống cộng sinh với cây không thuộc họ đậu
- Vi khuẩn lam (Cyanobacteria): Một số vi khuẩn lam tự dưỡng đạm hay thanh
tảo sống chung với nhiều vi sinh vật chân hạch, từ các loại nấm cho đến các thực vật hạt
kín [7].
- Azospirillum
Phát hiện năm 1974, là vi khuẩn Gram âm có dạng xoắn, sống tự do, đường kính
1µm, dài 2,1 - 3,8µm chuyển động trong môi trường lỏng bởi một tiêm mao dài ở đầu
( polan flagellum), trong môi trường đặc ở 30
0
C nhiều tiêm mao bên (lateral flagellum)
ngắn hơn cũng được thành lập.
Trong những năm gần đây người ta phát hiện nhiều nhóm vi khuẩn này sống ở
trong vùng rễ, trong rễ cây, thân cây và lá các cây không thuộc họ đậu như lúa, bắp, mía,
sorghum, và một số loại cỏ.
 giúp tăng năng suất lúa từ 32 - 81% ở điều kiện nhà lưới (Mirza và
ctv, 2000; Malik và ctv, 2002). Nhưng ở điều kiện ngoài đồng vi khuẩn nầy chỉ làm tăng
năng suất lúa được 10 - 30% [11].
 tăng sinh ở cả trong điều kiện hiếu khí và kỵ khí với sự hiện diện
hoặc không có hợp chất nitơ trong môi trường, nhưng thích hợp là vi hiếu khí. Nhiệt độ
tối hảo từ 35 - 37
0
C. Một số dòng là những vi sinh vật tự dưỡng không bắt
buộc. Vi khuẩn phát triển tốt trên muối của những acid hữu cơ như malate,

succinate, hay pyruvate. Fructore và những đường đôi khác cũng có thể được vi khuẩn
sử dụng như là nguồn carbon . Một số dòng cần biotin cho sự phát triển của
chúng [7], [11].
Ngoài khả năng cố định nitơ chúng còn có khả năng khử nitrat, chống lại vi
khuẩn gây bệnh thối lá ở cây dâu tằm. Theo Eckert (2001) chi  có 7 loài là:
16
)+)  *+)+)  +)*+)
và ) [35].
Một số báo cáo gần đây cho thấy vi khuẩn này có thể tiết ra những kích thích tố
tăng trưởng như: IAA (Indole - 3 - acetic acid), IBA (Indole - 3 - butyric acid), ABA
(abscisic acid) và cytokynins. Những kích thích tố đó làm tăng chiều dài rễ, tăng thể tích
rễ và số lượng rễ. Từ đó, chúng làm tăng khả năng hấp thu khoáng chất và nước, tăng
khả năng sinh trưởng và phát triển cũng như tăng năng suất của cây. Ngoài ra, chúng còn
giúp cho cây chống chịu được điều kiện khô hạn.
- Gluconacetobacter diazotrophicus [11].
Năm 1988, được Cavalcante V. A và Dobereiner J phân lập lần đầu tiên từ rễ và
thân cây mía trồng ở nhiều khu vực khác nhau trên khắp Brazil.
,)là vi khuẩn Gram âm; ưa acid; vi hiếu khí bắt buộc; tế bào
dạng que thẳng tròn đầu ( 0,7 - 0,9µm đến khoảng 1 - 2µm) tồn tại ở dạng đơn, đôi hoặc
chuỗi mà không có nội bào tử; sử dụng đường (glucose, fructose, sucrose…) ở nồng độ
khác nhau làm nguồn C nhưng tăng trưởng tốt nhất là ở nồng độ sucrose 10% và pH =
5,5.
,)có khả năng cố định đạm và sản xuất ra hormone thực vật
( auxin, gibberellin), có thể hoà tan Zn và phosphorus nên ,) được xem
là một loài vi khuẩn đầy hứa hẹn, với khả năng cung cấp gần một nửa nitơ cố định được
ở dạng hữu ích cho cây [11].
- Herbaspirillum [11].
- là các vi khuẩn hình que, Gram âm, rộng khoảng 0,5 - 0,6µm.
Chúng sinh trưởng tốt trong môi trường có dicarboxylic và tổng hợp nitơ trong một
khoảng pH biến thiên từ 5,3 - 8. Trong môi trường bán đặc vi khuẩn - tạo

thành một lớp màng mỏng, trắng, mịn ( pellicle). Khi cấy chuyển lên môi trường đặc
Nfb thì lớp màng này phát triển thành khuẩn lạc nhỏ, ẩm, ánh xanh và trên môi trường
đặc BMS thu được khuẩn lạc màu trắng sữa.
- có khả năng cố định đạm cộng sinh trong mô của những cây thân
cỏ như: Lúa, bắp, mía, sorghum, chuối và khóm. Ngoài ra chúng còn tạo ra những sản
phẩm của phytohormones như auxins và gibberillins rất tốt cho sự tăng trưởng của cây.
- Burkholderia [11].
17
Vi khuẩn thuộc vi khuẩn Gram âm, có hình dạng hình que, đường
kính khoảng 1µm, chúng có thể di chuyển nhờ các chiên mao ở đầu (Jesús et al, 2004).
sinh trưởng và phát triển trong điều kiện kỵ khí hoặc hiếu khí, nhưng trong
môi trường ít khí oxy thì phát triển tốt nhất, chúng phát triển sâu trong môi trường nuôi
cấy từ 1 - 4mm (Paulina et al, 2001). Trong môi trường nuôi cấy chúng tạo thành các
khuẩn lạc màu trắng hoặc hơi vàng, đường kính khoảng 2 - 4mm, tròn, phẳng hoặc dài
(Jesús et al, 2004). sống cộng sinh với cây trồng và có khả năng cố định
đạm.Ví dụ như khi các vi khuẩn  sống cộng sinh với cây luá sẽ cố định
đạm khoảng 19% tổng lượng đạm cần thiết cho nhu cầu của cây lúa. Năng suất của cây
lúa có chủng loài   tương đương với năng suất của cây lúa
không chủng loài   nhưng có bón phân đạm 25 - 30kg/ha
(Van et al, 2000).

Vi khuẩn  và  có dạng que
ngắn, một số có dạng que dài và tất cả đều có khả năng chuyển động nhờ chiêm mao
(Lương Thị Phương Thảo, 2010). Những đặc điểm trên cũng là những đặc điểm nổi bật
của hình dạng cố định đạm. Đa số các dòng Burkholderia có khuẩn lạc
màu trắng đục, dạng tròn, có độ nổi mô, bìa nguyên, một số khuẩn lạc có màu vàng, bìa
răng cưa, kích thước khuẩn lạc từ 0.5–1.5 mm. (Nguyển Thị Minh Thư, 2010)
 được tìm thấy ở rễ bắp, lúa và cà phê (Estrada et al., 2001).
Loài được tìm thấy ở rễ cây lúa trồng ở miền nam Việt
Nam, thí nghiệm ở cây lúa chủng sau 14 ngày chúng giúp

tăng khả năng đâm chồi 33%, rễ tăng 57% diện tích lá tăng 30% năng xuất lúa tăng 13-
22% (La Nguyễn Tường Vi, 2010). Tiến hành chủng vi khuẩn -
 và giống vi khuẩn  vào cây lúa, kết quả cho thấy vi khuẩn có
khả năng cố định đạm khoảng 19% tổng số đạm cần thiết cho cây (Vera et al., 2000).

 là một trong 9 loài của các phức 
 đã được đánh và khẳng định là một trong số những vi sinh vật đa năng trao đổi
chất được biết đến nhiều nhất, đang phát triển trên hơn 200 hợp chất hữu cơ, sửa chữa N
2
và mang nhiều kháng sinh. Những ngiên cứu khảo sát khả năng cố định đạm của
18
 cho thấy khi chúng sống cộng sinh trong cây bắp trồng ở Mexico cố định
đạm tốt như ở cây mía trồng ở Brazil và Nam Phi (Reis et al., 2004).
Pseudomonas[11],[22],[34],[35],[36]
là một chi lớn có nhiều ứng dụng trong thực tiễn sản xuất nông
nghiệp. Trong vô số các ứng dụng đó thì khả năng cố định đạm của giống Pseudomonas
đã được khẳng định từ năm 1994 (Chan et al.,1994). Cố định đạm sinh học trên làm tăng
đạm tổng số lên 20 - 25% (Dobereiner, 1992).[32]
Theo nghiên cứu của Kapoor khi phối hợp chủng Azotobacter sp với các chủng
phân giải phosphat như Bacillus sp, ) Thí nghiệm làm tăng năng suất
lúa, bông vải lên 10-20% [32].
Sandhya V và cộng sự đã phân lập được  trên các loại
cây trồng tại các vùng đất khô cằn ở Ấn Độ qua nghiên cứu khảo nghiệm thì chủng này
có khả năng sản xuất các phytohormon (IAA, GA, cytokinin), phân giải Phosphat khó
tan ngoài ra chúng còn có tiềm năng lớn trong việc nghiên cứu kiểm soát sinh học để tạo
ra thuốc trừ sâu sinh học hiệu quả mà không gây ảnh hưởng đến môi trường [40].
1.3. Tình hình nghiên cứu ngoài nuớc.
Năm 1986 phân bón vi sinh do Noble Hiltner sản xuất đầu tiên tại Đức được đặt
tên là Nitragen, đây là loại phân được chế tạo bởi vi khuẩn do Bijerink phân
lập năm 1988. Từ đó đến nay đã có rất nhiều công trình nghiên cứu nhằm ứng dụng và

mở rộng việc sản xuất các loại phân bón vi sinh vật cố định N
2
mà thành phần còn được
bổ sung phối hợp thêm một số chủng vi sinh vật có ích khác ví dụ như xạ khuẩn cố định
N sống tự do các vi khuẩn cố định N sống tự do '
()))
Hiệu quả của việc nhiễm chế phẩm cho đất và hạt giống, cây con
đã được chứng minh trên các thí nghiệm đồng ruộng. Theo nghiên cứu của Puneet
(1998) cho thấy việc nhiễm kích thích nẩy mầm của hạt, kích thích ra rễ
và sinh trưởng, năng suất lúa mì, ngô tăng 10-15% so với đối chứng [30].
Tổng kết các kết quả nghiên cứu của Nhật Bản, Hoa Kỳ, Trung Quốc, Ấn Độ cho
thấy sử dụng chế phẩm  có thể cung cấp cho cây trồng từ 30-60 kg
N/ha/năm và tổng lượng N do vi sinh vật tổng hợp trên hành tinh có thể đạt đến 240 triệu
19
tấn/năm. Vi khuẩn cố định N tự do   còn có khả năng tổng hợp B1,
giberellin, cytokinin kích thích tăng trưởng cây trồng [33].
Fulchieri (1993) nghiên cứu sử dụng 3 chủng để xử lý hạt cho ngô.
Kết quả cho thấy đã làm tăng chiều cao cây, tăng sinh khối và tăng năng suất ngô lên
59% so với đối chứng, các chủng này có thể cung cấp khoảng 60 kg N/ha [35].
Nghiên cứu của Puneet (1998) cũng cho thấy nếu bón phối hợp )
với các chủng phân giải P như  sẽ làm tăng năng suất lúa mì tăng
17,7%, trong khi chỉ tăng 9% . Kapoor cũng cho kết quả tương tự khi phối
hợp chủng   với các chủng phân giải phosphat như   
) Thí nghiệm làm tăng năng suất lúa, bông vải lên 10-20% [35].
El-Komy (2005) nghiên cứu phối hợp hai chủng cố định N và phân
giải lân xử lý cho lúa mì. Kết quả cho thấy hàm lượng N trong thân
lúa mì của các thí nghiệm có xử lý hai chủng này tăng 37-53%; hàm lượng P trong thân
tăng 48,6%; hàm lượng K tăng 10-14,3% so với đối chứng không xử lý. Kết quả nghiên
cứu cũng cho thấy xử lý phối hợp hai chủng có tác dụng cộng hưởng, tốt hơn xử lý đơn
chủng [34].

Zemrany (2006) nghiên cứu sử dụng chủng )*cho ngô. Kết quả cho
thấy khi sử dụng chủng này đã làm giảm 50% lượng N cho cây mà năng suất ngô vẫn
đảm bảo [33].
Abbas Akbari và cộng sự (2007) đã phân lập và tuyển chọn được một số chủng
 có khả năng sinh tổng hợp IAA kích thích sinh trưởng của cây lúa mì.
Kết quả là sự nhiễm các chủng  đã làm tăng đường kính gốc lúa, chiều
dài rễ, trọng lượng khô và số lượng lông rễ so với đối chứng [27].
Elazar Fallik and Yaacov Okon ( 1996) nghiên cứu sử dụng 
 kết hợp với than bùn cho  và ngô. Kết quả cho thấy chiều dài
thân, trọng lượng khô, năng suất tăng đáng kể. Sinh khối vi khuẩn là 10
8
CFU/1g than
bùn có hiệu quả gây nhiễm hạt giống cao nhất [24].
Fabricio Cassa´n và cộng sự ( 2009) đã nghiên cứu phối hợp hai chủng
 Az39 và "( E109 xử lí cho ngô và đậu
20
tương. Kết quả cho thấy xử lí phối hợp hai chủng cho hiệu quả cao hơn so với xử lí đơn
chủng. Tỉ lệ nảy mầm, chiều cao cây, chiều dài rễ, trong lượng khô đều tăng so với đối
chứng [25].
Andres D. Naiman và cộng sự ( 2009) đã nghiên cứu xử lý gây nhiễm vi khuẩn
 và * cho lúa mì. Kết quả cho thấy chiều
cao cây tăng 12%, đường kính gốc thân tăng 40%, năng suất tăng 16% [23 ].
1.4. Nghiên cứu trong nước
Ở Việt Nam, phân vi sinh vật cố định đạm ở cây họ đậu và phân vi sinh vật phân
giải lân đã được nghiên cứu từ năm 1960. Đến năm 1987, phân Nitragin trên nền đất
mang than bùn mới được hoàn thiện. Đến 1991 đã có hơn 10 đơn vị trong cả nước tập
trung nghiên cứu phân vi sinh vật. Các nhà khoa học đã phân lập được nhiều chủng vi
sinh vật cố định đạm và một số vi sinh vật phân giải lân.
Nhằm mục tiêu phát triển nông nghiệp sinh thái bền vững và ứng dụng CNSH
vào nông nghiệp, trong những năm gần đây Việt Nam có khá nhiều nghiên cứu về

và và các vi khuẩn nội sinh có khả năng cố định đạm khác
làm phân sinh học.
Phạm Bích Hiên và cộng sự ( 2003) đã nghiên cứu 10 chủng của
Việt Nam và nhận thấy rằng ngoài khả năng cố định N chúng còn có khả năng sinh tổng
hợp chất kích thích sinh trưởng IAA. Nhiệt độ thích hợp của các chủng này là 25-30
0
C,
pH thích nghi rộng từ 5,5- 8,0 [10].
Nguyễn Hữu Hiệp, Renato đã phân lập các dòng vi khuẩn nội sinh để sản xuất
phân vi sinh ở quy mô phòng thí nghiệm cho cây mía trồng tại tỉnh Sóc Trăng”. Cao
Ngọc Điệp, Nguyễn Văn Mít cũng nghiên cứu hiệu quả phân vi khuẩn
," và vi khuẩn  trên năng suất
và trữ lượng đường trên cây mía (**L.) trồng trên đất phù sa tỉnh
Hậu Giang”. Trần Thanh Phong (2012) cũng nghiên cứu đánh giá khả năng cố định
đạm của vi khuẩn nội sinh đến năng suất và chất lượng của trái khóm trồng tại Huyện
Tân Phước, Tỉnh Tiền Giang” [12].
Phạm Ngọc Lan (1999) đã phân lập được 37 chủng trên đất gò đồi
vùng Thừa Thiên - Huế. Nhóm nghiên cứu cũng tuyển chọn được hai chủng có khả năng
21
kháng kháng sinh, tồn tại được ở pH kiềm ( pH = 8). Kết quả thử nghiệm gây nhiễm cây
giống keo tai tượng trong vườn ươm đã làm tăng tỷ lệ sống, sinh khối, chiều cao cây và
hàm lượng N trong lá cũng cao hơn so với đối chứng [14].
Nguyễn Thị Phương Chi (1999) nghiên cứu bón thử nghiệm chủng cố định N tự
do  và chủng phân giải phosphate , 
. Kết quả cho thấy chế phẩm sinh học làm tăng sinh trưởng chiều cao mạ 7,47
- 16,93% và năng suất lúa tăng từ 13,39 – 55,85% [3].
Lâm Minh Tú, Trần Văn Tuân (2003) nghiên cứu sản xuất một số phân bón đơn
chủng, đa chủng cho cây trồng. Các chủng sử dụng trong nghiên cứu là 
(""$)Thử nghiệm trên
khoai tây làm tăng năng suất từ 100 - 300% so với đối chứng [19].

Phạm Văn Toản (2003) sử dụng phân bón sinh học giảm được 20% phân bón vô
cơ N, P, K nhưng năng suất khoai tây vẫn tăng so với đối chứng 15-50%, cà chua tăng
12-34%, lạc tăng 30% và giảm đáng kể bệnh héo xanh [18].
Nguyễn Ngọc Dũng, Hồ Thị Kim Anh (1999) nghiên cứu ảnh hưởng của các
chủng cố định N trong rễ lúa đến sinh trưởng của mầm lúa CR 203. Nhóm tác giả đã
phân lập được 78 chủng cộng sinh với rễ lúa. Các chủng này có đặc điểm của chi
)Các chủng này kích thích sự nảy mầm và rễ của lúa CR 203 [1].
Lăng Ngọc Dậu (2004) đã nghiên cứu khả năng tạo IAA của vi khuẩn
*, tiến hành nuôi cấy chủng vi khuẩn này trên môi trường Nfb có
bổ sung Tryptophan, theo dõi tại những thời điểm khác nhau. Kết quả cho thấy tại thời
điểm 10 ngày sau khi cấy ủ khả năng tao IAA cao nhất [4].
Ngô Thanh Phong, Cao Ngọc Diệp (2012) đã nghiên cứu xác định mức độ cố
định đạm sinh học của ).,/ và Pseudomonas sp. BT1 trên cây lúa cao
sản OM2517 trồng ngoài đồng. Kết quả 2 chủng này có thể thay thế 25 - 50% N cho
năng xuất cao hơn đối chứng khi bón 100%N mà không nhiễm vi khuẩn.
Nguyễn Anh Dũng và cộng sự (2010), đã phân và xác định mức độ cố định đạm
sinh học của Azospirillum trên cây ngô trong bầu đất tại Đăk Nông. Kết quả chủng này
có thể thay thế 25 – 50% N cho năng xuất cao hơn đối chứng khi bón 100%N mà không
nhiễm vi khuẩn [6].
22
23
PHẦN II. NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1 Nội dung nghiên cứu
Để đạt được mục tiêu của đề tài chúng tôi tiến hành nghiên cứu các nội dung sau:
Phân lập, mô tả đặc điểm sinh học và định danh bằng sinh học phân tử một số
chủng vi khuẩn cố định đạm cộng sinh trong rễ câyngô.
Tuyển chọn các chủng vi khuẩn nội sinh có khả năng cố định đạm bằng nghiên
cứu thử nghiệm trên cây ngô.
Nghiên cứu xây dựng quy trình nhân sinh khối của các chủng vi khuẩn nội sinh
được tuyển chọn.

2.2 Vật liệu và địa điểm nghiên cứu
2.2.1 Vật liệu và thiết bị nghiên cứu
* Vật liệu:
- Các chủng vi khuẩn cố định đạm nội sinh được phân lập từ rễ cây ngô trong
giai đoạn trổ cờ tại huyện Ea Súp, Buôn Ma Thuột, Krông Năng thuộc tỉnh Đăk Lăk.
- Giống ngô lai Giống DK-888 là một giống lai đơn do tập đoàn Charoen -
Pokphand của Thái Lan sản xuất.
* Hóa chất: Acid Malic, KH
2
PO
4
, Na
2
MoO
4
, CuSO
4
, ZnSO
4
, Saccarose, Agar,
Biotin, Pyridoxine
* Thiết bị nghiên cứu: Đĩa petri, micropipette, que cấy, box cấy vô trùng, máy
quang phổ spectrophotometer Plus 100 (Nhật Bản), máy ủ nhiệt, nồi hấp khử trùng, PCR
C1000 (Biorad, Mỹ); GelDoc (Biorad, Mỹ); Điện di Biorad (Mỹ).
2.2.2 Địa điểm nghiên cứu.
- Địa điểm thu mẫu: Được thực hiện tại các huyện Ea Súp, Krông Năng, Krông
Păk thuộc tỉnh Đăk Lăk.
- Địa điểm thí nghiệm: Được thực hiện tại viện CNSH & MT, Trường Đại học
Tây Nguyên.
- Địa điểm thực nghiệm: Tại xã Ea Rôk – Huyện Ea Súp – Tỉnh Đăk Lăk.

24
2.2.3 Thời gian nghiên cứu.
Đề tài thực hiện từ tháng 08/2012 tới tháng 08/2013.
2.3 Phương pháp nghiên cứu.
2.3.1 Phương pháp thu mẫu.
Thu thập một cách ngẫu nhiên rễ cây ngô trong giai đoạn trổ cờ thuộc các giống
khác nhau, trên các nền đất khác nhau, mỗi ruộng lấy 5 cây (4 cây ở 4 góc và 1 cây ở
giữa ruộng) tại các huyện Ea Súp, Krông Năng, thành phố BMT tỉnh Đăk Lăk.
Toàn bộ bộ rễ được đựng trong túi nilon đã khử trùng. Các mẫu sau khi lấy được
ghi nhãn nơi lấy, ngày lấy và người thu mẫu. Mẫu rễ cây ngô sau khi thu được đem tới
phòng thí nghiệm, rửa thật sạch đất bám ở rễ dưới vòi nước chảy, để ráo tự nhiên, để
riêng từng mẫu rồi tiến hành phân lập hoặc bọc riêng từng mẫu trong túi nilon đã khử
trùng buộc chặt và bảo quản trong tủ lạnh (5
0
C) nếu chưa phân lập ngay [7], [20].
2.3.2 Phương pháp phân lập
Cắt rễ thành những khúc nhỏ 2 - 3cm. Các mẫu rễ được để riêng trong các bình
tam giác tiến hành khử trùng bề mặt. Rễ được khử trùng bằng dung dịch chloromine 1%
trong 30 phút, tiếp tục khử trùng bằng cồn 70
0
5 phút, H
2
O
2
3 phút rồi rửa thật sạch bằng
nước cất vô trùng (6 lần). Sau đó lấy khoảng 2g mẫu cho vào cối giã nhuyễn rồi thêm
0,5 - 2ml nước cất vô trùng vào cối, để yên 10 phút và hút lấy phần trong cho vào
eppendorf, để yên 10 phút cho dịch mẫu lắng xuống và lấy phần nước trong để tiến hành
phân lập. Lấy 0,5ml dịch nghiền rễ cho vào ống nghiệm chứa 5ml môi trường NFb bán
đặc (không đạm). Ủ ở nhiệt độ 32

0
C trong vòng 4 - 5 ngày, mỗi nghiệm thức lặp lại 3
lần.
Quan sát những ống nghiệm có vòng đậm (vòng pellicle), cách bề mặt môi
trường 2 – 5 mm chỉ thị có sự hiện diện của vi khuẩn cố định đạm nội sinh. Chuyển vi
khuẩn từ môi trường bán đặc sang môi trường đặc tiến hành làm thuần giống [20].
Làm thuần giống: Cấy ria các khuẩn lạc được lựa chọn lên các đĩa petri chứa môi
trường Nfb đặc để thu khuẩn lạc đơn. Quá trình làm thuần được tiến hành 2 - 3 lần.
Chọn khuẩn lạc đơn đã được làm thuần cấy chuyền vào ống thạch nghiêng để giữ giống
[6],[7],[20].
* Môi trường Nfb không đạm: [6], [32].
25
- Acid Malic: 5g
- K
2
HPO
4
: 0,5g
- MgSO
4
.7H
2
O: 0,2g
- NaCl: 0,1g
- CaCl
2
: 0,02g
- KOH: 4g
- 1 ml dung dịch stock vitamin (10 mg biotin và 20mg pyridoxine trong 100 ml
nước cất).

- 2ml dung dịch vi lượng (200mg Na
2
MoO
4
.2H
2
O, 235mg MnSO
4
.H
2
O, 280 mg
H
3
BO
3
, 8 mg CuSO
4
.5H
2
O, 24 mg ZnSO
4
.7H
2
O hòa tan trong 200 ml nước cất).
- Agar: 1,75 g/ lít
- 2ml Bromthymol blue 0,5%
- Thêm nước cất vừa đủ 1 lít.
- pH điều chỉnh đến 6,8.
* Môi trường đặc có chứa 15g/lít agar (Dobreigner, 1995)
2.3.3 Phương pháp mô tả đặc điểm hình thái, đặc điểm sinh học của các chủng vi

khuẩn cố định đạm nội sinh.
Mô tả các đặc điểm hình thái của các chủng dưới kính hiển vi, xác định đặc điểm
sinh học và định danh theo khoá phân loại của Bergey 1994.
2.3.3.1. Phương pháp nhuộm gram.
Nhuộm gram bằng bộ kit nhuộm: Crystol Violet, Lugol, ethanol 95%, dung dịch
safanin 0,5%, nước cất.
2.3.3.2. Phương pháp đo kích thước tế bào vi khuẩn.
Kích thước vi khuẩn được đo trên kính hiển vi điện tử có thị kính ×10, vật
kính ×40.
Quan sát vào kính hiển vi ta thấy có 5 khoảng chia của thước đo vật kính
(tức 50 µm) nằm gọn vào 20 khoảng chia của thước đo thị kính, vậy mỗi khoảng
chia của thước đo thị kính với độ phóng đại đang dùng là 2,5 µm.
Tiến hành đo kích thước theo trình tự sau.