Nghiên cứu tạo chế phẩm aspergillus niger không sinh độc tố để phòng chống nấm mốc và độc tố ochratoxin a trên cà phê

BỘ GIÁO DỤC VÀ ðÀO TẠO
TRƯỜNG ðẠI HỌC NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI













ðÀO THỊ HƯƠNG




NGHIÊN CỨU TẠO CHẾ PHẨM ASPERGILLUS NIGER KHÔNG
SINH ðỘC TỐ ðỂ PHÒNG CHỐNG NẤM MỐC VÀ ðỘC TỐ
OCHRATOXIN A TRÊN CÀ PHÊ

LUẬN VĂN THẠC SĨ NÔNG NGHIỆP


Chuyên ngành : Công nghệ Sinh học
Mã số : 60.42.02.01

Giảng viên hướng dẫn : TS. Trần Thị Mai

TS. Nguyễn Văn Giang





HÀ NỘI - 2013
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………


i

LỜI CAM ðOAN

Tôi xin cam ñoan số liệu và kết quả nghiên cứu trong luận văn này là hoàn
toàn trung thực và chưa ñược sử dụng ñể bảo vệ một học vị nào.
Tôi xin cam ñoan mọi sự giúp ñỡ cho việc thực hiện luận văn ñã ñược cảm
ơn và các thông tin trích dẫn luận văn ñã ñược ghi rõ nguồn gốc.
Tác giả luận văn



ðào Thị Hương

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………


ii

LỜI CẢM ƠN

ðể hoàn thành luận văn tốt nghiệp này, tôi ñã nhận ñược sự hướng dẫn,
giúp ñỡ và góp ý nhiệt tình của anh chị em ñồng nghiệp tại Bộ môn nghiên
cứu Công nghệ sinh học sau thu hoạch – Viện Cơ ñiện nông nghiệp và Công
nghệ sau thu hoạch. Và sự hướng dẫn, góp ý của quý thầy cô cùng toàn thể
cán bộ Bộ môn Công nghệ vi sinh – Khoa Công nghệ Sinh học – Trường ðại
học Nông nghiệp Hà Nội
Trước hết, tôi xin chân thành cảm ơn ñến quý thầy cô Trường ðại học
Nông nghiệp Hà Nội, ñặc biệt là những thầy cô ñã tận tình dạy bảo cho tôi
suốt thời gian học tập tại trường.
Tôi xin gửi lời biết ơn sâu sắc ñến TS. Trần Thị Mai và TS. Nguyễn
Văn Giang ñã dành rất nhiều thời gian và tâm huyết hướng dẫn nghiên cứu và
giúp tôi hoàn thành luận văn tốt nghiệp.
Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới GS. TS. Nguyễn Thùy Châu và
ThS. Nguyễn Văn Nguyện - Viện Cơ ñiện nông nghiệp và Công nghệ sau thu

hoạch là chủ nhiệm ñề tài nghiên cứu và dự án “Hoàn thiện công nghệ sản
xuất chế phẩm vi sinh ñể phòng chống nấm sinh ñộc tố và ñộc tố nấm mốc
trên ngô, lạc, cà phê” cùng anh chị em ñồng nghiệp ñã tạo mọi ñiều kiện ñể
tôi hoàn thành luận văn.
Tôi xin chân thành cảm ơn gia ñình và bạn bè ñã tạo rất nhiều ñiều
kiện, giúp ñỡ tôi học tập và hoàn thành tốt luận văn tốt nghiệp này.

Hà Nội, Ngày 03 tháng 04 năm 2013
Học viên


ðào Thị Hương
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………


iii

MỤC LỤC

Lời cam ñoan i
Lời cảm ơn ii
Mục lục iii
Danh mục các chữ viết tắt vi
Danh mục bảng vii
Danh mục hình ix
Danh mục ñồ thị x
1 MỞ ðẦU 1
1.1 ðặt vấn ñề 1
1.2 Mục tiêu 2
1.3 Nội dung nghiên cứu 3

2 TỔNG QUAN 4
2.1.1 ðại cương về cây cà phê Robusta 4
2.1.2 ðặc ñiểm cây cà phê 4
2.1.3 ðặc ñiểm ñất trồng cà phê 6
2.2.1 Nguồn gốc ñộc tố ochratoxin 8
2.2.2 Các loại ñộc tố ochratoxin 8
2.2.3 Tính chất ochratoxin 9
2.2.4 ðộc tính của ochratoxin A 10
2.3 Sự tạo ñộc tố và sự nhiễm ochratoxin A trên nông sản 11
2.3.1 Sự tạo ochratoxin A bởi nấm mốc 11
2.3.2 Con ñường sinh tổng hợp ochratoxin A 12
2.3.3 Sự nhiễm ochratoxin A trên nông sản thực phẩm 14
2.3.4 Mức ñộ nhiễm nấm mốc sinh ñộc tố và ñộc tố ochratoxin A trên
cà phê ở Việt Nam
16
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………


iv

2.3.5 Sự tạo ñộc tố của A niger 17
2.4.1 Tình hình phòng chống ñộc tố ochratoxin A trên thế giới 21
2.4.2 Tình hình nghiên cứu ở Việt nam 22
2.5.1 Biện pháp ngăn ngừa, hạn chế ñộc tố nấm mốc. 22
2.5.2 Khử nhiễm ochratoxin A bằng hấp phụ sinh học 23
2.5.3 Phòng chống ochratoxin A phương pháp ñối kháng cạnh tranh. 24
3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 26
3.1.1 ðối tượng nghiên cứu: 26
3.1.2 Hóa chất 26
3.1.3 Môi trường 26

3.1.4 Thiết bị và dụng cụ 27
3.2.1 Phương pháp lấy mẫu cho phân tích ochratoxin A 28
3.2.2 Phương pháp xác ñịnh mức ñộ nhiễm mốc trên cà phê 28
3.2.3 Phương pháp phân lập nấm mốc 29
3.2.4 Xác ñịnh ñộ ẩm 31
3.2.5 Phương pháp ñịnh lượng mật ñộ Aspergillus niger trong cơ chất
nuôi cấy và trong chế phẩm.
31
3.2.6 Phương pháp xác ñịnh nhanh chủng nấm sinh và không sinh ñộc
tố tiến hành theo phương pháp của K Yabe và cộng sự.
32
3.2.7 Xác ñịnh sự tạo orchratoxin A của các chủng Aniger . 32
3.2.8 Phương pháp phân tích ochratoxin A trong cà phê 32
3.2.9 Phương pháp xác ñịnh khả năng giảm ochratoxin A bằng các
chủng A niger không sinh ochratoxin A 36
3.2.10 Nuôi cấy nấm mốc Aspergillus niger ở qui mô phòng thí nghiệm 36
3.2.11 Phương pháp sản xuất bào tử A niger ở qui mô 100kg/mẻ. 36
3.2.12 Phương pháp tạo chế phẩm AN 37
3.2.13 Phương pháp bố trí thí nghiệm với cà phê ngoài ñồng ruộng 37
3.2.14 Phương pháp theo dõi năng suất và các yếu tố cấu thành năng suất 38
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………


v

3.2.15 Kiểm tra chất lượng chế phẩm mốc sau thời gian bảo quản 38
3.2.16 Phương pháp xử lý số liệu thống kê 38
4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 39
4.1 Xác ñịnh khả năng sinh ñộc tố ochratoxin A của các chủng A niger 39
4.2 Nghiên cứu khả năng cạnh tranh, giảm ñộc tố của các chủng A niger

không sinh với các chủng sinh OTA hàm lượng cao
42
4.2.1 Hiệu quả giảm ñộc tố OTA của chủng sinh ñộc tố cao bằng các
chủng không sinh ñộc tố 42
4.2.2 ðánh giá khả năng cạnh tranh của chủng A niger AN2 với chủng
A niger pec2 sinh ñộc tố ochratoxin A cao.
44
4.3 Nghiên cứu công nghệ nhân nuôi tạo chế phẩm AN chứa chủng
A niger AN2 phòng chống nấm mốc và ñộc tố ochratoxin A trên cà phê 45
4.3.1 ðiều kiện lên men và thời gian thu hồi sinh khối A niger AN2 45
4.3.2 Nghiên cứu công nghệ nuôi cấy bề mặt sản xuất bào tử chủng
A niger AN2 quy mô phòng thí nghiệm
46
4.3.3 Nghiên cứu sản xuất bào tử A niger AN2 ở quy mô 100 kg/mẻ 50
4.3.4 Qui trình sản xuất chế phẩm AN từ chủng A niger AN2
ñể phòng chống nấm mốc và ñộc tố ochratoxin A nhiễm trên cà phê 52
4.5.1 Hiệu quả của chế phẩm AN ñến bệnh do nấm, sinh trưởng và
năng suất cà phê tại vùng thử nghiệm 56
4.5.2 Hiệu quả phòng chống nấm mốc và ñộc tố ochratoxin A trên cà
phê của chế phẩm AN 58
4.5.3 ðánh giá chất lượng chế phẩm AN 61
5 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 64
TÀI LIỆU THAM KHẢO 66
PHỤ LỤC 72

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………


vi

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT

1. VSV: vi sinh vật
2. OTA: ochratoxin A
3. A. niger: Aspergillus niger
4. KLPT: khối lượng phân tử
5. KPHð: không phát hiện ñược
6. HPLC: sắc ký lỏng cao áp
7. & cs: và cộng sự
8. v/ph: vòng/ phút
9. bao bì PP: bao bì polypropylene


Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………


vii

DANH MỤC BẢNG


STT Tên bảng Trang

2.1 Thành phần hữu cơ, vô cơ và khoáng trong ñất trồng cà phê tại
huyện Cư Kuin – ðắc Lắc
7
2.2 Giới hạn nhiễm OTA cho phép trong 1 số sản phẩm 16
4.1 Khả năng sinh OTA của các chủng Aspergillus niger phân lập từ
cà phê và ñất trồng cà phê
39

4.2 Hiệu quả giảm OTA của chủng A. niger pec2 bằng các chủng A.
niger không sinh ñộc tố
43
4.3 Mật ñộ bào tử của chủng A. niger AN2 tạo ñược trên các môi
trường khác nhau
47
4.4 Khả năng tạo bào tử của chủng A. niger AN2 ở các nhiệt ñộ nuôi
cấy khác nhau
48
4.5 Ảnh hưởng của ñộ ẩm môi trường ñến khả năng tạo bào tử của
chủng A. niger AN2 48
4.6 Ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy ñến khả năng tạo bào tử của
chủng A. niger AN2
49
4.7
Ảnh
hưởng của tỷ lệ tiếp giống
tới
mật ñộ bào tử A. niger AN2 50
4.8 Ảnh hưởng của ñộ dày khối ủ tới mật ñộ bào tử A. niger AN2 51
4.9 Mật ñộ bào tử A. niger AN2 trong chất mang ở các thời gian bảo
quản khác nhau
52
4.10 Tỉ lệ rụng quả và năng suất trên cây cà phê 57
4.11 Mật ñộ các vi sinh vật có khả năng sinh OTA trong ñất 58
4.12 Tỷ lệ nhiễm nấm mốc sinh ñộc tố và hàm lượng OTA trong hạt
cà phê sau thu hoạch và sau các thời gian bảo quản khác nhau
59
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………

viii

4.13 Kết quả phân tích chế phẩm bào tử mốc chủng A. niger AN2 61
4.14 Ảnh hưởng của thời gian bảo quản chế phẩm ñến mật ñộ bào tử
A. niger AN2
61
4.15 Ảnh hưởng của thời gian bảo quản chế phẩm ñến hoạt tính giảm
ochratoxin A. 62


Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………


ix

DANH MỤC HÌNH


STT Tên hình Trang

2.1 Con ñường sinh tổng hợp ochratoxin A 14
2.2 Hình dáng khuẩn lạc A. niger 18
2.3 Hình dạng bào tử nấm A. niger 18
4.1 Chủng A. niger Pec2 và chủng A. niger AN2 40
4.2 Xác ñịnh khả năng sinh ñộc tố của các chủng bằng phương pháp
sắc kí bản mỏng
41
4.3 Sắc kí ñồ HPLC chủng AN pec2 42
4.4 Sắc kí ñồ HPLC chủng AN2 42

4.5 Khả năng cạnh tranh của chủng A. niger AN2 không sinh ñộc tố
và chủng A. niger pec2 sinh ñộc tố OTA cao
45
4.6 ðường cong sinh trưởng của chủng A. niger AN2 46
4.7 Hiệu quả thử nghiệm trên cà phê sau 12 tháng bảo quản 60
4.8 Sắc ký ñồ hàm lượng ochratoxin A cà phê trong lô thí nghiệm,
KPHð
60

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………


x

DANH MỤC ðỒ THỊ


STT Tên ñồ thị Trang

4.1 Mật ñộ bào tử AN2 tạo ñược trên các môi trường khác nhau 72
4.2 Ảnh hưởng của nhiệt ñộ ñến khả năng tạo bào tử AN2 72
4.3 Ảnh hưởng ñộ ẩm môi trường ñến khả năng tạo bào tử A. niger AN2 73
4.4 Ảnh hưởng thời gian nuôi cấy ñến mật ñộ bào tử A. niger AN2 73
4.5 Ảnh hưởng tỷ lệ tiếp giống ñến mật ñộ bào tử A. niger AN2 74
4.6 Ảnh hưởng ñộ dày khối ủ ñến mật ñộ bào tử A. niger AN2 74
4.7 Lựa chọn chất mang phù hợp cho sản xuất bào tử A. niger AN2
ở thời gian bảo quản khác nhau
75

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………

1

1. MỞ ðẦU

1.1. ðặt vấn ñề
Ở nước ta, cây cà phê ñược trồng rộng rãi ñóng vai trò trọng yếu và có
giá trị kinh tế rất cao. Theo Tổng cục thống kê, tính ñến năm 2005, diện tích
trồng cà phê ở nước ta là khoảng 450 000 ha. Thống kê của Hiệp hội cà phê
cacao Việt Nam Vicofa cho biết hiện nay cả nước ta có khoảng 530 000 ha
ñất trồng cà phê, tập trung chủ yếu tại các tỉnh Tây Nguyên trong ñó ðắc Lắc
là tỉnh có diện tích cà phê cao nhất nước khoảng 190.765 ha (Vicofa, 2005)
Với khí hậu nóng ẩm, là ñiều kiện thuận lợi cho nấm mốc phát triển
gây tổn thất lớn cho cà phê ở giai ñoạn sau thu hoạch và sinh ra các ñộc tố ñặc
biệt nguy hiểm với sức khoẻ con người và ñộng vật kinh tế, trong ñó ñộc tố
Ochratoxin A nhiễm phổ biến trên cà phê. ðộc tố Ochratoxin A nhiễm ở mức
ñộ thấp, làm giảm sức ñề kháng, gây bệnh cho người, làm giảm năng suất vật
nuôi, khi nhiễm ở mức ñộ cao có thể gây ung thư.
Theo nghiên cứu của Z. Ilic và cộng sự , kết quả cho thấy 93% các mẫu
cà phê nhiễm nấm mốc chủ yếu là A. niger và 8,7% trong số ñó sinh ñộc tố
ochratoxin A (Z. Ilic & cs, 2007). Nghiên cứu của S. L. Leong và cộng sự về
cà phê Việt Nam cũng cho thấy hầu hết các mẫu kiểm tra ñều nhiễm nấm mốc
trong ñó chủ yếu là nhiễm A. niger (S.L.Leong & cs, 2004). Theo báo cáo của
Nguyễn Văn Thường, hầu hết các mẫu cà phê nhiễm nấm mốc A. niger, nhiều
mẫu kiểm tra phát hiện ochratoxin A ở mức 3-6ppb, tuy vậy hàm lượng ñộc tố
này có thể sẽ tăng lên trong quá trình bảo quản (Nguyễn Văn Thường & cs,
2006) . Nguyễn Thùy Châu và cộng sự ñã kiểm tra cà phê tại khu vực Tây
Nguyên sau 1 tháng bảo quản hầu hết nhiễm nấm mốc A. niger sinh
ochratoxin A, 20% các mẫu khi phân tích chứa ochratoxin A với hàm lượng

từ 1-10ppb (Nguyễn Thùy Châu & cs, 2010).
Trên thế giới, việc nghiên cứu mức ñộ nhiễm nấm mốc và ñộc tố nấm
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………


2

mốc trên lương thực, thực phẩm là vấn ñề quan trọng nhằm bảo vệ sức khoẻ
con người và các ñộng thực vật kinh tế. Giới hạn về mức ñộ nhiễm
Ochratoxin A ñã là một trong những tiêu chuẩn an toàn vệ sinh thực phẩm của
các quốc gia.
ðã có nhiều phương pháp nghiên cứu, áp dụng ñể loại bỏ ochratoxin A
bằng hóa chất, chiếu xạ. Các phương pháp này mang lại hiệu quả nhưng làm
tổn hại ñến chất lượng nông sản, dư lượng hóa chất sau xử lý cũng là một vấn
ñề gây mất an toàn thực phẩm. Ngày nay, việc loại bỏ nấm mốc sinh ñộc tố và
ñộc tố nấm mốc ngay từ trước thu hoạch bằng các chủng nấm mốc ñối kháng
ñang ñược quan tâm. Việc phòng chống nấm mốc sinh ochratoxin A ñã ñược
nhiều nhà khoa học của các nước nghiên cứu. Các tác giả như Ringot và
Bejaoui cho thấy chủng A. niger không sinh ñộc tố ñã có khả năng ức chế
chủng A. niger, A. ochraceus và Penicillium sinh ochratoxin A theo cơ chế
cạnh tranh. Kết quả này ñã ñược cộng ñồng châu Âu công nhận và khuyến
cáo sử dụng chủng A. niger không sinh ñộc tố ñể phòng chống ochratoxin A
trên ngô ở giai ñoạn ngoài ñồng (Ringot, 2006; Bejaoui , 2006).
Ở nước ta, công tác vệ sinh an toàn lương thực, thực phẩm ñã có những
tiến bộ rõ rệt và ngày càng ñược chú ý nhưng các biện pháp phòng trừ ñộc tố
mốc chủ yếu tập trung vào hoá chất. Trong khi ñó, vấn ñề an toàn vệ sinh thực
phẩm và ô nhiễm môi trường ñang trở thành mối quan tâm lớn. Vì vậy, việc
nghiên cứu và ứng dụng các chế phẩm sinh học trong phòng chống nấm sinh ñộc
tố và ñộc tố nấm mốc là rất cấp thiết. Xuất phát từ những lý do trên, chúng tôi
tiến hành ñề tài: “Nghiên cứu tạo chế phẩm Aspergillus niger không sinh ñộc

tố ñể phòng chống nấm mốc và ñộc tố ochratoxin A trên cà phê”
1.2. Mục tiêu
ðưa ra quy trình sản xuất chế phẩm Aspergillus niger không sinh ñộc tố
giảm mức nhiễm nấm mốc và ñộc tố nấm mốc ochratoxin A trên cà phê tới
mức cho phép theo tiêu chuẩn của Tổ chức Lương thực thế giới và Tổ chức
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………


3

Y tế thế giới, chất lượng sản phẩm thay ñổi không ñáng kể ñảm bảo vệ sinh
an toàn thực phẩm, giảm ô nhiễm môi trường.
1.3. Nội dung nghiên cứu
- Nghiên cứu mức ñộ nhiễm nấm mốc sinh ochratoxin A và xác ñịnh
khả năng tạo ñộc tố ochratoxin A các chủng phân lập trên cà phê và ñất trồng
cà phê ở các vùng trọng ñiểm.
- Nghiên cứu khả năng cạnh tranh của các chủng Aspergillus niger
không sinh ochratoxin A với các chủng sinh ochratoxin A hàm lượng cao.
- Nghiên cứu công nghệ nhân nuôi, tạo chế phẩm bào tử Aspergillus
niger ñối kháng không sinh ochratoxin A ở quy mô phòng thí nghiệm và quy
mô pilot 100kg/mẻ.
- ðánh giá an toàn của chế phẩm tại Khoa Dược lý - Viện Kiểm nghiệm
thuốc TW – Bộ Y tế.
- Thử nghiệm và ñánh giá hiệu quả chế phẩm chứa Aspergillus niger
không sinh ochratoxin A trên cà phê.

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………


4

2. TỔNG QUAN

2.1. Giới thiệu cây cà phê và ñất trồng cà phê
2.1.1. ðại cương về cây cà phê Robusta
Cà phê Robusta (hay còn gọi là cà phê Vối) tên khoa học: Coffea
canephora hoặc Coffea robusta là cây quan trọng thứ hai trong các loài cà phê.
Khoảng 39% các sản phẩm cà phê ñược sản xuất từ loại cà phê này.
Nước xuất khẩu cà phê Vối lớn nhất thế giới là Việt Nam. Các nước
xuất khẩu quan trọng khác gồm Coote d’Ivoire, Uganda, Brasil, Ấn ðộ.
Ở Việt Nam, từ năm 1930, cây cà phê bắt ñầu ñược trồng thành những
ñồn ñiền ñể khai thác nhân. Từ ñó ñến nay, diện tích, năng suất và sản lượng
cà phê ở nước ta ñã không ngừng tăng lên.
Những vùng trồng cà phê tập trung chính ở nước ta có ðắc Lắc, Lâm
ðồng, ðồng Nai, Gia Lai, Bình Phước , một số tỉnh miền núi phía Bắc như Sơn
La, Hòa Bình, …
Cây cà phê ñược De Jussien phân loại vào năm 1735. Cà phê thuộc bộ
Long ðởm (Gentianales), họ Cà phê (Rubiaceae), chi Coffea.
Hiện nay ñã có trên 100 loại cà phê ñược phát hiện, trên cơ sở ñặc ñiểm
từng loài, người ta ñã phân ra làm 3 loại giống chính: Cà phê Chè, cà phê Vối,
cà phê Mít.
Cà phê ở nước ta hiện nay trồng cả ba loại cà phê nói trên trong ñó cà
phê Robusta (cà phê Vối ) chiếm phần lớn diện tích và sản lượng tập trung
chủ yếu ở các tỉnh Tây Nguyên (Vicofa, 2005)

2.1.2. ðặc ñiểm cây cà phê
2.1.2.1. ðặc tính sinh học cây cà phê
Cây cà phê có 3 loại rễ: Rễ cọc có ñộ dài từ 0,3-0,5 m, mọc từ thân chính;
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………


5

rễ nhánh là những rễ nhánh mọc ra từ rễ cọc, ăn sâu xuống ñất tới 1,2- 1,5 m; rễ
con hầu hết tập trung ở tầng ñất mặt (từ 0-30 cm). Cây cà phê thân gỗ, cành mọc
từ thân chính gọi là cành cơ bản (cành cấp 1), cành mọc từ cành cấp 1 gọi là
cành thứ cấp (cành cấp 2). Trong ñiều kiện chăm sóc tốt, các cành cơ bản của
cây cà phê bắt ñầu xuất hiện sau trồng 20 – 40 ngày. Lá có tuổi thọ từ 7 – 10
tháng, lá, cành và thân cà phê là nơi dự trữ các nguồn dinh dưỡng ñể tạo hoa và
nuôi dưỡng sự phát triển của quả. Hoa cà phê mọc ra ở các chồi nách lá của cành
sơ cấp và cành thứ cấp cà phê Robusta thụ phấn theo hình thức giao phấn và
không ra hoa lại ở những ñoạn cành (hoặc nách lá) ñã ra hoa năm trước.
Sau khi thụ phấn, quả phát triển nhanh, thường quả cà phê có 1-2 nhân
(tùy theo lượng nước tưới và chế ñộ dinh dưỡng). Thời gian sinh trưởng ñối với
quả cà phê Vối thường từ 9-11 tháng (tuỳ theo ñiều kiện chăm sóc). Năng suất cà
phê Robusta ñạt khá cao 2300 – 4000 kg hạt/ha; hàm lượng cafein 1,7 – 4,0 %.
(Vicofa, 2005)
2.1.2.2. Thu hoạch và bảo quản cà phê
Niên vụ cà phê Robusta ñược tính từ tháng 10 ñến hết tháng 9 dương
lịch năm sau Thời gian thu hoạch tại các tỉnh Tây Nguyên thường kéo dài
trong 4 tháng, tính từ cuối tháng 10 ñến hết tháng 1. Cà phê hái xong phải chế
biến ngay. Nếu không kịp phải tãi quả cà phê trên nền gạch thoáng mát, tầng
không quá dày 30 – 40 cm. Không ủ ñống cà phê làm cho cà phê lên men.
Không giữ cà phê hái về quá 24h. Cà phê chỉ bảo quản khi ñạt ñộ ẩm khoảng
12,5% tránh sự xâm nhiễm của nấm mốc và ñộc tố nấm mốc.

2.1.2.3. Tình hình sản xuất và xuất khẩu cà phê ở Việt Nam
Tổ chức Cà phê Quốc tế (ICO) trụ sở tại London cho biết sản lượng cà
phê niên vụ 2011/12 của Việt Nam tăng lên mức 21 triệu bao 60kg, hay
15,8% của sản lượng toàn cầu.
Số liệu và các sự kiện về sản lượng và xuất khẩu cà phê của Việt Nam
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………


6

ñối với năm niên vụ hiện nay kết thúc vào tháng 9. Việt Nam là nhà sản xuất
cà phê lớn thứ hai thế giới sau Brazil và ñứng ñầu về sản lượng robusta.
Xuất khẩu cà phê của Việt Nam lên mức kỷ lục gần 1,6 triệu tấn trong
niên vụ 2011/12 sau khi ước tính 1,51 triệu tấn ñược xuất trong giai ñoạn
tháng 10/2011 ñến tháng 8/2012 (Vicofa, 2005) .
2.1.3 ðặc ñiểm ñất trồng cà phê
2.1.3.1. Hệ vi sinh vật trong ñất trồng cà phê
Tại ðăc Lăc, phần lớn diện tích ñất là ñất ñỏ bazan nâu ñỏ hình thành
và phát triển trên các cao nguyên bazan phần lớn có ñộ dốc thấp, tầng ñất mịn
dày, có thành phần cơ giới nặng (tỷ lệ sét >40%), tơi xốp khi ẩm, ñộ xốp
trung bình 62-65%, khả năng giữ nước và hấp thu nước tốt Rất thích hợp
với các loại cây công nghiệp dài ngày có giá trị hàng hoá cao như cà phê.
Hệ vi sinh vật chủ yếu trong ñất ñỏ bazan nâu ñỏ là hệ vi sinh vật phân
giải lân trong ñó phải kể tới sự có mặt của các nấm mốc.
Các nghiên cứu của Cục Khảo sát ñịa chất Hoa Kỳ cho thấy: các chủng
vi khuẩn ñặc biệt thuộc loài Pseudomonas và Bacillus các chủng nấm thuộc
loài Penicillium, Aspergillus có khả năng phân giải các phosphat khó tan
trong ñất nên chúng tồn tại khá phổ biến trong nguồn ñất ñỏ bazan (U.S.
Department of the Interior, 2001).
Sự có mặt của các loài nấm mốc ñặc biệt là Penicillium, Aspergillus

trong ñất là nguyên nhân dẫn tới sự nhiễm nấm mốc và ñộc tố nấm mốc trên
cà phê và ñất trồng cà phê. Những nghiên cứu gần ñây cho thấy một số chủng
của chi Aspergillus và Penicillium có khả năng tạo ñộc tố ochratoxin trên cà
phê (Dahman-levinson & cs, 2006).
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………


7

2.1.3.2. ðặc ñiểm ñất trồng cà phê tại huyện Cư Kuin – ðắc Lắc
Bảng 2.1. Thành phần hữu cơ, vô cơ và khoáng trong ñất trồng cà phê
tại huyện Cư Kuin – ðắc Lắc
Thành phần cấp hạt, %
ðộ sâu
tầng
ñất, cm
Dung
trọng
g/cm
3

Tỷ
trọng
g/cm
3

ðộ
xốp,
%
ðộ

ẩm, %

2,0-0,2
mm
0,2-0,02
mm
0,02-0,002
mm
≤0.002
mm
0-10 1,03 2.70 61.9 33.8 5.0 18.7 33.9 42.4
10-35 0.93 2.72 65.8 33.1 1.4 10.9 24.5 63.2
35-55 10 2.70 56.0 34.1 4.3 15.7 22.8 57.2
55-80 1.20 2.69 59.5 33.2 5.4 15.5 24.4 54.7
80-105 1.11 2.70 59.1 40.4 31.7 29.1 17.6 21.6

Tổng số %
Dễ tiêu,
mg/100g
ðộ chua,
cmol(+)/kg
pH
ðộ sâu
tầng ñất,
cm
OC N P2O5

K2O

P2O5

K2O
Trao
ñổi
Tiềm
tàng
H2O

KCl
0-10 2.55

0.17 0.38 0.54 108.0

57.00

0.10 29.12

5.9 4.8
10-35 0.90

0.08 0.28 0.48 65.8 6.12 0.15 25.80

5.9 4.2
35-55 0.61

0.06 0.15 0.35 39.2 45.70

0.10 21.40

6.2 4.5

55-80 0.38

0.07 0.15 0.28 27.5 32.5 0.10 22.30

6.2 4.6
80-105 0.14

0.02 0.14 0.29 167.3

45.00

0.12 21.30

6.5 4.5

Cation trao ñổi, cmol (+)kg ñất
CEC, cmol
(+)kg
ðộ sâu tầng
ñất, cm
Ca++ Mg++

K+ Na+ Tổng ðất Sét
BS,%
0-10 8.91 5.64 1.21 0.14 15.90 29.44 47.99 54.0
10-35 4.50 4.28 0.26 0.14 9.18 21.79 41.84 42.0
35-55 4.20 4.62 0.97 0.14 9.93 20.32 34.34 48.9
55-80 4.62 4.85 0.69 0.14 10.30 20.40 34.48 50.5
80-105 4.32 4.05 0.90 0.23 9.50 18.64 47.90 51.0
Nguồn: Viện Nông hóa Thổ nhưỡng

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………


8

2.2. ðộc tố Ochratoxin A
2.2.1. Nguồn gốc ñộc tố ochratoxin
Ochratoxin là nhóm ñộc tố ñược sinh ra bởi 1 số chủng nấm mốc thuộc
các chi Aspergillus và Penicillium và là loại ñộc tố có tiềm năng gây ung thu,
viêm thận cho người và ñộng vật. ðộc tố này ñược phát hiện trên nhiều nông
sản khác nhau như ngũ cốc và các sản phẩm của chúng
Ochratoxin là một nephotoxin lần ñầu tiên ñược tìm thấy ở nấm mốc
Aspergillus ochraceus vùng Nam Phi, trên hạt lúa bị nhiễm mốc (van der
Merwe & cs, 1965). Ở Anh chúng ñược tìm thấy ở ngô, bột ngô và bột cacao,
ở ðức tìm thấy ochratoxin trong thịt. Tuy nhiên ở các nước nhiệt ñới
Ochratoxin có nhiều trong cà phê.
Nakajima năm 1997 ñã ghi nhận tỷ lệ 30% nhiễm hàm lượng
ochratoxin A từ 0,1 – 17,4 µg/kg cà phê nhân ñược nhập vào Nhật Bản từ
Châu Phi và các nước Asian. Một số nhà nghiên cứu còn phân tích ñược
ochratoxin trên và phê rang (H. Tsubouchi 1988) và một số công trình cho
biết rằng có thể loại bỏ 78% hàm lượng ochratoxin nhờ quá trình rang cà phê
ở 200
0
C trong 20 phút.
2.2.2. Các loại ñộc tố ochratoxin
Có 7 loại ñộc tố ochratoxin ñược phát hiện tuy nhiên có 3 loại ñược
nghiên cứu nhiều là ochratoxin A, ochratoxin B và ochratoxin C.
* Ochratoxin A: Công thức phân tử C
20
H

18
ClNO
6
; ochratoxin A ñộc là
do sự ghép một nhân phenylalanin và một nhân izocumarin khi phân hủy nó
tạo ra dyhydro – izocumarin ñây là chất gây ñộc.

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………


9

* Ochratoxin B: Công thức phân tử C
20
H
19
NO
6
là dẫn xuất dechloro
ochratoxin A

* Ochratoxin C: Công thức phân tử C
20
H
22
ClNO
6
là ethyl este của
ochratoxin A

Trong các loại trên, ochratoxin A ñược nghiên cứu nhiều nhất do ñặc
tính gây ung thư và viêm thận cũng như sự nhiễm phổ biến của nó trên ngũ
cốc. Ochratoxin A gây ñộc nhiều và mạnh hơn ochratoxin B và ochratoxin C
do ñó ñược xem là ñối tượng chính cho việc xác ñịnh ochratoxin (van der
Merwe & cs, 1965).
2.2.3 Tính chất ochratoxin
Ochratoxin là hợp chất tinh thể màu trắng, ít tan trong nước, tan trong
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………


10

các dung môi hữu cơ như benzen, clorofrom, axetonnitrin ; không tan trong
các dung môi hòa tan chất béo như n-hexan, ethyl eter, eter dầu hỏa
Hầu hết ochratoxin phát huỳnh quang màu xanh ở bước sóng λ = 460
nm dưới ñèn tử ngoại UV. Ochratoxin có thể bảo quản trong etanol ở nhiệt ñộ
thấp trong vài năm mà không bị phân hủy (van der Merwe et al, 1965).
ðặc tính lý hóa của các ochratoxin
Ochratoxin KLPT
λ
max
hấp thu

ðiểm nóng
chảy (
0
C)
ε
(l.mol
-1

.Cm
-1
)
Ánh sáng
huỳnh quang
A 403 330 169 5550 Xanh lục
B 369 320 221 6000 Xanh lam
C 431 330 - 6200 Xanh lam

2.2.4. ðộc tính của ochratoxin A
Sự nhiễm ochratoxin A ở một số sản phẩm thực vật và ñộng vật ñã ñược
thông báo rộng rãi, có sự thay ñổi lớn hàm lượng ochratoxin A ở các hạt
lương thực trong thời gian bảo quản do ñiều kiện khí hậu (Nguyễn Văn
Thường, 2006).
Thận là cơ quan nhạy cảm nhất ñối với ochratoxin A như có thể gây ra
thương tổn cấp tính cũng như mãn tính cho thận. Thêm vào ñó, tác dụng của
ñộc tố ñối với hệ miễn dịch và tác dụng gây quái thai của ochratoxin cũng ñã
ñược xác ñịnh. Ochratoxin A cũng là một chất có khả năng gây ung thư. Thí
nghiệm cho chuột uống ochratoxin A trong hai năm ở các liều từ 3500-6000
µg/kg trọng lượng cơ thể chuột cái và 70µg/kg trọng lượng cơ thể/ ngày ở
chuột ñực, ñã kích thích tạo các u ở thận (Abbas Z & cs, 2013).
Tác dụng ñầu tiên của ochratoxin A vào cơ thể là ức chế sinh tổng hợp
protein. Tác dụng là ñặc trưng và bao gồm ức chế cạnh tranh của sự tổng hợp
phenylalanin tRNA
Phe
là quá trình cần thiết cho các bước acyl hoá axit amin cơ
bản trong sinh tổng hợp protein.
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………

11

Khi phân tích huyết thanh người, nhận thấy ochratoxin A ñạt tới 40
mg/ml huyết thanh. Sự dao ñộng ở mức ñộ nhiễm ñã liên quan tới ñịa lý, mùa,
sự thay ñổi hàng năm của hàm lượng ochratoxin A ở các sản phẩm thực
phẩm. Bệnh thận ñịa phương của vùng Balkan là một bệnh nghiêm trọng,
chẳng hạn như vùng Vratza ở Bungary, với cách bảo quản truyền thống, ñã là
vùng có tỷ lệ này rất cao (T. Petkova-Bocharova & cs, 2003)
Ochratoxin A ñộc là do sự ghép một nhân phenylalanin và một nhân
izocumarin khi phân hủy tạo ra chất dehydroizocumarin ñây là chất gây ñộc
(Harris và Mantle, 2001). Tác dụng của ñộc tố này ảnh hưởng ñến sức khỏe con
người và gây tổn thất trong chăn nuôi gia súc. Ochratoxin A tác ñộng lên thận gây
ra các ñợt bộc phát bệnh thận ở ñộng vật và là tác nhân gây tổn thất về mặt kinh tế.
Ochratoxin A là loại ñộc tố nguy hiểm nhất cho người và vật nuôi
Liều ñộc cấp tính LD50 của Ochratoxin A ñối với vịt con 1 ngày tuổi là
25 µg/con theo ñường miệng, với chuột ñực là 22 mg/kg và chuột cái là 20
mg/kg, ñối với lợn 1,0-6,0 mg / kg. Gà bị nhiễm ochratoxin A ở nồng ñộ thấp
chậm thành thục sinh dục và ñẻ ít trứng, ở nồng ñộ cao gây rối loạn gan thận
và làm chết gà. ðối với vịt khi bị nhiễm ochratoxin A sẽ bị viêm ruột, rối loạn
thận, hoại tử ở tiểu quản thận. Ochratoxin A gây sẩy thai ở cả ñộng vật thí
nghiệm và ñộng vật chăn nuôi như lợn, bò (O'Brien và Dietrich, 2005)
2.3. Sự tạo ñộc tố và sự nhiễm ochratoxin A trên nông sản
2.3.1. Sự tạo ochratoxin A bởi nấm mốc
Ochratoxin A thu ñược ñầu tiên từ Aspergillus ochraceus, nhưng những
nghiên cứu tiếp theo cho thấy các biến chủng của chi Aspergillus và
Penicillium có thể tạo các ochratoxin.
- Các nấm mốc tạo ochratoxin ở chi Aspergillus gồm: A. ochraceus, A.
alliaceus, A. elegans, A. fresenii, A. melleus, A. ostianus, A. petrakii, A.
screotium, A. Sulphureus (Pardo et al, 2005). Sản sinh ochratoxin chủ yếu trên
các loại hạt, ñậu phộng khô, ñậu, hạt tiêu, hạt cà phê xanh và hoa quả khô.

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………


12

- Các nấm mốc tạo ochratoxin ở chi Penicillium gồm: P. verrucosum, P.
viridicatum, P. chrysogenum, P. conmune, P. cyclopium, P. expansum, P.
palitans, P. purpurescence, P. nordiceum, P. Variable (Pitt et Hocking,
1997), chủ yếu gây ô nhiễm trên hạt ngũ cốc
- Ochratoxin A ñược sinh ra bởi các loài nấm mốc Aspergillus niger chủ
yếu nhiễm trên ngũ cốc, hạt có dầu, thức ăn chăn nuôi và cà phê (Abarca et al.
Năm 1994; Belli et al, 2004.)
Việc phòng chống nấm mốc A. niger và A. ochraceus sinh ochratoxin A
trên ngô và cà phê ñã ñợc nhiều nhà khoa học của các nước như Brazin, Pháp,
Mỹ nghiên cứu. Fernado E. và Francisco ñã phát hiện rằng trong số 11 chủng
Penicillium sống nội sinh trong cây cà phê, 4 chủng có khả năng tạo ochratoxin
A là P. brevicompactum,

P. crustosum, P. olsonii and P. Oxalicum (Fernando,
Francisco, 2006)
Ochratoxin ñược tạo ở nhiệt ñộ tối thích từ 20°C ñến 30°C và hoạt tính
0,953 (39% hàm lượng nước tính theo phần trăm trọng lượng khô), ở nhiệt ñộ
thấp 15°C, hàm ẩm yêu cầu cao hơn a
w
= 0.997 hay 52% hàm lượng nước. Các
loài nấm mốc Penicillium thường tạo ochratoxin trong ñiều kiện nhiệt ñộ
thấp, chẳng hạn P. viridicatum có khả năng tạo ochratoxin A ở 5°C – 10°C.
Trong khi ñó, các loài thuộc Aspergillus tạo ochratoxin ở nhiệt ñộ cao hơn.
2.3.2. Con ñường sinh tổng hợp ochratoxin A
Dựa trên một mô hình ñồng phân hóa học theo cấu trúc của OTA một

con ñường sinh tổng hợp ñã ñược ñề xuất trước ñây, theo ñó phần dị vòng
OTA là cấu trúc tương tự mellein. Vì vậy mellein ñã ñược ñề xuất như một
tiền chất của OTA. Ngược lại, (Harris , Mantle, 2001) ñã mô tả trong các thí
nghiệm với các tiền chất ñánh dấu phóng xạ của OTA mellein dường như
ñóng một vai trò không quan trọng trong con ñường sinh tổng hợp OTA. Tuy
nhiên, việc thí nghiệm ñánh dấu phóng xạ bằng cách sử dụng cả hai tiền chất
ñánh dấu phóng xạ là 14C và 13C- cho thấy rằng phân nửa phenylalanine bắt
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………


13

nguồn từ con ñường shikimate và phân nửa dihydroisocoumarin từ con ñường
pentaketide. Bước ñầu tiên trong tổng hợp polyketide isocoumarin bao gồm
sự ngưng tụ của một ñơn vị acetate (acetyl-CoA) ñến bốn ñơn vị malonate
(Hình 2.1).
Dữ liệu gần ñây cho thấy bước này ñòi hỏi hoạt ñộng của một tổng hợp
polyketide (O’Callaghan et al, 2003). Hơn nữa, các bảng mã tổng hợp gene
polyketide xuất hiện rất khác nhau giữa các loài Penicillium and Aspergillus
(O’ Callaghan & cs, 2003;).
ðã có nhiều nghiên cứu về sản phẩm cuối cùng trong con ñường sinh
tổng hợp polyketide theo một phương pháp phản ứng cơ bản. Chìa khóa xây
dựng các bước phản ứng này là ngưng tụ decarboxylative tương tự như bước
kéo dài chuỗi các quá trình sinh tổng hợp acid béo trước ñây (Kao & cs,
1994). Trong quá trình sinh tổng hợp của hầu hết các chất chuyển hóa
polyketide, kế tiếp bước ngưng tụ tiền thân carbon của axit ñược xúc tác bởi
một nhóm các hệ thống ña chức năng enzyme ñược gọi là polyketide
synthases (PKSs), (Metz & cs, 2001).
Một PKS ñiển hình của nấm (Hình 2.1) bao gồm ketosynthetase (KS),
acyltransferase (AT) và acyl hóa protein (ACP) và có thể có dehydratase

(DH), enoyl reductase (ER), ketoreductase (KR) và thioesterase (TE)
(Graziani & cs, 2004). Sự hiện diện hay vắng mặt của các phản ứng trong một
PKS quyết ñịnh về loại polyketide hình thành. PKSs sản xuất cao giảm
polyketides có thể tùy chọn trong những KR, DH và ER; PKSs sản xuất một
phần polyketides giảm chứa KR hoặc DH, trong khi PKSs sản xuất
polyketides không giảm thì không hề chứa các dạng này (Fujii & cs, 2001).

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………


14


Hình 2.1. Con ñường sinh tổng hợp ochratoxin A

2.3.3. Sự nhiễm ochratoxin A trên nông sản thực phẩm
Ochratoxin A ñã ñược tìm thấy trên các loại nông sản như ngô, lạc, lúa
mì, ñại mạch, cà phê, bia, nho, các loại thức ăn gia súc. Ochratoxin A ñã tìm
thấy trong máu của người ở các nước như Bulgari, Hungari, Nhật bản,