Phan tich du luong chat khang sinh trong thuc pham

Đại học Bách Khoa TP.HCM
Khoa công nghệ Hóa Học
Bộ môn Công Nghệ Thực Phẩm
BÁO CÁO PHÂN TÍCH THỰC PHẨM
CÁC PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH LƯỢNG DƯ
THUỐC KHÁNG SINH TRONG THỰC PHẨM
TP.HCM, 12/2011
Sinh viên thực hiện:
1. Vũ Minh Triết 60902903
2. Bùi Thiên Duy 60900368
3. Trần Tấn Lộc 60901467
4. Trương Đờ Kháng 60901168
Giảng viên hướng dẫn: TS. Vũ Ngọc Hòa
Nội dung báo cáo tiểu luận
-
Giới thiệu tổng quan về chất kháng sinh
-
Các phương pháp xác định lượng chất
kháng sinh trong thực phẩm
-
Biện pháp khắc phục lượng dư chất kháng
sinh trong thực phẩm.
I. Giới thiệu chất kháng sinh
1 Định nghĩa
-
Kháng sinh còn được gọi là trụ sinh là những chất có
khả năng tiêu diệt vi khuẩn hay kìm hãm sự phát triển
của vi khuẩn một cách đặc hiệu. Nó có tác dụng lên vi
khuẩn ở cấp độ phân tử, thường là một vị trí quan
trọng của vi khuẩn hay một phản ứng trong quá trình
phát triển của vi khuẩn [1].

2. Tác dụng của chất kháng sinh

Được xem là phụ gia của thức ăn chăn nuôi gia
sức và thủy hải sản
-
Làm thuốc chữa bệnh
Penicillin G
3. Cơ chế tác động của chất kháng sinh
Chất
kháng
sinh
Penicilin
Sulfamid
Quinolon
Cephalosporin
Tetracyline
Aminosid
Macrolid
Licosamid
4. Phân loại chất kháng sinh
5. Mặt trái của thuốc kháng sinh

Tích tụ thuốc kháng sinh trong cơ thể động vật và
con người

Hiện tượng nhờn thuốc
Kháng sinh cấm Chỉ tiêu kiểm tra
Giới hạn phát hiện tối thiểu
EU Mỹ Nhật
Chloramphenicol Chloramphenicol (CAP) 0.3 ppb 0.3 ppb 0.5 ppb

Malachite
green/Leucomalachite green
Malachite green /
Leucomalachite green
(MG/LMG)
2.0 ppb 2.0 ppb 2.0 ppb
Furazolidone 3-amino-2-oxazolidone
(AOZ)
1.0 ppb 1.0 ppb 1.0 ppb
Furaltadone 5-methylamorfolino-3-
amino-2-oxazolidone
(AMOZ)
1.0 ppb 1.0 ppb 1.0 ppb
Nitrofurantoin 1-aminohydantoin (AHD) 1.0 ppb 1.0 ppb 1.0 ppb
Nitrofurazone Semicarbazide (SEM) 1.0 ppb 1.0 ppb 1.0 ppb
6. Các chất kháng sinh cấm và giới hạn sử dụng
7. Các chất kháng sinh thường gặp trong thực phẩm
-
Thuốc kháng sinh họ fluoroquinolone
-
Chloramphenicol
-
Penicillin
-
Sulfonamit
II. Phương pháp xác định hàm lượng chất kháng sinh
1. Phân tích hàm lượng Chloramphenicol trong thủy sản
bằng kít elisa thông qua phân tích khẳng định bằng LC
– MS/MS.
a. Đối tượng: Tôm, cua, cá, ghẹ, hải sản,…

b. Dụng cụ
Kit thử của các hãng R-Biopharm và TAPB
Hệ thống LC-MS/MS
c. Tiến hành
- Phân tích trên LC – MS/MS
- Các thông số chính:
LC: Pha động: ACN: H20 (80:20)
Tốc độ dòng: 0,3ml
Thể tích tiêm:10ul
MS/MS: ESI (–)
MRM : 321  152
321  194
321  256
326  157
d. Kết quả
- Thứ tự phát hiện: Tôm = Nhuyễn thể < Cá < Cua, Ghẹ
< Chả giò, há cảo < Thuỷ sản tẩm bột < Thuỷ sản khô <
Mắm thuỷ sàn
-
Lượng tinh bột có trong mẫu phân tích có ảnh hưởng
đáng kể đến độ chính xác của xét nghiệm ELISA.
-
Hàm lượng phát hiện là >0,3ppb.
Mức độ ảnh hưởng của nền mẫu tới kết quả của phép
thử ELISA là khác nhau giữa các loại thủy sản khác nhau
2. Phương pháp xác định dư lượng kháng sinh
streptomycin
a. Đối tượng: Chủ yếu là thịt gia súc như thịt heo,…
b. Dụng cụ:
Máy trắc quang UV-VIS

Cuvét thủy tinh có chiều dày 2 cm
Ngoài ra còn các dụng cụ của phòng thí nghiệm như:
c. Hóa chất
HCl 1M
NaOH 1M
Streptomycin sunphat
Nước cất
d. Tiến hành
.
Chuẩn bị mẫu phân tích
20g Nguyên Liệu
Nghiền, xay
10ml nước
cất
Máy xay sinh tố
5 Phút
Định mức lên 50ml bằng
nước cất
Đun cách thủy
Sôi trong 10 Phút
Li tâm, lấy nước trong
Phễu chiết
10ml
clorofooc
Lắc 10 Ph, để yên 15 Ph
Tách lấy tướng hữu cơ
Phễu chiết
•
2 ml NaOH 1N
•

4ml
K2SO4.24H2O
•
20 ml nước cất
Lắc 30 Ph, để yên 25 Ph
Dung dịch nước

Pha dãy chuẩn
Mẫu streptomycin
sunphat nồng độ 1
mg/ml
Dung dịch 0.1μg/ml Dung dịch 0.5μg/ml Dung dịch …μg/ml Dung dịch 2.5μg/ml
Định mức 20ml Định mức 20ml Định mức 20ml Định mức 20ml
Thủy phân bằng kiềm Thủy phân bằng kiềm Thủy phân bằng kiềm Thủy phân bằng kiềm
Đun cách thủy Đun cách thủy Đun cách thủy Đun cách thủy
2ml K2SO4.24H2O 2% 2ml K2SO4.24H2O 2% 2ml K2SO4.24H2O 2% 2ml K2SO4.24H2O 2%
Định mức 20ml Định mức 20ml Định mức 20ml Định mức 20ml
Để im 20Ph Để im 20Ph Để im 20Ph Để im 20Ph
Tiến hành đo Tiến hành đo Tiến hành đo Tiến hành đo

Các bước:
+ Đặt sóng đo và bật máy chạy cho ổn định (5 phút);
+ Đo mật độ quang của mẫu chuẩn và mẫu phân tích ở
bước sóng 525 nm bằng Cuvét có chiều dày 2 cm. Dùng
mẫu trắng ở kênh so sánh làm mẫu so sánh và đo mỗi
mẫu 3 lần;
+ Lập đồ thị đường chuẩn theo hệ toạ độ D – C. Trong đó
D là mật độ quang của dung dịch mẫu chuẩn có nồng độ
C tương ứng ;
+ Xác định nồng độ Cx của chất phân tích theo đường

chuẩn đã dựng được.
e. Tính kết quả

Hàm lượng của streptomycin trong mẫu phân tích được tính
theo công thức sau:

Tính bằng g/g

Trong đó:

a là lượng mẫu cân (ở đây a = 20 g)

V là thể tích pha mẫu (V = 20 ml)

Cx là nồng độ streptomycin xác định được theo đường chuẩn
Co = (Cx .V) / a
3. Phân tích tồn dư kháng sinh nhóm Quinolone trong tôm
bằng phương pháp ELISA
Đối tượng: Tôm,…
a. Mẫu

Mẫu trắng: 5 kháng sinh thuộc nhóm quinolones gồm
enrofloxacin, flumequin, norfloxacin, Ciprofloxacin và
sarafloxacin ở dạng bột và đều là sản phẩm của Sigma-
Aldrich

Mẫu gốc: 1 mg/ml: Hòa tan trong metalnon và NH4OH
2M. Dung dịch dùng củng cố mẫu được pha loãng từ
dung dịch gốc (1 mg/ml) bằng nước cất. Hỗn hợp
methanol/PBS (50/50) pH 7,4 (dung dịch PBS pH 7,4 là

hỗn hợp 9 gam NaCl, 7,78 gam Na2HPO4.2H2O và
0,75 gam KH2PO4 pha trong 1 lít nước cất).
- Mẫu Phân tích
Mẫu tôm tại các vị trí
khác nhau
Bỏ đầu và vỏ
Nghiền đồng nhất bằng máy
moulinex
Lưu giữ ở âm 80°C.
b. Dụng cụ
Kít ELISA phân tích Quinolone Hệ thống LC-MS/MS
c. Các tham số độ xác thực và độ mạnh của phương pháp được tính
toán theo các công thức sau:
o.
Độ xác thực (%) = X %100
o.
Độ nhạy (%) = X %100
o.
Độ đặc hiệu (%) = X %100
Trong đó :
o.
N là tổng số mẫu phân tích = N+ + N-
o.
N+ là số mẫu thực sự dương tính (mẫu củng cố)
o.
N- là số mẫu thực sự âm tính (mẫu trắng)
o.
PA là số mẫu dương tính theo kết quả phân tích trong số N+ mẫu
o.
FN là số mẫu âm tính theo kết quả phân tích trong số N+ mẫu

o.
FP là số mẫu dương tính theo kết quả phân tích trong số N- mẫu
o.
NA là số mẫu âm tính theo kết quả phân tích trong số N- mẫu