CÁC PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH LƯỢNG DƯ THUỐC KHÁNG SINH TRONG THỰC PHẨM

Các phương pháp xác định lượng dư thuốc kháng sinh trong thực phẩm


  !"#
$%$%&'()(*+
,-+./,0
CÁC PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH
LƯỢNG DƯ THUỐC KHÁNG SINH
TRONG THỰC PHẨM
GVHD : TS. Vũ Ngọc Hòa
Sinh Viên:Vũ Minh Triết 60902903
Bùi Thiên Duy 60900368
Trần Tấn Lộc 60901467
Trương Đờ Kháng 60901168

TP. HCM 12/2011
1
Các phương pháp xác định lượng dư thuốc kháng sinh trong thực phẩm
2
Các phương pháp xác định lượng dư thuốc kháng sinh trong thực phẩm
Mục lục
Mục lục hình ảnh
Hình 1.1: Penicillin G
Hình 1.2 Sơ đồ thể hiện cơ chế tác dụng của thuốc kháng sinh trên vi khuẩn
Hình 1.3 Cấu trúc cơ bản của nhóm Quinolone
Hình 1.4 Cân bằng Acid Base của nhóm Acidic Quinolone
Hình 1.5 Cân bằng acid base của nhóm Piperazinyl Quinolone
Hình 1.6 Công thức cấu tạo của Ciprofloxacin
Hình 1.7 Công thức cấu tạo của Enrofloxacin
Hình 1.8 Công thức phân tử chung của họ chloramphenicol
Hình 1.9 Sơ đồ tổng hợp chloramphenicol từ acid shikimic

Hình 1.10 Sản phẩm penicillin lên men tự nhiên nhờ P.chrysogenum
Hình 2.1 Hệ thống LC-MS/MS
Hình 2.4: Máy xay sinh tố
Hình 2.5: Máy ly tâm
Hình 2.6: Bình định mức các loại
Hình 2.7: Pipet các loại
Hình 2.8: Phễu chiết cỡ 250 ml
Hình 2.9: Quy trình thực hiện
Hình 2.10: Âm tính: Hai vạch
Hình 2.11: Dương tính: Hai vạch
Hình 2.12: Kết quả sai: khi vạch chuẩn không xuất hiện.
Mục lục bảng số liệu
Bảng 1.1: Danh mục chất kháng sinh cấm sử dụng trong sản xuất, kinh doanh thủy sản
3
Các phương pháp xác định lượng dư thuốc kháng sinh trong thực phẩm
Bảng 1.2 Yêu cầu của các thị trường về giới hạn phát hiện của
phương pháp phân tích một số kháng sinh cấm
Bảng 2.1 Tổng hợp kết quả phân tích sàng lọc CAP trên ELISA và khẳng định trên LC-MS/MS
Bảng 2.2. Tương quan giữa nồng độ CAP xác định bằng ELISA và tỷ lệ dương giả
Bảng 2.3 Kết quả phân tích kiểm tra đường chuẩn
Đồ thị 2.4 Đường chuẩn
Bảng 2.5. Khả năng phát hiện của phương pháp ở nồng độ giới hạn phát hiện và giới hạn nồng
độ tối đa cho phép theo Quyết định 2377/90 CE của Uỷ ban Châu Âu đối với một số Quinolone
Bảng 2.6. Các tham số độ mạnh của phương pháp đối với các quinolone được thử tại ngưỡng
phát hiện tối thiểu
Bảng 2.7: Chương trình pha động
Lời nói đầu
4567"89 !7!:;575 !
<5=>7?@>A !7:B:CDE
A"F67GHD7I;JC#;D:E5K"#7LJM

 !;@;JC; !575NO@7GHD7IPJ!
 !:BO>QRSSSD75ATUG5AUD7
6:C!VFWW=ED7XY7Z
:CP5P:7I575GUAD7:B:CQ?
6@:E[5E\]@]75AFF7+EAQ?5ED
7^7ZED76:C!>PQ_5
75`9 !J@E7Za>>b
D76A>5EOG:c]95757G7D
7:B:CO>d
+A@@;D7:C7LJMBA !U
 ;c; c9@G7G;JMDF6FAe5 cI
FO!f575@5@;D7JFg`e7
5 FO!;`;8FA75HD!G?M;5A:`O!FA
FCD7cJ758G_:>DFC"#;DFA7?
h]QJ4
iV
j

k
FV
k

k
b
l

l
F
m


m
:
k
5b
k
::V
k
Q
k
Q
k
V
m
;7
n
j
n
o
:Q
j
5Q
k
 o
m
@VQ
l

j
:
l

n
j
F
o
@pJb
m
Jb
m
JFV
k
b
j

n
j
n
j
U
k
5
m

j

j
7
m
Q
j


k
:
k
5b
k

l

j
F
k
7
l
b
l


m
@V
l
U 7
j
;b
m
Q
k
@;V
m
Jb7
l

J
k
b
j

m
@Q
k

j
F
k

j

UU
k
5
m

j

j
7U
m
U
m
;
k
OQ

k
5
m

j
5b
k
 U
j
FV
j

q
Các phương pháp xác định lượng dư thuốc kháng sinh trong thực phẩm
b
k
r
l
F
m
JFV
k
b
j
n
j
n
j
5
m


j

j
7
k
7
j
;b
m
5V
k
V
o

]
j
b
j
Q
m
Fb
m
;@ b@
k
:
k
b
j
n

j

j
V
m
;7]
o
b@@
k
5Q
m
Fb
J
m
7
j

l
]
l
V
m
QJ
m

I Tổng quan về chất kháng sinh
1.1 Định nghĩa
1.2 Khái niệm về chất kháng sinh [1]
7=:CFAM7FAXDGUQJ!5#@
PB7"895#:`!+JMFQ5#_D

:bL;FA5Ksr95#@G?rP
895#
 ftantibioticstu7vcIfXtantibiosisttantitwFA
tchống lạit5AtbiosistwFAtcuộc sốngtD7:;IF7IF
5#5@;D7FADFD@fV85755#;
DI;`5A"5
131 Tác dụng của chất kháng sinh
I7FAXD:IF7"7I95#;U5
#bFQO^:_?bL;`:5A@E:
@8x>9:7I5#`:5A7"bO^Fy
 :D7OW:x5AGU1z2R4565!F
,]FF9O7w{F]HJ|F]|F]:B:`QD,]FFD
7A@DX!5!:EKO!5Q};;5QI;MY;
:?;55\]@FAD7:CJ4:8:EKO!F}
+A=XD7F;]@F;F@];55
:CJ4:8KXUO!5AF7DX!5!IF
7I575;5AFX!5!IF575_5F6:C
FAD7}~1•
Hình 1.1: Penicillin G
TUA!O!bQ>6:CXKD7+U
1z3S;2S€:>R•€}7IL5_FAJO!F}+U1z‚S7IA@G
HI=•€V";7IL5J7IVAb@:BGf1S€:>2€
O!@EƒY:g:ED7D7YXJM
•
Các phương pháp xác định lượng dư thuốc kháng sinh trong thực phẩm
5!UfXUO!ƒ4I;O!7Ib@:?6
HV5AO!Fb@r:PJM;55~1•
1.4 Cơ chế động của chất kháng sinh [3].
 D7:C:5AV8;7Z>>5#b@O!
7J!4O^E„

• …>7"AF5>OA„+UG7"}CA9>OA54
]FF;]F7;5@
• …>!5M9A>OA
• …>7"@89547F†J]7;];
• …>7"}C]„…>7"}C]954
]@F;F@7J]7;FJ]7u]@@pv;
• …>7"}CJF]„…>7"}C5A:9J
F]†FrF]75A†
‚
Các phương pháp xác định lượng dư thuốc kháng sinh trong thực phẩm
Hình 1.2 Sơ đồ thể hiện cơ chế tác dụng của thuốc kháng sinh trên vi khuẩn
‡
Các phương pháp xác định lượng dư thuốc kháng sinh trong thực phẩm
isJM5EV>95!?>7"}C]{F@7J]7„\]@
• ˆ1„IW5AM8Q8:V5K3S\
• ˆ2„,O>s9?C:xQrPAFT]J
• ˆ3„ ‰+{OK:7à1J] 4C
•   ˆq„)A5gF@7]7A7]7 à ?U}C
]
]@F]7
• IW5A8:V5K3S\Š‰O8àU`J6W5AT
]J6:CAF
• F]F
• IW5A8:V5K•S\Š‰O8à?>]J@F7†]7]àU
J6W5AT]J6AF
 7":B O>AO?AD7>:C
5#xO!5A^D7U`H@ 
6:C5#xO!Q5#A@>5P>H@5A
^;D7U`5# FD@:C?U‹4
?:9D7>A:X;5ŒFAFIXs


 7IF5#O^FAAxD9e
F65hOG5!;A:}D55@Q;VJ!:EK;rb
:>FJM„JMJ!#5AJMP#uP#=:C
FAB#;M#;w#v7J!#JM>>5#;
=7P#[FA5#8; 77G? OK
QJ!7P#:CJ4V8O!=7?:E;!I
ƒJK=:9:8QJ!5#:BOKIFA@>:+>V8O!
r@>;OWOGJ4F7J!#
1.5 Phân loại thuốc kháng sinh [4].
• +•F]F„,]F;]F;{FF];{HFF];
FHFF];\FFF;,]FF];&]]
• +•F]F7„
< >!1„]†JHF;]F]H;]†F;]ŽF
< >!2„]†F
< >!3„]†H];]†H];]†H];]†H];]†ŽJ];]†H];
]†JH]
• +]@F]„]@F];‹H@@F];F]@F;%H@]@F;
@F;]H@F
• +7J„{;O@;+]@;ˆ]@;@;
\]@
• +FJ„{Ž@;‰H@;•@@;5@;
F@;\@
• +F7J„)@;FJ@
• +rF„{JFJH;F]†FH;†FH;†FH;†FH;
F]5†FH;ˆ†FH;H†FH;,]†FH;\†FH
• +•<<JŽF„FŽF];]JŽF];JŽF];\]JŽF];
ŽF];JŽF]
• +\F†J„\F†J;\F†]HŽF;\F†JŽ;\F†7FŽ
R

Các phương pháp xác định lượng dư thuốc kháng sinh trong thực phẩm
1.6 Sản xuất thuốc kháng sinh
x>7:E:CFAf5#5AD
• ,]FF:C7GHDfDI;575
• 75@fH#\]@]7]F7 
• F]FO:x:CbFf\]@]75]]Ž]F];@:C
7GHDO^V}C
• p
1.7 Mặt trái của thuốc kháng sinh
i6EJMyw"ƒ>5@GU5!7LJMAE
I77ZA:]FEJMs"•
 V8OKJI77LJM :eI`J
FC7=cJ"#8:EKO!ƒ4xO>F5
4b@O!:87sCiP>8O>5A5P_7Fx;Q_
WVQ>6;DFA_6:8;:BJ47r
E;G x>; :e[:K5A :e)JM`
CFy;JŒ:>XrG F XsEIUJ7LJM
EF7:WEA=FAEF76JxJxOK5 !
D7YXG?M;G?9V8:I56D
7‘?O:h5A!?8b@XUO!
,G?xDFAJŒ6L5 ;D7 X!
:I567I5#xO!
,i!7b’>J"=,;‘:K7J
DQxF6 b9@:C !:D6
]AF!9  !"#;,;
FC7cJ7e;x7Z@8]A77
b@??:x7LJM+H@Q7LJM7e;xƒ
77ZDJƒOK“”I;OKO!XKJFC7A@7ZsM
V8b@Q!C5#s?567
 F7A@ OKb•5AcF  

c•7GJA;>F5#s56 
7>rGFAF5#b@O!•7GFGUI
7+>7:CFŒ5A?U •7G;8PD@JFC
7K•7G5A7G#>O>+XU•7G?JFC
77Z5 PDM75AV8;JŒ:>X@:} 5
#OP;>_QJƒOKƒ#V
 `O!5!FJMD77Zb@FI;JŒ:Q7"89
F5#GUIV8:5Y9@7G

U e@+ )b,6:b@:B>AG7PP
7LJM7U 5AJFC7K_rx@J
z
Các phương pháp xác định lượng dư thuốc kháng sinh trong thực phẩm
7e;x7IU 7LJM7 CFyFEFC;7L
JMFQM:8=fO!7e:>AO:C–a!ŒK
:CFD@">CD@2‚F7:C!:F:C
7LJMEDFAF]Fu>1•;3•€v;@F7u1•€v;F7u13;2q€v;
†FHu1S€v;]@uR;3•€v;]@Fu‡;z•€v;FFu‡;2q€v
:;F]FFA7!:BOKD7LJMQErI~1q•
1qzŒKA:C8;bs:>qq;z‚€7IŒJ7
5Cr?r@:Kaf2;•:>11SSFx756Q#A:;F
7F]F>•F!D:>R‡;•S€;†F]r>R3;33€;
F]@F]>‚2;•S€;HFF>‚S€~1q•
‹:xGO>:CVH:KJFCI"#:8
>:CXJM@fX"#?JFCI7rQ
#a
 QD;7 ICJM
1 {7F75A>#fe
?U;Ie@;
D;DHLFy ;

D#@LL4;D
OGrG;]O J@
DGb7GHD
I; c:"
5J665AFg;
JK5ME5AOGrG;
>O>
2 F]F
3 F†
q FŽ]
• F]
‚ ‹7]
‡ ‹]JŽF]
R ]JŽF]
z +†uOcG|ŽFJ]v
1S ‰JŽF]
11 ˆ]]F]u–F]v
12 &JŽF]
13 +JŽF]
1q F]O]F
1• ‹]@F7FO]7Fu‹•\v
1‚ ˆF@]J]7
1‡ F†u‹]]Hv
1R ˆ]iF]u@7F5F]v
1z +|FrF]7uD7LJM7GHD;
J•7GHD#5AK5AWv
Bảng 1.1: Danh mục chất kháng sinh cấm sử dụng trong sản xuất, kinh doanh thủy sản [11]
TT Kháng sinh cấm Chỉ tiêu kiểm tra
Giới hạn phát hiện tối thiểu
EU Mỹ Nhật

1S
Các phương pháp xác định lượng dư thuốc kháng sinh trong thực phẩm
1 F]F F]Fu{,v S3O S3O S•O
2 F]
]]Š)]F]
]]
F]]]Š
)]F]]]
uˆŠ)ˆv
2SO 2SO 2SO
3 |ŽFJ] 3<<2<HŽFJ]
u{%—v
1SO 1SO 1SO
q |FJ] •<]@F†F<3<
<2<HŽFJ]
u{%—v
1SO 1SO 1SO
• +† 1<@Ju{‹v 1SO 1SO 1SO
‚ +†Ž] \]OŽJ]u\•v 1SO 1SO 1SO
Bảng 1.2 Yêu cầu của các thị trường về giới hạn phát hiện của
phương pháp phân tích một số kháng sinh cấm [5]
1.8 Một số thuốc kháng sinh thường gặp
1.8.1 Thuốc kháng sinh họ fluoroquinolone [10].
˜F]FA7:C7LJMB5!:EKƒ
4_5A:5MQs9eFA5#]O]F]Ž@]
‹+{@7]@7]7]&&˜F]AxFAJŒ7D9J
FJH‹"Q}#9;rF]:CAE>!„

• ˜F]>!?D„H;†F]r];FJHJ;HF;
• ˜F]>!?„†FH;]H;†F]H;F]†FHp

• ˜F]>!?O„OF†FH;†FH;]†FHp
• ˜F]>!?„]H;F†FH;]†FHp
|FrF]FA7rF]:
@QL|W_5Ks7I‚9!IbG˜F]75A|FrF]7
:EFAI7GU>>5#
 Công thức cấu tạo
 ?D9rF]FACD5=V?+;5K
s?qW]];5Ks?3WOH@FJŒ7D9
rF]cXCDA„iKs1„8WQF@F`@F™iKs
‚„8WQ|™iKs2;‚;R8WQ@QL+
11
Các phương pháp xác định lượng dư thuốc kháng sinh trong thực phẩm
DeVOG9˜F] {J+FJH
Hình 1.3 Cấu trúc cơ bản của nhóm Quinolone
O Tính chất Acid - Base nhóm quinolone
˜F]OH@F_5Ks7I3Q:b@FACDs
J7IrF]?Q]QQsO7]‹"5A
8rF]AF„{JrF]u{˜v5A,]Ž@F
˜F]u,˜v
{JrF]u{˜v„[KG‚S:>‚z
6ec_J=`J{˜cX˜F]
>!?D

Hình 1.4 Cân bằng Acid Base của nhóm Acidic Quinolone
,]Ž@FrF]u,˜v„K;1G••N‚‚5A2
G‡2NRz6e8c_OJ„J;
J=5AJ™7I,˜FA‹†FH;‹†FH;+†FH;
%†FH;]†FH;O†FH;,]JJ

Hình 1.5 Cân bằng acid base của nhóm Piperazinyl Quinolone

 Ciprofloxacin
†FHFA7†FrF];F,˜;8I5
#JV5Ab
• Q„1N@F@FN‚N†FN1;qNJ@JNqNHN‡N1N]Ž@F3N
rF]OH@FJ
•  ?„
1‡

1R
|+
3
%
3

• FCbL„3313•ŠF
• +!:G@„31RN32S


12
Các phương pháp xác định lượng dư thuốc kháng sinh trong thực phẩm
Hình 1.6 Công thức cấu tạo của Ciprofloxacin
• sD„FAO>A5A;x6;Ds
]F;]@F]]FJ]IJJKJ]FB;K
FA‚S5ARR
J Enrofloxacin

•†FHFA7†FrF];F,˜;8I5
#JV5Ab
• Q„1N@F@FN‡NuqN]@FN1N]Ž@FvN‚N†FN1;qNJ@J
NqNHN3NrF]OH@FJ

•  ?„
1z

22
|+
3
%
3

• FCbL„3•zqŠF
• +!:G@„21zN221


Hình 1.7 Công thức cấu tạo của Enrofloxacin
• sD„FA8A5A;šx6_›‡;
K„G•5ARNz
] Nguồn gốc của Ciprofloxacin và Enrofloxacin trong thực phẩm
13
Các phương pháp xác định lượng dư thuốc kháng sinh trong thực phẩm
†FH5A•†FH:C:5AKA;pJ6J@QF!
?UU ;`JU 5A?U7e;x;`
5A 7I9:59@7G:5U;`7I 
:D@`Q:8XO!P77ZHb5AV8
† Ứng dụng và ảnh hưởng của Ciprofloxacin và Enrofloxacin
†FH5A•†FH:CJ4FA75A:5
F7A@:C7LJMW?O!5E: 
D;ƒ4@>HV6;5QƒVr7JMp+
†FrF]u†FH;•†FHQvFA7
:s;[7LJM56FED:K;:Cr@:KD`Z5A:E
7>7LJM:I56œ]5PG_:>rPU_

+†FrF]>J4FE5AaJA7ZFAG_Q7M:x
HV5ArPU_9OaF;OKF4u]O7wAK’>,<
b:ANOcJgO@>v
CcJ•O†FrF];>UOP1•SN2SS
KŠA@PFC†FrF]:5AV8G2•ŠA@i6FCA@7Z
 b@:s@;>sFY@FbJA`UrE7ZOK
+A;5!7LJMAF5 F7JM
IJ4AAGUJŒ6I_5#+5@7Z
G_:>GU:EKO!Fyƒ4:cFA
1R2 Chloramphenicol [13]
a. Lịch sử
F]FFAD7:C!:cJOQ?
:F56„9•Fu,]‹57;1zq‡v;ˆOu(5†&FF7;
1zqRv5A(]Žžu1zqRvF]F:CFA7De
:VGD5A@f!DEA:BQ?7GHD
D7A@+5@[5=U:BH:K:CDe
bL5A8A !7GHDFI7A@
Hình 1.8 Công thức phân tử chung của họ chloramphenicol
:„
1q
Các phương pháp xác định lượng dư thuốc kháng sinh trong thực phẩm
• F]F‰„F
2
%N
• +]@F7]F‰„N
• @]&‰„
3
%N
• @]&&‰„
3


2
%N
• @]&&&‰„u
3
v
2
%N
b. Tính chất
F]FFA7}O>5A6:b@:B:C7LJM:8:EK
!rGEO!ˆb5AˆJV+J7I!?M
  I5!?JMF]F:EKH6GJxc
;5!7LJM5A8!7FCF]F"#_A
5D:ED@G;:Cr:K`Z5A>A7Q`_E6;
:`O!FA6 !8
F]FFAD:AW`5A5A; 4;5KD:W;
s6;Ec5ADOa;JJKF]FOE5X
 VJ@sOE5X56!K!::>1SS
S

c. Tác hại của cloramphenicol
7LJMU ;x7:AG7ZcJ77G
#"#b@@:>V85AFC:8?Uf7Z
5AFW:5A ;]8JŒ6O>:}5E!7
ˆb@ 8 ;FA5 5AGFI7LJMM
ŒƒI;FA5#b@O!FI;5A5@V8
@FA5 OKƒF5#:BFIP7Z IK
F]F:5AV8œ7V78b@“?HsH”;
:`O!FAœ7œOKHJxcK5AL5F]F=
:9@HV>J4aJA+AF]F=8b@7@•;>

 cM
Kƒ7F]F8FAGOx;5AJ
F]F [QJ!5#b@O!:A=J!F 5
#FCb@QG@JŒ:>>6Q5AFAHD!O!
>5
,VƒD:FV";`A9@7G cu ;
FV;7vF]F;†5AV87ZG_Q
:>!ƒƒ;FADGUIsMFbA@5AGUb@
:O>;IF>
d. Sản xuất chloramphenicol
1•
Các phương pháp xác định lượng dư thuốc kháng sinh trong thực phẩm
Cơ chế sinh tổng hợp chloramphenicol:
+A@@GUbF:CEE575GU7
}CD7F]F„Streptomyces, Nocardia, Arthrobacter,
Corynebacterium,...
:9F"FA: Streptomyces venezuelae,
S.omiyaensis Streptomyces phaeochromogenes, Streptsporangium viridogriseum và
Corynebacterium hydrocarboclastus.
‹bLF]F?5=]@F]JQ5EV>D
7A@Y8:C}CrJ5=;]@FF;@7]
 Ÿ5IFA ?U;7}CF]F
:CG?d!TO}75A JA@@Q!?
G?YHG@GO}77IJ 5=c7LJMc
JJg:JD
1q
;>rG"! PD@O^?J5=
Q7G#rP7}CfJXF!Q^_
S.venezuelae, 7V:c}CJ5=:Z7}C
F]F5KsJ7

1‚
Các phương pháp xác định lượng dư thuốc kháng sinh trong thực phẩm
1‡