Nghiên cứu kiểu gen SSR và các tính trạng kinh tế của tập đoàn nấm men saccharomyces cerevisiae

BỘ GIÁO DỤC VÀ ðÀO TẠO
TRƯỜNG ðẠI HỌC NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI




CHU THỊ QUỲNH DIỆP




NGHIÊN CỨU KIỂU GEN SSR VÀ CÁC
TÍNH TRẠNG KINH TẾ CỦA TẬP ðOÀN
NẤM MEN SACCHAROMYCES CEREVISIAE



LUẬN VĂN THẠC SĨ NÔNG NGHIỆP




Chuyên ngành : Công nghệ sinh học
Mã số : 60.42.80


Người hướng dẫn khoa học : TS. ðẶNG XUÂN NGHIÊM

HÀ NỘI - 2013


Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………


i

LỜI CAM ðOAN

Tôi xin cam ñoan rằng số liệu và kết quả nghiên cứu trong luận văn này là
trung thực và không trùng lặp với các ñề tài khác.
Tôi cũng xin cam ñoan rằng các thông tin trích dẫn trong luận văn ñều ñược
ghi rõ nguồn gốc.

Học viên



Chu Thị Quỳnh Diệp

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………


ii
LỜI CẢM ƠN

Luận văn này ñược thực hiện tại phòng thí nghiệm bộ môn Công nghệ Vi
sinh, Khoa Công nghệ Sinh học, trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội. ðể hoàn
thành ñược luận văn này tôi ñã nhận ñược rất nhiều sự ñộng viên, giúp ñỡ của
nhiều cá nhân và tập thể.
Trước hết, tôi xin chân thành bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc và kính trọng tới
TS. ðặng Xuân Nghiêm, người ñã tận tình chỉ bảo, hướng dẫn tôi hoàn thành luận
văn này. Tôi cũng xin chân thành cảm ơn Ks. Nguyễn Ngọc Hòa, Ks. Nguyễn Ngọc
Chỉnh, Ks. Nguyễn Khắc Hải, Ks. ðỗ Hải Quỳnh ñã nhiệt tình giúp ñỡ tôi trong
suốt quá trình nghiên cứu.
Tôi xin gửi lời cảm ơn Ban Giám hiệu Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội,
Ban chủ nhiệm khoa Công nghệ Sinh học, Ban Quản lý ðào tạo sau ñại học, các
Thầy Cô giáo trong Bộ môn Công nghệ Vi sinh, Khoa Công nghệ Sinh học, ñã tạo

mọi ñiều kiện và giúp ñỡ tôi về kiến thức cũng như chuyên môn trong suốt 2 năm
học tập và làm luận văn.
Cuối cùng tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành và sâu sắc ñến gia ñình, bạn bè,
những người thân ñã luôn bên tôi, ñộng viên và khuyến khích tôi trong suốt quá
trình học tập và nghiên cứu.

Hà Nội, ngày 02 tháng 04 năm 2013
Học viên


Chu Thị Quỳnh Diệp




Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………


iii

MỤC LỤC

LỜI CAM ðOAN i
LỜI CẢM ƠN ii
MỤC LỤC iii
DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT vi
DANH MỤC BẢNG vii
DANH MỤC HÌNH Error! Bookmark not defined.

PHẦN I: MỞ ðẦU 1

1.1. ðặt vấn ñề 1
1.2. Mục ñích và yêu cầu 3
1.2.1.Mục ñích 3
1.2.2. Yêu cầu 3
PHẦN II: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 4
2.1. Giới thiệu chung về nấm men (Saccharomyces cerevisiae) 4
2.1.1. Nguồn gốc, phân loại 4
2.1.2. ðặc ñiểm chính của nấm men 6
2.2. Vai trò của nấm men trong sản xuất rượu 14
2.3. Giới thiệu về simple sequence repeats (SSRs) 15
2.3.1. Khái niệm 15
2.3.2. Phân loại SSRs 16
2.3.3. Phân bố của SSRs 16
2.3.4. Các phương pháp phát hiện các trình tự SSRs 17
2.3.5. Phân tích trình tự SSRs 18
2.3.6. Vai trò của SSRs 18
2.4. Tổng quan tình hình nghiên cứu thuộc lĩnh vực của ñề tài 20


Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………


iv

PHẦN III VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 23
3.1. Vật liệu 23
3.1.1. ðối tượng nghiên cứu 23
3.1.2. Thiết bị 24
3.2. Môi trường 26
3.3. Thời gian và ñịa ñiểm nghiên cứu 27

3.3.1. Thời gian 27
3.3.2. ðịa ñiểm 27
3.4. Nội dung nghiên cứu 27
3.4.1. Thống kê toàn bộ các locus SSR của S. cerevisiae 27
3.4.2. Khảo sát mức ñộ ña hình của các locus SSR nấm men bằng PCR 27
3.4.3. Khảo sát các tính trạng kinh tế của tập ñoàn nấm men 27
3.5. Phương pháp nghiên cứu 28
3.5.1. Thống kê toàn bộ các locus SSRs của S. cerevisiae 28
3.5.2. Khảo sát mức ñộ ña hình của các locus SSR nấm men bằng PCR 28
3.5.3. Khảo sát các tính trạng kinh tế của tập ñoàn nấm men 29
PHẦN IV: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 34
4.1. Thống kê toàn bộ các locus SSR của S. cerevisiae 34
4.2. Khảo sát mức ñộ ña hình của các locus SSR nấm men bằng PCR 39
4.2.1. Thiết kế mồi cho các locus SSR tiềm năng 39
4.2.2. Khảo sát sự ña hình của 15 locus SSR tiềm năng 41
4.3. Khảo sát các tính trạng kinh tế của tập ñoàn nấm men 45
4.3.1. Khảo sát ñặc ñiểm hình thái của các isolate nấm men 45
4.3.2. Sự sinh trưởng theo mật ñộ quang của các isolate nấm men 50
4.3.3. Khả năng tạo sinh khối của các isolate nấm men 55
4.3.4. Khả năng chịu cồn của các isolate nấm men 56
4.3.5. Khả năng chịu áp suất thẩm thấu của các isolate nấm men 59
4.3.6. Khả năng chịu lạnh của các isolate nấm men 61


Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………


v

4.3.7. Khả năng chịu khô hạn của các isolate nấm men 63

4.3.8. Khả năng lên men rượu của các isolate nấm men trên môi trường dịch
chiết ñu ñủ
67
PHẦN V: KẾT LUẬN VÀ ðỀ NGHỊ 70
5.1. Kết luận 70
5.2. ðề nghị 71
TÀI LIỆU THAM KHẢO 72
PHỤ LỤC 81




Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………


vi

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT

Cs. Cộng sự
DNA Deoxyribonucleic acid
ISSR Inter-Simple Sequence Repeat (ñoạn giữa của các
trình tự lặp lại ñơn giản)
NST Nhiễm sắc thể
OD Optical density (mật ñộ quang)
PCR Polymerase chain reaction (Phản ứng chuỗi trùng hợp)
PGA Poly-γ-Glutamate
PIC Polymorphism information content (hệ số ña dạng
từng locus gene)
S. cerevisiae Saccharomyces cerevisiae

SSRs Simple sequence repeats (trình tự lặp lại ñơn giản)
T
m
Melting Temperature (nhiệt ñộ nóng chảy)
T
o
Thời ñiểm bắt ñầu

TS Tiến sĩ
YPD Yeast peptone dextrose






Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………


vii

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1. Danh sách 40 isolate nấm men ñược sử dụng trong nghiên cứu 23

Bảng 2. Các thiết bị sử dụng trong ñề tài 25

Bảng 3. Các hoá chất sử dụng trong ñề tài 26

Bảng 4. Phân bố của SSR trên từng NST của nấm men Saccharomyces cerevisiae 34

Bảng 5. 15 cặp mồi SSR sử dụng ñể nghiên cứu sự ña hình các locus SSR ở
nấm men (S. cerevisiae).
40

Bảng 6. Sự ña dạng di truyền của 15 locus SSR ở nấm men 41

Bảng 7. ðặc ñiểm hình thái khuẩn lạc và tế bào của các isolate nấm men. 46

Bảng 8. Năng suất rượu và pH của dịch lên men rượu từ nấm men trên môi
trường dịch chiết ñu ñủ sau 3 ngày lên men 68




Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………


viii
DANH MỤC HÌNH

Hình 2.1. Một tế bào nấm men ñang mọc chồi. Cell wall (thành tế bào),
Nucleus (nhân), Mitochondria (ty thể), Vacuole (không bào), spindle (ñiểm
mọc chồi).
6

Hình 2.2. Các tế bào nấm men và cấu tạo bên trong tế bào. A: Hình ảnh các tế
bào nấm men S. cerevisiae; B: Cấu tạo bên trong tế bào nấm men.
7

Hình 2.3. Chu kỳ sống của nấm men. 9

Hình 4.1. Phân loại các trình tự SSR ở nấm men theo dạng lặp. 35

Hình 4.2. Phân loại SSR nấm men theo mức ñộ hoàn hảo. 36

Hình 4.3. Phân loại SSR ở nấm men dựa theo chiều dài ñoạn lặp 38

Hình 4.4a. Sản phẩm PCR nhân dòng locus SCI.4.1 42

Hình 4.4b. ðiện di sản phẩm SSR-PCR với mồi SCVI.1.3 43

Hình 4.5. Sơ ñồ hình cây về mức ñộ tương ñồng di truyền dựa trên 15 trình tự SSR
của 40 isolate nấm men. Thang trục hoành chỉ hệ số tương ñồng (coefficient).
44

Hình 4.6. Sinh trưởng của các isolate nấm men ở 30ºC 53

Hình 4.7. Sinh khối của các isolate nấm men nghiên cứu 55

Hình 4.8. Khả năng chịu cồn của nấm men tại nồng ñộ cồn 10%. 58

Hình 4.9. Khả năng chịu áp suất thẩm thấu của nấm men tại nồng ñộ ñường 15%. .60

Hình 4.10. Khả năng chịu ñông ñá và làm tan. Sau khi ñược ñóng băng ở - 20ºC
trong 19 giờ, các mẫu ñược làm tan trong nước ở nhiệt ñộ phòng và ñược nuôi
trong môi trường YPD lỏng. Tỷ lệ sống sót của chủng ñối chứng là 100%.
62

Hình 4.11. Khả năng chịu khô hạn của các isolate nấm men ở 30ºC, ñộ ẩm 75% 65

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………


1

PHẦN I: MỞ ðẦU

1.1. ðặt vấn ñề
Nấm men có vai trò quan trọng trong công nghiệp thực phẩm, lên men
rượu bia, bánh mì, protein ñơn bào, làm thức ăn bổ sung cho chăn nuôi, vi sinh
vật probiotics có tác dụng tăng cường hệ miễn dịch cho người và vật nuôi, v.v.
Có thể nói nó là vi sinh vật quan trọng nhất trong công nghiệp thực phẩm và ñồ
uống có cồn.
Nấm men cũng là vi sinh vật nhân chuẩn ñơn bào (Eukaryote) ñược sử dụng
rộng rãi nhất trong nghiên cứu sinh học tế bào, sinh học phân tử, di truyền học, v.v.
Chính vì vậy, nấm men là sinh vật nhân chuẩn ñầu tiên ñược giải trình tự toàn bộ
genome vào năm 1996. S. cerevisiae ở thể lưỡng bội chứa 16 cặp nhiễm sắc thể, có
kích thước khác nhau từ 200 – 2.200 kb. So với các sinh vật nhân chuẩn ña bào
khác nấm men có khoảng trên 6000 gen khác nhau mã hoá cho tất cả các phân tử
protein ñược tổng hợp trong tế bào và nấm men có bộ gen rất nhỏ gọn (Dujon,
1996). Các chủng nấm men khác nhau với kiểu hình và ñặc tính lên men khác nhau
ñã sớm ñược nhận ra bởi các nhà sản xuất rượu bia và làm bánh mỳ, trước khi
chúng ñược phân biệt bởi các nhà di truyền học.
S. cerevisiae không chỉ ñược sử dụng ñể lên men bánh mỳ mà nó còn ñược
sử dụng rộng rãi trong ngành công nghiệp thực phẩm như ñể lên men bia, lên men
rượu, sử dụng trong sản xuất rượu vang và sâmpanh, v.v. (Nguyễn Lân Dũng và cs.,
2001); trong y học, như việc dùng S. cerevisiae ñể sản xuất insulin chữa bệnh tiểu

ñường, hay mới gần ñây người ta nghiên cứu sử dụng nấm men ñể sản xuất văc-xin
viêm gan B (Nguyễn Thị Phương Trang và cs., 2007). Càng ngày người ta càng tìm
ra nhiều ứng dụng của S. cerevisiae ñể phục vụ cho cuộc sống của con người. Trên
thế giới, nghiên cứu ứng dụng nấm men bắt ñầu bằng việc phân lập, phân loại, chọn
lựa, lai tạo các chủng nấm men có các tính trạng kinh tế tốt ñể dùng vào sản xuất
thực phẩm, ñồ uống có cồn cũng như thức ăn chăn nuôi (Myers và Attfield, 1999;
Meric và cs., 1995; Trần Văn Hiếu và cs., 2006; ðậu Ngọc Hào và Phạm Minh
Hằng, 2000; ðậu Ngọc Hào, 2000; Lê Thành Tâm, 1996; Lê Thành Tâm và cs.,


Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………


2

1989; Nguyễn ðình Dũng và cs., 1980). S. cerevisiae còn ñược sử dụng ñể biểu
hiện các protein hay enzyme tái tổ hợp phục vụ nhiều mục ñích khác nhau (Ansen
và cs., 2009; Schoeman và cs., 1999; Trần Văn Hiếu và cs., 2006). Ngày càng nhiều
chủng nấm men S. cerevisiae biến ñổi gen với khả năng lên men cao hơn, chất
lượng lên men tốt hơn, thành phần dinh dưỡng quý hơn và sức chống chịu cao, ñặc
biệt là khả năng chịu lạnh ñã ñược tạo ra (Nevoigt và cs., 2000; Panadero và cs.,
2007;
Randez-Gil
và cs., 1999).
Trong cùng một ñiều kiện sản xuất, cùng nguyên liệu ñầu vào, rượu hay bánh
mỳ ñược lên men bởi các chủng nấm men khác nhau có thể có chất lượng khác xa
nhau (Jubany và cs., 2008). Vì vậy, ñể chọn lựa ñược các chủng nấm men thuần
thích hợp cần thiết phải có một công cụ sinh học phân tử giúp phân biệt giữa các
chủng nấm men về các ñặc tính sinh học (khả năng sinh trưởng phát triển, kích
thước tế bào, khả năng chống chịu các ñiều kiện môi trường: áp suất thẩm thấu, hạn,

lạnh, nhiệt ñộ cồn cao, v.v.) và các ñặc tính kinh tế (khả năng làm nở bánh mì, khả
năng lên men cồn, v.v.) khác nhau. Hầu hết các nghiên cứu so sánh các phương
pháp sinh học phân tử sử dụng trong việc phân biệt, kiểm ñịnh các chủng/loài sinh
vật về mặt di truyền phân tử ñều có chung nhận ñịnh là phương pháp SSRs là một
công cụ hữu ích, kinh tế, ñáng tin cậy và hiệu quả nhất (Gallego và cs., 2005;
Schulle, 2004).
Tuy bộ gene của nấm men ñã ñược giải trình tự nhưng chưa có nghiên cứu
mang tính hệ thống ñiều tra về phân bố các trình tự SSR và mức ñộ ña hình của
từng locus trong các sinh vật này cũng như mối liên quan kiểu hình SSR với các
tính trạng kinh tế của nhóm vi sinh vật này; chưa có công bố nào ñưa ra bộ chỉ thị
SSR chuẩn ñể kiểm ñịnh các chủng trong một loài.
Chính vì vậy, với mong muốn dùng chỉ thị phân tử ñể kiểm ñịnh các chủng
nấm men sử dụng trong công nghiệp thực phẩm, hay thức ăn chăn nuôi, chúng tôi
chọn ñề tài:
“Nghiên cứu kiểu gen SSR và các tính trạng kinh tế của tập ñoàn nấm
men Saccharomyces cerevisiae”.


Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………


3

ðề tài này có thể cung cấp thêm cơ sở về phân tử và phương pháp hữu hiệu
cho việc phân ñịnh các chủng/loài nấm men Saccharomyces cerevisiae, có thể tìm
ra chỉ thị phân tử cho các tính trạng kinh tế của các chủng vi sinh này, giúp cho việc
giám ñịnh và ñánh giá men giống, thực phẩm nhanh và hiệu quả hơn.
1.2. Mục ñích và yêu cầu
1.2.1.Mục ñích
- Thiết lập một bộ sưu tập các chủng nấm men S. cerevisiae.

- Nghiên cứu sự ña hình của các locus SSR của nấm men S. cerevisiae ñể sử
dụng chúng như những chỉ dấu di truyền phân tử.
- Khảo sát các tính trạng kinh tế và tính trạng sinh học của các chủng nấm men
nhằm tìm ra mối tương quan (nếu có) giữa kiểu gen SSR với từng tính trạng
có ý nghĩa kinh tế.
- Tuyển chọn và bảo tồn các chủng nấm men S. cerevisiae có khả năng sinh
trưởng mạnh, có sức chống chịu tốt ñồng thời lên men nhanh và hiệu quả ñể
ứng dụng trong công nghệ sản xuất ñồ uống, công nghệ thực phẩm.
1.2.2. Yêu cầu
- Thống kê toàn bộ các locus SSR của nấm men dựa vào trình tự của chủng ñã
ñược giải mã.
- Thiết kế mồi cho các locus SSR tiềm năng và khảo sát mức ñộ ña hình của
các locus ñó, lập bản ñồ SSR của Saccharomyces cerevisiae.
- Khảo sát các tính trạng kinh tế và tính trạng sinh học của các isolate nấm men.
 ðặc ñiểm, hình thái của các isolate nấm men.
 Sự sinh trưởng, phát triển và năng suất sinh khối.
 Khả năng chịu cồn.
 Khả năng chịu áp suất thẩm thấu.
 Khả năng chịu lạnh.
 Khả năng chịu khô hạn.
 Khả năng lên men rượu.


Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………


4

PHẦN II: TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1. Giới thiệu chung về nấm men (Saccharomyces cerevisiae)
2.1.1. Nguồn gốc, phân loại
Từ thời kỳ tiền sử, loài người ñã biết ép nước quả và ngâm hạt ñể làm rượu
vang, bia và làm nở bột nhờ quá trình lên men của nấm men. Ðường hoặc tinh bột
ñược chuyển hoá thành rượu thông qua hoạt ñộng của các enzyme. Sự lên men xảy
ra ở nhiệt ñộ trong phòng với nhịp ñiệu bình thường, chậm chạp. Nhà bác học Ðức
Liebig (1803 - 1873) ñã quan sát thấy một quá trình hóa học xảy ra trong quá trình
lên men. Không có một lực sống nào tham gia vào quá trình ấy và ông khẳng ñịnh
quá trình giống như sự chuyển hóa trong cơ thể sống, nhưng nó xảy ra không có
chất sống tham gia (
Wilkins
, 2004).
Ngay từ thời Leewenhoek, người ta ñã biết nấm men bao gồm những hạt
hình cầu nhỏ bé không có dấu hiệu của sự sống. Vào những năm 1836 và 1837, các
nhà sinh học, trong ñó Schwann, ñã quan sát thấy quá trình nảy chồi ở nấm men tạo
nên những hạt cầu nhỏ bé mới là dấu hiệu biểu hiện rõ rệt của sự sống. Các nhà sinh
học nói nhiều về những tế bào nấm men, nhưng Liebig ñã bác bỏ những nhận ñịnh
ñó (
Wilkins
, 2004).
Nhà bác học Pháp là Louis Pasteur (1822 - 1895) ñã bảo vệ bản chất sống
của nấm men. Năm 1856, những người Pháp nấu rượu vang ñã mời ông làm cố vấn.
Rượu vang và bia bảo quản lâu thường bị chua và gây thiệt hại lớn về kinh tế. Các
nhà hóa học có thể giúp ñỡ ñược gì không? Pasteur ñã phát hiện ra quy luật khá lý
thú là rượu vang và bia ñược bảo quản tốt có chứa những tế bào nấm men tròn, nhỏ.
Còn khi chất nước ñó bị chua thì những tế bào nấm men bị kéo dài ra. Như vậy, có
hai loại nấm men: loại tạo thành rượu và loại làm rượu chua dần. Ðun nóng nhẹ sẽ
giết chết các tế bào nấm men và làm ngừng quá trình gây chua. Nếu người ta làm
ñúng lúc sau khi ñã hình thành rượu nhưng chưa bắt ñầu có sự gây chua thì có thể
bảo quản ñược rượu vang. Thực tiễn ñã xác nhận những kết luận của Pasteur là

ñúng. Khi nghiên cứu quá trình này, Pasteur ñã làm sáng tỏ hai mặt của vấn ñề. Thứ
nhất, các tế bào nấm men là những cơ thể sống, vì chỉ khi ñun nóng nhẹ là có thể


Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………


5

thủ tiêu khả năng lên men; tế bào vẫn còn lại không bị phá hủy, nhưng trong chúng
sự sống ñã bị hủy diệt. Thứ hai, chỉ có những tế bào nấm men sống mới gây ra sự
lên men (
Wilkins
, 2004).
Ngày nay, khi ñã có rất nhiều nghiên cứu về nấm men thì chúng ta biết
Saccharomyces là một chi nấm men ñược sử dụng rộng rãi trong ngành thực phẩm
như bánh mỳ, sản xuất cồn, thực phẩm chức năng, y học, mỹ phẩm, v.v.
Saccharomyces có nghĩa là nấm ñường và là loại vi sinh vật ñược sản xuất với quy
mô lớn nhất trên thế giới.
Giống (chi) Saccharomyces có khoảng 40 loài ( Van der Walt, 1970) và các
loài ñược biết nhiều do chúng ñược ứng dụng trong việc làm nở bánh mỳ hay trong
sản xuất bia, rượu, v.v. Chúng hiện diện trong các sản phẩm có ñường, trái cây chín,
ñất, phấn hoa, v.v.
Các chủng nấm men nghiên cứu có vị trí phân loại như sau:
Lớp: Ascomycetes
Bộ: Saccharomyateae
Họ: Saccharomycetaceae
Chi: Saccharomyces
Một số loài ñại diện:
Saccharomyces bayanus

Saccharomyces boulardii
Saccharomyces bulderi
Saccharomyces cariocanus
Saccharomyces cariocus
Saccharomyces cerevisiae
Saccharomyces chevalieri
Saccharomyces dairenensis
Saccharomyces ellipsoideus
Saccharomyces martiniae
Saccharomyces monacensis
Saccharomyces norbensis


Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………


6

Saccharomyces paradoxus
Saccharomyces pastorianus
Saccharomyces spencerorum
Saccharomyces turicensis
Saccharomyces unisporus
Saccharomyces uvarum
Saccharomyces zonatus
Trong ñó loài ñược con người sử dụng phổ biến nhất là S. cerevisiae.
2.1.2. ðặc ñiểm chính của nấm men
a. Hình thái bên ngoài
S. cerevisiae ña số có hình bầu dục, hình ô van, hình elip. Kích thước tế bào
theo ñường kính lớn từ 5 - 10 µm và kích thước ñường kính nhỏ từ 1 - 7 µm. Kích

thước tế bào của nấm men thay ñổi theo ñộ tuổi và mức ñộ ña bội.
b. Cấu tạo
Nấm men S. cerevisiae có cấu tạo tế bào khá phức tạp, gần giống như tế bào
thực vật với ñầy ñủ các thành phần cấu tạo như thành tế bào, màng tế bào chất, tế
bào chất, ty thể, riboxom, nhân, không bào và các hạt dự trữ (Rosini và cs., 1982;
Burke và cs., 2000).

Hình 2.1. Một tế bào nấm men ñang mọc chồi. Cell wall (thành tế bào), Nucleus
(nhân), Mitochondria (ty thể), Vacuole (không bào), spindle (ñiểm mọc chồi).
Nguồn: />.


Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………


7


Hình 2.2. Các tế bào nấm men và cấu tạo bên trong tế bào. A: Hình ảnh các tế bào
nấm men S. cerevisiae; B: Cấu tạo bên trong tế bào nấm men.
Nguồn: />.
 Thành tế bào: cấu tạo chủ yếu là polysaccharide như glucan, mannan, chitin.
Trong và ở hai bề mặt thành tế bào có protein, lipoprotein và các enzyme khác nhau.
Trên thành tế bào có nhiều lỗ, qua ñó các chất dinh dưỡng hòa tan ñi qua thành và
màng tế bào vào trong tế bào ñể tham gia quá trình trao ñổi chất trong tế bào.
 Nguyên sinh chất: là chất lỏng nhớt, có ñộ nhớt gấp 800 lần so với nước,
có cấu tạo từ các chất protein, lipid và carbohydrate. Các quá trình lên men quan
trọng nhất ñều xảy ra ở nguyên sinh chất.
 Nhân: nhân tế bào nấm men là nhân ñiển hình, có màng nhân, bên trong
là chất dịch nhân có chứa hạch nhân. Cũng như nhân tế bào của vi sinh vật bậc cao,

nhân tế bào nấm men ngoài DNA còn có protein và nhiều loại enzyme. Hạch nhân của
tế bào nấm men không phải chỉ gồm một phân tử DNA như ở vi khuẩn mà ñã có cấu
tạo nhiễm sắc thể ñiển hình, có thể thực hiện quá trình phân bào nguyên nhiễm còn gọi
là nguyên phân. Quá trình nguyên phân gồm 4 giai ñoạn như ở vi sinh vật bậc cao. Số
lượng nhiễm sắc thể trong tế bào nấm men ñơn bội là 16 (Lodder, 1971).
 Ty thể: khác với vi khuẩn, nấm men ñã có ty thể giống như ở tế bào bậc
cao, ñó là cơ quan sinh năng lượng của tế bào. Ty thể nấm men có hình bầu dục,
ñược bao bọc bởi hai lớp màng, màng trong gấp khúc thành nhiều tấm răng lược
hoặc nhiều ống nhỏ làm cho diện tích bề mặt của màng trong tăng lên. Cấu trúc của
hai lớp màng ty thể giống cấu trúc của màng nguyên sinh chất. Trên bề mặt của


Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………


8

màng trong có dính vô số các hạt nhỏ hình cầu. Các hạt này có chức năng sinh năng
lượng và giải phóng năng lượng của ty thể. Trong ty thể còn có một phân tử DNA
có cấu trúc hình vòng, có khả năng tự sao chép. Những ñột biến tạo ra tế bào nấm
men không có DNA ty thể làm cho tế bào nấm men phát triển rất yếu, khuẩn lạc nhỏ
bé. Trong ty thể còn có cả các thành phần cần cho quá trình tổng hợp protein như
ribosome, các loại RNA và các loại enzyme cần thiết cho sự tổng hợp protein. Các
thành phẩn này không giống với các thành phần tương tự của tế bào nấm men
nhưng lại rất giống của vi khuẩn. DNA của ty thể rất nhỏ nên chỉ có thể mang mật
mã tổng hợp cho một số protein của ty thể, số còn lại do tế bào tổng hợp rồi ñưa vào
ty thể. Người ta ñã chứng minh ñược quá trình tự tổng hợp protein của ty thể. Quá
trình này bị kìm hãm bởi chloramfenicol giống như ở vi khuẩn, trong khi ñó chất
kháng sinh này không kìm hãm ñược quá trình tổng hợp protein ở tế bào nấm men
(Lodder, 1971).

 Ribosome: của tế bào nấm men có hai loại: 70S và 80S. Loại 80S gồm 2
tiểu thể 60S và 40S nằm trong tế bào chất, một số khác gắn với màng tế bào chất.
Một số nghiên cứu ñã chứng minh rằng các ribosome gắn với màng tế bào chất có
hoạt tính tổng hợp protein cao hơn. Loại 70S là loại ribosome có trong ty thể
(Lodder, 1971).
 Không bào: trong không bào có chứa dịch tế bào, trong ñó có muối hòa
tan, enzyme và các chất keo. Ngoài ra trong không bào còn có chất béo, volutin,
glycogen.
 Glycogen: hay còn ñược gọi là tinh bột ñộng vật là chất dinh dưỡng dự
trữ của nấm men. Chất béo không phải là cấu tử nhất thiết phải có trong tế bào. Ở
những tế bào non, chất béo có rất ít, tế bào càng trưởng thành thì lượng chất béo
cũng tăng theo.
 Volutin: là dẫn xuất của nucleic acid chứa nhiều phốt pho (Lodder, 1971).
c. Sinh sản
S. cerevisiae là ñiển hình của nấm dị tản lưỡng cực. Dị tản là kiểu có sự lai
nhau giữa hai loại tế bào khác nhau như a với α tạo dạng dị hợp tử lưỡng bội a/α. Ở
nấm men, trong ñiều kiện bình thường, sự hợp bào và hợp nhân chỉ xảy ra giữa các


Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………


9

tế bào khác nhau về giới tính là a và α do các alen khác nhau của locus MAT quy
ñịnh. Do có sự tham gia của 2 alen nên gọi là lưỡng cực.
Chu trình sống của nấm men gồm hai giai ñoạn có thể chuyển ñổi qua lại. Tế
bào có thể tồn tại ở cả dạng lưỡng bội và cả dạng ñơn bội. Trong cả hai trường hợp,
tế bào mẹ sinh sản dinh dưỡng bằng cách tạo chồi giống hệt nó. Thời gian sinh sản
hình thành tế bào mới khoảng 30 - 40 phút. Tốc ñộ sinh sản của nấm men phụ thuộc

vào thành phần và nồng ñộ chất dinh dưỡng của môi trường, nhiệt ñộ, pH và mức
ñộ hiếu khí. Nhiệt ñộ thích hợp cho nấm men sinh sản là 29 - 31°C, pH thích hợp
vào khoảng 5 - 5,8 ( Bùi ðức Hợi và cs., 2009).


Hình 2.3. Chu kỳ sống của nấm men. Budding (bắt ñầu nảy chồi), Haploid α (thể
ñơn bội α), haploid a (thể ñơn bội a), conjugation (sự kết hợp), diploid a/α (thể
lưỡng bội a/α), spore (bào tử).
Nguồn: />.
Khi một chồi phát triển hoàn chỉnh sẽ tách ra khỏi tế bào mẹ, vị trí chồi rời tế
bào mẹ gọi là ñiểm sinh sản hay sẹo. Khi gặp ñiều kiện dinh dưỡng không thuận lợi
thì các tế bào khác giới sẽ kết hợp lại với nhau tạo thành hợp tử, sau ñó tế bào tiếp
hợp lưỡng bội nẩy chồi cho ra một tế bào giống hệt nó và mang 16 cặp NST. Trong
ñiều kiện môi trường bất lợi, tế bào tiếp hợp giảm phân ñể hình thành 4 tế bào ñơn
bội trong ñó 2 tế bào ñơn bội mang gen a và 2 tế bào ñơn bội mang gen α. Túi bào


Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………


10
tử này sẽ chờ khi nào môi trường dinh dưỡng thuận lợi ñể phát triển sinh sản theo
hình thức nảy chồi (Lodder, 1971). Bào tử nang bền với tác nhân bên ngoài như
nhiệt ñộ cao, khô hạn, nhưng kém bền nhiệt hơn so với bào tử vi khuẩn, chúng
thường chết ở nhiệt ñộ 60
o
C.
2.1.3. Yêu cầu về dinh dưỡng và ảnh hưởng của các yếu tố dinh dưỡng
Hiện nay người ta nhận thấy quá trình dinh dưỡng của nấm men gồm hai giai
ñoạn: chất dinh dưỡng qua màng tế bào chất vào tế bào và chuỗi các phản ứng hoá

học biến ñổi chất dinh dưỡng ñể tổng hợp vật liệu cho tế bào. Môi trường dinh
dưỡng chứa những thành phần có áp suất thẩm thấu khác nhau. Các chất không ñiện
ly như ñường sucrose, rượu, axit hữu cơ, amino acid xâm nhập qua màng tế bào
bằng cách khuếch tán theo gradient nồng ñộ hay vận chuyển thụ ñộng, do sự khác
nhau về nồng ñộ các chất này giữa tế bào và môi trường. Các ion tích ñiện trong
môi trường như K
+
, Cl
-
, Mg
2+
, Ca
2+
và các ion kim loại khác có thể vào tế bào thụ
ñộng theo gradient nồng ñộ hay ñược vận chuyển ngược lại gradient nồng ñộ (vận
chuyển chủ ñộng). Natri có ý nghĩa rất quan trọng trong sự tăng trưởng của tế bào
nấm men. Ion Natri là thành phần duy nhất di chuyển vào tế bào bằng cả 2 cơ chế:
thụ ñộng và chủ ñộng vào tế bào. Nấm men mang theo cả sucrose, amino acid ngay
cả khi không có sự chênh lệch nồng ñộ các chất này giữa tế bào với môi trường. Kết
quả thí nghiệm cho thấy: khi thêm NaCl vào môi trường từ 1 - 1,5%, dẫn ñến quá
trình tổng hợp hoạt ñộng tăng, gia tăng hoạt tính sinh sản của nấm men và hiệu suất
thành phẩm cao hơn, phẩm chất thành phẩm ñược cải tiến, ñồng thời hạn chế sự
phát triển của nấm men lạ (Regine và cs., 1993).
Thức ăn nuôi tế bào nấm men gồm các hợp chất nitơ, hợp chất khoáng, các
carbohydrate, vitamin và các chất sinh trưởng (Bùi ðức Hợi và cs., 2009). Trước
hết, nấm men tiêu hoá các amino acid sau ñó ñến các sản phẩm thuỷ phân protein,
nấm men hầu như không tiêu hoá các protein tự nhiên. Các muối luôn là nguồn thức
ăn rất tốt cho nấm men. Nấm men tiêu hoá gần như hoàn toàn nitơ của amoniac, còn
các nitrite lại gây ñộc cho tế bào nấm men.
Nấm men cần thức ăn khoáng có chứa phốt pho, kali, magiê, sắt, v.v. các

vitamin và chất sinh trưởng ñể một phần tổng hợp trong nội bào, một phần ñể ở


Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………


11
dạng dự trữ. Nấm men thường ñược dùng như là nguồn bổ sung ñạm và vitamin vì
nó có tới 50% protein, giàu vitamin B
1
, B
2
, B
6
, pentotenic acid, folic acid,
riboflavin, và biotin (
Broach
và cs., 1991).
Các carbohydrate cần cho nấm men như vật liệu xây dựng nên tế bào cũng
như nguồn cung cấp năng lượng. Nấm men tiêu hoá các carbohydrate khác nhau.
Nấm men không tiêu hoá lactose và các polysaccaride cao hơn. Chúng chỉ tiêu hoá
trực tiếp các ñường ñơn giản (sucrose và maltose ñược thuỷ phân sơ bộ bằng
enzyme của nấm men) (Lương ðức Phẩm, 2009).
Năng lượng hóa học cần thiết cho nấm men do sự chuyển hoá ñường trong
nội bào cung cấp. Nấm men có thể phân huỷ ñường bằng cách hô hấp hiếu khí hoặc
lên men rượu.
Sự thuỷ phân ñường trong ñiều kiện hiếu khí có thể biểu diễn bằng phương trình:
C
6
H

12
O
6
+ 6O
2
→ 6CO
2
+ H
2
O + 2324.10
3
J
Sự lên men rượu ñược biểu diễn bằng phương trình:
C
6
H
12
O
6
→ 2CO
2
+ C
2
H
5
OH + 117,32.10
3
J
Quá trình phân huỷ ñường ñược biểu diễn một cách ñơn giản như sau:

Glucose
Các sản phẩm trung gian
Axit pyruvic
CO
2
+ C
2
H
5
OH
(lên men)

CO
2
+ H
2
O
(hô h
ấp)

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………


12
2.1.4. Sức chống chịu của nấm men
Trong ñời sống ngoài tự nhiên cũng như trong các quy trình lên men nhân
tạo, nấm men có khi phải ñương ñầu với các ñiều kiện bất lợi của môi trường như:
ñóng băng, tan băng, nồng ñộ ñường cao, sự khô hạn, và các chất oxi hoá mạnh.
Các ñại phân tử trong tế bào gồm protein, nucleic acid và màng sẽ bị hư hỏng nặng
trong các ñiều kiện stress. ðiều này dẫn tới việc ức chế sự tăng trưởng của tế bào và
khả năng lên men (Shima và Takagi, 2009). ðể tránh các thiệt hại gây chết, các tế
bào nấm men cần có nhiều cơ chế chống lại stress, ví dụ như sự cảm ứng stress biểu
hiện protein, sự tích tụ các chất chống lại stress hay thay ñổi thành phần của màng
bằng việc ñiều chỉnh sự biểu hiện gen mã hóa các enzyme tương ứng qua sự thúc
ñẩy bởi các stress.
Các yếu tố về ngoại cảnh ảnh hưởng tới sinh trưởng phát triển của nấm men
là: nhiệt ñộ, nồng ñộ oxi hoà tan hay ñộ hiếu khí, pH môi trường, hàm lượng sản
phẩm chính tạo ra, thành phần môi trường và các ñiều kiện khác của môi trường
nuôi cấy cho sinh trưởng của nấm men nhiệt ñộ tối thích vào khoảng 29
o
C - 31
o
C
nhưng với lên men lại không hoàn toàn như vậy. Nhiệt ñộ lên men ở khoảng 30
o
C -
35

o
C, bắt ñầu tích tụ rượu etylic càng sớm, tốc ñộ lên men nhanh và kết thúc sớm
nhưng không lên men ñược hết ñường (Lương ðức Phẩm, 2009). Nhiệt ñộ không
những chỉ ảnh hưởng tới cường ñộ lên men và sinh trưởng của nấm men mà còn
ảnh hưởng tới sinh tổng hợp các sản phẩm phụ và thứ cấp (Lương ðức Phẩm,
2009). Nhiệt ñộ càng cao càng dễ sinh và tích tụ các sản phẩm loại này. ðiều này
không có lợi cho chất lượng của sản phẩm chính. Giữa nhiệt ñộ và ñộ hiếu khí có
quan hệ chặt chẽ với nhau. Nấm men sinh trưởng mạnh mẽ ở khoảng thời gian ñầu
của quá trình lên men (sau pha tiềm phát). Trong thời gian này dịch lên men có
lượng oxi hoà tan và nhiệt ñộ rất thích hợp cho nấm men sinh trưởng và lên men.
Nhiệt ñộ quá thấp cũng ảnh hưởng tới khả năng sinh trưởng và lên men của nấm
men (Baguena và cs., 1991; Almeida và Pais, 1996).
ðộ hiếu khí ñược thể hiện bằng lượng oxi hoà tan trong môi trường, ñơn vị
tính là mg O
2
/lít môi trường. Ở ñiều kiện nhiệt ñộ càng cao lượng oxi hoà tan càng
thấp. Oxi hoà tan vào môi trường lỏng ở dạng bọt khí nhỏ làm kích thích sinh sản


Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………


13
của nấm men và tạo ñiều kiện cho tế bào nấm men hô hấp. Trong môi trường có
khuấy trộn và thổi khí làm cho bọt khí càng phân tán nhỏ và ñều hơn, do ñó tế bào
nấm men càng ñược tiếp xúc với chất dinh dưỡng và oxi tốt hơn.
pH của môi trường có ảnh hưởng tới ñời sống của nấm men, trong quá trình
nuôi thì pH giảm dần hay tăng ñộ chua do sự tạo thành CO
2
và các axit hữu cơ trong

quá trình (Lương ðức Phẩm, 2004).
Khí CO
2
cũng như là chất trao ñổi tự nhiên, ở nồng ñộ xác ñịnh nó có thể
kìm hãm hoặc thậm chí ñình chỉ sinh sản nấm men (Lương ðức Phẩm, 2004). CO
2

cao làm quá trình hô hấp chậm lại .
Rượu etylic ñược tích tụ khi nấm men sinh trưởng phát triển và chúng tích tụ
càng ngày càng nhiều. Hàm lượng rượu cao dần sẽ làm cho nấm men sinh trưởng
chậm dần và ñến một nồng ñộ nào ñó có thể sẽ làm cho nấm men dừng hẳn sự phát
triển (Burke và cs., 2000).
Thành phần môi trường nuôi cấy và lên men có ảnh hưởng lớn tới sinh
trưởng của nấm men và trao ñổi chất trong tế bào, ñặc biệt có thể quyết ñịnh cả hiệu
suất lên men hoặc chuyển hướng lên men từ sản phẩm này sang sản phẩm khác.
ðường và các chất hoà tan khác trong môi trường tạo áp suất thẩm thấu, áp suất
thẩm thấu thường chênh lệch giữa tế bào nấm men và môi trường nuôi cấy. Sự
chênh lệch này làm cho các chất dinh dưỡng dễ hoà tan vào môi trường tế bào qua
màng và sản phẩm của tế bào hào tan vào môi trường. Áp suất thẩm thấu quá cao
gây hiện tượng khô sinh lý teo chất nguyên sinh dẫn tới nấm men không sinh trưởng
ñược và tổng sinh khối giảm, thậm chí tế bào sẽ ngừng phát triển.
Nhiều năm trở lại ñây, nấm men ñược phát triển bằng cách sử dụng các kĩ thuật
nuôi cấy, sử dụng công nghệ sinh học ñể làm thay ñổi mức ñộ hoạt ñộng trao ñổi chất
như quá trình chuyển hoá carbon, chuyển hoá nitơ, cũng như các phản ứng chống lại
stress của môi trường (Higgin và cs., 2001; Tanaka và cs., 2006).
2.1.5. Vai trò của nấm men trong ñời sống
S. cerevisiae là nấm men không gây bệnh. Di truyền học, Sinh học phân tử,
Hóa sinh trao ñổi chất, v.v., ñã dùng nó như một sinh vật mẫu trong các thí nghiệm
(Dynamac, 1990). Trong nhiều thế kỷ, khả năng sinh ethanol và CO
2

của S.


Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………


14
cerevisiae ñược lợi dụng ñể sản xuất nước giải khát có cồn, ethanol (
Mariam
và cs.,
2009) và bánh mỳ; ứng dụng nhiều trong y học (Dae-Kyun và cs., 2006); sản xuất
thực phẩm chức năng, sản xuất thức ăn chăn nuôi, v.v. Ngày nay, khoảng trên 2
triệu tấn S. cerevisiae ñược dùng trên toàn thế giới mỗi năm (
Glick
và
Pasternak
,
2003). Ngoài vai trò sinh học - công nghiệp quan trọng, S. cerevisiae còn là ñối
tượng nghiên cứu có ý nghĩa, ñặc biệt là làm mô hình mẫu ñể nghiên cứu các sinh
vật nhân chuẩn khác bao gồm cả con người (Johnson và cs., 1998; Johnson và cs.,
2006). Nhiều gen liên quan tới chu kỳ phân chia tế bào của S. cerevisiae tương tự
các gen ở người (
Harvey
và cs., 1996). Hiểu biết về những gen này ñã giúp phân lập
và mô tả ñặc trưng các gen gây bệnh ung thư ở người (Richardson và cs., 1990;
Whitfield
và cs., 2002; George và Gary, 1998). ðồng thời, hệ di truyền của nấm men
ñược sử dụng rộng rãi, nhiễm sắc thể nấm men nhân tạo là công cụ không thể thiếu
ñược ñể nghiên cứu tổ chức vật chất của DNA người (Saha và cs., 1998). Tháng 4
năm 1996, S. cerevisiae trở thành sinh vật nhân chuẩn ñầu tiên có bộ nhiễm sắc thể

ñược giải mã hoàn toàn, việc này càng làm tăng thêm vai trò của nó trong nghiên
cứu cơ bản (Dujon, 1996). Ngoài việc sử dụng S. cerevisiae trong chế biến thực
phẩm, người ta còn sử dụng rộng rãi nó ñể sản xuất các thành phần phân tử của tế
bào như lipid, protein (Bigelis, 1985; Stewart và Russell, 1985).
2.2. Vai trò của nấm men trong sản xuất rượu
Hệ vi sinh vật trong bánh men tham gia các quá trình chuyển hóa cơ chất:
Giai ñoạn ñầu vi khuẩn phát triển hình thành các axit hữu cơ (axit hoá dịch ñường
trước khi lên men), pH giảm xuống tạo ñiều kiện cho các loài nấm mốc phát triển,
nấm men cũng bắt ñầu phát triển (tốc ñộ phát triển yếu hơn nấm mốc). Quá trình
chuyển hóa tinh bột thành ñường: nhờ nấm mốc Aspergillus sp., Rhizopus sp.,
Mucor sp., v.v., tạo ra amylase (α - amylase, glucoamylase). Quá trình chuyển hóa
ñường thành rượu nhờ các loài nấm men Saccharomyces (Lương ðức Phẩm, 2004).
Sản phẩm rượu ñã ñược biết ñến từ cách ñây hơn ba thiên niên kỉ. Rượu là
những hợp chất hữu cơ có một hay nhiều nhóm OH nối với nguyên tử cacbon no
(nếu hợp chất có nhóm OH ở nguyên tử cacbon không no của dãy mạch không vòng
thì ñược xếp vào loại enol; hợp chất có nhóm OH ở cacbon của vòng thơm ñược xếp


Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………


15
vào loại phenol). Tuỳ theo số lượng nhóm OH có trong phân tử mà phân biệt monol,
ñiol, triol và poliol.
Trong quá trình sản xuất rượu, tế bào nấm men không có khả năng chuyển
hoá hồ tinh bột thành rượu. Chúng chỉ có khả năng sử dụng ñường, chuyển ñường
thành rượu. Vì vậy, sau khi nấu ñể dịch hoá, dịch tinh bột cần ñược chuyển thành
ñường trước khi lên men. Lên men là giai ñoạn quan trọng cuối cùng và chủ yếu
nhất của quá trình sản xuất rượu cồn. Trong quá trình này, nấm men thực hiện quá
trình thuỷ phân ñường. Quá trình lên men do tác ñộng của các tế bào nấm men như

sau: ñường và các chất dinh dưỡng của môi trường lên men ñược hấp phụ và
khuyếch tán vào bên trong tế bào men ñể chuyển hoá qua các hợp chất trung gian và
cuối cùng tạo thành rượu và khí CO
2
. Rượu và khí CO
2
tạo thành ñược khuyếch tán
qua màng tế bào ra môi trường bên ngoài. Rượu hoà tan trong nước nên tan nhanh
vào dung dịch lên men còn CO
2
hoà tan kém trong nước nên chúng bị bão hoà trong
dung dịch. Khi dung dịch ñã bão hoà CO
2
thì CO
2
tạo thành ñược bám quanh tế bào
nấm men và lớn dần lên. Lượng CO
2
tích tụ lớn ñến mức nào ñó nó thắng khối
lượng của tế bào nấm men thì tế bào nấm men ñược bọt khí CO
2
kéo dần lên bề mặt
dịch lên men. Khi lên ñến mặt thoáng, CO
2
ñược thoát ra và tế bào nấm men có
khối lượng lớn hơn khối lượng riêng dịch lên men ñược lắng xuống. Nhờ sự chuyển
ñộng lên xuống này mà quá trình lên men ñược tăng cường. Sau khi quá trình lên
men kết thúc sản phẩm ñược chuyển qua giai ñoạn chưng cất ñể thu rượu.
2.3. Giới thiệu về simple sequence repeats (SSRs)
2.3.1. Khái niệm

Simple sequence repeats (SSRs), còn ñược gọi là các chuỗi lặp ñơn giản, các
chuỗi lặp liền kề ngắn = short tandem repeats (STRs) hay các ñoạn ña hình chuỗi
ñơn giản = simple sequence length polymorphisms (SSLPs) là nhóm các chuỗi
DNA ñơn giản lặp lại ngắn từ 2-6 bp và kích thước tại mỗi locus là 20–100 bp.
SSRs ñược tìm thấy trong tất cả cơ thể sống, ñặc biệt là ở những cơ thể sống có bộ
gen lớn và phân bố ñều trên genome.
SSRs có tính ña hình rất cao (ña hình theo chiều dài), là những alen ñồng trội
(codominant-alen) bao gồm 2 loại: alen ñồng hợp và alen dị hợp, nó có các tính chất


Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………


16
cần thiết chất cần thiết cho một marker. Tần số ñột biến từ 10
4
- 5.10
-6
, nó tuân theo
ñịnh luật Mendel. Vị trí của SSRs trên nhiễm sắc thể có thể ñược xác ñịnh bằng PCR
từ một lượng DNA rất nhỏ. Xác ñịnh SSRs PCR trên một loài nào ñó thì có thể áp
dụng trên những loài khác có quan hệ họ hàng (Nguyễn Thị Phương Dung, 2005).
Ví dụ: SSRs lặp 1 nucleotide (A)11: AAAAAAAAAAA;
SSRs lặp 2 nucleotide (GT)6: GTGTGTGTGTGT;
SSRs lặp 3 nucleotide (CTG)4: CTGCTGCTGCTG;
SSRs lặp 4 nucleotide (ACTC)4: ACTCACTCACTCACTC.
2.3.2. Phân loại SSRs
Các SSRs ñược phân loại theo loại chuỗi lặp như sau:
− SSRs hoàn hảo: gồm các chuỗi lặp ñều ñặn. (Vd:TATATATATATATATA).
− SSRs không hoàn hảo: có một bp nằm xen giữa các chuỗi lặp (Vd

TATATATAC
TATATA).
− SSRs gián ñoạn: có các chuỗi nhỏ khác nằm bên trong (Vd
TATATACGTG
TATATATATA).
− SSRs phức: gồm 2 chuỗi lặp khác nhau (Vd TATATATATAGTGTGTGT)
(Hà Viết cường, 2009).
2.3.3. Phân bố của SSRs
Trên một bộ genome, SSRs phân bố không ñều vì:
Tần số của chúng khác nhau giữa vùng mã hóa và vùng không mã hóa. Do
tốc ñộ ñột biến cao nên vùng mã hóa có mật ñộ SSRs thấp hơn so với vùng không
mã hóa. Người ta ñã chứng minh rằng, các SSRs với chuỗi lặp là 3 hoặc 6 bp tồn tại
với mật ñộ tương ñương ở vùng mã hóa và không mã hóa. Tuy nhiên, các SSRs với
chuỗi lặp không phải là bội số của 3 thì tồn tại chủ yếu ở vùng không mã hóa.
Vai trò chức năng của SSRs. Các nghiên cứu trên thực vật cho thấy, áp lực
chọn lọc tác ñộng khác nhau lên vùng 5’UTR, vùng mã hóa và 3’UTR.
Tần số thay ñổi theo ñơn vị phân loại (theo nghĩa số lượng tuyệt ñối các
locus SSRs và motif của chuỗi lặp). Ở thực vật, tần số SSRs cao ở thực vật có bộ
gen nhỏ (vd: 0.85% ở cây Arabidopsis) và thấp hơn ở cây có bộ gen lớn (vd: 0.37%