Khảo sát hàm lượng chất kháng sinh họ quinolone trong thủy sản bằng kỹ thuật sắc ký lỏng ghép khối phổ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ
KHOA SƯ PHẠM
















ĐỀ TÀI:









Luận văn tốt nghiệp
Ngành: Sư phạm Hóa học

KHẢO SÁT DƯ LƯỢNG CHẤT KHÁNG SINH HỌ
QUINOLONE TRONG TÔM, CÁ BẰNG KỸ THUẬT
SẮC KÝ LỎNG GHÉP KHỐI PHỔ

Giáo viên hướng dẫn:
TS. Nguyễn Thị Thu Thủy
Th.S Lê Bảo Ngọc
Sinh viên thực hiện:
Nguyễn Lâm Thùy Dương
MSSV: 2091959
Lớp: Sư phạm Hóa học K35
Cần Thơ, 2012
Luận văn tốt nghiệp Nguyễn Lâm Thùy Dương



I
LỜI CẢM ƠN
  

Để hoàn thành đề tài Khảo sát hàm lượng chất kháng sinh họ Quinolone trong thủy
sản bằng kỹ thuật sắc kí lỏng ghép khối phổ, ngoài sự nỗ lực của bản thân, tôi đã học hỏi
được nhiều kiến thức, kinh nghiệm và kỹ năng chuyên môn bổ ích, thiết thực từ quý thầy
cô và bạn bè. Với tấm lòng trân trọng và biết sâu sắc, tôi xin gửi lời cảm ơn đến:
 Cô Nguyễn Thị Thu Thủy – Bộ môn Sư Phạm Hóa Học – Khoa Sư Phạm đã trực
tiếp hướng dẫn tôi. Cô đã tận tình giúp đỡ, quan tâm, động viên và tạo mọi điều
kiện thuận lợi nhất để tôi hoàn thành đề tài tốt nghiệp.

 Cô Lê Bảo Ngọc – Giám Đốc Trung Tâm Dịch Vụ Phân Tích Thí Nghiệm
TP.HCM chi nhánh Cần Thơ đã giúp đỡ tôi và tạo điều kiện thuận lợi về trang

thiết bị, dụng cụ, hóa chất để tôi hoàn thành đề tài.

 Các anh chị làm việc tại Trung Tâm Dịch Vụ Phân Tích Thí Nghiệm TP.HCM chi
nhánh Cần Thơ, đặc biệt là các anh trong tổ Sắc Ký đã nhiệt tình giúp đỡ và chia sẻ
những kinh nghiệm bổ ích trong quá trình thực hiện phân tích mẫu.

 Tập thể các thầy cô Bộ môn Hóa - Khoa Sư Phạm đã truyền thụ những kiến thức,
kinh nghiệm giảng dạy quý báu trong suốt bốn năm qua.

 Cuối cùng xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến gia đình và tập thể các bạn lớp Sư phạm
hóa khóa 35 đã luôn bên cạnh, ủng hộ và chia sẻ những khó khăn, vất vả trong suốt
thời gian qua.

Sinh viên thực hiện






Nguyễn Lâm Thùy Dương
Luận văn tốt nghiệp Nguyễn Lâm Thùy Dương



II

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ CỘNG HÒA XÃ HÔI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM
KHOA SƯ PHẠM Độc lập – Tự do – Hạnh phúc
BỘ MÔN HÓA HỌC

NHẬN XÉT VÀ ĐÁNH GIÁ CỦA CÁN BỘ HƯỚNG DẪN
1. Cán bộ hướng dẫn: Ts. Nguyễn Thị Thu Thủy
Th.s Lê Bảo Ngọc
2. Tên đề tài: “Khảo sát hàm lượng chất kháng sinh họ quinolone trong tôm, cá
bằng kĩ thuật sắc ký lỏng ghép khối phổ”
3. Sinh viên thực hiện: Nguyễn Lâm Thùy Dương MSSV: 2091959
Lớp Sư phạm Hóa học K35
4. Nội dung nhận xét:
a. Nhận xét về hình thức LVTN:





b. Nhận xét về nội dung của LVTN:
- Đánh giá nội dung thực hiện đề tài:





- Những vấn đề còn hạn chế:




Luận văn tốt nghiệp Nguyễn Lâm Thùy Dương

III

c. Nhận xét đối với từng sinh viên tham gia thực hiện đề tài (ghi rõ từng nội dung
chính do sinh viên nào chịu trách nhiệm nếu có):





d. Kết luận, đề nghị và điểm:






Cần Thơ, ngày tháng….năm 2013
Cán bộ hướng dẫn

Luận văn tốt nghiệp Nguyễn Lâm Thùy Dương



IV

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ CỘNG HÒA XÃ HÔI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM
KHOA SƯ PHẠM Độc lập – Tự do – Hạnh phúc
BỘ MÔN HÓA HỌC

NHẬN XÉT VÀ ĐÁNH GIÁ CỦA CÁN BỘ PHẢN BIỆN

1. Cán bộ phản biện:

2. Tên đề tài: “Khảo sát hàm lượng chất kháng sinh họ quinolone trong tôm, cá
bằng kĩ thuật sắc ký lỏng ghép khối phổ”
3. Sinh viên thực hiện: Nguyễn Lâm Thùy Dương MSSV: 2091959
Lớp Sư phạm Hóa học K35
4. Nội dung nhận xét:
a. Nhận xét về hình thức LVTN:





b. Nhận xét về nội dung của LVTN:
- Đánh giá nội dung thực hiện đề tài:

- Những vấn đề còn hạn chế:



Luận văn tốt nghiệp Nguyễn Lâm Thùy Dương



V


c. Nhận xét đối với từng sinh viên tham gia thực hiện đề tài (ghi rõ từng nội dung
chính do sinh viên nào chịu trách nhiệm nếu có):





d. Kết luận, đề nghị và điểm:






Cần Thơ, ngày tháng….năm 2013
Cán bộ phản biện

Luận văn tốt nghiệp Nguyễn Lâm Thùy Dương



VI
MỤC LỤC


LỜI CẢM ƠN I
MỤC LỤC V
DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT X
DANH MỤC HÌNH XI

DANH MỤC BẢNG XII
TÓM TẮT NỘI DUNG……………………………………………………………………… XIII
PHẦN I: MỞ ĐẦU 1
I. LÝ DO CHỌN ĐỀ TÀI 1
II. MỤC ĐÍCH CỦA ĐỀ TÀI 1
III. GIỚI HẠN CỦA ĐỀ TÀI 2
IV. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2
V. CÁC BƯỚC THỰC HIỆN ĐỀ TÀI 2
PHẦN II: NỘI DUNG 3
A. CƠ SỞ LÍ THUYẾT………………………………………………………………………… 3
I. GIỚI THIỆU VỀ CHẤT KHÁNG SINH
[3],[4],[11]
3
1. Định nghĩa 3
2. Nguyên nhân tồn lưu kháng sinh trong thực phẩm 3
3. Cơ chế tác động của chất kháng sinh 3
4. Phân loại chất kháng sinh 4
II. GIỚI THIỆU VỀ QUINOLONE
[3],[4],[7],[8],[10],[11],[12]
4
1. Khái quát 4
2. Phân loại Quinolone 5
3. Công thức cấu tạo 5
4. Tính chất acid - base nhóm quinolone: 5
III. CIPROFLOXACIN, ENROFLOXACIN
[3],[4],[6],[12],[14]
6
1. Ciprofloxacin: 6
2. Enrofloxacin: 7
3. Tác dụng điều trị của Enrofloxacin và Ciprofloxacin 8

Luận văn tốt nghiệp Nguyễn Lâm Thùy Dương



VII
3.1. Ciprofloxacin 8
3.2. Enrofloxacin 8
4. Tác hại và liều lượng cho phép của Enrofloxacin, Ciprofloxacin 8
IV. SẮC KÍ LỎNG HIỆU NĂNG CAO
[2],[3],[4],[5],[13]
10
1. Khái niệm 10
2. Phân loại 10
2.1. Sắc ký phân bố (Partition Chromatography: PC). 10
2.2. Sắc ký hấp phụ 10
2.3. Sắc ký trao đổi ion (IE-HPLC) và cặp ion (IP-HPLC). 10
2.4. Sắc ký rây phân tử (FG-HPLC). 10
3. Ưu nhược điểm của phương pháp sắc kí lỏng hiệu năng cao 10
4. Các đại lượng đặc trưng của sắc kí lỏng hiệu năng cao 11
4.1. Thời gian lưu 11
4.2. Hệ số phân bố 11
4.3. Hệ số dung lượng 12
4.4. Hiệu năng 12
4.5. Độ chọn lọc α 13
4.6. Số đĩa lí thuyết (N) và chiều cao (H) của đĩa lí thuyết trong cột sắc ký 13
4.7. Độ phân giải (R
s
) 13
5. Các bộ phận của máy sắc kí lỏng hiệu năng cao 14
5.1. Bình chứa dung môi giải ly cột 14

5.2. Bộ khử khí (Degasse ) 16
5.3. Bơm cao áp 16
5.4. Bộ phận tiêm mẫu ( injection) 16
5.5. Cột sắc ký 17
5.5.1. Khái niệm 17
5.5.2. Phân loại 17
5.6. Đầu dò 17
5.7. Bộ phận ghi nhận tín hiệu 18
5.8. In dữ liệu 18
6. Giới thiệu về đầu dò khối phổ – đầu dò MS ba tứ cực 18
Luận văn tốt nghiệp Nguyễn Lâm Thùy Dương



VIII
6.1. Bộ tạo ion 19
6.2. Bộ tách khối 19
6.3. Một số kỹ thuật scan trên thiết bị MS/MS ba tứ cực 21
6.4. Bộ dò ion (detector) 22
V. MỘT SỐ PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH HỌ QUINOLONE
[3],[4],[6],[8],[10]
22
1. Phương pháp trắc quang 22
2. Phương pháp Elisa 23
2.1. Giới thiệu chung 23
2.2. Nguyên liệu 23
2.3. Hướng dẫn an toàn 23
2.4. Bảo quản và lưu trữ 24
2.5. Nguyên tắc thử 24
2.6. Kết quả 24

3. Phương pháp điện hóa 25
4. Phương pháp HPLC – đầu dò UV và DAD 25
5. Phương pháp HPLC – đầu dò huỳnh quang 25
6. Phương pháp HPLC – đầu dò MS 26
7. Phương pháp xác định dư lượng enrofloxacin, ciprofloxacin trong thịt gà, cá tra
bằng phương pháp sắc kí lỏng ghép 2 lần khối phổ (LC-MS/MS) 26
7.1. Nguyên tắc 26
7.2. Thiết bị – hóa chất 26
7.3. Qui trình xử lí mẫu 28
7.4. Điều kiện phân tích bằng LCMS 28
7.5. Dung dịch chuẩn 29
7.6. Khảo sát khoảng tuyến tính và dựng đường chuẩn của enrofloxacin và
ciprofloxacin 29
7.7. Xác định hiệu suất thu hồi và độ chụm của phương pháp trên mẫu thực tế như
cá diêu hồng, cá basa, thịt gà 29
B. THỰC NGHIỆM 31
I. XÂY DỰNG CÁC YẾU TỐ TRONG QUÁ TRÌNH THỰC NGHIỆM 31
1. Nguyên tắc 31
Luận văn tốt nghiệp Nguyễn Lâm Thùy Dương



IX
2. Dụng cụ và thiết bị 31
3. Hóa chất 31
4. Cách tiến hành 32
4.1. Yêu cầu chung 32
4.2. Chuẩn bị các dung dịch chuẩn 32
4.2.1. Chuẩn dung dịch gốc C
o

(100ppm): 32
4.2.2. Chuẩn trung gian 32
4.2.3. Chuẩn làm việc: 32
4.3. Chọn lọc các yếu tố phân tích bằng LC-MS 33
4.3.1 Khảo sát khoảng tuyến tính 33
4.3.2 Khảo sát độ lặp lại 36
4.3.3 Giới hạn phát hiện, giới hạn định lượng 39
4.3.4. Khảo sát độ đúng 40
4.3.5 Tổng kết kết quả thẩm định phương pháp 41
4.4. Thu mua mẫu 41
4.5. Tiến hành phân tích mẫu 41
II. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 42
1. Kết quả xác định dư lượng chất kháng sinh Enrofloxacin 42
2. Kết quả xác định dư lượng chất kháng sinh Ciprofloxacin 43
PHẦN III: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 45
I. KẾT LUẬN 45
II. KIẾN NGHỊ 45
PHỤ LỤC 47
TÀI LIỆU THAM KHẢO 65









Luận văn tốt nghiệp Nguyễn Lâm Thùy Dương

X
DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT

HPLC
High performance liquid chromatography
LC
Liquid chromatography
GC
Gas chromatography
LOD
Limit of detection
LOQ
Limit of quantitation
ppm
Parts per million
ppb
Parts per billion
MS
Mass spectroscopy
UV
Ultraviolet
UV-VIS
Ultraviolet- Visible
MLOD
Method limit of detection
MRM
Multiple reaction monitoring
Rpm

Revolutions per minute
RSD
Relative standard deviation
ESI
Electrospray ionization
APCI
Atmospheric pressure chemical ionization.
API
AQ
PQ
MRL
Atmospheric pressure ionization.
Acidic quinolone
Piperazinyl quinolone
Maximum Range Limit









Luận văn tốt nghiệp Nguyễn Lâm Thùy Dương



XI
DANH MỤC HÌNH

Hình 1. Cấu trúc cơ bản của nhóm quinolone 5
Hình 2. Cân bằng acid base của nhóm acidic quinolone 6
Hình 3. Cân bằng acid base của nhóm piperazinyl quinolone 6
Hình 4. Công thức cấu tạo của ciprofloxacin 7
Hình 5. Công thức cấu tạo của enrofloxacin 7
Hình 6. Thời gian lưu của cấu tử phân tích 11
Hình 7. Sơ đồ hệ thống HPLC 14
Hình 8. Sơ đồ cấu tạo ba tứ cực của hãng Agilent 20
Hình 9. Sự phân mảnh diễn ra ở Q2 20
Hình 10. Khối phổ của chất phân tích ứng với từng giai đoạn trong bộ ba tứ cực 21
Hình 11. Phức tạo thành giữa Fe(III) với ciprofloxacin (λmax =430nm). 22
Hình 12. Đường chuẩn enrofloxacin 34
Hình 13. Đường chuẩn của ciprofloxacin 35

Luận văn tốt nghiệp Nguyễn Lâm Thùy Dương



XII
DANH MỤC BẢNG

Bảng 1. Một số dung môi và tính chất của chúng. 15
Bảng 2. Tóm tắt cách xác định một số quinolone bằng phương pháp điện hóa 25
Bảng 3. Kết quả dựng đường chuẩn của enrofloxacin 33
Bảng 4. Kết quả dựng đường chuẩn của ciprofloxacin. 34
Bảng 5. Chương trình gradient 37
Bảng 6. Điều kiện MS 38
Bảng 7. Khảo sát độ lặp lại của tín hiệu đo với chuẩn enrofloxacin 38
Bảng 8. Khảo sát độ lặp lại của tín hiệu đo với chuẩn ciprofloxacin 39
Bảng 9. Kết quả khảo sát độ đúng đối với enrofloxacin 40
Bảng 10. Kết quả khảo sát độ đúng đối với ciprofloxacin 40
Bảng 11. Tổng kết kết quả thẩm định phương pháp 41
Bảng 12. Số liệu thu mua mẫu 41
Bảng 13. Kết quả xác định dư lượng chất kháng sinh Enrofloxacin 42
Bảng 14. Những mẫu bị phát hiện dư lượng Enrofloxacin 42
Bảng 15. Kết quả xác định dư lượng chất kháng sinh ciprofloxacin 43
Bảng 16. Những mẫu bị phát hiện nhiễm ciprofloxacin 43

Luận văn tốt nghiệp Nguyễn Lâm Thùy Dương



XIII

TÓM TẮT NỘI DUNG

Sử dụng chất kháng sinh trong nuôi trồng thủy sản để đề phòng và điều trị các
bệnh nhiễm trùng đã đạt được nhiều thành tựu to lớn, giúp sản lượng và chất lượng của
các mặt hàng thủy sản ngày càng được nâng cao. Tuy nhiên, những hậu quả do nó gây
cũng không ít. Trong những năm gần đây, do việc lạm dụng chất kháng sinh mà một số lô
hàng của Việt Nam xuất khẩu sang thị trường Nhật Bản, Mĩ bị trả về do phát hiện có dư
lượng các chất kháng sinh vượt quá giới hạn cho phép, gây ảnh hưởng xấu đến sức khỏe
người tiêu dùng. Vấn đề nghiên cứu và áp dụng các phương pháp tiên tiến để phân tích
xác định, đánh giá dư lượng kháng sinh sao cho vừa hiệu quả vừa phù hợp với điều kiện
thực tế ở nước ta là rất cần thiết.
Đề tài “ KHẢO SÁT DƯ LƯỢNG CHẤT KHÁNG SINH HỌ QUINOLONE
TRONG TÔM CÁ BẰNG KĨ THUẬT SẮC KÍ LỎNG GHÉP KHỐI PHỔ LC/MS-MS”

được thực hiện với mục đích đánh giá được tình hình dư lượng chất kháng sinh họ
Quinolone ở các chợ trên địa bàn thành phố Cần Thơ, giúp cho người dân cảnh giác hơn
đối với việc sử dụng các sản phẩm từ tôm, cá, đồng thời kết quả thu được sẽ là thông tin
bổ ích đến người nuôi trồng thủy sản giúp họ sử dụng hợp lí các chất kháng sinh trong
quá trình nuôi, giảm thiệt hại cho các doanh nghiệp xuất khẩu thủy sản. Do thời gian và
điều kiện có giới hạn nên đề chỉ mới khảo sát được 2 chất kháng sinh thuộc họ quinolone
là enrofloxacin và ciprofloxacin. Nội dung thực hiện:
 Bước 1: Thu mua mẫu ở một số chợ trên địa bàn Thành Phố Cần Thơ.
 Bước 2: Xử lý mẫu: mẫu sau khi đồng nhất được tách chiết bằng dung môi
HCOOH/acetonitril, thổi khô và cô cạn bằng MeOH/H
2
O 1:1
 Bước 3: Tiến hành phân tích trên hệ thống sắc ký lỏng ghép 2 lần khối phổ
LC/MS-MS
Sau khi tiến hành thu mua và phân tích 48 mẫu tôm, cá được bán trên địa bàn thành phố
Cần Thơ đã thu được kết quả như sau:
 Trong 24 mẫu tôm, có 0% nhiễm ciprofloxacin, 2/24 (8,33%) mẫu nhiễm
enrofloxacin từ 6,08-7,02ppb, không có mẫu nào vượt quá giới hạn tối đa cho
phép.
Luận văn tốt nghiệp Nguyễn Lâm Thùy Dương



XIV
 Trong 24 mẫu cá, có 3/24 (12,5%) mẫu ciprofloxacin từ 0,64-2,05ppb nhưng vẫn
còn trong giới hạn cho phép (10ppb), có 6/24 (25%) mẫu nhiễm enrofloxacin từ
1,28-17,76ppb, trong đó có 2 mẫu vượt quá giới hạn cho phép (10ppb).

Luận văn tốt nghiệp Nguyễn Lâm Thùy Dương

1
PHẦN I: MỞ ĐẦU
I. LÝ DO CHỌN ĐỀ TÀI
Ở nước ta, nghề nuôi trồng thủy hải sản phát triển mạnh trong những năm
gần đây và trở thành một trong những ngành kinh tế chủ lực của đất nước, theo thống kê
tổng giá trị xuất khẩu thủy sản năm 2012 đạt khoảng 6,2 tỷ USD, với 2 mặt hàng chủ lực
là tôm và cá tra. Tuy nhiên trong thời gian gần đây một số lô hàng của Việt Nam xuất
sang thị trường Nhật Bản, Mỹ phát hiện dư lượng ciprofloxacin, enrofloxacin (họ
quinolone) Do người nuôi lạm dụng kháng sinh trong quá trình nuôi, làm ảnh hưởng
tới sức khỏe người tiêu dùng và làm giảm khả năng cạnh tranh của thủy sản Việt
Nam. Chính vì vậy ngày 16/1/2012, Bộ Nông Nghiệp và Phát Triển Nông Thôn đã
ban hành Thông tư số 03/2012/TT – BNNPTNT bổ sung các chất Cypermethrin,
Deltamethrin và Enrofloxacin vào danh mục hóa chất, kháng sinh cấm sử dụng
trong sản xuất, kinh doanh thủy sản. Trước tình đó các doanh nghiệp xuất khẩu tôm
và Cục quản lý chất lượng nông lâm sản và thủy sản (NAFIQAD) đã tăng cường công
tác kiểm soát dư lượng kháng sinh trong thành phẩm tôm và tôm nguyên liệu, xuất
phát từ nhu cầu trên nên chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài “Khảo sát hàm lượng
chất kháng sinh họ quinolone trong tôm, cá bằng kĩ thuật sắc ký lỏng ghép khối
phổ” ở địa bàn thành phố Cần Thơ, nhằm giúp người dân cảnh giác hơn trong việc sử
dụng các sản phẩm từ tôm, cá và làm giảm thiệt hại cho doanh nghiệp xuất khẩu thủy hải
sản.
II. MỤC ĐÍCH CỦA ĐỀ TÀI
Đề tài được thực hiện với mong muốn đánh giá được phần nào tình trạng dư lượng
chất kháng sinh trong một số loại thủy sản ở thành phố Cần Thơ, từ đó giúp người tiêu
dùng biết được mức độ an toàn của chúng, đồng thời kết quả thu được sẽ là thông tin bổ
ích gửi đến người nuôi thủy sản, giúp họ ý thức hơn trong quá trình sử dụng kháng sinh
trong quá trình nuôi, tránh ảnh hưởng tới sức khỏe người tiêu dùng và làm giảm khả
năng cạnh tranh của thủy sản Việt Nam.

Luận văn tốt nghiệp Nguyễn Lâm Thùy Dương



2

III. GIỚI HẠN CỦA ĐỀ TÀI
Khảo sát dư lượng kháng sinh họ quinolone trên một số mẫu tôm, cá ở khu vực
thành phố Cần Thơ thời gian từ 3/2012 đến 4/2013.
Do thời gian có hạn nên đề tài chỉ khảo sát một số loại dư lượng đang được sử
dụng rộng rãi như: ciprofloxacin, enrofloxacin.
IV. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Để thực hiện đề tài “Khảo sát hàm lượng chất kháng sinh họ quinolone trong
tôm, cá bằng kĩ thuật sắc ký lỏng ghép khối phổ”. Tôi đã sử dụng các phương pháp
nghiên cứu khoa học
- Điều tra
- Tổng kết kinh nghiệm (đọc tài liệu và tham khảo từ những nghiên cứu trước)
- Tiến hành thí nghiệm tại phòng thí nghiệm
Trong điều kiện thí nghiệm của đề tài, tôi sử dụng kỹ thuật Sắc kí lỏng ghép khối
phổ bằng phương pháp QQQ_LC/MS/MS( Ref: Journal of Chromatography A, 1088
(2005))
V. CÁC BƯỚC THỰC HIỆN ĐỀ TÀI
o Giai đoạn 1: Nhận đề tài, tìm hiểu và nghiên cứu tài liệu, xây dựng đề cương (3-
2012)
o Giai đoạn 2: Tiếp tục nghiên cứu tài liệu, tiến hành các thí nghiệm tại Trung tâm
dịch vụ phân tích thí nghiệm TP Hồ Chí Minh, chi nhánh Cần Thơ (3-2012 đến 9-
2012).
o Giai đoạn 3: Thu thập mẫu và tiến hành phân tích mẫu ở Cần Thơ cũng như
Đồng bằng sông Cửu Long (10-2012 đến 12-2012).

o Giai đoạn 4: Thu thập và xử lí số liệu thu được, tổng kết và viết bài (1-2013 đến
4-2013).
Nơi thực hiện đề tài: PTN Trung Tâm Phân Tích Dịch Vụ Thí Nghiệm TP Hồ Chí Minh
chi nhánh Cần Thơ (CASE Cần Thơ).
Luận văn tốt nghiệp Nguyễn Lâm Thùy Dương



3


PHẦN II: NỘI DUNG
A. CƠ SỞ LÍ THUYẾT
I. GIỚI THIỆU VỀ CHẤT KHÁNG SINH
[3],[4],[11]
1. Định nghĩa
Kháng sinh là những chất có khả năng tiêu diệt vi khuẩn hay kìm hãm sự phát
triển của vi khuẩn một cách đặc hiệu. Nó ngăn vi khuẩn nhân lên bằng cách tác động ở
mức phân tử, thường là một vị trí quan trọng của vi khuẩn hoặc tác động vào một hay
nhiều giai đoạn chuyển hóa cần thiết của đời vi khuẩn.
2. Nguyên nhân tồn lưu kháng sinh trong thực phẩm
Có nhiều nguyên nhân dẫn đến việc tồn lưu kháng sinh trong thực phẩm, nhưng chủ
yếu là do các nguyên nhân sau:
 Có thể nhiễm lẫn vào thức ăn do thức ăn tiếp xúc môi trường có chứa kháng sinh.
 Do sử dụng thường xuyên kháng sinh: Mục đích kích thích tăng trọng, phòng bệnh
mùa dịch bệnh, chữa bệnh.
 Nhằm kéo dài thời gian bảo quản, tránh hư hỏng cho thực phẩm
3. Cơ chế tác động của chất kháng sinh
Khi một chất kháng sinh được đưa vào cơ thể, nó sẽ giết chết các vi khuẩn gây bệnh.
Kháng sinh diệt trùng bằng nhiều cách:

 Ức chế sự thành lập vách tế bào: Ngăn cản sự tổng hợp thành của tế bào vi trùng
như penicillin, cephalosporin, vancomycin
 Ức chế nhiệm vụ của màng tế bào
 Ức chế sự chuyển hóa của vi trùng như sulfamides, trimethoprim,…
 Ức chế tổng hợp protein của vi trùng tetracycline, aminoglycosides, macrolides,…
 Ức chế sự tổng hợp và hoạt động của acid nucleic như flouroquinolones và
rifampicin.
Luận văn tốt nghiệp Nguyễn Lâm Thùy Dương



4
4. Phân loại chất kháng sinh
 Nhóm β lactam các Penicillin: Penicilin, Methicilin, Ampicilline, Amoxicilline,
Cloxacilline, Sultamicillin, Piperacilline, Imipenem
 Nhóm β lactam các Cephalosporin:
Thế hệ 1: Cefadroxil, Cephalexin, Cefalothin, Cephazolin
Thế hệ 2: Cefaclor
Thế hệ 3: Cefixime, Ceftriaxone, Cefuroxime, Cefixime, Ceftazidime,
Cefotaxime, Cefpodoxime
 Nhóm Tetracyclin: Tetracycline, Doxycyline, Clotetracyclin, Oxytetracyclin,
Minocyclin, hexacyclin.
 Nhóm Aminosid : Amikacin, Tobramycin, Neomycin, Gentamycin, Kanamycin,
Streptomycin.
 Nhóm Macrolid: Azithromycin, Roxithromycin, Erythromycin, rovamycin,
Clarithromycin, Spiramycin
 Nhóm Lincosamid: Lincomycin, Clindamycin
 Nhóm Quinolon: Acid nalidixic, lomefloxacin, ciprofloxacin, norfloxacin,
ofloxacin, levofloxacin, Gatifloxacin, Moxifloxacin, Pefloxacin, Sparfloxacin
 Nhóm 5- nitro- imidazol: Clotrimazole, Metronidazole, Tinidazole, Secnidazole,

Miconazole, ornidazole.
 Nhóm Sulfamid: Sulfaguanidin, Sulfamethoxazol, Sulfadiazin, Sulfasalazin
II. GIỚI THIỆU VỀ QUINOLONE
[3],[4],[7],[8],[10],[11],[12]
1. Khái quát
Quinolone là một kháng sinh được sử dụng rộng rãi trong việc điều trị nhiễm trùng
ở người và động vật. Mục tiêu chính của chúng là enzyme DNA gyrase của vi khuẩn cụ
thể là tại topoisomerase II. Quinolone có thành phần hóa học là dẫn xuất của acid
nalidixic
Phần lớn các thuốc quinolone sử dụng trên lâm sàng là thuộc fluoroquinolones -
nghĩa là nhóm quinolone có gắn thêm nguyên tử fluorine dính vào vòng trung tâm, điển
hình ở vị trí số 6.
Luận văn tốt nghiệp Nguyễn Lâm Thùy Dương



5
2. Phân loại Quinolone
Thuốc quinolone được phân chia thành các thế hệ dựa trên phổ tác dụng lên vi khuẩn
của chúng:
 Thế hệ thứ nhất: Cinoxacin, Flumequine, Oxolinic acid, Piromidic acid, Pipemidic
acid, Rosoxacin…
 Thế hệ thứ hai: Ciprofloxacin, Enoxacin, Fleroxacin, Lomefloxacin, Nadifloxacin,
Norfloxacin, Ofloxacin, Pefloxacin, Rufloxacin…
 Thế hệ thứ ba: Balofloxacin, Gatifloxacin, Grepafloxacin, Levofloxacin,
Moxifloxacin, Pazufloxacin, Sparfloxacin, Temafloxacin, Tosufloxacin,…
 Thế hệ thứ tư: Clinafloxacin, Garenoxacin, Gemifloxacin, Sitafloxacin,
Trovafloxacin, Prulifloxacin,…
 Thế hệ mới đang phát triển: Ecinofloxacin
3. Công thức cấu tạo:

Công thức cấu tạo chung của hợp chất Quinolones là vòng thơm có chứa N, vị trí
thứ 4 có gắn nhóm ketone, vị trí thứ 3 có gắn nhóm carboxylic. Các dẫn xuất của
Quinolone gồm các hợp chất mà: Vị trí 1: có thể gắn nhóm alkyl hoặc aryl, vị trí thứ 6: có
thể gắn thêm F, vị trí 2, 6, 8: có thể gắn thêm một nguyên tử N
N
1
2
3
4
5
6
8
7
OH
OO

Hình 1. Cấu trúc cơ bản của nhóm quinolone
4. Tính chất acid - base nhóm quinolone:
Quinolone có một nhóm carboxylic ở vị trí số 3 nên đây là một hợp chất có tính acid.
Một số quinolone có chứa thêm nhóm amine khác nên có thêm tính base. Dựa vào pKa
có thể chia nhóm quinolone thành hai loại: Acidic quinolone (AQ) và Piperazinyl
quinolone (PQ)
 Acidic quinolone (AQ): chỉ có một giá trị pKa thuộc khoảng 6.0 đến 6.9.Trong
nước chúng tồn tại ở dạng trung hòa hoặc dạng anion. Thường AQ gồm những
Luận văn tốt nghiệp Nguyễn Lâm Thùy Dương



6
quinolone thuộc thế hệ thứ nhất.

X
X
N
O
R
1
R
2
R
3
R
4
COOH
X
X
N
O
R
1
R
2
R
3
R
4
COO
pK

Hình 2. Cân bằng acid base của nhóm Acidic quinolone
 Piperazinyl quinolone (PQ): có hai giá trị pKa, pKa

1
khoảng 5.5 – 6.6 và pKa
2

khoảng 7.2 - 8.9. Trong nước chúng có thể tồn tại ở ba dạng khác nhau: dạng
cation, dạng trung hòa và dạng anion; một số PQ là Danofloxacin, Difloxacin,
Norfloxacin, Ofloxacin, Benofloxacin, Marbofloxacin, Pipemidic acid.
X
X N
O
R
R R
COOH
N
N
R
H
X
X N
O
R
R R
N
N
R
H
COO
X
X N
O

R
R R
N
N
R
COO

Hình 3. Cân bằng acid base của nhóm Piperazinyl quinolone
III. CIPROFLOXACIN, ENROFLOXACIN
[3],[4],[6],[12],[14]

1. Ciprofloxacin
Ciprofloxacin là kháng sinh thuộc nhóm fluoroquinolone, loại PQ, có thể chống vi
khuẩn gram dương và gram âm.
Tên gọi: 1-cyclopropyl-6-fluoro- 4-oxo- 7-piperazin- 1-yl- quinoline- 3-carboxylic
acid

Tên khác: Ciloxan, Cipro, Cipro XR, Cipro XL Ciproxin, Ciproflox hay
Ciprofloxacino
Công thức hóa học: C
17
H
18
FN
3
O
3

Trọng lượng phân tử: 331,35 g/mol
Nhiệt độ nóng chảy: 318-320

o
C
Luận văn tốt nghiệp Nguyễn Lâm Thùy Dương



7

NN
OH
OO
F
NH

Hình 4. Công thức cấu tạo của Ciprofloxacin
Tính chất: là bột kết tinh màu vàng nhạt, tan một phần trong nước, tan rất ít trong
ethanol, methylene chloride. Tan tốt trong dung dịch acid acetic loãng, có hai giá trị pKa
là 6,0 và 8,8
2. Enrofloxacin
Enrofloxacin là kháng sinh thuộc nhóm fluoroquinolone, loại PQ, có thể chống vi
khuẩn gram dương và gram âm.
Tên gọi: 1-Cyclopropyl-7-(4-ethyl-1-piperazinyl)-6-fluoro-1,4-dihydro-4-oxo-3-
quinolonecarboxylic acid
Công thức hóa học: C
19
H
22
FN
3
O

3

Trọng lượng phân tử: 359,4 g/mol
Nhiệt độ nóng chảy: 219-221
o
C
Công thức cấu tạo:

N N
HO
O O
F
N
CH
3

Hình 5. Công thức cấu tạo của Enrofloxacin
Luận văn tốt nghiệp Nguyễn Lâm Thùy Dương



8
Tính chất: là tinh thể màu vàng nhạt, tan nhẹ một phần trong nước ở pH = 7, có
hai giá trị pKa: khoảng 5 và 8-9.
3. Tác dụng điều trị của Enrofloxacin và Ciprofloxacin
3.1. Ciprofloxacin
- Các bệnh nhiễm trùng của: đường hô hấp, tai giữa (viêm tai giữa), xoang (viêm
xoang), mắt, thận, đường tiết niệu, ổ bụng, xương khớp
- Nhiễm trùng huyết.
- Nhiễm trùng hoặc có nguy cơ nhiễm trùng (dự phòng) trên bệnh nhân có hệ miễn

dịch suy yếu (như bệnh nhân bị suy giảm miễn dịch hoặc có tình trạng giảm bạch cầu).
- Ngoài ra, thuốc còn có tác dụng cộng hưởng với các nhóm kháng sinh khác (như
betalactam, aminozid) nên khi phối hợp thường cho kết quả cao (điển hình là phối hợp
với azocillin). Ciprofloxacin ức chế enzym gryrase gây cản trở thông tin nhiễm sắc thể
(một vật liệu di truyền cần thiết cho chuyển hóa) làm cho vi khuẩn giảm sinh sản một
cách nhanh chóng. Trong khi đó, các nhóm kháng sinh khác (như betalactam, aminozid),
không ức chế enzym gryrase rất dễ bị vi khuẩn kháng. Vì thế, ciprofloxacin (và các
fluoroquinolon khác) được xem là "vũ khí chiến lược" dành dùng cho các trường hợp vi
khuẩn không đáp ứng với các kháng sinh khác.
3.2. Enrofloxacin
Enrofloxacin có hiệu quả điều trị cao đối với nhiều bệnh nhiễm khuẩn đường hô
hấp và tiêu hóa, cơ quan sinh dục của người và động vật.
Enrofloxacin có phổ kháng khuẩn rộng đối với cả vi khuẩn gram (+) và(-). Thuốc
hấp phụ nhanh: 30-60 phút sau khi tiêm hoặc uống thuốc đã tăng nhanh trong huyết thanh
và các phủ tạng nên tiêu diệt mầm bệnh nhanh.
4. Tác hại và liều lượng cho phép của Enrofloxacin, Ciprofloxacin
Do cơ chế ức chế tổng hợp acid nucleic mà kháng sinh nhóm fluoroquinolone
được cho là có nguy cơ gây đột biến gen, gây sẩy thai khi sử dụng cho động vật mang
thai, và khuyến cáo là không nên dụng kháng sinh nhóm fluoroquinolone cho động vật
mang thai, động vật sinh sản và làm giống.
- Làm thương tổn sự phát triển sụn và khớp chịu lực của động vật non nên có thể gây
Luận văn tốt nghiệp Nguyễn Lâm Thùy Dương



9
hại cho sự phát triển xương khớp của thai nhi và trẻ em tuổi trưởng thành.
- Gây đau cơ, viêm dây thần kinh, đặc biệt là các dây chằng, nghiêm trọng nhất là làm
đứt gót chân Achill. Hay gặp ở người già vì dây chằng vốn bị suy yếu.
- Ảnh hưởng không tốt đến thần kinh gây nhức đầu, mệt mỏi, mất ngủ, kích động, run

rẩy. Hiếm gặp hơn là gây co giật, lo âu, trầm cảm, ác mộng, ảo giác hoặc xuất hiện trạng
thái tâm thần. Người có tiền sử bệnh tâm thần dễ gặp các hiện tượng này.
- Gây một số phản ứng nghiêm trọng: phù mặt, phù thanh quản, khó thở đe dọa tính
mạng. Người có cơ địa dị ứng dễ bị tai biến này.
- Cũng như các kháng sinh phổ rộng khác, việc lạm dùng liều cao làm cho
ciprofloxacin tiêu diệt hết các vi khuẩn có lợi, gây mất cân bằng sinh thái vi khuẩn trong
cơ thể. Trong thực tế, sau khi dùng một liều mạnh ciprofloxacin điều trị khỏi nhiễm
khuẩn hô hấp, trẻ có thể bị tiêu chảy do rối loạn vi khuẩn đường ruột.
Sự tồn lưu thời gian dài sau khi sử dụng thuốc kháng sinh nhóm fluoroquinolone
là nguyên nhân dẫn đến việc hạn chế và cấm sử dụng những kháng sinh thuộc nhóm này.
Ở Mỹ, cơ quan quản lý thực phẩm và dược phẩm của Mỹ (FDA: Food and Drug
Administration) đã không chấp nhận sự tồn lưu kháng sinh nhóm fluoroquinolone trong
sản phẩm thủy sản. Ở châu Âu, EU đã đưa ra giới hạn lớn nhất (MRLs) đối với dư lượng
thuốc trong thực phẩm cung cấp cho con người vào những năm 1990. Trong “Council
directive 96/23/EC in 1996” đã quy định rõ là enrofloxacin trong cơ, gan, thận của bò,
heo, gia cầm (gà, vịt) là 30ppb; trong sữa bò là 100ppb
Theo quyết định số: 2864/QĐ-BNN-QLCL của Bộ Nông Nghiệp và Phát Triển
Nông Thôn qui định chỉ tiêu kiểm tra về chất lượng, an toàn thực phẩm đối với lô hàng
thủy sản xuất khẩu: giới hạn cho phép của enrofloxacin, ciprofloxacin trong tôm nuôi, cá
tra, basa và sản phẩm chế biến từ tôm nuôi, cá tra, basa.
+ Thị trường EU: 100μg/kg (tổng 2 chỉ tiêu)
+ Thị trường Hàn Quốc: 100μg/kg (tổng 2 chỉ tiêu)
+ Thị trường Liên Bang Nga: 0,1 mg/kg (tổng 2 chỉ tiêu)
+ Thị trường Canada: Không cho phép (MRL = 1ppb)
+ Thị trường Nhật Bản: Không cho phép (MRL = 10ppb)


Luận văn tốt nghiệp Nguyễn Lâm Thùy Dương

10
IV. SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO
[2],[3],[4],[5],[13]

1. Khái niệm
Sắc ký lỏng hiệu năng cao là một phương pháp chia tách trong đó pha động là chất
lỏng và pha tĩnh chứa trong cột là chất rắn đã được phân chia dưới dạng tiểu phân hoặc
một chất lỏng phủ lên một chất mang rắn, hay một chất mang đã được biến đổi bằng liên
kết hoá học với các nhóm chức hữu cơ .Quá trình sắc ký lỏng dựa trên cơ chế hấp phụ,
phân bố, trao đổi ion hay phân loại theo kích cỡ (rây phân tử).
2. Phân loại
Trong HPLC, tùy bản chất của quá trình sắc ký của pha tĩnh (SP) trong cột tách mà
người ta chia thành:
2.1. Sắc ký phân bố (Partition Chromatography: PC)
2.2. Sắc ký hấp phụ, có 2 loại:
+ Pha thường (Normal phase: NP-HPLC),
+ Pha ngược hay pha đảo (Reverse phase: RP- HPLC),
2.3. Sắc ký trao đổi ion (IE-HPLC) và cặp ion (IP-HPLC)
2.4. Sắc ký rây phân tử (FG-HPLC)
- Trong đó, sắc ký phân bố (SKPB) được ứng dụng nhiều nhất vì có thể phân tích
được những hợp chất từ không phân cực đến những hợp chất rất phân cực, hợp chất
ion có khối lượng phân tử không quá lớn (<3000).
- Trong 4 loại này, loại thứ 4 là chỉ để tách các chất có phân tử lượng lớn hơn 1000
đvC.
3. Ưu nhược điểm của phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao
Ưu điểm: HPLC có khả năng tách và định lượng đồng thời các chất có độ phân
cực gần nhau. Vì vậy có thể tách được các đồng phân và đồng đẳng của nhau. Các đầu dò
trong HPLC có độ nhạy cao (đầu dò UV; đầu dò huỳnh quang và điện hóa) cho phép xác
định đến nồng độ cỡ ppb (đầu dò MS). Phương pháp này cho độ tách tốt (các chất nhồi

trong cột có kích thước rất nhỏ), cột tách có thể sử dụng nhiều lần; khả năng thu hồi mẫu