NGHIÊN CỨU ĐỊNH LƯỢNG ĐỘC TỐ SINH HỌC BIỂN ASP TRONG THỦY SẢN VÀ SẢN PHẨM THỦY SẢN BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG GHÉP KHỐI PHỔ TANDEM LC-MS/MS

i

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
____________________





Đinh Đăng Huy






NGHIÊN CỨU ĐỊNH LƯỢNG ĐỘC TỐ SINH HỌC BIỂN ASP
TRONG THỦY SẢN VÀ SẢN PHẨM THỦY SẢN BẰNG PHƯƠNG PHÁP
SẮC KÝ LỎNG GHÉP KHỐI PHỔ TANDEM LC-MS/MS








LUẬN VĂN THẠC SỸ KHOA HỌC

Hà Nội - Năm 2009


i
ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
_____________________




Đinh Đăng Huy





NGHIÊN CỨU ĐỊNH LƯỢNG ĐỘC TỐ SINH HỌC BIỂN ASP
TRONG THỦY SẢN VÀ SẢN PHẨM THỦY SẢN BẰNG PHƯƠNG PHÁP
SẮC KÝ LỎNG GHÉP KHỐI PHỔ TANDEM LC-MS/MS



Chuyên ngành : Hoá phân tích
Mã số : 60 44 29

LUẬN VĂN THẠC SỸ KHOA HỌC



NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC
GS.TS. PHẠM HÙNG VIỆT



Hà Nội - Năm 2009
LỜI CẢM ƠN

Bản luận văn này được thực hiện và hoàn thành tại Trung tâm Chất
lượng Nông lâm thủy sản vùng 4, 30 Hàm Nghi – Quận 1, Thành phố HCM
với sự hướng dẫn của GS.TS. Phạm Hùng Việt.
Với lòng biết ơn sâu sắc, tôi xin trân trọng cảm ơn GS.TS. Phạm Hùng
Việt đã hướng dẫn và giúp đỡ tôi hoàn thành luận văn này.
Tôi xin chân thành cảm ơn TS. Dương Hồng Anh đã hướng dẫn, giúp
đỡ tôi trong quá trình nghiên cứ
u.
Xin chân thành cảm ơn Ban lãnh đạo Trung tâm Chất lượng Nông lâm
thủy sản vùng 4, Tập thể phòng kiểm nghiệm Trung tâm vùng 4, bạn bè và
đồng nghiệp đã quan tâm giúp đỡ tôi trong thời gian vừa qua.
Xin chân thành cảm ơn Ban lãnh đạo Trường, Khoa Hóa học, cùng các
thầy cô Trường đại học Khoa học Tự nhiên đã tận tình chỉ dạy và hướng dẫn
trong suốt quá trình học và làm luận văn.

Hà Nội, tháng 12 năm 2009

Học viên
























Đ
Đ
i

i
n
n
h
h


Đ
Đ
ă
ă
n
n
g
g


H
H
u
u
y
y




i
MỤC LỤC
MỞ ĐẦU..........................................................................................................................1

Chương 1 - TỔNG QUAN...............................................................................................4

1.1. Hiện tượng thủy triều đỏ ...................................................................................4

1.2. Độc tố sinh học biển trong thủy sản..................................................................6

1.3. Đại cương về axít domoic (DA)........................................................................8

1.3.1. Tính chất hóa lý. .......................................................................................8

1.3.2. Nguồn tích tụ DA trong nhuyễn thể: ........................................................8

1.3.3. Độc tính của DA .......................................................................................9

1.4. Một số phương pháp phân tích DA...................................................................9

1.4.1. Phương pháp sinh hóa trên chuột............................................................10

1.4.2. Phương pháp sắc ký lỏng (LC-UV, LC-DAD, LC-FLD, LC-MS/MS)..11

1.5. Ưu và nhược điểm của các phương pháp dẫn đến việc sử dụng phương
pháp LC-MS/MS trong phân tích DA.............................................................
12

1.5.1. Phương pháp sinh hóa trên chuột............................................................12

1.5.2. Phương pháp sắc ký lỏng........................................................................12

1.6. Đại cương về sắc ký lỏng hiệu năng cao ghép khối phổ

[2], [5]
........................12

1.6.1. Một số định nghĩa và phương trình cơ bản.............................................13

1.6.2. Những thành phần cơ bản của hệ thống LC-MS/MS (Waters) ..............15

1.6.3. Loại hợp chất phù hợp phân tích bằng sắc ký lỏng ................................23

1.6.4. Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình tách của các chất trong cột............23

1.7. Kỹ thuật chuẩn bị mẫu cho phân tích sắc ký...................................................26

1.7.1. Chiết lỏng - lỏng: ....................................................................................27

1.7.2. Chiết pha rắn SPE:..................................................................................27

Chương 2 – NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU..................................29

2.1. Nội dung nghiên cứu của đề tài.......................................................................29

2.2. Mô hình thực nghiệm ......................................................................................29

2.3. Thiết bị, dụng cụ, hoá chất:.............................................................................29

2.3.1. Thiết bị, dụng cụ: ....................................................................................29

2.3.2. Thuốc thử, hóa chất: ...............................................................................30

2.4. Thông tin về mẫu nghiên cứu:.........................................................................30

2.5. Xác định các thông số tối ưu:..........................................................................31

2.5.1. Xác định các thông số tối ưu cho MS.....................................................31

2.5.2. Cột:..........................................................................................................31

2.5.3. Pha động và chế độ gradient:..................................................................32

2.5.4. Dung môi chiết:.......................................................................................32

2.5.5. Thiết lập bảng mẫu: ................................................................................32

2.5.6. Tính toán :...............................................................................................33

2.5.7. Khảo sát khoảng tuyến tính: ...................................................................33

2.5.8. Giới hạn phát hiện của phương pháp:.....................................................33

2.5.9. Độ lặp lại của phương pháp:...................................................................34

2.5.10. Độ thu hồi của phương pháp:................................................................34

2.5.11. Thực nghiệm xác định DA trên mẫu nhuyễn thể..................................35

Chương 3- KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN........................................................................36

3.1. Xác định các thông số tối ưu:..........................................................................36

3.1.1. Xác định các thông số tối ưu của MS/MS ..............................................36

ii
3.1.2. Pha động và chương trình chạy gradient. ...............................................40

3.1.3. Dung môi chiết:.......................................................................................45

3.2. Khoảng tuyến tính:..........................................................................................47

3.3. Giới hạn phát hiện của phương pháp: .............................................................49

3.4. Độ lặp lại và độ thu hồi của phương pháp: .....................................................49

3.5. Thực nghiệm xác định DA trên nhuyễn thể....................................................51

3.6. Đánh giá độ tin cậy của phương pháp:............................................................52

3.7. Qui trình phân tích Axít domoic. ....................................................................54

3.7.1. Phạm vi áp dụng: ....................................................................................54

3.7.2. Nguyên tắc: .............................................................................................54

3.7.3. Thiết bị, dụng cụ, hóa chất, dung dịch:...................................................54

3.7.4. Chuẩn bị mẫu:.........................................................................................57

3.7.5. Tiến hành thử nghiệm:............................................................................58

3.7.6. Đảm bảo chất lượng................................................................................60

3.7.7. Tính toán kết quả: ...................................................................................60

KẾT LUẬN....................................................................................................................61

TÀI LIỆU THAM KHẢO..............................................................................................62

PHỤ LỤC 1: CÔNG THỨC CẤU TẠO ĐỘC TỐ SINH HỌC BIỂN...................1

PHỤ LỤC 2: MỘT SỐ SẮC KÝ ĐỒ TIÊU BIỂU KHI TỐI ƯU...........................4

PHỤ LỤC 3. ĐƯỜNG BIỂU DIỄN ĐỘ TUYẾN TÍNH ......................................13

PHỤ LỤC 4. SẮC KÝ ĐỒ CHẠY MẪU NHUYỄN THỂ 2 MẢNH VỎ...........19

PHỤ LỤC 5. SẮC KÝ ĐỒ PHÂN TÍCH MẪU NHUYỄN THỂ 2 MẢNH VỎ
………….BẰNG HPLC –UV ........................................................................
29





iii
DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT
Chữ viết tắt Tiếng Anh Tiếng Việt
DA Axít domoic Axít Domoic
DAD Diot Array Detector Đầu dò Diot Array
EU European Liên minh Châu Âu

FA Formic acid Axít Formic
FLD Fluorescence Detector Đầu dò huỳnh quang

HPLC High Performance Liquid
Chromatography
Sắc ký lỏng hiệu năng cao
LC-MS/MS Liquid Chromatograph
Tandem Mass Spectrometer
Sắc ký lỏng ghép 2 lần
khối phổ
LOD Limit of Detection Giới hạn phát hiện
LOQ Limit of Quantitative Giới hạn định lượng
NPLC Normal Phase Liquid
Chromatography
Sắc ký lỏng pha thuận
ND Not detected Không phát hiện
RPLC Reversed Phase Liquid
Chromatography
Sắc ký lỏng pha đảo
SPE Solid Phase Extraction Chiết pha rắn
TFA Trifluoroacetic acid Axít Trifluoro axetic
UV Ultra Violet Cự
c tím
VIS Visible Nhìn thấy

iv
DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng Diễn giải Trang
Bảng 01. Một số dung môi sử dụng trong HPLC .....................................................26

Bảng 02. Chi tiết mẫu thực nghiệm ..........................................................................30

Bảng 03. Kết quả khảo sát giá trị hiệu điện thế mao quản........................................36

Bảng 04. Kết quả khảo sát giá trị hiệu điện thế cone................................................37

Bảng 05. Kết quả khảo sát năng lượng va chạm.......................................................38

Bảng 06. Các Ion thứ cấp và các điều kiện tối ưu của năng lương va chạm ............39

Bảng 07. Điều kiện gradient 1– pha động 1.............................................................40

Bảng 08. Bảng gradient 2 – pha động 1....................................................................41

Bảng 09. Bảng gradient 1 – pha động 2....................................................................42

Bảng 10. Bảng gradient 2 – pha động 2....................................................................43

Bảng 11. Bảng gradient 3 – pha động 2....................................................................44

Bảng 12. So sánh cường độ tín hiệu ion 266,25 ở nồng độ 2 ppm...........................47

Bảng 13. Bảng tổng hợp thông số về độ tuyến tính theo các ion: Error! Bookmark
not defined.

Bảng 14. Kết quả xác định giới hạn phát hiện của phương pháp ............................49

Bảng 15. Kết quả phân tích độ lặp lại và độ thu hồi của phương pháp. ...................49

Bảng 16. Kết quả phân tích mẫu nhuyễn thể (tính trên Ion 266,25) ........................51

Bảng 17. So sánh kết quả phương pháp HPLC-UV và LC-MS/MS.........................53





v
DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ
Hình Diễn giải Trang
Hình 01. Sơ đồ đơn giản của hệ thống sắc ký lỏng...................................................16

Hình 02. Sơ đồ van cao áp ở vị trí nạp......................................................................17

Hình 03. Sơ đồ van cao áp ở vị trí tiêm ....................................................................17

Hình 04. Pha tĩnh của cột sắcký pha đảo. .................................................................18

Hình 05. Pha tĩnh của cột sắc ký pha thuận. .............................................................19

Hình 06. Bộ kết nối phun điện tử..............................................................................20

Hình 07. Bộ ion hóa hóa học.....................................................................................20

Hình 08. Hệ thống đầu dò tứ cực ..............................................................................22

Hình 09. Nguyên lý hoạt động của đầu dò MS/MS..................................................23

Hình 10. khả năng tách của cột C8 và C18...............................................................24

Hình 11. Ảnh hưởng của pH dung môi đến khả năng tách của chất.........................24

Hình 12. Ảnh hưởng của độ phân cực dung môi đối với quá trính sắc ký. ..............25

Hình 14. Mô hình thực nghiệm.................................................................................29

Hình 15. Sắc ký đồ ứng với giá trị tối ưu Capillary = 2 KV.....................................37

Hình 16. Sắc ký đồ tối ưu Ion mẹ ứng với giá trị tối ưu cone volt = 30 V...............38

Hình 17. Cách phân mảnh ion của DA .....................................................................39

Hình 18. Sắc ký đồ ở điều kiện Collision energy 15 eV...........................................40

Hình 19. Sắc ký đồ chạy chuẩn DA gradient 1– pha động 1....................................41

Hình 20. Sắc ký đồ chạy chuẩn DA gradient 2– pha động 1....................................42

Hình 21. Sắc ký đồ chạy chuẩn DA gradient 1– pha động 2....................................43

Hình 22. Sắc ký đồ chạy chuẩn DA gradient 2– pha động 2....................................44

Hình 23. Sắc ký đồ chạy chuẩn DA gradient 3– pha động 2....................................45

Hình 24. Sắc ký đồ chạy mẫu chiết bằng dung môi MeOH:H20: 1:1 ......................46

Hình 25. Sắc ký đồ chạy mẫu chiết bằng dung môi Formic: metanol:H20: 2:5:93..46

Hình 26. Sắc ký đồ chạy mẫu chiết bằng dung môi MeOH: H20: 2:1 .....................47

Hình 27. Đồ thị biểu diễn đường tuyến tính .............................................................48

Hình 28. Kết quả chạy mẫu nghêu tại Nam Định trên LC-MS/MS và HPLC-UV...53

Hình 29. Kết quả chạy mẫu CRM trên LC-MS/MS và HPLC-UV ..........................54




1
MỞ ĐẦU
Theo ước tính của Tổ chức nông lương (FAO), tổng kim ngạch xuất
nhập khẩu các sản phẩm thủy sản trong năm 2008 của thế giới lần đầu tiên
trong lịch sử đã vượt 100 tỷ USD. Một nửa xuất khẩu thủy sản trên thế giới

bắt nguồn từ các nước đang phát triển trong khi 80% nhập khẩu thuộc về các
nước phát triển. Xuấ
t khẩu ròng từ các nước đang phát triển đạt mức 25,4 tỷ
USD trong năm 2008. Các sản phẩm từ thủy sản là một nguồn thu ngoại tệ
quan trọng tại các nước đang phát triển. Ở Việt Nam, thủy sản ngày càng
đóng vai trò thiết yếu vào kim ngạch xuất khẩu của Việt Nam. Sau hơn 1 năm
gia nhập WTO, ngành thủy sản Việt Nam đã có một bước tiến nhảy vọt trong
công tác xuất kh
ẩu thủy sản, chỉ trong năm 2007 sản lượng thủy sản cả nước
ước đạt 3,9 triệu tấn với kim ngạch xuất khẩu 3,75 tỷ USD, trong đó sản
phẩm nhuyễn thể hai mảnh vỏ cũng chiếm một tỷ trọng đáng kể. Đến năm
2008, kim ngạch xuất khẩu thủy sản nước ta đã vượt ngưỡng 4 tỷ USD.
Một trong các thị trường nh
ập khẩu lớn của ngành thủy sản Việt Nam
là Liên minh Châu Âu (EU). Theo quy định của Ủy ban liên minh Châu Âu,
để một nước ngoài khối EU được phép xuất khẩu thủy sản vào EU phải đảm
bảo các yếu tố: (i) Hệ thống văn bản quy pham pháp luật và năng lực cơ quan
quản lý an chất lượng vệ sinh toàn thực phẩm của nước xuất khẩu và EU là
tương đương. (ii) Hệ thống phòng kiểm nghiệm tham gia vào công tác kiể
m
tra, chứng nhận chất lượng đảm bảo vệ sinh an toàn thực phẩm của nước xuất
khẩu và EU tương đương nhau. (iii) Bắt buộc phải thực hiện các chương trình
giám sát dư lượng độc hại trong thủy sản nuôi và giám sát điều kiện đảm bảo
vệ sinh vùng thu hoạch nhuyễn thể 2 mảnh vỏ. (iv) Đồng thời thủy sản phải
được phân tích các chỉ tiêu theo quy định của EU trước khi xu
ất khẩu cùng
với các đòi hỏi nghiêm ngặt về kỹ thuật phân tích.
Như vậy, thực hiện chương trình giám sát điều kiện đảm bảo vệ sinh
vùng thu hoạch nhuyễn thể 2 mảnh vỏ là một điều kiện tiên quyết giúp Việt
Nam được phép xuất khẩu nhuyễn thể hai mảnh vỏ vào EU. Hai nội dung liên

2
quan đến kỹ thuật đóng vai trò chính trong việc thực hiện chương trình này là
định danh, phân loại tảo độc (các loài tảo độc có khả năng sinh độc tố) và
phân tích độc tố sinh học biển (ASP- độc tố gây mất trí nhớ, DSP – độc tố gây
tiêu chảy, PSP – độc tố gây liệt cơ).
Dạng tồn tại chính của độc tố gây mất trí nhớ (ASP) là axit Domoic có
công thức cấu tạo:

Ngành thủy sản hiện nay đang rất cần có những qui trình phân tích phù
hợp theo yêu cầu của các thị trường nhập khẩu giúp cơ quan chức năng kiểm
soát các hóa chất độc hại nói chung và đặc biệt là các độc tố có mối nguy gắn
liền với loài (độc tố sinh học biển với loài nhuyễn thể hai mảnh vỏ, Histamine
đối với họ cá thu ngừ…). Vì vậy, cần thiết phải xây dựng qui trình phân tích
để xác
định Axít domoic trong nhuyễn nhể 2 mảnh vỏ. Ngoài một số nghiên
cứu của một số tổ chức khoa học hoặc tiêu chuẩn ở nước ngoài với phương
pháp được sử dụng xác định hàm lượng Axít domoic bằng kỹ thuật HPLC-
UV và LC/MS
n
, phương pháp sinh hóa trên chuột

thì hiện nay Việt nam chưa
có tiêu chuẩn riêng về phương pháp thử cho loại độc tố này. Vì vậy vấn đề
nghiên cứu, cải tiến phương pháp đã được nghiên cứu trên thế giới để có thể
áp dụng xác định hàm lượng DA trong nhuyễn thể hai mảnh vỏ, phù hợp với
điều kiện của Việt nam (nền mẫu phân tích, thiết bị, hóa chất môi trường … )
là rất cần thiết. Nó giúp các phòng thử nghi
ệm ứng dụng thực tế giúp cơ quan

chức năng kiểm soát chặt chẽ dư lượng độc tố này để đáp ứng yêu cầu xuất
khẩu.
Với khuôn khổ luận văn thạc sĩ chuyên ngành hóa phân tích, chúng tôi
tập trung tìm ra điều kiện phân tích tối ưu trên thiết bị LC-MS/MS hiện có tại


3
phòng thí nghiệm để “Nghiên cứu định lượng độc tố sinh học biển ASP
(Axít domoic) trong thủy sản và sản phẩm thủy sản bằng phương pháp sắc
ký lỏng ghép 2 lần khối phổ” và thực hiện phân tích trên một số mẫu nhuyễn
thể tại các vùng thu hoạch tại Việt Nam.



4
Chương 1 - TỔNG QUAN
1.1. Hiện tượng thủy triều đỏ
Trong các hệ sinh thái thủy vực, các loài vi tảo là những sinh vật sản
xuất sơ cấp đồng thời còn là nguồn dinh dưỡng chủ yếu của nhiều loài động
vật phù du, ấu trùng tôm cua, một số loài thân mềm ăn lọc và cá, v.v. Phần
lớn các loài vi tảo là có lợi cho các sinh vật thủy sinh. Tuy vậy, một phần nhỏ
trong chúng, với khoảng 100 trong tổng số trên 5.000 loài tảo phù du đã được
phát hiện trên thế giới thuộc tả
o khuê (Bacillariophyta), tảo giáp
(Dinoflagellata), các tảo có roi khác và vi khuẩn lam (Cyanobacteria) có chứa
các độc tố gây hại cho sinh vật khác.
Các loài tảo và vi khuẩn có chứa các sắc tố màu khác nhau, sống trôi
nổi, dưới những điều kiện môi trường nhất định có thể sinh trưởng thành các
quần thể to lớn ở vùng ven bờ gây nên sự đổi màu nước. Sự đổi màu nước tự
nhiên thành mầu đỏ, nâu, vàng nâu nhạt (màu hổ phách) hoặc xanh vàng ở các

vùng nước rộng lớn diễ
n ra là kết quả của sự nở hoa (Algal blooms) của các
loài vi tảo và vi khuẩn lam trong thủy vực. Ví dụ: màu đặc trưng của Biển Đỏ
gây nên bởi sự nở hoa của vi khuẩn lam Oscillatoria erythraeum có chứa các
sắc tố đỏ phycoerythrin ...
“Thủy triều đỏ” là sự sinh trưởng mạnh mẽ của các loài phù du nào đó
gây ra làm đổi màu nước. Các loài này có thể sản sinh ra độc tố gây chết tôm,
cá, thân mềm và con người ăn phải cũng bị ng
ộ độc và có thể bị tử vong.
Hiện tượng nở hoa của tảo độc hại (Harmful Algal Blooms) là các sự
kiện mà tại đó sự tăng mật độ của một hoặc một số loài tảo độc hại đạt tới
mức có thể gây nguy hại tới các sinh vật khác.
Người ta chia hiện tượng nở hoa của tảo độc hại thành một số loại sau:
a. Các loài không chứa độc t
ố nhưng khi nở hoa làm thay đổi màu
nước; dưới những điều kiện đặc biệt chẳng hạn như trong các vịnh kín, tảo nở
hoa có thể tăng đến mật độ rất cao làm chết cá và các động vật không xương
sống có trong thủy vực đó do cạn kiệt oxy. Tiêu biểu trong nhóm này là các


5
loài: Gonyaulax polygramma, Noctiluca scintillans (tảo giáp), Trichodesmium
erythraeum (tảo lam).
b. Các loài sản sinh ra các độc tố mạnh mà ta có thể phát hiện được
thông qua chuỗi thức ăn tới con người, gây nên một loạt các chứng bệnh về
thần kinh và tiêu hóa, chẳng hạn như:
Độc tố PSP (Paralytic Shellfish Poisoning) do các loài tảo giáp:
Alexandrium acatenella, A. catenella, A. cohorticula, ... sản sinh ra.
Độc tố DSP (Diarrhetic Shellfish Poisoning) do các loài tảo giáp
Dinophysis acuta, D. acuminata, D. fortii, D. norvergica, ... sản sinh ra.

Độc tố ASP (Amnesic Shellfish Poisoning) do các loài tảo khuê
Pseudonitzschia multiseries, P. pseudodelicatissima, P. australis, ... sản sinh
ra.
Độc tố CFP (Ciguatera Fish Poisoning) do các loài tảo giáp chủ yếu
sống đáy Gambierdiscus toxicus, Ostreopsis spp, Prorocentrum spp, ... s
ản
sinh ra.
Độc tố NSP (Neurotoxic Shellfish Poisoning) do các loài
Gymnodinium breve, Gymnodinium G. cf.breve (New Zealand), ... sản sinh
ra.
Độc tố Các độc tố tảo lam do các loài tảo lam Anabaena circinalis,
Mycrocystis aeruginosa, Nodularia spumigena, ... sản sinh ra.
c. Các loài không độc với người nhưng lại độc với cá và các động vật
không xương sống (đặc biệt trong các hệ thống nuôi thâm canh) do phá hủy
hoặc làm tắc các mang của chúng; bao gồm các loài tảo khuê Chaetoceros
convolutus, tảo giáp Gymnodinium mikimotoi,... gây nên.
Một vài loài tảo có thể gây độc ngay ở mật độ thấp chưa làm thay đổi
màu nước, chẳng h
ạn như loài Alexandrium tamarense, các độc tố PSP được
phát hiện trong thân mềm khi mật độ của loài này thấp hơn 10
3
tế bào/lít,
trong khi các tảo khác thường gây hại khi chúng xuất hiện ở các mật độ cao
hơn, làm thay đổi màu nước và kết quả là gây nên thủy triều đỏ. Loài


6
Gyrodinium aureolum gây chết cá và các động vật đáy ở mật độ cao hơn 10
7

tế bào/lít (Andersen, 1996).
Những tác hại do tảo độc hại nở hoa gây nên là rất lớn. Người ta đã
thống kê được từ tháng 9/1988 đến tháng 3/1989 tại các vịnh Villareal,
Carigara và vùng Samar (Philippin) đã có 45 người bị ngộ độc, trong đó có 6
người chết. ở vịnh Manila từ năm 1988 đến nay đã có 672 trường hợp bị ngộ
độc, trong đó có 101 người chết. Năm 1989 ở vịnh False (Nam Phi) loài
Gymnodinium sp. nở hoa đã làm chết khoảng 40 tấn bào ng
ư. ở Monte
Hermosa (Achentina) từ ngày 11 đến ngày 17/11/1995 tảo độc nở hoa đã làm
chết khoảng 45 triệu con ngao (Mesoderma macroides).
Theo thống kê của Fukuyo (1992), các loài tảo độc hại nở hoa ở biển
Seto Inland (Nhật Bản) đã gây nên những thiệt hại về kinh tế rất lớn; cụ thể là
từ năm 1987 đến năm 1991 ở khu vực này đã xuất hiện 745 lần tảo nở hoa
trong đó có 46 lần gây chết cá hàng loạt vớ
i tổng số thiệt hại là 4.452 triệu
yên, v.v.
Ở Việt Nam, một số lần tảo độc hại nở hoa làm thiệt hại về kinh tế đã
được ghi nhận: vào tháng 5, 6/1995 tảo Noctiluca scintillans nở hoa ở khu vực
vịnh Văn Phong – Bến Gỏi thuộc vùng biển Khánh Hoà đã làm chết khoảng
20 tấn tôm hùm với thiệt hại ước tính khoảng 6 tỷ đồng (Nguyen Ngoc Lam et
al., 1996).
1.2. Độc tố sinh học biển trong thủy sản
a. Độc tố sinh học biển trong nhuyễn thể có nguồn gốc từ sinh vật phù
du. Thông qua đường thức ăn của nhuyễn thể, độc tố được tích tụ hoặc
chuyển hóa trong cơ thể nhuyễn thể, bao gồm:
Độc tố gây liệt cơ (paralytic shellfish poisonings - PSP): có khoảng 20
loại là các dẫn xuất của saxitoxin. Liều lượng gây chết cho người là từ 0,1 tới
1 mg. Các độc tố PSP bền với nhiệt và có thể tan trong n
ước.

7
Độc tố gây tiêu chảy (Diarrheic shellfish poisoning –DSP) là nhóm độc
tố có khối lượng phân tử lớn, bao gồm axit okadaic, dinophysis,
pectenotoxins và yessotoxin.
Độc tố gây mất trí nhớ (Amnesic shellfish poisoning - ASP) gây lên bởi
domoic axit. Domoic axit thường được phát hiện tại hàm lượng thấp ở trong
rất nhiều loài tảo đỏ (Chondria armata, Alsidium corallinum và Digenea
simplex).
Độc tố thần kinh (Neurotoxin Shellfish Poisoning - NSP) bao gồm các
đồng phân của brevetoxin. Các phân tử này có thể tan trong mỡ.
Tất cả các loài nhuyễn thể (loài thân mềm ăn thức ăn bằng phươ
ng thức
màng lọc) đều có nguy cơ bị nhiễm độc tố. Tuy nhiên, chúng thường thấy ở
một số loài sau: PSP thường có trong vẹm, nghêu, sò, điệp; DSP thường có
trong vẹm, trai, điệp; ASP thường chỉ có trong vẹm, NSP thường có trong
trai, vẹm.
b. Khi con người ăn nhuyễn thể 2 mảnh vỏ đã bị tích tụ độc tố có thể gây
ra nhiều triệu chứng nhưng các triệu chứng này tùy thuộc vào loại độc t
ố, hàm
lượng độc tố trong nhuyễn thể và lượng nhuyễn thể mà chúng ta ăn vào cơ
thể. Các triệu chứng:
Gây ra bởi PSP: phần lớn sẽ ảnh hưởng đến hệ thần kinh, bao gồm: tê liệt
cơ, nói ngọng, khó thở, mẩm ngứa, sốt, mệt mỏi.
Gây ra bởi DSP: gây ra các triệu chứng rối loạn tiêu hóa, ví dụ: nôn mửa,
tiêu chảy, đau bụng, đối với trẻ em thì kèm theo các dấu hiệ
u như sốt, đau
đầu.
Gây ra bởi ASP: tương tự như DSP độc tố ASP cũng gây ra các triệu
chứng nôn mửa, tiêu chảy, đau bụng đồng thời kèm theo các triệu chứng đối

với hệ thần kinh (lẫn, mất trí nhớ, tai biến mạch máu, hôn mê)
Gây ra bởi NSP: Giải phóng Na
+
trong quá trình vận chuyển ion vào
trong tế bào dẫn tới việc không điều chỉnh được Na
+
vào trong tế bào làm
thay đổi đặc tính của tế bào, gây ra sự giải phóng thần kinh phá huỷ
Acetylcholine gây co cơ.


8
1.3. Đại cương về axít domoic (DA)
1.3.1. Tính chất hóa lý.
DA là chất bột màu trắng, nóng chảy ở nhiệt độ 223-224
o
C, tan tốt trong
nước (8mg/ml), tan ít trong metanol (0.6mg/ml).
Tên đầy đủ: ([2S-[2α,3β,4β (1Z,3E,5R)]]-2-Carboxy-4-(5-carboxy-1-
methyl-1,3-hexadienyl)-3- pyrrolidineacetic acid)
Công thức phân tử: C
15
H
21
NO
6
:
Công thức cấu tạo:

Trọng lượng phân tử: 311.34 g/mol.

Độ tan trong nước là 8 mg/ml ở 25
o
C, trong Metanol là 0.6 mg/ml.
Nhiệt độ nóng chảy từ 223-224
o
C.
1.3.2. Nguồn tích tụ DA trong nhuyễn thể:
DA được phát hiện đầu tiên từ loài tảo đỏ lớn Chondria ớ phía nam
Nhật Bản (Take moto and Daigo, 1958). Tuy nhiên đến năm 1987 nó lại bùng
phát tại Canada do loài Pseudo-nitzschia sinh ra (Perl et all.., 1990).
Pseudo-nitzschia phân bố rộng khắp trong nước biển trên thế giới, ở cả
khí hậu ấm và khí hậu lạnh. Tảo nở hoa tăng lên khi thời tiết chuyển từ mùa
xuân sang mùa thu khi có mưa rào và dồi dào chất giúp cho quá trình tăng
trưởng [B. Jeffery*, T. Barlow, K. Moizer, S. Paul, C. Boyle1]. Ngoài ra cùng
v
ới việc tốc độ gió và dòng nước thấp giúp cho việc tăng sự tích tụ tảo trên
vùng nước mặt ấm.
DA được tìm thấy trong các loài nhuyễn thể như sò (Cerastoderma
edule), cua (Cancer magister), nghêu (Scrobicularia plana), trai (Mytilus


9
edulis), razor clams (Siliqua patula) and điệp (Pecten maximus) [Wekell et al.,
1994; Rhodes et al., 1998; Vale and Sampayo, 2001].
DA bị tích tụ trong nhuyễn thể do cơ chế ăn kiểu màng lọc nên có thể
trực tiếp các loài tảo độc hoặc các vi sinh vật đã có hàm lượng DA bị tích tụ
trong NT2MV, hàm lượng độc tố ở hệ thống tiêu hóa của nhuyễn thể cao hơn
so với ở cơ thịt, tốc độ tích tụ DA trong nhuyễn thể cũng rất khác nhau giữa
các loài nhuyễn thể [Vale and Sampayo, 2001; Hay et al., 2000], Kh
ả năng

chuyển hóa DA trong nhuyễn thể là rất thấp.
Khi nhuyễn thể đã bị tích tụ độc tố sinh học biển, ta có thể nuôi lưu
(nuôi ở trong môi trường nước biển sạch) thì có thể làm giảm hàm lượng độc
tố. Ví dụ, theo nghiên cứu của (Novaczek, 1992): 50% hàm lượng DA trong
loài vẹm xanh được rửa giải trong vòng 24 h nuôi lưu, trong khi đó phải mất
86 ngày để rửa giải 50% DA trong razor clams (Siliqua patula) (Horner et al.,
1993)
1.3.3. Độc tính của DA
LD
50
của DA khoảng 2,3 mg/kg khối lượng cơ thể theo nghiên cứu của
Iverson và các cộng sự (1989).
Quy định của các thị trường nhập khẩu (Canada, Mỹ, Châu Âu, Úc...) và
Việt Nam quy định mức giới hạn tối đa cho phép trong nhuyễn thể là 20 µg
DA/g thịt nhuyễn thể (20ppm), khi kết quả phân tích vượt mức trên sẽ bị đình
chỉ vùng thu hoạch và lấy mẫu tăng cường để kiểm tra chỉ tiêu này.
1.4. Một số phương pháp phân tích DA
Dựa vào tính chất và cấu trúc của Axít domoic (DA), hiện nay trên thế
giới đã có một số phương pháp xác định trong các nền mẫu khác nhau (nước
biển, tảo, nhuyễn thể hai mảnh vỏ...) như: sinh hóa trên chuột (mouse
bioassay), sắc ký lỏng với đầu dò UV-VIS, huỳnh quang (HPLC-UV/FLD)
hoặc LC-MS/MS.


10
Tuy nhiên tại Việt Nam, hiện chưa có một tiêu chuẩn hoặc phương pháp
nào đề cập đến việc phân tích DA ngoại trừ một số qui trình tự xây dựng của
một số phòng kiểm nghiệm.
Sau đây là một số phương pháp điển hình, phù hợp đáp ứng được phân
tích dư lượng DA trong thủy sản và sản phẩm thủy sản:

1.4.1. Phương pháp sinh hóa trên chuột
Pha loãng dung dịch chuẩn ASP ở một s
ố nồng độ tăng dần bằng nước
vô trùng và tiêm vào màng bụng một số con chuột, tiêm mỗi con 1 ml cho đến
khi xác định được nồng độ gây chết chuột trong khoảng thời gian từ 5 đến 7
phút. Lưu ý: kiểm tra pH của các dung dịch trước khi tiêm. pH của dung dịch
phải nằm trong khoảng từ 2-4, không được lớn hơn 4,5.
Từ nồng độ được chọn, pha loãng thêm hai nồng độ mới bằng cách
thêm hay bớt 1 ml nướ
c vô trùng so với thể tích ban đầu. Thí dụ nếu 10ml
chuẩn được pha loãng với 25ml nước vô trùng thì khi pha thêm hai dung dịch
mới sử dụng thể tích nước vô trùng là 24ml và 26ml.
Tiêm mỗi nồng độ chuẩn pha loãng thu được ở bước trên vào một
nhóm gồm 10 chuột (10 chuột/ một nồng độ), mỗi con chuột 1ml dung dịch.
Xác định thời gian gây chết chuột tính từ thời điểm tiêm xong đến thời điểm
tim chuột đập lần cu
ối cùng.
Lặp lại qui trình trên 1 hoặc 2 ngày sau đó với dung dịch chuẩn làm
việc mới được chuẩn bị.
Tính thời gian gây chết trung bình của mỗi nhóm 10 chuột ứng với mỗi
độ pha loãng. Loại bỏ các độ pha loãng có thời gian gây chết chuột trung bình
nhỏ hơn 5 phút hoặc lớn hơn 7 phút. Từ thời gian gây chết chuột thu được, tra
bảng Sommer’s, để xác định hàm lượng độc tố tính theo đơn vị MU trong
1ml dung dịch (MU/ml) ứ
ng với mỗi độ pha loãng. Tính hệ số chuyển đổi CF
(hệ số chuyển đổi giữa lượng độc tố tính bằng µg và tính bằng MU) cho mỗi
độ pha loãng bằng cách chia nồng độ của dung dịch (µg/ml) với số đơn vị độc
tố tính theo MU vừa tra (MU/ml). Đơn vị của CF sẽ là µg/MU

11
Tính giá trị trung bình của các hệ số CF thu được ở trên. Sử dụng hệ số
CF này trong tính kết quả.
Hệ số chuyển đổi CF cần được kiểm tra thường xuyên, việc kiểm xoát
lại hệ số chuyển đổi CF được thực hiện bằng cách chích vào 5 con chuột dung
dịch chuẩn đã pha loãng sao cho thời gian gây chuột chết nằm trong khoảng
5-7 phút. Xác định hệ số CF và so sánh với CF tham chiếu đã xác định đượ
c
trước đó. Sự sai lệch phải nằm trong khoảng ± 20 %. Nếu sự sai lệch vượt
khoảng này, tiêm thêm 5 con chuột và bổ sung vào 5 con chuột đã chích trước
đó để có nhóm chuột gồm 10 con, chọn và chích thêm nhóm chuột thứ hai
gồm 10 con với cùng nồng độ dung dịch chuẩn như nhóm 1. Tính hệ số CF
của 2 nhóm chuột và tính CF trung bình. Hệ số CF thu được này được xem
như giá trị CF mới sử dụng trong tính kết quả, vì độ
lệch nằm ngoài khoảng ±
20 % có khả năng do kỹ thuật hoặc do sự thay đổi đáp ứng của giòng chuột
đối với độc tố. Sư thay đổi này đòi hỏi phải thay đổi hệ số CF [Sổ tay phương
pháp của Trung tâm Chất lượng Nông lâm thủy sản vùng 4, 2009].
1.4.2. Phương pháp sắc ký lỏng (LC-UV, LC-DAD, LC-FLD, LC-
MS/MS)


Thường mẫu được ly trích bằng một dung môi hữu cơ và được làm
sạch bằng cách cho qua cột chiết pha rắn (nếu cần). Sau đó, dịch chiết được
làm sạch và được hòa tan trong dịch pha động tiêm vào hệ thống HPLC với
các đầu dò UV, PDA, FLD hoặc MS/MS. Đối với đầu dò huỳnh quang FLD,
sau khi qua cột phân tích DA được cho phản ứng với một chất phù hợp để tạo
thành hợp chất có tính chất huỳnh quang trước khi vào
đầu dò.
Dựa vào ái lực của các cấu tử giữa pha tĩnh (pha đảo hoặc pha thuận)

thường là chất rắn và pha động (lỏng) mà mỗi cấu tử sẽ được rửa giải ra khỏi
cột theo thứ tự khác nhau. Cấu tử ra khỏi cột được đưa vào đầu dò UV,
PDA/DAD (Photo Diot Array detecter) hoặc đầu dò khối phổ MS/MS. Đối
với đầu dò UV hay DAD bên cạnh việc phát hiện bởi tín hiệu bị dung môi
chứ
a cấu tử rửa giải hấp thụ ở một bước sóng nhất định để định lượng. Đối


12
với đầu dò khối phổ cấu tử ra khỏi cột được đưa vào đầu dò MS và ở đây cấu
tử được ion hóa, phân mảnh và được phát hiện dựa vào thông số m/z. Trên cơ
sở này nên đầu dò MS có thể định danh và định lượng một cách rõ ràng,
khẳng định về một hợp chất nào đó.
1.5. Ưu và nhược điểm của các phương pháp dẫn đến việc sử dụng
phương pháp LC-MS/MS trong phân tích DA
1.5.1. Phương pháp sinh hóa trên chuột


Phương pháp sinh hóa trên chuột có ưu điểm là thực hiện nhanh, đơn
giản, dễ làm, có thể thực hiện với số lượng mẫu lớn, đầu tư ban đầu ít (về
nhân lực, thiết bị, hóa chất, dụng cụ), đối với phân tích độc tố thì phương
pháp sinh hóa trên chuột đang được chọn là một trong các phương pháp kiểm
khẳng định. Tuy nhiên đối với các loại độc tố có nhiều
đồng phân thì không
thể phân biệt được hàm lượng của từng loại độc tố (ví dụ DSP, PSP có nhiều
hợp chất cùng nhóm). Ngoài ra, tại một số nước luật pháp không cho phép
làm các thử nghiệm trên động vật.
1.5.2. Phương pháp sắc ký lỏng

Phương pháp sắc ký lỏng có ưu điểm là một phương pháp khá nhạy và

có tính chọn lọc rất cao, có thể định lượng và khẳng định ngay mà chi phí
phân tích ở mức trung bình. Tuy nhiên phương pháp lại khó có thể phát triển
để phân tích thêm các nhóm chất độc tố sinh học biển khác như DSP, PSP với
mức giới hạn cho phép thấp (ppb).

Với những tồn tại của các phương pháp trên đới với DA thì việc cần có
một phương pháp khác như phương pháp LC-MS/MS riêng cho DA và có thể
phát triển để định lượng DSP, PSP cùng với việc dễ dàng áp dụng cho hầu hết
các phòng kiểm nghiệm về an toàn thực phẩm và đáp ứng đủ yêu cầu đề ra
của các tiêu chuẩn quốc tế cũng như yêu cầu trong nước là vô cùng cần thiết.
1.6. Đại cương về
sắc ký lỏng hiệu năng cao ghép khối phổ
[2], [5]


13
Sắc ký lỏng là một trong những kỹ thuật phân tích dụng cụ liên quan
đến quá trình tách các chất khác nhau trong cùng một mẫu ra khỏi nhau. Kỹ
thuật này cho phép người phân tích nhận danh và định lượng từng cấu tử
trong mẫu thông qua các dung dịch chuẩn và phổ đồ tương ứng của chúng.
1.6.1. Một số định nghĩa và phương trình cơ bản
1.6.1.1. Chiều rộng pic

Chiều rộng pic được đo bằng cách mở rộng hai bên pic xuống
đường
nền và đo chiều rộng ở đường nền. Tuy nhiên, người ta thường đo tại bán
chiều cao picvì thực hiện dễ dàng và có độ tin cậy cao hơn.
1.6.1.2. Thời gian lưu (tr) và thời gian lưu hiệu chỉnh (tr’)

Thời gian lưu là tổng thời gian hợp chất trong pha động và pha tĩnh, có

đơn vị đo thường dùng là phút. Tại một nhiệt độ cột và tốc độ dòng cố định,
mỗi hợp chất tốn cùng một thời gian trong pha động. Thời gian trong pha
động được xác định bằng cách tiêm một hợp chất không bị lưu lại vào hệ
thống HPLC và đo thời gian lưu của nó. Thời gian lưu này được gọi là th
ời
gian chết của cột và biểu thị là t
m
hoặc t
o
.
Bởi vì mỗi hợp chất tiêu tốn cùng thời gian trong pha động, sự khác
nhau trong thời gian lưu là do bởi sự khác nhau thời gian tiêu tốn trong pha
tĩnh. Nếu lấy thời gian lưu của một hợp chất trừ thời gian chết của cột (t
m
) ta
sẽ có được thời gian tiêu tốn thật sự của một hợp chất trong pha tĩnh, giá trị
này được gọi là thời gian lưu hiệu chỉnh (t
r
’) và được tính bởi:
t
r
’ = t
r
- t
m
(0.1)
Trong đó:
t
r
: thời gian lưu

t
m
: thời gian của pic không bị giữ lại hay thời gian chết của cột
1.6.1.3. Tỷ số phân bố

Tỷ số phân bố k hay hệ số chứa (k’) cho biết thời gian một hợp chất
nằm trong pha tĩnh bao lâu so với hợp chất khác. Nếu k = 0 thì ta nói là
hợp chất không bị lưu giữ.


14
m
mr
t
tt
k
−
=
(0.2)
Tỷ số phân bố phản ánh độ lớn thật sự lưu giữ hợp chất hơn thời
gian lưu.
1.6.1.4. Hằng số phân bố (KD)

Hằng số phân bố được định nghĩa là tỷ số nồng độ của hợp chất
trong pha tĩnh và pha động.
m
s
D
C
C

K =
(0.3)
C
s
: Nồng độ hợp chất trong pha tĩnh
C
m
: Nồng độ hợp chất trong pha động
Hằng số phân bố rất tiện lợi để mô tả và dự đoán những thay đổi
khả năng lưu giữ dựa trên thay đổi kích cỡ và nhiệt độ cột.
1.6.1.5. Hiệu năng cột

Hiệu năng tách của cột được biểu diễn bởi số đĩa lý thuyết (n).
⎟
⎟
⎠
⎞
⎜
⎜
⎝
⎛
=
⎥
⎦
⎤
⎢
⎣
⎡
=
b

r
h
r
W
t
W
t
n 16545,5
2
(0.4)
W
b
= 1,699W
h
: chiều rộng pic tại đáy
t
r
: thời gian lưu của pic
W
h
: Chiều rộng pic tại nửa chiều cao (cùng đơn vị với t
r
)
Ngoài ra còn dùng số đĩa lý thuyết hiệu dụng N
2
'
2
'
16545,5
⎥

⎦
⎤
⎢
⎣
⎡
=
⎥
⎦
⎤
⎢
⎣
⎡
=
b
r
h
r
W
t
W
t
N
(0.5)
Một đại lượng khác dùng để đo hiệu năng của cột là tương đương
chiều cao của một đĩa lý thuyết (h hoặc HETP).
n
L
h =
(0.6)
n : tổng số đĩa lý thuyết

L : chiều dài của cột (mm)


15
1.6.1.6. Hệ số

tách

(α)
Còn được gọi là độ chọn lọc, cho biết khoảng cách giữa 2 pic.
1
2
k
k
=
α
(0.7)

k
1
: tỷ số phân bố của pic giải hấp trước
k
2
: tỷ số phân bố của pic giải hấp sau
1.6.1.7. Độ phân giải (R)
Độ phân giải dùng để đánh giá khả năng tách giữa 2 chất
⎟
⎟
⎠
⎞

⎜
⎜
⎝
⎛
−
−
=
21
12
18,1
hh
rr
WW
tt
R
(0.8)
t
r1
: thời gian lưu của pic 1
t
r2
: thời gian lưu của pic 2
W
h1
: chiều rộng ở bán chiều cao của pic 1 (cùng đơn vị với t
r
)
W
h2
: chiều rộng ở bán chiều cao của pic 2 (cùng đơn vị với t

r
)
Khi độ phân giải R ≥ 1,5 thì 2 chất tách hoàn toàn khỏi nhau.
1.6.2. Những thành phần cơ bản của hệ thống LC-MS/MS (Waters)
Hệ thống gồm 7 phần chính:
 Hệ thống bơm (Pump system)
 Hệ thống tiêm mẫu (Injection system)
 Buồng cột (Column ovent - điều chỉnh nhiệt độ cột)
 Cột sắc ký (pha tĩnh – stationary phase)
 Pha động (mobile phase – (hỗn hợp) dung môi)
 Đầu dò khối phổ (Detector)

Hệ thống xử lý dữ liệu


16
Hình 01. Sơ đồ đơn giản của hệ thống sắc ký lỏng
1.6.2.1. Hệ thống bơm
Đặc điểm và yêu cầu của một hệ thống bơm cao áp:
- Áp suất có thể đạt đến 1000 bar (15.000 Psi)
- Có thể điều chỉnh tốc độ dòng trong khoảng 0,01 – 10 ml/min
- Thể tích chết nhỏ
- Trơ với dung môi của pha động
- Có thể trộn 2 hay nhiều dung môi v
ới nhau
1.6.2.2. Hệ thống tiêm mẫu:
a. Đặc điểm và yêu cầu của một hệ thống tiêm mẫu:
- Có tác dụng tiêm mẫu
- Tự động tắt khi áp suất cao
- Có thể bơm tuần hoàn mẫu

b. Cấu tạo và sơ đồ hoạt động của van cao áp:
- Vị trí nạp: mẫu được nạp vào ống chứa mẫu
Hình 02
- Vị trí tiêm: van cao áp xoay 1 góc 60
o
và dung môi sẽ đẩy mẫu ở
sample loop theo đường ống và đi vào cột (
Hình 03)


17

Hình 02. Sơ đồ van cao áp ở vị trí nạp

Hình 03. Sơ đồ van cao áp ở vị trí tiêm
1.6.2.3 Buồng cột
Dùng để ổn định nhiệt độ cột và dung môi qua cột trong quá trình phân
tích
1.6.2.4. Cột sắc ký

Là một loại cột đặc biệt được nhồi đầy bằng các hạt nhồi (pha tĩnh), kích
thước cột: Dài (L): 5-30cm, đường kính trong: 2-5mm, kích cỡ hạt: 1.7, 3, 5,