ĐÁNH GIÁ HIỆU QUẢ PHÂN TÍCH e.COLI và COLIFORMS TRONG THỦY hải sản BẰNG PHƯƠNG PHÁP NUÔI cấy

Mục Lục
Mục Lục 1
DANH SÁCH CÁC BẢNG 3
DÁNH SÁCH CÁC HÌNH 4
Chương 1 5
MỞ ĐẦU 5
1.1 Đặt vấn đề 5
1.2 Mục đích và yêu cầu 6
1.2.1 Mục đích 6
1.2.2 Yêu cầu 6
Chương 2 7
TỔNG QUAN TÀI LIỆU 7
2.1 Đại cương về E. coli và coliformss 7
2.1.1 Đại cương về E. coli 7
2.1.2 Đại cương về coliforms [2, 6, 12] 11
2.2 Giới thiệu đại cương về tôm sử dụng trong chế biến thực phẩm [10, 3] 12
2.2.1 Thành phần hóa học và giá trị dinh dưỡng 12
2.2.3 Ảnh hưởng của việc nhiễm vi sinh vật [1, 6] 15
Chương 3 17
VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 17
3.1 Thời gian và địa điểm thực hiện 17
3.1.1 Thời gian: 17
3.1.2 Địa điểm: 17
3.2 Vật liệu 17
3.2.1 Mẫu 17
3.2.2 Thiết bị và dụng cụ 17
3.3 Môi trường và thuốc thử 18
3.3.1 Môi trường 18
3.3.2 Thuốc thử : 21
3.4 phương pháp thí nghiệm 22
3.4.1 Phương pháp pha loãng theo dãy thập phân 22

3.4.2 Kỹ thuật lấy mẫu 22
3.4.3 Kỹ thuật chuẩn bị ống thạch nghiêng và đổ đĩa 23
3.4.4. Kỹ thuật cấy giống 23
3.4.5 Kỹ thuật cấy phân lập 24
3.5 Phương pháp phân tích 24
3.5.1 Định lượng Coliorms bằng phương pháp điếm khuẩn lạc 24
3.5.2 Định lượng E. coli bằng phương pháp đếm khuẩn lạc 27
3.5.3 Phương pháp định tính E. coli 29
Chương 4 31
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 31
4.1 Xác định mật độ coliforms trong dịch tăng sinh và giới hạn phát hiện E. coli khi thực hiện
trên chủng vi sinh vật thuần khiết 31
4.1.1 Phân lập chủng 31
4.1.2 Xác định mật độ Coliforms trong các độ pha loãng 33
4.1.3 Xác định giới hạn định tính E. coli 34
4.2 Xác định khả năng đinh lượng các dòng coliforms và khả năng định tính E. coli trên
sản phẩm thủy hải sản 35
1
4.2.1 Xác định khả năng định lượng các dòng coliforms khác nhau trên sản phẩm tôm
Amaebi 35
4.2.2 Xác định khả năng định tính E. coli trên sản phẩm tôm Amaebi 36
4.3 Khảo sát sự ảnh hưởng của việc đông lạnh mẫu đến kết quả đinh lượng Coliforms và định
tính E. coli 37
4.3.1 Ảnh hưởng của sự đông lạnh mẫu đến kết quả định lượng coliforms 38
4.3.2 Ảnh hưởng của sự đông lạnh mẫu đến kết quả định tính E. coli 39
Chương 5 39
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 39
5.1 Kết luận 39
5.2 Đề nghị 40
2

DANH SÁCH CÁC BẢNG
Bảng 2.1: Biểu hiện sinh hóa của E. coli 9
Bảng 2.2: Đặc điểm sinh hóa của các giống trong nhóm coliforms phân 12
Bảng 4.1: Biểu hiện sinh hóa của 3 chủng Coliforms được phân lập 31
Bảng 4.2. Kết quả định lượng các chủng thuần C1 và C2 trong các độ pha loãng 33
Bảng 4.3: Kết quả phát hiện E. coli trong các độ pha loãng khác nhau 34
Bảng 4.4: Kết quả định lượng chủng C1 và C2 sau khi nhiễm vào sản phẩm tôm Amaebi 35
Bảng 4.5: Kết quả định tính E. coli sau khi nhiễm vào sản phẩm tôm Amaebi 36
Bảng 4.6. Kết quả định lượng chủng C1 và C2 38
Bảng 4.7. Kết quả khảo sát sự định tính E. coli trong tôm Amaebi đông lạnh và không đông
lạnh 39
3
DÁNH SÁCH CÁC HÌNH
Hình 2.1: Hình dạng E. coli bắt màu hồng nhìn dưới kính hiển vi điện tử 8
Hình 2.3: Vi khuẩn E. coli biểu hiện dương tính trong môi trường BGBL 9
Ống 1 (+), Ống 2 (-) 9
12
Hình 2.4: Hình dạng Coliforms nhìn dưới kính hiển vi điện tử 12
Hình 3.1: Hình dạng Coliforms trên môi trường VRB 26
Hình 3.2: Hình dạng E. coli trên môi trường EMB 28
Hinh 3.3: Kết quả thử nghiệm sinh hóa E. coli 29
Hình 4.1: Các thử nghiệm sinh hoá trong nghiệm pháp IMViC 32
Ống 1(Indol), Ống 2 (MR), Ống 3 (VP), Ống 4 (Citrate) 32
Hình 4.2: Dấu hiệu dương tính E. coli trong môi trường tăng sinh sinh chọn lọc BGBL ống 1,
2, 3 , 4 (+), ống 5 (-) 37
Biểu đồ 4.1: Kết quả định lượng Coliforms trong mẫu đông lạnh và không đông lạnh 38
4
Chương 1
MỞ ĐẦU
1.1 Đặt vấn đề

Trong thời đại ngày nay, mọi quốc gia trên thế giới đều xem việc kiểm soát chất
lượng ATVSTP là mối quan tâm hàng đầu, vì chất lượng thực phẩm nói chung,
ATVSTP nói riêng, không những có ảnh hưởng trực tiếp đến tình trạng sức khỏe của
con người, mà còn là nguồn động lực quyết định sự phát triển của toàn nhân loại, có
liên quan mật thiết đến sự phồn vinh của nền kinh tế và sự hưng thịnh của các hoạt
động: thương mại, văn hóa, an ninh, chính trị, xã hội và đối với sự trường tồn của một
quốc gia. Các loại thực phẩm có chất lượng cao, cân đối dinh dưỡng, an toàn về mặt vệ
sinh, sẽ là tiền đề vô cùng quan trọng trong việc bảo vệ sức khỏe cho con người nói
riêng và quá trình phát triển một đất nước nói chung.
Từ đó cho thấy, chất lượng thực phẩm, đặc biệt là chất lượng an toàn thực phẩm
về phương diện Vi sinh vật luôn là một trong những vấn đề được nhà nước cũng như
các bộ ngành hết sức quan tâm, đặc biệt hơn là ở người tiêu dùng. Một trong những chỉ
tiêu mà chúng ta đang quan tâm hiện nay là số lượng E. coli và coliforms có trong thực
phẩm nói chung và thực phẩm từ thủy hải sản nói riêng, với sự hiện diện một số lượng
nhất định của chúng trong thực phẩm, sẽ phản ánh thực phẩm đó mất an toàn cho
người sử dụng. Vì vậy phương pháp dùng trong phân tích các vi sinh vật này cần phải
cho kết quả chính xác. Do đó việc nghiên cứu đánh giá hiệu quả phân tích của phương
pháp dùng trong quá trình kiểm tra là một việc làm có ý nghĩa thực tiễn, nhằm để xác
định được mức độ tin cậy của phương pháp mà các phòng thí nghiệm đang sử dụng.
Xuất phát từ những vấn đề trên và được sự đồng ý của Bô môn Công nghệ Sinh học
trường Đại học Nông lâm, TP. HCM cùng với sự hướng dẫn của thầy
ThS. Nguyễn Tiến Dũng, chúng tôi thực hiện khóa luận tốt nghiệp với đề tài: “ĐÁNH
GIÁ HIỆU QUẢ PHÂN TÍCH E. COLI VÀ COLIFORMS TRONG THỦY HẢI SẢN
BẰNG PHƯƠNG PHÁP NUÔI CẤY”
5
1.2 Mục đích và yêu cầu
1.2.1 Mục đích
Đề tài nhằm góp phần tìm hiểu và đánh giá hiệu quả phân tích E. coli và
Coliforms trong THS bằng phương pháp nuôi cấy. Đây là một trong những phương
pháp được các phòng thí nghiệm sử dụng hiện nay.

1.2.2 Yêu cầu
Nội dung khoá luận nhằm:
- Xác định giới hạn định lượng, giới hạn phát hiện của phương pháp phân tích
E. coli và coliforms.
- Xác định khả năng định lượng các dòng coliforms khác nhau và định tính
E. coli trên sản phẩm tôm Amaebi.
- Khảo sát sự ảnh hưởng của việc đông lạnh mẫu đến kết quả đinh lượng
coliforms và định tính E. coli
6
Chương 2
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1 Đại cương về E. coli và coliformss
2.1.1 Đại cương về E. coli
2.1.1.1 Lịch sử phát hiện và vị trí phân loại
- Lịch sử phát hiện [5, 7]
Năm 1885, vi khuẩn do Theodor Escherich phát hiện từ trong tã lót của các trẻ
em bị bênh tiêu chảy và được đặt tên đầu tiên là Bacterium colicommune.
Năm 1889, vi khuẩn này được giới chuyên môn đổi tên thành Escherich nhằm tri
ân người có công khám phá.
Năm 1895, chúng được liệt kê vào giống Bacillus.
Năm 1896, chúng được đặt tên là Bacterium coli.
Sau nhiều tên gọi khác nhau, đến năm 1991, vi khuẩn này được định danh thống
nhất toàn cầu.
Escherichia coli và đây cũng là tên khoa học
- Vị trí phân loại: [8]
Vi khuẩn Escherichia coli có vị trí phân loại như sau:
• Ngành: Proteobacteria.
• Lớp: Gamma Proteobacteria.
• Bộ: Enterobacteriales.
• Họ: Enterobactericeae.

• Giống: Escherichia.
• Loài: E. coli.
- Đặc điểm phân bố: [2, 5]
Vi khuẩn E. coli có nhiều trong đường ruột của động vật ăn thịt, ăn tạp hơn là
động vật ăn cỏ. Ngoài ra vi khuẩn này có thể tồn tại và phân bố rộng rãi ngoài môi
trường tự nhiên, vì loài vi khuẩn này có thể sống được trong bụi, phân, nước từ vài
tuần đến vài tháng.
Do sự phân bố rộng rãi trong tự nhiên nên E. coli dễ dàng nhiễm vào thực phẩm
từ nguyên liệu hay thông qua nguồn nước trong quá trình sản xuất, chế biến.
7
2.1.1.2 Đặc điễm hình thái [7, 11]
E. coli là trực khuẩn hình gậy nhỏ, gram âm bắt màu hồng, kích thước dài hay
ngắn tùy thuộc vào môi trường nuôi cấy trung bình 2 - 3 x 0,5µm, hai đầu tròn, có lông
quanh tế bào, đứng riêng lẻ đôi khi xếp thành chuỗi ngắn, di động không hình thành
nha bào, trong bệnh phẩm có khi bắt màu lưỡng cực hai đầu.
Hình 2.1: Hình dạng E. coli bắt màu hồng nhìn dưới kính hiển vi điện tử
2.1.1.3 Đặc điểm nuôi cấy
E. coli là vi khuẩn hiếu khí và kị khí tùy tiện, nhiệt độ phát triển thích hợp nhất là
37
0
C, pH thích hợp là 7,2 - 7,4 nhưng cũng có thể phát triển ở 44
0
C. Mọc tốt trên môi
trường dinh dưỡng thông thường, chịu được nhiệt độ biến thiên từ 4 - 45
0
C.
Đặc điểm phát triển trên môi trường chuyên biệt: [6, 8]
- Trên môi trường EMB (Eosin methyl blue agar): E. coli cho khuẩn lạc có ánh
kim màu tím, tròn, dẹt.
- Trên môi trường Kliger iron agar (KIA): E. coli lên men đường glucose và

lactose làm cho phần nghiêng và phần sâu có màu vàng, sinh hơi nhưng không sinh
H
2
S.
- Trên môi trường thạch dinh dưỡng tạo khuẩn lạc tròn ướt, màu trắng đục hơi lồi
để lâu có dạng khô rìa hơi nhăn.
- Trên môi trường canh dinh dưỡng sau khi nuôi cấy 4 - 5 giờ E. coli làm đục đều
môi trường, sau đó lắng xuống đáy, có màu tro nhạt đôi khi có màu tro xám, có mùi
trứng thối.
8
- Trên môi trường Brilliant Green Bile Lactose agar (BGBL agar): Vi khuẩn sinh
hơi và làm thay đổi màu của môi trường vì lên men đường lactose.
Hình 2.3: Vi khuẩn E. coli biểu hiện dương tính trong môi trường BGBL
Ống 1 (+), Ống 2 (-)
2.1.1.4 Đặc điễm sinh hóa [6]
E. coli có khả năng lên men và sinh hơi một số loại đường thông thường như:
lactose, glucose, manitol, thường người ta căn cứ vào khả năng lên men đường lactose
để phân biệt E. coli với một số vi khuẩn đường ruột khác, E. coli có phản ứng sinh hóa
biểu hiện ở Bảng 2.1:
Bảng 2.1: Biểu hiện sinh hóa của E. coli
Phản ứng sinh hóa Biểu hiện
Urea +
H
2
S -
Indol +
Methyl Red (MR) +
Vosges Proskauer (VP) -
Citrate -
2.1.1.5 Cấu tạo kháng nguyên và độc tố:

- Kháng nguyên [9]
9
E coli có cấu tạo kháng nguyên rất phức tạp, được chia làm nhiều loại: O, H, K, F.
+ Kháng nguyên O (Somatic antigen): Là kháng nguyên chịu nhiệt, không bị hủy
ở nhiệt độ 100
0
C trong 2 giờ, khi tiếp xúc với cồn 50% vẫn không bị phân hủy. Tuy
nhiên sẽ bị phân hủy bởi formol 5%.
+ Kháng nguyên H (Flagellar antigen): Có trên 50 loại khác nhau, được cấu tạo
bởi protein, kháng nguyên H có một số tính chất ngược lại so với kháng nguyên O
như: Kháng nguyên H không chịu được nhiệt, sẽ bị hủy bởi cồn 50%, các protenase,
không bị hủy bởi formol 5%. Khi kháng nguyên H gặp kháng thể tương ứng sẽ xảy ra
hiện tượng ngưng kết H.
+ Kháng nguyên K (Capsular antigen): Bản chất là polysaccharid hay protein,
tính chất chịu nhiệt của kháng nguyên này tương đối kém, sẽ bị thiêu hủy ở 100
0
C
trong 1 giờ.
+ Kháng nguyên F (Fimbrias antigen): Về hình dáng có dạng sợi, dài khoảng
4µm, thẳng hay xoắn đường kính 2,1 – 7nm, giúp vi khuẩn bám vào tế bào niêm mạc
ruột, kháng nguyên này có vai trò quan trọng trong khả năng gây bệnh của vi khuẩn.
- Độc tố
Độc tố E. coli: loại có giáp mô độc tính mạnh hơn loại không có giáp mô.
Độc tố của E. coli gồm có hai loại:
+ Nội độc tố: gây tiêu chảy.
+ Ngoại độc tố: gây tan huyết, phù thủng.
2.1.1.6 Tính chất gây bệnh [6, 9]
Khi E. coli tiết ra các độc tố tế bào (cytotoxin), do các dòng vi khuẩn này có
mang một plasmid có thể giúp chúng bám dính vào màng nhày của ruột, gây tiêu chảy
không có máu hoặc có máu ở người, ngoài ra còn có các hội chứng khác gây nhiễm ở

bộ phận sinh dục, viêm màng bụng, có khi gây nhiễm trùng huyết.
Dựa vào tính chất gây độc của vi khuẩn E. coli mà hiên nay người ta đã phân chia
thành các nhóm sau:
+ Nhóm E. coli gây bệnh EPEC (Enteropathogentic E. coli): Gây viêm ruột và
tiêu chảy ở trẻ em.
+ Nhóm sinh độc tố ruột ETEC (Enterotoxigenic E. coli) : Gây tiêu chảy và viêm
đại tràng.
10
+ Nhóm sinh độc tố EIEC (Enteroin vasin E. coli): Gây tiêu chảy có đàm lẫn máu
+ Nhóm sinh độc tố VETEC (Verocy toxin producing E. coli): Gây tiêu chảy,
viêm đại tràng, xuất huyết, làm tổn thương mau mạch gây phù thủng.
2.1.1.7 Triệu chứng trúng độc [12]
Tùy theo dòng xâm nhiễm, thời gian ủ bệnh từ 8 - 44 giờ, trung bình là từ 12 - 24
giờ, người trúng độc có biểu hiện đau bụng dữ dội, ít nôn mửa, đi phân lỏng 1 - 15 lần
trong ngày, nếu nặng thì sốt cao, các chi co giật, đổ mồ hôi, thời gian khỏi bệnh tương
đối dài.
2.1.1.8 Biện pháp phòng ngừa
Để phòng ngừa được bệnh thì chúng ta cần phải tuân thủ nghiêm ngặt qui chế vi
sinh như sau:
+ Phải xử lý phân và dụng cụ của bệnh nhân sạch sẽ.
+ Không ăn những loại thực phẩm không đảm bảo chất lượng, đặt biệt là sản
phẩm từ thịt chưa được chế biến kỹ.
+ Khi có dịch viêm dạ dày ruột đang xảy ra thì tốt nhất chúng ta nên ăn chín,
uống chín và phải giữ gìn vệ sinh chân, tay thật tốt trước khi ăn.
2.1.2 Đại cương về coliforms [2, 6, 12]
Coliforms được xem là vi sinh vật chỉ thị, bởi vì số lượng của chúng hiện diện
trong mẫu thực phẩm chỉ thị khả năng có sự hiện diện của các vi sinh vật gây bệnh
khác trong thực phẩm. Các nhà nghiên cứu cho rằng sự hiện diện số lượng Coliforms
cao trong thực phẩm thì khả năng hiện diện các vi sinh vật gây bệnh khác cũng rất cao.
Tuy vậy mối liên hệ giữa số lượng vi sinh vật chỉ thị và vi sinh vật gây bệnh còn đang

được tranh cải về khoa học, cho đến nay mối liên hệ này vẫn không được thống nhất
trong các hội đồng khoa học.
Nhóm coliorms tổng số bao gồm cả những vi sinh vật hiếu khí và kỵ khí tùy
nghi, gram âm, hình que, không sinh bào tử, có khả năng lên men đường lactose và
sinh hơi từ nguồn carbon trong môi trường nuôi cấy lỏng trong 24 - 48 giờ ở 37
0
C.
Căn cứ vào nhiệt độ nuôi cấy, coliformss được các nhà nghiên cứu chia thành
hai nhóm nhỏ là: Nhóm coliorms tổng số và Faecal coliforms.
Faecal coliforms hay còn gọi là nhóm coliorms phân, vì nhóm này có nguồn
gốc từ phân của các loài động vật. Trên thực tế kiễm nghiệm coliforms phân được
11
quan tâm nhiều hơn coliforms. Hiện nay người ta đã phân lập được 4 giống thuộc
nhóm coliforms có nguồn gốc từ ruột người và động vật máu nóng. Bốn giống có tên
và tính chất sinh hóa của chúng được thể hiện qua Bảng 2.2
Bảng 2.2: Đặc điểm sinh hóa của các giống trong nhóm coliforms phân
Ghi chú: + dương tính, - âm tính, +(-) đa số là dương tính, -(+) đa số là âm tính
Nhóm coliforms phân được dùng để chỉ thị mức độ vệ sinh trong quá trình chế
biến, bảo quản, vận chuyển, thực phẩm, nước uống cũng như để chỉ thị sự ô nhiễm
phân trong môi trường, đặt biệt là E. coli là loài được quan tâm nhiều nhất về vi sinh
vật an toàn thực phẩm.
Hình 2.4: Hình dạng Coliforms nhìn dưới kính hiển vi điện tử
2.2 Giới thiệu đại cương về tôm sử dụng trong chế biến thực phẩm [10, 3]
2.2.1 Thành phần hóa học và giá trị dinh dưỡng
2.2.1.1 Thành phần hóa học
Thành phần hóa học của tôm gồm có: Nước chiếm 70 - 80%, protein chiếm 13 -
25%, lipid chiếm 0,05 - 3%, thành phần khoáng chất chiếm khoảng 0,6 - 15%, ngoài ra
Tên giống Indol MR VP Citrat
Escherichia với một loài duy nhất là E.
coli

+(-) + - -
Enterobacter (gồm 2 loài E.aerobacter và
E.cloacae)
-(+) - + +
Citrobacter -(+) + - +
Klebsiella -(+) - + +
12
còn có glucid, vitamin. Những thành phần có hàm lượng tương đối nhiều là nước,
protid, lipid, chất khoáng. Hàm lượng glucid trong tôm rất ít và tồn tại dưới glucogen.
Thành phần hóa học của tôm thường khác nhau tùy theo giống loài, vị trí nơi đánh bắt,
trạng thái sinh lý, mùa vụ và thời tiết.
Sự khác nhau về thành phần hóa học và sự biến đổi của chúng làm ảnh hưởng
rất lớn đến mùi vị và giá trị dinh dưỡng của sản phẩm, đến việc bảo quản tươi nguyên
liệu và qua quá trình chế biến nguyên liệu.
2.2.1.2 Giá trị dinh dưỡng
Trong khẩu phần ăn của mỗi người phải hài hòa, cân đối về hàm lượng protein,
lipid, glucid. Để đáp ứng được yêu cầu trên thì thực phẩm từ thủy hải sản chiếm tỷ lệ
cao trong việc cung cấp đạm, chất dinh dưỡng, chất béo. Do đó nguồn thức ăn từ biển,
sông hồ ngày càng được khai thác, chế biến thành những loại món ăn đặc sản.
Tôm cung cấp nhiều chất dinh dưỡng như: protein, các chất khoáng… cho cơ
thể, các chất này giúp tăng sức đề kháng cho cơ thể, cấu tạo và tái tạo xương. Tôm đặc
biệt quan trọng đối với trẻ em, phụ nữ có thai và người lớn tuổi, giúp cho sự tăng
trưởng, phát triển và phục hồi sức khỏe …
Ngoài thành phần kể trên tôm còn có các muối khoáng: Canxi, sắt, kẽm… các
vitamin B
1
,

vitamin E, rất cần thiết cho cơ thể.
2.2.2 Sự hư hỏng do vi sinh vật trên tôm sau đánh bắt

Trong quá trình chế biến, bảo quản thực phẩm, nếu không đảm bảo yêu cầu vệ
sinh theo đúng yêu cầu kỹ thuật các chất dinh dưỡng trong thức ăn sẽ bị vi sinh vật,
oxi trong không khí, ánh sáng, nhiệt độ, độ ẩm phân hủy thành những chất có hại.
Ví dụ: Đạm bị phân hủy thành NH
3
,

H
2
S, các amin độc như: Histamin, betain,
Nguyên liệu thủy sản dễ hư hỏng vì: Cơ thể thủy sản có nhiều nước, chiếm
khoảng 80%, cơ thịt có cấu tạo lỏng lẻo, nên dễ bị vi khuẩn xâm nhập và phá hủy. Khi
điều kiện thuận lợi vi khuẩn sẽ phát triển, sinh sôi nảy nở, cuối cùng các vi khuẩn có
hại này làm hỏng thực phẩm gây nguy hiểm tới tình trạng sức khỏe của người tiêu
dùng.
Sau khi tôm, mực, cá chết, vi khuẩn trong bao tử, trong ruột của mực, tôm, xâm
nhập vào nội tạng, các mô cơ, đồng thời vi khuẩn từ môi trường ngoài cũng xâm nhập
vào tiến hành các giai đoạn phân giải, phân hủy gây hư hỏng nguyên liệu.
13
- Hiện tượng đập vỡ cấu trúc nguyên liệu
+Nguyên nhân: Do nguyên liệu đựng trong các cần xé, thùng nhựa khi vận
chuyển bị dằn xốc hoặc khi bị tốc vỡ mạnh tay gây ra dập nát nguyên liệu.
+ Tác hại: Khi cấu trúc nguyên liệu bị hư hỏng do va chạm cơ học thì khả năng
tự bảo vệ của nó kém, các chất do tích tụ ở những vị trí có cấu trúc hư hỏng, đồng thời
vi sinh vật từ ngoài cũng xâm nhập vào, những biến đổi hóa học vì thế cũng phát triển
làm giảm giá trị cảm quan của tôm nguyên liệu
- Hiện tượng nguyên liệu biến đổi về trạng thái cơ thịt
+ Nguyên nhân: Do tác động vật lý trong quá trình đánh bắt, vận chuyển nguyên
liệu từ khi đánh bắt đến khi về chế biến là một khoảng thời gian dài để vi khuẩn xâm
nhập và lây nhiễm.

Do các biến đổi hóa học, đồng thời trong khoảng thời gian dài này các biến đổi
sinh hóa trong cấu trúc nguyên liệu bước vào giai đoạn phân giải, phân hủy.
+ Tác hại: Cả hai nguyên nhân trên đều dẫn đến nguyên liệu bị mềm nhũn, ươn
thối, làm giảm giá trị cảm quan. Do cơ thịt nguyên liệu lúc này bị mềm ra không còn
rắn chắc và mất khả năng đàng hồi tạo điều kiện thuận lợi cho vi khuẩn hoạt động.
Mặt khác quá trình phân giải luôn có quá trình phân hủy đi kèm sẽ chuyển hóa nguyên
liệu, cụ thể là các acid amin, thành các hợp chất như: Indol, uera, NH
3
, H
2
S… gây ra
các mùi rất khó chịu và làm cho nguyên liêu bị mềm, nông nước và cuối cùng là ươn
thối.
- Hiện tựơng hư hỏng về mặt hóa học
+ Nguyên nhân: Do điều kiện đánh bắt kéo dài hoặc điều kiện bảo quản không
tốt. Nguyên liệu sau khi bước vào giai đoạn mềm nhũn, tổ chức cơ thịt lỏng lẻo, bắt
đầu cho quá trình phân hủy, lúc này các protit bị phân giải thành các acid amin. Đây là
nguồn dinh dưỡng của các loài vi sinh vật sống trên cơ thể nguyên liệu. Các vi sinh vật
sẽ phân hủy các acid amin làm cho nguyên liệu bị thối rửa, có mùi khai và các mùi lạ
khác.
+ Tác hại: Nguyên liệu bị mềm nhũn có mùi khó chịu và làm mất giá trị thực
phẩm.
- Hiện tượng tôm bị biến đen
14
Đối với tôm trong quá trình chế biến, có một số tôm xuất hiện những chấm đen
trên thân. Những chấm đen này không có ý nghĩa làm giảm giá trị dinh dưỡng hay độ
tươi của tôm, mà với sự xuất hiện của chúng chỉ chứng tỏ rằng tôm đã mất giá trị cảm
quan mà thôi.
+ Nguyên nhân: Hiện tượng tôm bị biến đen là quá trình hóa sinh tự nhiên xảy ra
trong tôm. Khi tôm chết bắt đầu xuất hiện những tế bào riêng biệt bị phá hủy và bị

phân chia thành những chất đơn giản dưới tác dụng của enzyme nội tại trong nguyên
liệu. Trong đó hai cơ chất quan trọng nhất tạo các vết đen trên nguyên liệu là: Tyrozin
và phenylanin. Trong tôm hay amino acid tồn tại rất nhiều, chúng rất dễ bị oxy hóa
dưới tác dụng của enzyme Tyrozinasa có sẵn trong nguyên liệu tạo thành một số sản
phẩm trung gian trước khi tạo thành sắc tố melanin màu đen.
+ Tác hại: Tôm bị biến đen chỉ làm giảm chất lượng bên ngoài, nghĩa là làm mất
giá trị chất lượng cảm quan chứ chưa ảnh hưởng gì đến giá trị dinh dưỡng.
- Hiện tượng tôm bị biến đỏ
+ Nguyên nhân: Trong bản thân tôm luôn luôn tồn tại một lượng đáng kể sắc tố
Astaxathin, khi nguyên liệu còn sống chúng sẽ liên kết với protein. Lúc này protein sẽ
bị tách ra khỏi cơ chất Astaxanthin. Trong trường hợp Astaxanthin rất dễ bị oxy hóa
thành astaxin có màu đỏ gạch.
+ Tác hại: Kèm theo hiện tượng tôm biến đỏ thì chất lượng tôm cũng giảm đi một
cách nghiêm trọng nhưng chưa đến giai đoạn hư thối. Chỉ khi đến vi sinh vật tiến hành
quá trình phân hủy tạo ra các sản phẩm cấp thấp thì nguyên liệu bắt đầu hư hỏng, ươn
thối.
2.2.3 Ảnh hưởng của việc nhiễm vi sinh vật [1, 6]
Vi sinh vật có mặt khắp mọi nơi trong không khí, đất, nước… khi gặp điều kiện
thuận lợi chúng sẽ phát triển, sinh sôi nảy nở rất nhanh.
Vì vậy trong quá trình chế biến thực phẩm nếu mất vệ sinh, vi sinh vật sẽ nhiễm
vào thực phẩm. Sau khi nhiễm vào thực phẩm chúng sẽ tham gia phân giải thực phẩm,
làm biến đổi chất lượng thực phẩm và làm cho thực phẩm trở nên độc hại. Bản thân
nhiều loại vi sinh vật sản sinh nội độc tố và ngoại độc tố gây độc cho người tiêu thụ
thực phẩm. Nhiều loại vi sinh vật có trong thực phẩm là nguyên nhân gây ra các bệnh
chuyền nhiễm cho người và động vật. Các loại thực phẩm có dinh dưỡng cao như: Cá,
15
tôm, thịt, sữa, chứng và các sản phẩm được chế biến từ chúng đều là thức ăn có giá trị
dinh dưỡng cho con người và cũng là môi trường rất tốt cho nhiều loại vi sinh vật phát
triển, ngay sau khi chúng đã xâm nhập vào.
16

Chương 3
VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.1 Thời gian và địa điểm thực hiện
3.1.1 Thời gian:
Thời gian thực hiện khóa luận từ tháng 12/2007 đến 05/2008.
3.1.2 Địa điểm:
Khóa luận được thực hiện tại Phòng Kiểm nghiệm vi sinh của Công ty Cổ phần
Thực phẩm xuất khẩu Cholimex, thuộc khu công nghiệp Vĩnh Lộc A. Công ty cổ phần
thực phẩm Cholimex là một đơn vị sản xuất kinh doanh trực thuộc Công ty xuất nhập
khẩu và đầu tư chợ lớn (Cholimex). Các mặt hàng chủ lực của Công ty là
- Thủy hải sản: Các loại thủy hải sản đông lạnh (tôm, cá, cua, mực, ghẹ…)
- Thực phẩm phối chế: Chả giò, chạo tôm, há cảo, hoành thánh…
- Hàng khô: Mực tẩm gia vị, cá thiều…
- Gia vị phối chế: Tương cà, tương ớt, nước mắm, nước tương…
3.2 Vật liệu
3.2.1 Mẫu
Mẫu dùng trong quá trình phân tích thí nghiệm được lấy từ tôm sú, tôm thẻ
nguyên liệu tại chợ Bà Điểm và thành phẩm tôm Amaebi tại phân xưởng I của Công ty
Cổ phần Thực phẩm xuất khẩu Cholimex.
3.2.2 Thiết bị và dụng cụ
3.2.2.1 Thiết bị
- Tủ ấm: 30
0
C, 37
0
C, 44
0
C.
- Tủ sấy diệt trùng
- Tủ mát giữ môi trường và giống vi sinh vật

- Tủ lạnh bảo quảng
- Nồi hấp thanh trùng Autoclave
- Cân điện tử
- Máy dập mẫu stomacher
17
- Máy Vortex (đồng nhất mẫu)
- Bể điều nhiệt
3.2.2.2 Dụng cụ
- Dụng cụ lấy mẫu: Hợp Inox dùng đựng dụng cụ (bao PE, kéo Inox, kẹp Inox,
muỗng Inox), đèn cồn, hột vẹt và thùng nhựa đựng mẫu.
- Dụng cụ cấy mẫu: Cốc thủy tinh dùng để bỏ đầu típ trong quá trình cấy, giá để
ống nghiệm bằng Inox, đèn cồn, hột vẹt, ống nghiệm, đĩa petri, pipetman, đầu típ, tất
cả điều phải vô trùng.
- Dụng cụ cấy phân lập giống: Các lọai que cấy vòng, thẳng.
- Dụng cụ pha chế môi trường: Chai thủy tinh, muỗng Inox, cốc thủy tinh, ống
nghiệm, đĩa petri, ống hút thủy tinh, quả bóp cao su…
3.3 Môi trường và thuốc thử
3.3.1 Môi trường
Phòng vi sinh của Công ty Cholimex sử dụng môi trường tổng hợp của hãng
Merck - Đức sản xuất. Tên và thành phần của từng loại môi trường
- Saline Peptone Water (SPW): Môi trường này dùng để pha loãng vi sinh vât
trong quá trình định lượng, được pha chế và phân phối vào ống nghiêm, mỗi ống
nghiệm được phân phối vào 9ml, hấp khử trùng ở 121
0
C/15 phút. Tuy nhiên trong quá
trình hấp khử trùng có thể xảy ra hiện tượng mất nước, vì vậy qua quá trình thực
nghiệm, chúng tôi đã phân phối vào mỗi ống nhiệm 9,3ml.
Thành phần môi trường gồm:
Peptone 1,0g
Nacl 8,5g

Nước cất 1000ml
- Môi trường Plate count agar (PCA): Môi trường này dùng để định lượng tổng vi
sinh vật hiếu khí, được pha chế, phân phối vào trong các bình thủy tinh, hấp khử trùng
ở 121
0
C/15 phút, được bảo quản trong tủ lạnh 2 – 8
0
C. Trước khi sử dụng môi trường
được đun chảy và làm nguội ở 45
o
C.
Thành phần gồm:
Peptone 5,0g
Cao nấm men 2,5g
18
Glucose 1g
Agar 14g
Nước cất 1000ml
- Môi trường Trypton Soya Agar (TSA): Đây là môi trường thạch không chọn lọc
có tác dụng phục hồi những tế bào bị tổn thương hay giảm sức sống. Được chuẩn bị
trong các bình hay chai thủy tinh, hấp khử trùng ở 121
0
C, bảo quản ở 4 - 8
0
C. Trước
khi sử dụng môi trường được đun chảy và làm nguôi ở 45
0
C trong bể điều nhiệt.
Thành phần gồm:
Trypticase peptone 15g

Phytonepeptone 5g
NaCl 5g
Agar 15g
Nước cất 1000ml
- Violet Red Bile Agar (VRB): Đây là môi trường dùng để định lượng Colifroms
tổng số, được chuẩn bị vô trùng trong các chai nước thủy tinh, đã hấp khử trùng ở
121
0
C/15 phút, đun chảy và làm nguội ở 45
0
C trong bể điều nhiệt trước khi sử dụng.
Thành phần gồm:
Cao nấm men 3g
Peptone 7g
Nacl 5g
Muối mật 1,5g
Lactose 10g
Neutral red 0,03g
Crystal violet 0,002g
Agar 18g
Nước cất 1000ml
- Eosin Methyl blue agar (EMB): Môi trường này dùng để phân lập E. coli, được
pha vào các chai thủy tinh và hấp khử trùng ở 121
0
C/15 phút, bảo quản ở 2 - 8
0
C,
trước khi sử dụng đun chảy để nguội 45
0
C rồi đổ đĩa, phải đổ đĩa trước một ngày mà ta

19
sử dụng. Tránh đổ môi trường lúc còn quá nóng vì như vậy sẽ làm nước động lại trên
thạch và mặt đĩa.
Thành phần gồm:
Peptone 10g
Lactose 5g
Sucrose 5g
K
2
PO
4
(dikali phosphat) 2g
Eosin 0,4g
Methyl blue 0,065g
Agar 13,5g
Nước cất 1000ml
- Brilliant Green Bile Lactose broth (BGBL): Môi trường này có dạng lỏng dùng
trong quá trình định tính E. coli hay cho việc khẳng định Coliforms tổng số, pha môi
trường trong cốc thủy tinh, khuấy cho tan, sau đó phân phối vào mỗi ống nghiệm 10ml
rồi cho ống Durham ngược vào, đậy nắp lại, bỏ vào bao PE cột lại hấp khử trùng ở
121
0
C/15 phút. Sau khi hấp phải kiểm tra lại, nếu ống nào có sinh hơi thì ta bỏ không
sử dụng.
Thành phần môi trường gồm:
Peptone 10g
Lactose 10g
Mật bò 20g
Brilliant green 0,0133g
Nước cất 1000ml

- Môi trường canh Tryptone broth: Môi trường này được sử dụng để thử
nghiệm Indol, ngoài ra còn có tác dụng làm tăng sinh vi sinh vật, đây là môi trường
lỏng được pha và phân phối vào mỗi ống nghiệm 5ml, hấp khử trùng ở 121
0
C/15 phút.
Thành phần môi trường gồm:
Tryptone 20g
Nacl 5g
H
2
O 1000ml
20
- Methyl Red – Voges Proskauer broth (MR – VP broth): Đây là môi trường lỏng,
được pha và phân phối vào mỗi ống nghiệm 5ml, hấp khử trùng ở 121
0
C/15 phút.
Dùng để thử nghiệm phản ứng sinh hóa Methyl red và Voges proskauer.
Thành phần gồm:
Peptone 5g
K
2
HPO
4
5g
Glucose 5g
Nước cất 1000ml
Môi trường Simmons Citrate agar: Đây là môi trường thạch nên được pha trong
cốc, đun tan hết agar, phân phối vào mỗi ống nghiệm khoảng 7ml, hấp khử trùng ở
121
0

C/15 phút. Sau khi hấp xong, lấy môi trường ra để ống nghiệm nằm nghiêng cho
đến khi thạch đông lại rồi mới sử dụng, môi trường này dùng trong quá trình thử
nghiệm sinh hóa.
Thành phần gồm:
Sodium citrate 2g
Nacl 5g
K
2
HPO
4
41g
NH
4
H
2
PO
4
41g
MgSO
4
0,2g
Bromothymol blue 0,08g
Agar 15g
Nước cất 1000ml
3.3.2 Thuốc thử :
- Thuốc thử Kovac
,
s
- Thuốc thử Methyl red
- Dung dịch α – napthol 5% trong cồn tuyệt đối.

- Dung dịch KOH 40%
21
3.4 phương pháp thí nghiệm
3.4.1 Phương pháp pha loãng theo dãy thập phân
Mẫu được pha loãng tuần tự thành dãy các nồng độ thập phân: 1:10, 1:100,
1:1000, 1:10000, được thực hiện bằng cách hút 1ml mẫu thêm vào 9ml dung dịch
pha loãng được chuẩn bị sẵn trong ống nghiệm, sau đó lắc kỹ ta sẽ được độ pha loãng
1/10. Dung dịch dùng trong pha loãng phải được hấp khử trùng ở 121
0
C/15 phút.
Trong quá trình thực hiện cần chú ý:
- Đối với mẫu là chất lỏng, trước khi pha loãng mẫu phải được lắc kỹ, cắm đầu
típ sâu vào trong mẫu sau đó hút ra 1ml, cho vào trong ống chứa dung dịch pha loãng
đầu tiên, lắc kỹ ống nghiệm chứa mẫu, thực hiện các độ pha loãng tiếp theo thành các
dãy thập phân cho đến khi đạt độ pha loãng mà mình mong muốn.
- Đối với các mẫu rắn hay bán lỏng, các thao tác được tiến hành như sau: Cân
10g mẫu vào trong bao PE thêm vào 90ml dung dịch pha loãng và để vào máy
stomacher, dập, cho vi khuẩn phân tán điều trong dung dịch. Sau khi mẫu và dung dịch
pha loảng được đồng nhất ta được dung dịch pha loãng 1/10. Thực hiện các độ pha
loãng tiếp theo, theo phương pháp pha loãng dãy thập phân như trên để được độ pha
loãng cần thiết.
3.4.2 Kỹ thuật lấy mẫu
Kết quả phân tích định lượng phụ thuộc rất nhiều vào phương pháp và quy trình
thu mẫu. Vì vậy trước khi tiến hành thu mẫu thì tất cả dụng cụ phải đảm bảo vô trùng.
Nhân viên lấy mẫu phải mặc đồ bảo hộ lao động, đeo khẩu trang, tóc phải được kẹp
rọn ràng và phải được bọc kín, tay phải được khử trùng và đeo găng tay sạch. Quá
trình lấy mẫu cũng không kém phần quang trọng bởi vì kết quả của mẫu lấy phân tích
phải phản ánh chính xác mọi đặt điểm và phải đặt trưng cho chất lượng của lô sản
phẩm đó. Lấy mẫu không đúng phương pháp, kết quả phân tích sẽ không phản ánh
đúng chất lượng của lô sản phẩm. Trong các nhà máy sản xuất, chế biến thực phẩm,

cần thiết phải thu mẫu tại nhiều thời điểm và công đoạn khác nhau trong quá trình sản
xuất, tránh việc thu mẫu chỉ tại một thời điểm, một vị trí hay một công đoạn, vì quá
trình thu mẫu như trên sẽ cho ta kết quả không khách quang.
22
3.4.3 Kỹ thuật chuẩn bị ống thạch nghiêng và đổ đĩa.
- Ống thạch nghiêng: Môi trường sử dụng làm thạch nghiêng là môi trường rắn.
Sau khi pha chế môi trường xong ta cho một thể tích hợp vào ống nghiệm
(khoảng 5 - 7ml), đậy nút lại và hấp khử trùng. Sau khi hấp xong ta lấy ống nghiệm ra
khỏi nồi hấp, đầu ống nghiệm được đặt trên một vật có độ cao vừa phải để tạo độ
nghiêng sao cho chiều dài của môi trường đạt không quá 2/3 chiều cao ống nghiệm,
tuyệt đối không để thạch chạm nút ống nghiệm. Để yên cho đến khi môi trường đông
đặt lại và tạo thành thạch nghiêng.
- Đổ đĩa: Môi trường đổ đĩa là môi trường rắn, cần đổ đĩa ở nhiệt độ
45
0
C - 55
0
C, nhằm hạn chế sự ngưng tụ hơi nước trên nắp đĩa petri và không để cho
môi trường quá nguội làm thạch đông đặc cục bộ, bề mặt môi trường không phẳng.
Trước khi đổ cần lắc nhẹ bình tam giác vài vòng để đảm bảo môi trường được đồng
nhất. Việc thực hiện đổ đĩa phải thực hiện cẩn thận trong tủ cấy vô trùng, không gian
vô trùng của ngọn đèn cồn, từng tự rót vào đĩa một lượng môi trường thích hợp sao
cho bề dày môi trường trong đĩa đạt khoảng 3 – 4mm. Sau khi đổ xong ta đặt đĩa trên
một mặt phẳng và để yên cho đến khi môi trường đông rắn lại
3.4.4. Kỹ thuật cấy giống
- Cách cấy giống từ ống thạch nghiêng sang môi trường lỏng
+ Ống nghiệm chứa vi sinh vật được cầm ở tay trái, tay phải cầm que cấy, ngón
út của tay phải dùng để mở nút, sau khi khử trùng que cấy, mở nút ống nghiệm, hơ
miệng ống nghiệm xoay vài vòng qua ngon lửa.
+ Đưa que cấy vào bên trong, để que cấy trạm trên thành ống nghiệm một lúc, để

cho que cấy nguội đi.
+ Lấy ít sinh khối từ trong ống nghiệm bằng cách chấm nhẹ đầu que cấy lên
khuẩn lạc trên bề mặt môi trường. Sau đó ta rút que cấy ra một cách cẩn thận tránh
không cho que cấy dính vào thành và miệng ống nghiệm.
+ Hơ nóng miệng ống nghiệm, đậy nút bông lại, đặt lên giá đỡ.
+ Đầu que cấy có chứa vi sinh vật được giữ ở vùng không khí vô trùng gần ngọn
đèn cồn.
+ Dùng tay trái lấy ống nghiệm mà ta cần cấy vi sinh vật vào, mở nút, khử trùng
miệng ống.
23
+ Chuyển giống vào môi trường bằng cách ta khuấy mạnh đầu que cấy trong môi
trường lỏng để tách sinh khối ra khỏi đầu que cấy.
- Cấy ria giống từ môi trường lỏng (dịch nuôi cấy, huyền phù tế bào) lên bề mặt
ống thạch nghiêng.
+ Thực hiện các thao tác phải hết sức thận trọng trong không gian vô trùng của
ngọn đèn cồn.
+ Thu sinh khối như trường hợp trên
+ Cấy giống lên bề mặt ống thạch nghiêng bằng cách đặt nhẹ đầu que cấy lên bề
mặt môi trường ở đáy ống. Dàn đều sinh khối ở phần đáy ống nghiệm. Sau đó cấy theo
hình sin từ đáy ống nghiệm lên đến đầu trên của mặt thạch nghiêng.
3.4.5 Kỹ thuật cấy phân lập
- Lắc đều ống nghiệm nuôi cấy.
- Khử trùng đầu que cấy trên ngọn lửa đến khi nóng đỏ. Mở nắp ống nghiệm
bằng ngón út và lòng bàn tay. Khử trùng miệng ống nghiệm.
- Làm nguội que cấy và lấy một vòng môi trường nuôi cấy.
- Khử trùng lại ống nghiệm, đậy nắp lại và đặt vào giá để ống nghiệm.
- Dùng một tay mở petri, một tay ria đầu que cấy trên mặt thạch. Vị trí bắt đầu ria
que cấy nằm ở rìa đĩa thạch và ở phía đối diện người cấy.
- Ria trên bề mặt thạch theo những đường zigzac trên khoảng 1/4 đĩa thạch.
Tránh trường hợp đầu que cấy đâm vào môi trường.

- Khử trùng que cấy trên ngọn lửa. Xoay đĩa petri 1/4 vòng tròn.
- Mở nắp petri và đợi que cấy nguội bằng cách áp đầu que cấy lên nắp petri. Bắt
đầu ria đường thứ hai từ một vị trí trên đường ria đầu tiên.
- Tiếp tục ria các đường tiếp theo tương tự đến khi ria kín bề mặt đĩa thạch. Khử
trùng lại que cấy sau khi ria xong.
3.5 Phương pháp phân tích
3.5.1 Định lượng Coliorms bằng phương pháp điếm khuẩn lạc.
3.5.1.1 Nguyên tắc
Mẫu đã được đồng nhất và được cấy một lượng nhất định lên môi trường chọn
lọc thích hợp chứa lactose. Đếm số khuẩn lạc lên men lactose và sinh acid sau khi ủ ở
37
0
C/24 - 48 giờ. Ngoài lactose, môi trường chọn lọc cho Coliforms còn chứa muối
24
mật ức chế vi khuẩn gram dương và chất chỉ thị pH như neutral red, crystal violet.
Trên môi trường nầy khuẩn lạc colifoms có màu đỏ đến màu đỏ đậm, đường kính >
0,5mm, xung quanh khuẩn lạc có vùng tủa múi mật. Việc khẳng định được thực hiện
bằng cách nuôi cấy trên môi trường canh chọn lọc như BGBL. Mật độ Colifoms được
tính dựa trên số khuẩn lạc điển hình đếm được, tỉ lệ khẳng định và độ pha loãng mẫu
trước khi cấy đĩa vào.
Truớc khi đổ môi trường chọn lọc vào ta phải cho môi trường TSA vào trước,
nhằm để phục hồi những tế bào bị tổn thương hay giảm sức sống do quá trình chế biến
và bảo quản, vì những tế bào bị tổn thương này có thể không phát triển được trên môi
trường chọn lọc.
3.5.1.2 Môi trường nuôi cấy
- Dung dich pha loãng Saline peptone water
- Tryptone Soya Agar
- Violet red bile agar
- Brilliant green bile lactose broth
3.5.1.3 Quy trình phân tích

- Mẫu: Mẫu được cân 10g vào bao PE trong điều kiện vô trùng, thêm 90g dung
dịch pha loãng SPW, đồng nhất mẫu bằng máy dập mẫu stomacher khoảng 30 giây.
Sau khi đồng nhất ta có nồng độ pha loãng mẫu là 10
-1
. Từ độ pha loãng 10
-1
ta tiếp tục
pha loãng mẫu theo phương pháp pha loãng thập phân để ta có độ pha loãng cần thiết.
- Cấy mẫu: Dùng pipet vô trùng hút dịch pha loãng mà ta thấy thích hợp cấy vào
đĩa petri. Mỗi độ pha loãng cấy hai đĩa, chọn hai hay ba độ pha loãng kế tiếp nhau để
cấy. Sau khi cấy xong ta đổ vào khoảng 5ml TSA đã được đun chảy và làm nguội
khoảng 45
0
C. Lắc tròn đĩa theo chiều xuôi và ngược kim đồng hồ, mổi chiều 3 - 5 lần
để dịch phân tán điều với môi trường. Đợi cho môi trường đặc và phục hồi các tế bào
tổn thương (khoảng 30 phút đến 1giờ). Tiếp theo ta bổ sung vào mỗi đĩa khoảng
10 - 15ml môi trường VRB đã được đun chảy và làm nguội ở 45
0
C. Trờ đông đặc lại ta
lật ngược đĩa lại, ủ đĩa ở 37
0
C trong 24 - 48 giờ.
- Khẳng định Coliforms: Trong trường hợp mẫu có chứa các nguồn carbon khác
không phải lactose, để tránh trường hợp vi sinh vật sử dụng các nguồn carbon trong
mẫu để lên men và tạo khuẩn lạc có hình dạng tương tự coliforms nên ta cần thực hiện
25