Nghiên cứu nhân giống cây vú bò (Ficus Simplicissima Lour.) bằng phương pháp nuôi cấy mô thực vật

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC




NGUYỄN THỊ BÍCH NGỌC




NGHIÊN CỨU NHÂN GIỐNG CÂY VÚ BÒ
(FICUS SIMPLICISSIMA LOUR.) BẰNG
PHƢƠNG PHÁP NUÔI CẤY MÔ THỰC VẬT






LUẬN VĂN THẠC SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Thái Nguyên - 2014






Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên



ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC




NGUYỄN THỊ BÍCH NGỌC



NGHIÊN CỨU NHÂN GIỐNG CÂY VÚ BÒ
(FICUS SIMPLICISSIMA LOUR.) BẰNG
PHƢƠNG PHÁP NUÔI CẤY MÔ THỰC VẬT

Chuyên ngành: Công nghệ sinh học
Mã số: 60.42.02.01


LUẬN VĂN THẠC SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Ngƣời hƣớng dẫn khoa học: PGS.TS. NGUYỄN THỊ TÂM



Thái Nguyên - 2014


i
LỜI CẢM ƠN

Tôi xin bày tỏ lời cảm ơn chân thành, sâu sắc tới PGS.TS. Nguyễn Thị
Tâm đã tận tình hƣớng dẫn, chỉ bảo và tạo mọi điều kiện giúp đỡ tôi trong quá
trình nghiên cứu và hoàn thành luận văn.
Trong quá trình nghiên cứu, tôi đã nhận đƣợc sự giúp đỡ của kĩ thuật
viên Trần Thị Hồng (Phòng Công nghệ tế bào - Khoa Sinh - Kỹ thuật nông
nghiệp - Trƣờng Đại học Sƣ phạm - Đại học Thái Nguyên). Tôi xin chân
thành cảm ơn sự giúp đỡ quý báu đó.
Tôi xin chân thành cảm ơn các thầy cô Bộ môn Di truyền và Sinh học
hiện đại - Trƣờng Đại học Sƣ phạm - Đại học Thái Nguyên đã tạo mọi điều
kiện thuận lợi để tôi thực hiện quá trình nghiên cứu.
Tôi cũng xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới Ban chủ nhiệm khoa, các thầy
cô giáo, cán bộ khoa Khoa học sự sống - Trƣờng Đại học Khoa học - Đại học
Thái Nguyên, đã giúp đỡ tôi trong quá trình học tập và thực hiện luận văn.


Tác giả

Nguyễn Thị Bích Ngọc





ii
LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của tôi dƣới sự hƣớng
dẫn của PGS.TS Nguyễn Thị Tâm. Các số liệu, kết quả nghiên cứu trong luận
văn là trung thực và chƣa đƣợc ai công bố.



Tác giả


Nguyễn Thị Bích Ngọc

iii
MỤC LỤC

Trang
LỜI CẢM ƠN i
LỜI CAM ĐOAN ii
MỤC LỤC iii
NHỮNG CHỮ VIẾT TẮT vi
DANH MỤC CÁC BẢNG vii
DANH MỤC CÁC HÌNH viii
MỞ ĐẦU 1
1. Đặt vấn đề 1
2. Mục tiêu nghiên cứu 2
3. Nội dung nghiên cứu 2
Chƣơng 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3
1.1. Giới thiệu chung về cây Vú bò 3
1.1.1. Đặc điểm phân loại và sinh học của cây Vú bò 3
1.1.2. Một số thành phần có hoạt tính dƣợc học của cây Vú bò 4
1.1.3. Ứng dụng của cây Vú bò trong y học 5
1.2. Kỹ thuật nhân giống cây trồng trong công nghệ sinh học thực vật 6
1.2.1. Ƣu thế và các phƣơng thức nhân giống in vitro 6
1.2.2. Các giai đoạn trong quy trình nhân giống vô tính in vitro 10
1.3. Chất điều hòa sinh trƣởng thuộc nhóm auxin và cytokinin sử dụng trong
nuôi cấy mô thực vật 11
1.3.1. Auxin 11

1.3.2. Cytokinin 13
1.4. Tình hình nhân giống cây dƣợc liệu bằng phƣơng pháp nuôi cấy mô tế
bào thực vật ở trong nƣớc 14

iv
Chƣơng 2. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 18
2.1. Vật liệu, địa điểm và thời gian nghiên cứu 18
2.1.1. Vật liệu thực vật 18
2.1.2. Hoá chất, thiết bị 18
2.1.3. Địa điểm và thời gian nghiên cứu 18
2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu 18
2.2.1. Phƣơng pháp nuôi cấy in vitro 19
2.2.2. Đƣa cây ra môi trƣờng tự nhiên 21
2.2.3. Phƣơng pháp xử lí và tính toán số liệu 22
2.2.4. Điều kiện thí nghiệm 22
Chƣơng 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 23
3.1. Kết quả nghiên cứu khử trùng hạt 23
3.2. Kết quả nghiên cứu ảnh hƣởng riêng rẽ của các chất kích thích sinh
trƣởng đến hiệu quả nhân chồi và sự sinh trƣởng của chồi Vú bò trong ống
nghiệm 25
3.2.1. Kết quả nghiên cứu ảnh hƣởng của BAP đến hiệu quả nhân chồi và sự
sinh trƣởng của chồi Vú bò 26
3.2.2. Kết quả nghiên cứu ảnh hƣởng của kinetin đến hiệu quả nhân chồi và
sự sinh trƣởng của chồi Vú bò 28
3.3. Kết quả nghiên cứu ảnh hƣởng kết hợp giữa BAP (kinetin) và NAA đến
hiệu quả nhân chồi và sự sinh trƣởng của chồi Vú bò 29
3.3.1. Kết quả nghiên cứu ảnh hƣởng kết hợp giữa BAP và NAA đến hiệu quả
nhân chồi và sự sinh trƣởng của chồi Vú bò 29
3.3.2. Kết quả nghiên cứu ảnh hƣởng kết hợp giữa kinetin và NAA đến hiệu
quả nhân chồi và sự sinh trƣởng của chồi Vú bò 31

3.3.3. Kết quả nghiên cứu ảnh hƣởng kết hợp giữa BAP, kinetin và NAA đến
hiệu quả nhân chồi và sự sinh trƣởng của chồi Vú bò 32

v
3.4. Kết quả nghiên cứu ảnh hƣởng của nồng độ NAA đến khả năng ra rễ của
chồi Vú bò 34
3.5. Kết quả nghiên cứu ảnh hƣởng của giá thể đến tỉ lệ sống và sự sinh
trƣởng của cây con trong vƣờn ƣơm 36
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 38
1. Kết luận 38
2. Đề nghị 38
TÀI LIỆU THAM KHẢO 39
PHỤ LỤC 44

vi
NHỮNG CHỮ VIẾT TẮT

BA: 6-Benzyladenine
BAP: 6-Benzylaminopurine
CS: Cộng sự
CT: Công thức
DNA: Deoxyribonucleic acid
ĐC: Đối chứng
IAA: Indole-3-acetic acid
IBA: Indole-3-butyric acid
Kinetin: 6-furfurylaminopurine
LV: Litvay, 1985
MS: Murashige và Skoog, 1962
NAA: Naphthalene acetic acid
2,4-D: 2,4-Dichlorophenoxy acetic acid

vii
DANH MỤC CÁC BẢNG


Trang
Bảng 3.1. Kết quả khử trùng hạt Vú bò
24
Bảng 3.2. Ảnh hƣởng của BAP đến hiệu quả nhân chồi và sự
sinh trƣởng của chồi Vú bò

26
Bảng 3.3. Ảnh hƣởng của kinetin đến hiệu quả nhân chồi và
sự sinh trƣởng của chồi Vú bò

28
Bảng 3.4. Ảnh hƣởng kết hợp giữa BAP và NAA đến hiệu quả
nhân chồi và sự sinh trƣởng của chồi Vú bò

30
Bảng 3.5. Ảnh hƣởng kết hợp giữa kinetin và NAA đến hiệu
quả nhân chồi và sự sinh trƣởng của chồi Vú bò

31
Bảng 3.6. Ảnh hƣởng kết hợp giữa BAP, kinetin và NAA đến
hiệu quả nhân chồi và sự sinh trƣởng của chồi Vú bò

33
Bảng 3.7. Ảnh hƣởng của nồng độ NAA đến khả năng ra rễ
của chồi Vú bò

35
Bảng 3.8. Ảnh hƣởng của giá thể đến tỉ lệ sống và sự sinh
trƣởng của cây Vú bò in vitro trong vƣờn ƣơm

37







viii
DANH MỤC CÁC HÌNH


Trang

Hình 1.1. Cây và quả Vú bò

4
Hình 3.1. Ảnh hƣởng của thời gian khử trùng đến tỉ lệ nảy mầm
và sự phát triển của chồi mầm Vú bò

25
Hình 3.2. Ảnh hƣởng của nồng độ BAP đến hệ số nhân chồi và
sự sinh trƣởng của chồi Vú bò

27
Hình 3.3. Ảnh hƣởng của nồng độ kinetin đến hệ số nhân chồi

và sự sinh trƣởng của chồi Vú bò

29
Hình 3.4. Ảnh hƣởng của của tổ hợp BAP và NAA đến hệ số
nhân chồi và sự sinh trƣởng của chồi Vú bò

31
Hình 3.5. Ảnh hƣởng của tổ hợp kinetin và NAA đến hệ số
nhân chồi và sự sinh trƣởng của chồi Vú bò

32
Hình 3.6. Ảnh hƣởng của tổ hợp BAP, kinetin và NAA đến hệ
số nhân chồi và sự sinh trƣởng của chồi Vú bò

34
Hình 3.7. Ảnh hƣởng của nồng độ NAA đến khả năng ra rễ của
chồi Vú bò

36
Hình 3.8. Ảnh hƣởng của giá thể đến sự sinh trƣởng của cây Vú
bò in vitro trong vƣờn ƣơm

37




1
MỞ ĐẦU

1. Đặt vấn đề
Nƣớc ta may mắn sở hữu nguồn tài nguyên cây thuốc khá dồi dào. Hiện
nay, có hàng ngàn loài cây thuốc gắn với những bài thuốc cổ truyền bản địa
đang đƣợc nhân dân khai thác phục vụ cho chữa trị các bệnh. Việc khai thác
quá mức và thiếu quan tâm đến bảo tồn là nguyên nhân chính khiến tài
nguyên cây thuốc ngày càng cạn kiệt, nhiều loài đứng trƣớc nguy cơ tuyệt
chủng [16].
Theo kết quả điều tra của Viện Dƣợc liệu, cả nƣớc ghi nhận gần bốn
nghìn loài cây thuốc, trong đó chỉ 10% là cây thuốc trồng, còn lại là cây thuốc
trong tự nhiên. Trƣớc tình hình suy giảm nhanh chóng nguồn cây thuốc, vấn
đề bảo tồn cây thuốc trở nên bức thiết. Để thực hiện đƣợc phƣơng châm lấy
dƣợc liệu làm nền tảng trong chiến lƣợc phát triển của ngành Y - Dƣợc, một
trong những trọng điểm của định hƣớng là đẩy mạnh công tác trồng trọt cây
thuốc trên quy mô lớn, phát triển nguồn dƣợc liệu hàng hoá phục vụ cho việc
điều trị trong nƣớc và xuất khẩu, mở ra cơ hội lớn cho việc giao thƣơng, tham
gia thị trƣờng quốc tế về dƣợc liệu và dƣợc phẩm có nguồn gốc tự nhiên [4].
Trong dân gian, một trong những cây thuốc đƣợc sử dụng chữa nhiều
bệnh ở ngƣời đó là cây Vú bò. Cây Vú bò đƣợc phân bố ở Trung Quốc, Ấn
Độ và Việt Nam, rải rác khắp các vùng núi thấp (dƣới 600m) đến trung du và
đồng bằng. Ở nƣớc ta, Vú bò là cây mọc hoang ở các vùng đồi núi [16].
Trong cây Vú bò có nhiều axit hữu cơ, axit amin, các chất triterpen,
alkaloid và coumarin. Bộ phận dùng làm thuốc ở cây Vú bò là rễ và vỏ rễ,
đƣợc dùng thay thế Hoàng kỳ nên có tên là Thổ hoàng kỳ. Theo Đông y, Vú
bò vị cay, ngọt, hơi ấm, có tác dụng kiện tỳ, bổ phế, hành khí lợi thấp, tráng

2
gân cốt, chữa phong thấp tê bại, ho do phế lao, ra mồ hôi trộm, chân tay mệt
mỏi vô lực, ăn ít bụng trƣớng, thủy thũng, viêm gan, bạch đới, phụ nữ sau
sinh không có sữa [20].

Hiện nay, cây Vú bò chƣa đƣợc trồng chính thức mà chỉ đƣợc sử dụng
làm thuốc bằng cách thu hái trong tự nhiên. Vú bò có thể trồng bằng hạt
nhƣng tỉ lệ nảy mầm thấp.
Kĩ thuật nhân giống cây trồng bằng phƣơng pháp nuôi cấy mô tế bào đã
đƣợc áp dụng trên nhiều đối tƣợng cây trồng nhƣ Sa nhân tím [6], Thanh hao
hoa vàng [11], Hoắc hƣơng [18], Lô hội [22], Lan Kim tuyến [24], Ba kích
[27] …và thu đƣợc thành công lớn trong thực tiễn sản xuất.
Xuất phát từ giá trị to lớn của cây Vú bò, việc ứng dụng kĩ thuật nuôi
cấy mô tế bào thực vật nhằm bảo vệ nguồn gen và tạo ra đƣợc một số lƣợng
lớn giống cây Vú bò sạch bệnh, cung cấp cho nuôi trồng là hết sức cần thiết,
do vậy chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài: “Nghiên cứu nhân giống cây Vú
bò (Ficus simplicissima Lour.) bằng phương pháp nuôi cấy mô thực vật”.
2. Mục tiêu nghiên cứu
Xác định đƣợc quy trình nhân giống cây Vú bò trong ống nghiệm và
giá thể đƣa cây ra môi trƣờng tự nhiên nhằm bảo tồn nguồn gen và tạo ra số
lƣợng nhất định cây con đồng đều cung cấp cho sản xuất.
3. Nội dung nghiên cứu
- Nghiên cứu khử trùng hạt để có mẫu sạch ban đầu trong ống nghiệm.
- Nghiên cứu ảnh hƣởng của một số chất điều hòa sinh trƣởng đến khả
năng nhân nhanh và sự sinh trƣởng của chồi Vú bò trong ống nghiệm.
- Nghiên cứu tạo cây hoàn chỉnh thông qua thăm dò ảnh hƣởng của
nồng độ NAA.
- Nghiên cứu giá thể đƣa cây ra môi trƣờng tự nhiên.


3
Chƣơng 1
TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1. Giới thiệu chung về cây Vú bò
1.1.1. Đặc điểm phân loại và sinh học của cây Vú bò
Cây Vú bò có tên khoa học là Ficus simplicissima Lour., tên thƣờng
gọi: Vú bò sẻ, Vú chó, Vú lợn, Ngải phún, Sung ba thùy [1], [16].
Vú bò thuộc chi Đa đề (Ficus).
Họ Dâu tằm (Moraceae).
Bộ Hoa hồng (Rosales).
Lớp Hai lá mầm (Magnoliopsida).
Ngành Hạt kín (Magnoliophyta).
Giới Thực vật (Plantae) [34].
Vú bò thuộc dạng cây nhỏ, cao 1 - 2m. Thân Vú bò ít phân cành, phần
ngọn non có lông. Lá Vú bò mọc so le, thƣờng tập trung ở ngọn thân, hình
bầu dục, gốc tròn hoặc hơi hình tim, đầu thuôn nhọn, có 3 thùy, rộng 4 - 18
cm, mặt trên nháp, mặt dƣới có lông nhỏ, mép khía răng, gân gốc 3, cuống lá
có lông dày cứng, lá kèm hình ngọn giáo [2], [16].
Vú bò có cụm hoa mọc ở kẽ lá gồm hoa đực và hoa cái, hoa đực không
cuống, lá đài 4, hình dải, dính nhau ở gốc, nhị 2, hoa cái có cuống, lá đài 4,
thuôn tù, bầu hình trái xoan. Cành, lá, cuống lá, hoa đều có lông mịn màu
vàng mốc [16].
Quả Vú bò thuộc loại quả phức không cuống, có ít lông, có vị chát,
giòn, màu lục, khi chín thì mềm màu tím, có vị ngọt nhẹ, bên trong có nhiều
hạt (quả thực). Tháng 5 đến tháng 12 là mùa ra hoa kết quả của Vú bò. Toàn
cây Vú bò có nhựa mủ. Rễ Vú bò hình trụ, màu vàng, tƣơng đối thẳng [16].

4

(A) (B)
Hình 1.1. Cây (A) và quả (B) Vú bò
1.1.2. Một số thành phần có hoạt tính dƣợc học của cây Vú bò
Trong rễ cây Vú bò có chứa các axit hữu cơ, axit amin, các chất

triterpen, alkaloid và coumarin…[20]. Trong đó alkaloid và coumarin là hai
trong số các thành phần đóng vai trò quan trọng trong dƣợc liệu.
Alkaloid là những hợp chất hữu cơ có chứa nitơ, đa số có nhân dị vòng,
có phản ứng kiềm, thƣờng gặp trong thực vật và đôi khi có trong động vật,
thƣờng có dƣợc lực tính rất mạnh và cho những phản ứng hóa học với một số
thuốc thử gọi là thuốc thử chung của alkaloid [25], [33].
Về tầm quan trọng trong dƣợc liệu, alkaloid nói chung là những chất có
hoạt tính sinh học. Nhiều alkaloid có tác dụng trên hệ thần kinh trung ƣơng
gây ức chế hoặc gây kích thích. Trong số alkaioid có chất gây tê tại chỗ, có
chất làm giãn cơ trơn, chống co thắt. Có alkaloid làm tăng huyết áp, có chất
làm hạ huyết áp, một số ít alkaloid có thể tác dụng trên tim đƣợc dùng làm
thuốc chữa loạn nhịp tim. Có alkaloid diệt ký sinh trùng dùng để chữa lỵ, trị
sán [8], [26].
Coumarin là những dẫn chất α- pyron có cấu trúc C6 - C3. Ngƣời ta có
thể coi α-pyron là một lacton (este nội) của axit hydroxycinnamic vì khi cho


5
tác dụng axit vô cơ lên axit hydroxycinnamic, ví dụ HCl thì sẽ đóng vòng
lacton. Ngƣợc lại, vòng lacton sẽ bị mở vòng khi tác dụng bởi kiềm. Sự mở
vòng và đóng vòng có tính thuận nghịch [35].
Về tác dụng của coumarin, đáng chú ý là tác dụng của các dẫn chất
coumarin chống co thắt, làm giãn nở động mạch vành. Một số coumarin có
tác dụng chống đông máu, tác dụng nhƣ vitamin P (làm bền và bảo vệ thành
mạch), chữa bệnh bạch biến hay bệnh lang trắng và bệnh vẩy nến, tác dụng
kháng khuẩn. Một số có tác dụng chống viêm [8].
1.1.3. Ứng dụng của cây Vú bò trong y học
Theo Đông y, bộ phận dùng của Vú bò chủ yếu là rễ và vỏ rễ. Thƣờng
rễ đào về thái mỏng, phơi hay sấy khô. Có khi sao vàng hay tẩm mật sao cho
thơm. Có khi nấu thành cao đặc mà dùng [14].

Vị thuốc Vú bò đƣợc sử dụng trong một số đơn thuốc sau:
(1) Chữa phong thấp: Ngày dùng 15 - 20g dƣới dạng thuốc sắc hay
ngâm rƣợu. Mỗi lít rƣợu ngâm 100 - 200g rễ sao vàng, mỗi ngày uống 15 -
20ml rƣợu này.
(2) Chữa đau phong thấp: Rễ Vú bò 60g, móng giò lợn 250g, rƣợu 60g.
Thêm ít nƣớc, sắc còn nửa bát, chia làm 2 lần uống trong ngày cách nhau 4 - 6
giờ.
(3) Chữa ngã bị ứ huyết, ngực bụng đau nhức, hòn cục: Toàn cây Vú bò
giã nát, thêm rƣợu và ít muối, sao nóng đắp lên nơi đau.
(4) Chữa đau dạ dày, viêm tinh hoàn, lòi dom, sa tử cung: Vú bò 30g,
Tô mộc, Hồi đầu thảo, Ngƣu tất, Mộc thông mỗi vị 12 g. Sắc uống
(5) Chữa bế kinh, sau khi đẻ ứ huyết đau bụng: Rễ Vú bò 30 - 60g. Sắc
nƣớc rồi thêm ít rƣợu uống.
(6) Chữa thấp khớp mạn tính: Vú bò (sao vàng) 20g, Dây đau xƣơng
(sao vàng) 16g, rễ Sung (sao) 12g, củ Ráy tía (sao) 12g, rễ Gối hạc (sao vàng)

6
16g, Thiên niên kiện 12g, rễ Bạch hoa xà 8g. Sắc nƣớc, cho thêm ít rƣợu để
uống.
(7) Chữa ứ máu tím bầm do ngã hay bị thƣơng: Lá hay quả giã nát,
chƣng với rƣợu, đắp hay chƣờm.
(8) Sƣng đau tinh hoàn: Rễ Vú bò tƣơi 60 - 120g. Sắc uống.
(9) Bạch đới: Rễ Vú bò khô 60g. Sắc uống
(10) Ăn không ngon miệng, tiêu hoá kém, hay đầy bụng, hay bị phân
sống: Vú bò 20g, Mộc hƣơng 4g, Thảo quả 6g, Đậu khấu 6g. Sắc uống.
(11) Các chứng viêm gan mạn, xơ gan, phù do suy dinh dƣỡng: Vú bò
20g, Diệp hạ châu 16g, Nhân trần 12g, Rau má 16g. Sắc uống.
(12) Khử đờm giảm ho (viêm phế quản, ho có đờm): Vú bò 20g, Mạch
môn 12g, Diếp cá 20g, lá Táo 16g. Sắc uống.
(13) Lợi sữa: Vú bò 20g, Trạch tả 20g, Mộc thông 20g, Xuyên sơn giáp

10g. Sắc uống
(14) Bổ khí, bổ huyết, bổ tỳ, bổ thận: Vú bò 20g, Đƣơng quy 10g, Bạch
truật 10g, Thục địa 10g. Sắc uống, ngày 1 thang. Có thể dùng đơn này với
liều cao hơn để ngâm rƣợu, ngâm 10 - 15 ngày. Uống 30ml mỗi ngày.
(15) Chữa bụng trƣớng đầy, đại tiện táo kết: Nhựa mủ trắng lấy từ cây
Vú bò, trộn với bột Nghệ vàng, làm thành viên. Mỗi lần uống 10 - 15g, ngày
uống 2 lần chiêu với nƣớc trắng [16], [19].
1.2. Kỹ thuật nhân giống cây trồng trong công nghệ sinh học thực vật
1.2.1. Ƣu thế và các phƣơng thức nhân giống in vitro
1.2.1.1. Ƣu thế của nhân giống in vitro
Kĩ thuật nhân giống in vitro phát triển và mở rộng trong những năm
gần đây do nhu cầu về lƣợng giống cây trồng tăng cao. Các giống cây trồng
cần lƣợng lớn nhằm phục vụ dự án trồng lại rừng, sản xuất lƣơng thực, thực

7
phẩm, dƣợc liệu, thức ăn gia súc và bảo vệ môi trƣờng. Nhân giống in vitro có
những ƣu điểm nổi bật mà các loại hình nhân giống khác không có đƣợc, đó là:
(1) Đƣa ra sản phẩm nhanh hơn: Từ một cây ƣu việt bất kì đều có thể
tạo ra một quần thể có độ đồng đều cao với số lƣợng không hạn chế, phục vụ
sản xuất thƣơng mại, dù cây đó là dị hợp về mặt di truyền.
(2) Nhân nhanh với hệ số nhân giống cao: Trong hầu hết các trƣờng
hợp, công nghệ vi nhân giống đáp ứng tốc độ nhân nhanh cao, từ một cây
trong vòng 1 - 2 năm có thể tạo thành hàng triệu cây.
(3) Sản phẩm cây giống đồng nhất: Vi nhân giống về cơ bản là công
nghệ nhân dòng. Nó tạo ra quần thể có độ đồng đều cao dù xuất phát từ cây
mẹ có kiểu gen dị hợp hay đồng hợp.
(4) Tiết kiệm không gian: Vì hệ thống sản xuất hoàn toàn trong phòng
thí nghiệm, không phụ thuộc vào thời tiết và các vật liệu khởi đầu có kích
thƣớc nhỏ. Mật độ cây tạo ra trên một đơn vị diện tích lớn hơn rất nhiều so
với sản xuất trên đồng ruộng và trong nhà kính theo phƣơng pháp truyền

thống.
(5) Nâng cao chất lƣợng cây giống: Nuôi cấy mô là một phƣơng pháp
hữu hiệu để loại trừ virut, nấm khuẩn khỏi các cây giống đã nhiễm bệnh. Cây
giống sạch bệnh tạo ra bằng cấy mô thƣờng tăng năng suất 15 - 30% so với
giống gốc.
(6) Khả năng tiếp thị sản phẩm tốt hơn và nhanh hơn: Các dạng sản
phẩm khác nhau có thể tạo ra từ hệ thống vi nhân giống nhƣ cây con in vitro
(trong ống nghiệm) hoặc trong bầu đất. Các cây giống có thể đƣợc bán ở dạng
cây, củ bi hay thân củ.
(7) Lợi thế về vận chuyển: Các cây con kích thƣớc nhỏ có thể vận
chuyển đi xa dễ dàng và thuận lợi, đồng thời cây con tạo ra trong điều kiện vô
trùng đƣợc xác nhận là sạch bệnh. Do vậy, bảo đảm an toàn, đáp ứng các quy
định về vệ sinh thực vật quốc tế.

8
(8) Sản xuất quanh năm: Quá trình sản xuất có thể tiến hành vào bất kì
thời gian nào, không phụ thuộc mùa vụ [31].
1.2.1.2. Các phƣơng thức nhân giống in vitro
* Nuôi cấy mô phân sinh (đỉnh sinh trưởng)
Khái niệm mô phân sinh chỉ đúng khi mẫu vật nuôi cấy đƣợc tách từ
đỉnh sinh trƣởng có kích thƣớc trong vòng 0,1mm tính từ chóp của tháp sinh
trƣởng. Trong thực tế thƣờng gặp khó khăn lớn trong việc nuôi thành công
các đỉnh sinh trƣởng riêng rẽ nhƣ vậy nên ngƣời ta chỉ áp dụng hình thức nuôi
cấy mô phân sinh với mục đích làm sạch virut cho cây trồng [3], [10].
Độ lớn của chồi (mô) nuôi cấy có mối tƣơng quan chặt chẽ với tỉ lệ
sống, khả năng cảm ứng và mức độ ổn định về mặt di truyền. Nếu độ lớn chồi
tăng thì tỉ lệ sống và tính ổn định tăng, nhƣng có thể làm giảm khả năng cảm
ứng của chồi/mô nuôi cấy và ngƣợc lại. Tuy nhiên, nếu xét về hiệu quả kinh
tế (thể tích bình nuôi, lƣợng dung dịch môi trƣờng dinh dƣỡng…): nếu độ lớn
tăng thì hiệu quả kinh tế giảm, nếu độ lớn giảm thì hiệu quả kinh tế tăng. Do

đó, phải có sự kết hợp hài hòa giữa các yếu tố trên để tìm ra kích thƣớc mẫu
tối ƣu [10].
Một đỉnh sinh trƣởng nuôi cấy ở điều kiện thích hợp sẽ tạo ra một hay
nhiều chồi và mỗi chồi sẽ phát triển thành một cây hoàn chỉnh. Xét về nguồn
gốc của các cây đó có ba khả năng: cây phát triển từ chồi đỉnh (chồi ngọn),
cây phát triển từ chồi nách phá ngủ, cây phát triển từ chồi mới phát sinh. Tuy
nhiên trong thực tế rất khó phân biệt đƣợc chồi phá ngủ và chồi mới phát sinh
[30].
Có hai phƣơng thức phát triển cây hoàn chỉnh từ nuôi cấy đỉnh sinh
trƣởng đó là: (1) Phát triển cây trực tiếp, thƣờng gặp chủ yếu ở các đối tƣợng
cây hai lá mầm nhƣ: hoa cúc, cẩm chƣớng, khoai tây, thuốc lá…(2) Phát triển
cây thông qua giai đoạn protocorm, thƣờng gặp chủ yếu ở các đối tƣợng cây
một lá mầm nhƣ phong lan, dứa, huệ…Từ một đỉnh sinh trƣởng ban đầu cùng

9
lúc tạo ra hàng loạt protocorm và các protocorm này có thể tiếp tục phân chia
thành các protocorm mới hoặc phát triển thành cây hoàn chỉnh. Bằng phƣơng
thức này chỉ trong một thời gian ngắn ngƣời ta có thể thu đƣợc hàng triệu cá
thể [10].
* Tái sinh cây hoàn chỉnh từ các bộ phận khác của cây
Ngoài đỉnh sinh trƣởng là bộ phận nuôi cấy dễ thành công thì các bộ
phận còn lại của cơ thể thực vật (ngoại trừ các mô đã hóa gỗ) cũng đều có thể
sử dụng cho việc nhân giống in vitro, chẳng hạn nhƣ đoạn thân, mảnh lá, các
bộ phận của hoa, vảy củ,… [30].
Sự phát sinh hình thái trực tiếp từ mẫu nuôi cấy bắt đầu từ các tế bào
nhu mô nằm ở trong biểu bì hoặc ngay phía dƣới bề mặt của thân. Một số tế
bào này trở thành mô phân sinh và các túi nhỏ gọi là thể phân sinh phát triển.
Khả năng cảm ứng của mô thực vật cũng tùy thuộc vào nồng độ của các chất
điều hòa sinh trƣởng thực vật, chủ yếu phụ thuộc vào tỉ lệ nồng độ giữa auxin
và cytokinin. Tỉ lệ này lớn hơn 1 thì thƣờng có khuynh hƣớng tạo rễ; tỉ lệ này

nhỏ hơn 1 thƣờng có khuynh hƣớng tạo chồi; nếu tỉ lệ này bằng 1 thì mô nuôi
cấy thƣờng phát sinh callus [10].
* Nhân giống in vitro thông qua giai đoạn mô sẹo (callus)
Nếu tái sinh cây hoàn chỉnh trực tiếp từ mẫu vật cấy ban đầu thì thu
đƣợc nhanh chóng các cây khá đồng nhất về mặt di truyền, tuy nhiên trong
nhiều trƣờng hợp mô nuôi cấy không tái sinh cây ngay mà phát triển thành
khối mô sẹo. Tế bào mô sẹo khi cấy chuyển nhiều lần sẽ không ổn định về
mặt di truyền, để tránh tình trạng đó cần sử dụng mô sẹo vừa phát sinh để thu
đƣợc cây tái sinh đồng nhất về di truyền. Thông thƣờng, ngƣời ta chỉ tiến
hành nhân giống qua giai đoạn mô sẹo đối với những đối tƣợng khó tái sinh
cây trực tiếp [30].
* Nhân giống thông qua phát sinh phôi vô tính - công nghệ hạt nhân tạo
Phôi vô tính là các cá thể nhân giống có cực tính bắt nguồn từ các tế
bào soma. Chúng rất giống phôi hữu tính ở hình thái, quá trình phát triển và

10
sinh lí, nhƣng do không phải là sản phẩm của quá trình thụ tinh giữa giao tử
đực và giao tử cái, vì vậy không có quá trình tái tổ hợp di truyền, do đó các
phôi vô tính có nội dung di truyền giống hệt với các tế bào soma đã sinh ra
chúng [10].
Khả năng tạo phôi vô tính trong nuôi cấy mô thực vật, ngoài các điều
kiện môi trƣờng, điều kiện nuôi cấy, còn phụ thuộc rất lớn vào loài, vào các
giống, dòng trong cùng một loài. Khả năng này đã đƣợc chứng minh là do
một hoặc vài gene phụ trách. Vì vậy, bằng biện pháp lai tạo có thể chuyển khả
năng tạo phôi vô tính cao từ cây này qua cây khác [10].
Hạt nhân tạo là phôi vô tính bọc trong một lớp vỏ polymer nhƣ agar,
agarose, alginatc… Trong cấu trúc lƣới của lớp vỏ đó, nƣớc, chất dinh dƣỡng
đƣợc cung cấp thay cho nội nhũ, giúp cho phôi vô tính có thể nảy mầm trở
thành cây hoàn chỉnh [10].
1.2.2. Các giai đoạn trong quy trình nhân giống vô tính in vitro

Theo Nguyễn Hoàng Lộc (2007), quy trình nhân giống vô tính in vitro
đƣợc thực hiện theo ba giai đoạn [13].
1.2.2.1. Giai đoạn I – Cấy gây
Đƣa mẫu vật từ bên ngoài vào nuôi cấy vô trùng phải bảo đảm những
yêu cầu: Tỉ lệ nhiễm thấp, tỉ lệ sống cao, tốc độ sinh trƣởng nhanh.
Chọn đúng phƣơng pháp khử trùng sẽ cho tỉ lệ sống cao và môi trƣờng
dinh dƣỡng thích hợp sẽ đạt đƣợc tốc độ sinh trƣởng nhanh [13].
1.2.2.2. Giai đoạn II – Nhân nhanh
Ở giai đoạn này, ngƣời ta kích thích tạo cơ quan phụ hoặc các cấu trúc
khác mà từ đó cây hoàn chỉnh có thể phát sinh.
Trong giai đoạn này cần nghiên cứu các tác nhân kích thích phân hóa
cơ quan, đặc biệt là chồi nhƣ: (1) Bổ sung riêng rẽ hoặc tổ hợp chất kích thích
sinh trƣởng phù hợp. Tăng tỉ lệ auxin/cytokinin sẽ kích thích mô nuôi cấy tạo

11
rễ và ngƣợc lại sẽ kích thích phát sinh chồi. (2) Đảm bảo điều kiện nhiệt độ,
ánh sáng phù hợp.
Mục tiêu quan trọng nhất của giai đoạn này là xác định đƣợc phƣơng thức
nhân nhanh nhất bằng môi trƣờng dinh dƣỡng và điều kiện khí hậu tối ƣu [13].
1.2.2.3. Giai đoạn III – Chuẩn bị và đƣa ra ngoài đất
Chuẩn bị và đƣa ra ngoài đất là giai đoạn quan trọng bao gồm việc tạo
rễ, huấn luyện thích nghi với thay đổi nhiệt độ, độ ẩm, sự mất nƣớc, sâu bệnh
và chuyển từ trạng thái dị dƣỡng sang tự dƣỡng hoàn toàn. Quá trình thích
nghi ở đây là quá trình thay đổi những đặc điểm sinh lí và giải phẫu của bản
thân cây non đó. Thời gian tối thiểu cho sự thích nghi là 2 - 3 tuần, trong thời
gian này cây phải đƣợc chăm sóc và bảo vệ trƣớc những yếu tố bất lợi nhƣ
mất nƣớc nhanh làm cho cây bị héo khô, nhiễm vi khuẩn và nấm gây nên hiện
tƣợng thối nhũn, cháy lá do nắng [13].
1.3. Chất điều hòa sinh trƣởng thuộc nhóm auxin và cytokinin sử dụng
trong nuôi cấy mô thực vật

Ngoài các chất cung cấp dinh dƣỡng cho mô nuôi cấy, việc bổ sung
một hoặc nhiều chất điều hòa sinh trƣởng nhƣ auxin, cytokinin và gibberellin
là rất cần thiết để kích thích sự sinh trƣởng, phát triển và phân hóa cơ quan.
Tuy vậy, yêu cầu đối với những chất này thay đổi tùy theo loài thực vật, loại
mô, hàm lƣợng chất điều hòa sinh trƣởng nội sinh của chúng. Các chất điều
hòa sinh trƣởng đƣợc sử dụng nhiều trong nuôi cấy mô thực vật thuộc nhóm
auxin và nhóm cytokinin [31].
1.3.1. Auxin
Bản chất hóa học của auxin tự nhiên trong tế bào thực vật là axit indol
axetic (IAA) và nó là dạng auxin đầu tiên, chủ yếu và quan trọng nhất trong
tất cả các loại thực vật. Trong thực vật nó không chỉ tồn tại ở dạng tự do mà
còn ở dạng liên kết không có hoạt tính sinh học nhƣ IAA-glucose, IAA-

12
myoinositol, IAA-glucan, IAA-aspartate…Các dẫn xuất khác của indol cũng
thể hiện hoạt tính của auxin là indol tryptamine, indol acetaldehyde, indol
pyruvate, indol ethanol [7].
Auxin đƣợc tổng hợp ở tất cả các thực vật bậc cao, tảo, nấm, vi khuẩn và
chủ yếu ở đỉnh chồi ngọn rồi di chuyển xuống các bộ phận non của cơ thể
thực vật nhƣ lá, rễ và các mô dự trữ…Auxin gồm có auxin tự nhiên và auxin
tổng hợp (IBA, NAA, 2,4-D…) [7].
Auxin có nhiều vai trò khác nhau trong đời sống thực vật, liên quan tới
hàng loạt các quá trình sinh lý: Kích thích phân chia và kéo dài tế bào, kích
thích sự mọc rễ ở cành giâm và kích thích sự phát sinh chồi phụ, auxin có các
ảnh hƣởng khác nhau đối với sự rụng lá, quả, sự đậu quả, sự phát triển và chín
của quả, sự ra hoa…Do hoocmon thực vật tác động lên sinh trƣởng thông qua
mối tƣơng quan nồng độ giữa các loại hoocmon khác nhau, nên các quá trình
trên đây không chỉ ảnh hƣởng của auxin mà còn của các hoocmon khác. Tùy
thuộc vào nồng độ tác dụng mà các mô thực vật có các kiểu phản ứng khác
nhau đối với auxin. Phản ứng chủ yếu và nhanh chóng nhất đối với xử lý

auxin là làm tăng độ kéo dài của tế bào thông qua tác dụng trực tiếp lên sự
giãn nở của vách tế bào [7], [31].
Các chất điều hòa sinh trƣởng thuộc nhóm auxin gồm một vài hợp chất
đã đƣợc sử dụng từ rất lâu trong nông nghiệp. Chỉ một thời gian ngắn sau khi
IAA đƣợc tìm thấy trong tự nhiên, nó đã đƣợc tổng hợp và trở thành một hợp
chất có giá trị. Nhƣng IAA không có lợi để dùng trong nông nghiệp bởi nó dễ
dàng bị phân hủy thành các hợp chất mất hoạt tính dƣới ảnh hƣởng của ánh
sáng và vi sinh vật. Một trong những tác dụng của auxin là kích thích sự hình
thành rễ của những lát cắt thân. Một số hợp chất tổng hợp nhân tạo có vai trò
tƣơng tự nhƣ IAA, trong đó có IBA. IBA là hợp chất có hoạt tính auxin yếu

13
nhƣng nó có khả năng ổn định và vô hiệu hệ enzyme làm mất hoạt tính của
auxin [7].
Các auxin thƣờng đƣợc dùng trong nuôi cấy mô và tế bào để kích thích
sự phân bào và sinh trƣởng của mô sẹo, đặc biệt là 2,4-D, tạo phôi vô tính, tạo
rễ… Những auxin dùng rộng rãi trong nuôi cấy mô là IBA (3-indol butiric
axit), IAA (3-indol axetic axit), NAA (naphthalen axetic axit), 2,4-D (2,4-
dichlorophenoxy axetic axit). Trong số các auxin, IBA và NAA chủ yếu sử
dụng cho môi trƣờng ra rễ và phối hợp với cytokinin sử dụng cho môi trƣờng
ra chồi. Auxin thƣờng hòa tan trong ethanol hoặc NaOH pha loãng [31].
1.3.2. Cytokinin
Phần lớn cytokinin là dẫn xuất của purin. Loại cytokinin đầu tiên phát
hiện đƣợc và cũng là dạng phổ biến nhất là zeatin tách từ mầm ngô. Ngoài ra
còn có hàng loạt cytokinin khác nhƣ kinetin, dihydrozeatin, benzyladenin,
chlorephenylurea…, trong đó kinetin không có mặt trong tự nhiên, mà ngƣời
ta thu nhận bằng cách xử lý nhiệt DNA [7].
Chứng minh về khả năng ngăn cản sự vàng lá của benzyladenin (BA) là
một phát hiện thu hút nhiều nhà sinh lý học từ những năm 1950. Những năm
1960, các nhà nghiên cứu thấy rằng BA có thể kích thích nhiều quá trình, BA

đƣợc sử dụng trong nuôi cấy mô để kéo dài chồi và phát sinh phôi với các
nồng độ khác nhau tùy theo đối tƣợng thực vật nuôi cấy và mục đích nuôi cấy
[7].
Cytokinin có mặt trong mọi thực vật, với hàm lƣợng cao nhất trong phôi
và trong quả đang phát triển. Hoạt tính của chúng đƣợc tăng cƣờng khi chúng
tƣơng tác với myo-inositol, nhƣng có thể bị mất khi kết hợp trong thành phần
của các glycoside [7].
Cũng nhƣ auxin, cytokinin tham gia điều hòa các phản ứng trong cây,
đồng thời làm tăng các quá trình trao đổi axit nucleic và protein. Cytokinin

14
điều chỉnh sinh trƣởng bằng nhiều cách nhƣ điều chỉnh tốc độ tổng hợp ADN
khi phân chia tế bào, làm chậm sự lão hóa của lá, góp phần phá vỡ trạng thái
ngủ của hạt, kích thích hạt nảy mầm, kích thích ra hoa và sinh trƣởng của quả,
gây nên sự hình thành chồi mầm trong nhiều mô, làm tăng diện tích phiến lá
do kích thích sự lớn lên của tế bào [31].
Trong môi trƣờng nuôi cấy mô, cytokinin cần cho sự phân chia tế bào,
tạo và nhân mô sẹo, phân hóa chồi từ mô sẹo hoặc từ các cơ quan, gây tạo
phôi vô tính, kích thích phát sinh chồi nách và kìm hãm ảnh hƣởng ƣu thế của
chồi đỉnh, tăng cƣờng phát sinh chồi phụ. Các loại cytokinin thƣờng đƣợc
dùng là: kinetin, BAP… Cytokinin hòa tan trong dung dịch HCl pha loãng
[31].
1.4. Tình hình nhân giống cây dƣợc liệu bằng phƣơng pháp nuôi cấy mô
tế bào thực vật ở trong nƣớc
Ở Việt Nam, công nghệ nuôi cấy mô tế bào phục vụ nhân giống cây
trồng đã đƣợc triển khai trên 20 năm nay. Nhân giống thƣơng mại quy mô
lớn đã đạt đƣợc ở một số cây trồng nhƣ nhân nhanh giống chuối (khoảng 2
triệu cây/năm), nhân nhanh giống khoai tây sạch bệnh, nhân nhanh các giống
mía mới nhập nội năng suất cao, nhân nhanh các dòng bạch đàn chọn lọc và
keo lai đạt 3 triệu cây/năm. Công nghệ nhân giống cũng đƣợc áp dụng trên

nhiều cây trồng khác nhau nhƣ dứa, dứa sợi, cà phê, tếch, các cây thuốc quý,
các loài lan và cây hoa, cây cảnh, cây ăn quả…Việc thƣơng mại hóa các quy
trình công nghệ trên đây là chìa khóa quan trọng để mở ra sự bùng nổ ứng
dụng công nghiệp vi nhân giống ở nƣớc ta trong những năm tới [10].
Đối với tài nguyên cây thuốc việc bảo tồn có ý nghĩa hết sức quan
trọng. Nhiều loài cây thuốc đang đứng trƣớc nguy cơ bị tuyệt chủng do khai
thác quá mức. Với những ƣu thế của công nghệ nuôi cấy mô tế bào, việc ứng
dụng vào bảo tồn nguồn gen cây thuốc đã đƣợc nhiều tác giả quan tâm nhƣ:

15
Năm 2006, nhóm nghiên cứu của Nguyễn Phú Lịch và cs đã tiến hành
nhân giống Thanh hao hoa vàng bằng kĩ thuật nuôi cấy in vitro. Nghiên cứu
cho thấy có thể sử dụng môi trƣờng MS cơ bản hoặc môi trƣờng MS bổ sung
BAP 1,5 mg/l hay kinetin 1,5 mg/l để nhân giống cây Thanh hao hoa vàng,
môi trƣờng bổ sung NAA 0,3 mg/l là môi trƣờng ra rễ thích hợp nhất [11].
Trong một nghiên cứu khác về cây Thanh hao của tác giả Nguyễn Thị Kim
Uyên và cs (2007) đã đề xuất môi trƣờng thích hợp cho sự nhân chồi là LV có
bổ sung BAP 0,3 mg/l, môi trƣờng thích hợp cho nuôi cấy tăng sinh tế bào
soma là LV + BA 0,5 mg/l + NAA 0,5 mg/l [29].
Nghiên cứu nuôi cấy rễ bất định sâm Ngọc Linh của tác giả Nguyễn
Trung Thành và cs đã cho thấy môi trƣờng nuôi cấy MS có bổ sung 2,4-D
1 mg/l là tối ƣu cho sự hình thành và phát triển mô sẹo của sâm Ngọc Linh; số
rễ bất định hình thành cao nhất và tăng trƣởng tốt ở nồng độ IBA 2 mg/l;
nồng độ đƣờng 50 g/l là tối ƣu cho sự sinh trƣởng của rễ bất định [23].
Nhóm nghiên cứu của Nguyễn Thị Kim Thanh (2008) đã tiến hành
nhân giống vô tính in vitro cây Lô hội và thu đƣợc kết quả: Môi trƣờng MS
bổ sung BAP 2,5 mg/l cho hệ số nhân cao, chất lƣợng chồi tốt. Bổ sung than
hoạt tính 1,5 - 2 g/l cho khả năng ra rễ đạt cao nhất. Giá thể ra cây Lô hội in
vitro thích hợp là cát mịn, tỉ lệ sống cao, cây sinh trƣởng phát triển tốt [22].
Tác giả Võ Châu Tuấn và Huỳnh Minh Tƣ (2010) đã đƣa ra môi trƣờng

tái sinh chồi in vitro cây Ba kích tím là MS bổ sung kinetin 0,25 mg/l, môi
trƣờng nhân chồi là MS bổ sung BAP 3,5 mg/l + IBA 0,2 mg/l, môi trƣờng
tạo rễ là MS bổ sung IBA 0,2 - 0,25 mg/l [27].
Vũ Thị Lan và cs (2011) đã đề xuất môi trƣờng thích hợp cho sự sinh
trƣởng mô sẹo cây Trinh nữ hoàng cung để thu sinh khối là: SB1 (MS + NAA
2,0 mg/l + BAP 0,5 mg/l) và SB2 (MS + NAA 2,0 mg/l + 1,0 mg/l BAP);
SK6 (MS + NAA 2,0 mg/l + kinetin 1,0 mg/l) và SK7 (MS + NAA 2,0 mg/l
+ kinetin 1,5 mg/l); SN9 (MS + NAA 2,0 mg/l + 10% nƣớc dừa) và SN10
(MS + NAA 2,0 mg/l + 20% nƣớc dừa) [9]. Cũng thông qua giai đoạn mô sẹo