khảo sát quy trình thu nhận các hợp chất có hoạt tính sinh học từ việc nuôi cấy tế bào hai

ĐẠI HỌC QUỐC GIA THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
o0o


QCH NGƠ DIỄM PHƢƠNG




KHẢO SÁT QUY TRÌNH THU NHẬN CÁC HỢP CHẤT
CĨ HOẠT TÍNH SINH HỌC TỪ VIỆC NI CẤY TẾ
BÀO HAI LỒI DROSERA

Chun ngành: Sinh hóa
Mã số: 62 42 30 15




TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC





Tp. Hồ Chí Minh, năm 2011

Công trình được hoàn thành tại: Trường ĐH Khoa học Tự nhiên, TP.HCM
Người hướng dẫn khoa học: NGƯT. PGS. TS. BÙI VĂN LỆ

Phản biện 1:


Phản biện 2:


Phản biện 3:


Luận án sẽ được bảo vệ trước Hội đồng chấm luận án cấp nhà nước họp tại


vào hồi giờ ngày tháng năm





Có thể tìm hiểu luận án tại thư viện:
(ghi tên các thư viện nộp luận án)
1

MỞ ĐẦU
Tính cấp thiết của luận án: Drosera có giá trị dược tính trong điều
trị các căn bệnh như: lao, ung thư, HIV, tim mạch, ho gà, hen
suyễn…kể cả những căn bệnh do đột biến [Samaj J., 1999]. Drosera

trong tự nhiên tương đối hiếm, là loài có nguy cơ tuyệt chủng, nhiều
quốc gia đã ban hành luật để bảo vệ chúng [Blehova A, 1995],
[Bonnet M, 1984]. Ở Việt Nam, có 3 loài Drosera [Phạm Hoàng Hộ,
1995]; chưa loài nào được nghiên cứu về thành phần hóa học, dược
tính [Đỗ Tất Lợi]. Đề tài đã ra đời với nhu cầu thiết yếu của nó.
Mục tiêu đề tài: Bảo tồn nguồn cây Drosera vốn khan hiếm; khai
thác tiềm năng dược tính 1 loài cây hoang dại ở Việt Nam; đáp ứng
nhu cầu thực vật cũng như về dược chất 1 cách chủ động
Đối tƣợng và nội dung nghiên cứu:
Đối tượng: cây bắt ruồi D. indica L. và D. burmanii Vahl
Nội dung nghiên cứu: thiết lập quy trình vi nhân giống 2 loài
Drosera được thu hái ở Việt Nam; sàng lọc, thu nhận, xác định một
số hợp chất có hoạt tính sinh học từ nguồn nguyên liệu in vitro của 2
loài Drosera này; khảo sát việc ứng dụng một số kỹ thuật làm tăng
năng suất thu nhận hoạt chất có tiềm năng trên hệ thống nuôi cấy tế
bào in vitro Drosera (cây con, dịch huyền phù): lựa chọn điều kiện
nuôi cấy thích hợp; bổ sung tiền chất; sử dụng những nhân tố cảm
ứng con đường sinh tổng hợp (elicitor, stress)
Bố cục của luận án: luận án gồm 150 trang, bao gồm: Mở đầu 2
trang, Tổng quan tài liệu 32 trang, Vật liệu phương pháp 28 trang,
Kết thào luận 82 trang, Kết luận và đề nghị 3 trang, với 54 bảng, 76
hình. Tài liệu tham khảo gồm 11 tài liệu tiếng Việt, 108 tài liệu tiếng
Anh, 11 tài liệu từ internet.

2

1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU
Dịch chiết từ Drosera được chứng minh là có nhiều dược tính và
những hoạt tính có giá trị ứng dụng khác [Samaj J., 1999]. Cho đến
nay, Drosera vẫn còn đang là đối tượng thu hút các nhà khoa học về

giá trị trị liệu của chúng. Tháng 5/2009, V.Madhavan và các cộng sự
(2009) vừa chứng minh được cả dịch chiết alcohol và dịch chiết nước
của D. burmanii đều có khả năng chống thụ thai trên chuột. Tháng
10/2009, Hema B và cộng sự (2009) đã khẳng định có thể sử dụng D.
burmanii để điều chế thuốc điều trị chứng co giật, động kinh với giá
thành rẻ mà hạn chế tác dụng phụ hơn so với thuốc tổng hợp. Do nhu
cầu của Drosera trên thế giới ngày càng tăng cao mà cây trong tự
nhiên lại đang trong tình trạng bị đe dọa tuyệt chủng nên nhiều công
trình trên thế giới đã tập trung nghiên cứu nuôi cấy in vitro cũng như
thu nhận dược chất bằng công nghệ nuôi cấy tế bào Drosera và đã
thu được một số kết quả khả quan [Hook L.(2001), Nahalka J.(1996),
Putalun W.(2010), Krolicka A.(2008)] . Thế nhưng cho đến nay chưa
thấy tài liệu nào công bố những nghiên cứu trên đối tượng này ở Việt
Nam.
2 VẬT LIỆU PHƢƠNG PHÁP
Nguyên liệu nuôi cấy: trái chứa hạt của 2 loài Drosera được thu thập
từ khu bảo tồn thiên nhiên Bình Châu – Phước Bửu (tỉnh Bà Rịa–
Vũng Tàu). Việc định danh mẫu thu hái được tiến hành bởi BM.
Thực vật học (nay là BM. Sinh thái và Sinh học tiến hóa) của Trường
ĐH Khoa học tự nhiên, TP. HCM.
2.1 Nuôi cấy in vitro hai loài Drosera để tạo nguồn nguyên liệu
khởi đầu
Nhân giống bằng chồi bên và tạo chồi bất định từ lớp mỏng tế bào
bằng cách bổ sung BA với các nồng độ khác nhau từ 0- 5mg/l; thử
3

nghiệm quy trình nuôi cấy hai bước trong việc cải thiện hệ số nhân
chồi [Christoph W.,2009]; tạo rễ và phát triển cây con hoàn chỉnh.
Chỉ tiêu theo dõi: tỷ lệ mẫu tạo chồi, số chồi/ 1 mẫu, chiều cao chồi.
2.2 Sàng lọc và thu nhận một số hợp chất có hoạt tính sinh học

từ nguồn nguyên liệu in vitro của Drosera
Các bước tiến hành sàng lọc để cô lập hoạt chất từ nguồn nguyên liệu
in vitro của hai loài Drosera
Xử lý mẫu: cây trưởng thành in vitro sau 8-10 tuần nuôi cấy của
hai loài Drosera được rửa sạch, phơi hay sấy khô ở nhiệt độ 50
0
C đến
trọng lượng không đổi, xay nhuyễn tạo bột cây khô.
Điều chế các loại cao chiết: bột cây khô được chiết kiệt với lần
lượt 4 loại dung môi có độ phân cực tăng dần: n-hexan, chloroform,
ethyl acetate, ethanol bằng phương pháp ngâm dầm trong 48 giờ, ở
nhiệt độ thường [Nguyễn Kim Phi Phụng, 2007].
Sàng lọc các cao chiết có hoạt tính sinh học mạnh: tiến hành khảo
sát và chọn phân đoạn cao có hoạt tính sinh học cao nhất ở mỗi định
hướng: (1)tìm hợp chất có hoạt tính kháng oxy hóa mạnh bằng thử
nghiệm năng lực khử của các phân đoạn cao có độ phân cực khác
nhau bằng phương pháp Yen và Duh (1993); (2)tìm hợp chất có khả
năng ức chế tăng sinh tế bào ung thư ruột kết DLD-1 của các phân
đoạn cao có độ phân cực khác nhau bằng phương pháp
Sulforhodamine B (SRB) [Rubinstein L.V.,1990]
Cô lập hoạt chất từ các phân đoạn đã sàng lọc: sắc ký cột silica
gel, sắc ký lọc gel Sephadex LH-20, sắc ký lớp mỏng điều chế với
bảng sắc ký tráng sẵn
Kiểm tra hoạt tính sinh học của hợp chất cô lập: (1) sử dụng
phương pháp TBA (thiobarbituric acid) và phương pháp FTC (ferric
thyocyante) để kiểm tra hoạt tính kháng oxy hóa [Zin Z. M.,2002];
4

(2) khảo sát ảnh hưởng của hoạt chất lên sự tăng sinh và phát triển tế
bào ung thư ruột kết DLD-1 bằng phương pháp đếm tế bào trên máy

Coulter counter và ảnh hưởng của hoạt chất lên sự sinh tổng hợp
protein và biểu hiện của protein mTOR (mammalian target of
rapamycin) [Sarbassov D. D.,2005], một protein kinase thiết yếu cho
sự tăng sinh và phát triển tế bào động vật, bằng phương pháp điện di
miễn dịch Western Blot.
2.2.1 Xác định cấu trúc và hàm lượng hoạt chất
Xác định cấu trúc: kết hợp các phương pháp hóa lý hiện đại như
khối phổ MS, cộng hưởng từ hạt nhân 1D và 2D (
1
H-,
13
C-, DEPT-
NMR, COSY, HMQC, HMBC)
Xác định hàm lượng: phổ tử ngoại (UV), sắc ký lỏng cao áp (HPLC)
2.2.2 Lựa chọn hợp chất có tiềm năng làm hợp chất đích cho
mục tiêu nghiên cứu tăng năng suất thu nhận trên đối
tượng này
Các hợp chất có hoạt tính sinh học sau khi cô lập và xác định cấu
trúc, được xác định hàm lượng trong hai loài Drosera nuôi cấy in
vitro bằng phương pháp HPLC.
2.3 Khảo sát việc ứng dụng một số kỹ thuật làm tăng năng suất
thu nhận hoạt chất lên hệ thống nuôi cấy cây con tái sinh
Khảo sát vòng đời in vitro để xác định các giai đoạn tăng trưởng ở
Drosera: theo dõi và ghi nhận thời gian của từng giai đoạn ở mỗi cá
thể trong một quần thể có cùng điều kiện nuôi cấy và trên cùng thành
phần môi trường như đã cố định từ khi hạt được gieo trong điều kiện
nuôi cấy in vitro cho đến khi cây bắt đầu có phát hoa từ đỉnh sinh
trưởn, nhằm tìm thời điểm thích hợp cho việc nuôi cấy cũng như tác
động tăng sinh hoạt chất.
5

Khảo sát điều kiện nuôi cấy thích hợp cho sự tăng trưởng và tích
lũy hoạt chất của cây con: lựa chọn các điều kiện nuôi cấy như hàm
lượng khoáng đa lượng, ánh sáng, pH môi trường, mật độ cá thể nuôi
cấy ban đầu.
Khảo sát một số tác nhân tác động lên sự tích lũy hoạt chất của cây
con: chất điều hòa tăng trưởng NAA, bổ sung tiền chất
(phenyalanine, tyrosine), sử dụng chất cảm ứng (acid salicylic, cao
nấm men), gây stress nitrogen.
Kiểm chứng hiệu quả làm tăng năng suất thu nhận hoạt chất lên hệ
thống nuôi cấy cây con tái sinh của các tác nhân đã khảo sát.
2.4 Khảo sát ứng dụng một số kỹ thuật làm tăng năng suất thu
nhận hoạt chất lên hệ thống nuôi cấy dịch huyền phù tế
bào
2.4.1 Tạo dịch huyền phù tế bào
Tạo mô sẹo: tìm nền khoáng và nồng độ đường thích hợp cho sự
sống của lớp mỏng tế bào, trên nền khoáng và nồng độ đường đó tìm
sự kết hợp 3 loại hormone tăng trưởng 2,4-D, NAA, KN thích hợp
nhất.
Tạo dịch huyền phù tế bào từ mô sẹo: 20-30 mẫu mô sẹo tạo thành
được chuyển vào một erlen có thể tích 125ml chứa 15ml môi trường
lỏng có cùng thành phần với môi trường tạo sẹo trước đó, erlen được
đặt trong điều kiện nuôi đã cố định, trên máy lắc 125 vòng/phút.
Thử nghiệm tạo dịch huyền phù tế bào trực tiếp từ lớp mỏng tế
bào: thử nghiệm nuôi lỏng lắc 20-30 mẫu lớp mỏng tế bào thân và rễ
trong điều kiện nuôi tương tự như tạo dịch huyền phù từ mô sẹo.
Kiểm tra khả năng sống của tế bào trong các dịch huyền phù tế bào
tạo thành bằng phương pháp nhuộm TTC: tế bào chết không có
màu trong khi tế bào sống có màu hồng do hoạt động hô hấp của tế
6

bào tạo ra những hợp chất có khả năng kết hợp với 2,3,5-
triphenyltetrazolium chloride (TTC) tạo phức chất formanzan màu
hồng [Victor M., 2006].
Lựa chọn dịch huyền phù tế bào được tạo thành từ loại mô có khả
năng tích lũy hoạt chất cao hơn làm nguồn vật liệu đầu cho các thí
nghiệm tăng sinh: xác định hàm lượng plumbagin trong mô lá, mô rễ
thu hoạch từ cùng các cá thể cây in vitro có độ tuổi 8-10 tuần
2.4.2 Ứng dụng một số kỹ thuật tăng năng suất thu nhận hoạt
chất lên hệ thống nuôi cấy dịch huyền phù tế bào
Khảo sát đường cong tăng trưởng của dịch huyền phù tế bào có
mật độ tế bào nuôi ban đầu khác nhau: kết hợp khảo sát đường
cong tăng trưởng và mật độ nuôi cấy tế bào ban đầu thích hợp. Theo
dõi và ghi nhận thời gian của mỗi pha trong dịch huyền phù tế bào
bằng phương pháp đếm tế bào trong buồng đếm có khả năng giữ
lượng thể tích cố định dịch huyền phù tế bào trên một diện tích đã
biết để xác định mật độ tế bào nuôi cấy cứ 4 ngày một lần.
Khảo sát điều kiện nuôi cấy thích hợp cho sự tăng trưởng và tích
lũy hoạt chất: ánh sáng, tốc độ lắc
Khảo sát một số tác nhân tác động lên sự tích lũy hoạt chất của
dịch huyền phù: chất điều hòa tăng trưởng 2,4-D; bổ sung tiền chất
(phenylalanine, tyrosine), sử dụng chất cảm ứng (acid salicylic).
Kiểm chứng hiệu quả làm tăng năng suất thu nhận hoạt chất lên hệ
thống nuôi cấy dịch huyền phù tế bào Drosera của các tác nhân đã
khảo sát bằng phương pháp HPLC.
2.5 Xử lý thống kê
Số liệu thu được từ kết quả của các thí nghiệm được xử lý thống kê
bằng phần mềm SPSS phiên bản 16.0 với Duncan, Dunnett test, độ
tin cậy 95% .
7

3 KẾT QUẢ -THẢO LUẬN
3.1 Nuôi cấy in vitro hai loài Drosera để tạo nguồn nguyên liệu
khởi đầu
Khử trùng nguyên liệu nuôi cấy: quy trình khử trùng có bước cải
tiến hơn là xử lý hạt với giberelin 1% trong 24 giờ, giúp rút ngắn rất
nhiều thời gian nẩy mầm thông thường của hạt Drosera (từ 21 ngày
xuống còn 15 ngày), với tỷ lệ hạt vô trùng và nẩy mầm đạt 93-95%.
Nhân giống bằng chồi bên: nồng độ thích hợp để nhân chồi bên từ
đốt thân D. indica là (0,5 mg/l), và D. burmanii là (2mg/l).
Nhân giống bằng tạo chồi bất định từ lớp mỏng tế bào: các bộ phận
lóng thân, lá, cuống lá, cuống hoa của cây con Drosera đều được thử
nghiệm. Tuy nhiên, sau 5 tuần nuôi cấy, chỉ có lớp tế bào ở đoạn
ngọn phát hoa là có khả năng tái sinh chồi bất định dưới tác động của
BA. Trong đó, nồng độ thích hợp để tạo chồi bất định từ lớp tế bào
của đoạn ngọn phát hoa của D. indica là (1 mg/l), và D. burmanii là
(2mg/l). Kết quả này được xem là 1 thành công trong việc nhân
nhanh giống cho Drosera, đặc biệt ở D. burmanii: cá thể có 1 đốt
thân rất ngắn nhưng có thể có từ 2-4 phát hoa dài; khi phát hoa được
cắt đi, lập tức phát hoa khác sẽ được tái sinh và nếu cắt liên tục phát
hoa non, cây có thể kéo dài đời sống hơn bình thường.
Thử nghiệm quy trình nuôi cấy hai bước trong việc cải thiện khả
năng nhân chồi và phát triển thành cây con hoàn chỉnh: đốt thân
hay chồi con được tiến hành nhân giống theo hai bước: (1) nuôi cấy
trên môi trường MS (rắn, lỏng) với nồng độ BA thích hợp đã xác
định (0,5mg/l cho D. indica; 2mg/l cho D. burmanii) nhưng chỉ trong
2 tuần; (2) sau đó các mẫu cấy đã được cảm ứng nhân chồi bên được
lập tức chuyển sang môi trường MS (rắn, lỏng) bổ sung đầy đủ các
thành phần ngoại trừ BA trong 3 tuần tiếp theo. Sau 5 tuần nuôi cấy,

8


so sánh với mẫu đối chứng không áp dụng quy trình nuôi cấy lỏng 2
bước. Kết quả cho thấy việc nuôi cấy hai bước theo quy trình của
Christoph Wawrosch (2009) áp dụng trên cả hai loài Drosera đều đạt
hiệu quả cao, trong đó NT2 (2 tuần đầu cảm ứng tạo chồi bằng MS
rắn bổ sung BA, 3 tuần sau chuyển mẫu đã cảm ứng sang môi trường
MS lỏng không bổ sung hormone) là thích hợp nhất cho việc cải
thiện khả năng nhân chồi và phát triển cây con với tỷ lệ tạo chồi cao
nhất (100%) và số chồi trên một mẫu cao hơn (D. indica: cao gấp
1,58 lần; D. burmanii cao gấp 2,03 lần) so với đối chứng.
Tạo rễ và phát triển cây con hoàn chỉnh: chồi con tách ra từ cụm
chồi mẹ sau 6-8 tuần nuôi cấy có thể phát triển thành cây con hoàn
chỉnh trên môi trường MS với đầy đủ các bộ phận kể cả việc tạo rễ
mà không cần bổ sung auxin.
3.2 Sàng lọc và thu nhận một số hợp chất có hoạt tính sinh học
từ nguồn nguyên liệu in vitro của Drosera
3.2.1 Sàng lọc và cô lập hợp chất có hoạt tính kháng oxy hóa
3.2.1.1 Sàng lọc và cô lập hoạt chất
Kết quả sàng lọc lần 1: trong 8 loại cao chiết đã điều chế, cao
chiết chloroform của D.indica (15,72g) được chọn.
Tiến hành giải ly trên sắc ký cột silica gel bằng hệ dung môi gồm
(chloroform:ethyl acetate) với độ phân cực tăng dần từ 0% ethyl
acetate đến 100% ethyl acetate trong chloroform.
Định tính phân đoạn chứa phenolic: chọn được 5 phân đoạn (1, 2,
5, 6, 9) trong 9 phân đoạn.
Kết quả sàng lọc lần 2: phân đoạn 6 ( 2g cao) có hoạt tính kháng
oxy hóa cao nhất.
Sắc ký lọc gel Sephadex LH-20, giải ly với hệ dung môi

chloroform-methanol (1:1) phân đoạn 6 cho phép cô lập được một
9


hợp chất A (m= 49mg) có dạng tinh thể hình kim mịn, vàng ánh sau
khi được kết tinh trong hệ dung môi chloroform-ethyl acetate (3: 7).
3.2.1.2 Khảo sát hoạt tính kháng oxy hóa của hợp chất cô lập
Kết quả ở cả hai phương pháp (FTC và TBA) đều cho khả năng ức
chế quá trình peroxide hóa lipid của hợp chất A rất cao, xếp cùng
nhóm với Vitamin E và BHA khi thống kê (bảng 3.11).
Bảng 3.1. % hoạt tính kháng oxy hóa AI (%) của A

Chứng âm
Vitamin E
BHA
Hợp chất A
AI (% ± SE)
(phương pháp TBA)
0,00 ± 0,00a
76,31± 5,34b*
90,06±1,89b*
81,21± 9,17b*
AI (% ± SE)
(phương pháp FTC)
0,00 ± 0,00a
12,79 ± 2,64ab
23,33±5,25b*
28,59 ± 6,53b*
Các số trung bình trong cột với các mẫu tự khác nhau thì khác biệt nhau, * chỉ sự khác biệt
giữa các nghiệm thức với đối chứng, sự khác biệt có ý nghĩa ở mức p=0,05

3.2.1.3 Xác định cấu trúc hóa học của hoạt chất A
Hợp chất được xác định có cấu trúc là C
15
H
10
O
7
; M=302,226, danh
pháp hóa học 2-(3,4-dihydrophenyl)-3,5,7-trihydroxy-4H-chromen-4-
one, tên thương mại là quercetin.
3.2.2 Sàng lọc và cô lập hợp chất có khả năng ức chế tăng sinh
tế bào in vitro
3.2.2.1 Sàng lọc và cô lập hoạt chất
Kết quả sàng lọc lần 1: trong 8 loại cao chiết từ hai loài Drosera
nuôi cấy in vitro, cao chloroform D. burmanii (18,45g) được chọn.
Sắc ký cột silica gel với pha động là hệ dung môi chloroform:
ether dầu hỏa với độ phân cực tăng dần từ 0% chloroform đến 100%
chloroform trong ether dầu hỏa.
Kết quả định tính phân đoạn cao chứa hợp chất phenolic: chọn ra
4 phân đoạn (2, 3, 4, 8) từ 8 phân đoạn sau sắc ký cột.
Kết quả sàng lọc lần 2: trong 4 phân đoạn khảo sát, phân đoạn thứ
3 cho tỷ lệ ức chế tăng sinh dòng tế bào ung thư ruột kết DLD-1 cao
nhất. Do đó, phân đoạn 3(3,48g) được chọn đem cô lập hợp chất có
10


khả năng ức chế tăng sinh tế bào. Sắc ký cột silica gel phân đoạn đã
chọn, giải ly bằng hệ dung môi (ether dầu hỏa:chloroform) với độ
phân cực tăng dần từ 20% chloroform cho đến 50% chloroform trong
ether dầu hỏa cho một phân đọan chứa hợp chất có dạng tinh thể hình

kim, màu cam đỏ.
Phân đoạn này được tinh chế nhiều lần bằng sắc ký lớp mỏng điều
chế với hệ dung môi ether dầu hỏa-chloroform (8:2) cho đến khi sản
phẩm thu được chỉ còn 1 vết tròn rõ có Rf = 0,48. Kết quả cho phép
cô lập được một hợp chất B (m=65mg)
3.2.2.2 Khảo sát hoạt tính của hợp chất cô lập được theo định
hướng có khả năng ức chế sự tăng sinh của tế bào ung thư
ruột kết ở người DLD-1
Kết quả từ các thí nghiệm đếm tế bào bằng máy đếm và xác định kích
thước tế bào Coulter counter cho thấy hợp chất B có khả năng ức chế
mạnh sự tăng sinh tế bào (IC50=3,53µM sau 48 giờ cảm ứng). Trong
đó, khi ở nồng độ cao (2,5-5µM), hợp chất B làm giảm kích thước tế
bào dần dần cho đến khi tế bào mất khả năng bám dính rồi chết. So
với resveratrol, một hợp chất ly trích từ vỏ trái nho đang được nghiên
cứu sử dụng như một dược chất điều trị ung thư, tác dụng ức chế tăng
sinh và phát triển của hợp chất B trên dòng tế bào DLD-1 khác hẳn:
res cũng ức chế sự tăng sinh tế bào nhưng làm tăng kích thước tế bào
trong 48 giờ đầu cảm ứng [AzizMH,2003], [Kristoffersen P.K.,
2006]. Nhưng so với rapamycin, một chất kháng sinh được công
nhận về khả năng ức chế con đường truyền tín hiệu của protein
mTOR, protein giữ vai trò chính trong việc tăng sinh và phát triển tế
bào, thì tác dụng của hợp chất B lên DLD-1 có phần tương tự: ức chế
và làm giảm kích thước tế bào dần dần cho đến khi mất khả năng
bám dính ngay sau 2 giờ cảm ứng [Noriko O., 2004]. Do vậy, với kết
11


quả đếm tế bào, hợp chất B có thể sẽ là một hợp chất có tiềm năng sử
dụng tương tự như rapamycin. Cũng vì lý do này, phương pháp điện
di miễn dịch được tiến hành nhằm khảo sát xem cơ chế tác dụng của

hợp chất B trong việc ức chế tăng sinh và phát triển của tế bào in
vitro thông qua sự biểu hiện của protein mTOR, một protein kinase
giữa vai trò thiết yếu cho sự tăng sinh và phát triển tế bào động vật,
và con đường truyền tín hiệu của nó giống hay khác với cơ chế tác
dụng của rapamycin. Kết quả cho thấy hợp chất B có ảnh hưởng lên
sự biểu hiện của mTOR và pmTOR nhưng cơ chế ảnh hưởng hoàn
toàn khác với rapamycin vì protein đích của hợp chất B không phải
S6K, một protein downstream của mTOR giữ vai trò quan trọng
trong sinh tổng hợp protein, như ở rapamycin.
3.2.2.3 Xác định cấu trúc hóa học của hợp chất B
Hợp chất được xác định có cấu trúc là C
11
H
8
O
3,
danh pháp hóa học 2-
methyl-5-hydroxy-1,4-naphthoquinone, tên thương mại plumbagin
3.2.3 Lựa chọn hợp chất có tiềm năng làm hợp chất đích cho
mục tiêu nghiên cứu tăng năng suất thu nhận trên đối
tượng này
Trong giới hạn của luận án, để nghiên cứu ứng dụng các kỹ thuật
tăng sinh thu nhận hoạt chất trên Drosera, kết quả định lượng bằng
HPLC giúp chọn 1 hoạt chất đích là plumbagin và đối tượng nghiên
cứu được chọn trong hai loài là D. burmanii.
3.3 Khảo sát việc ứng dụng một số kỹ thuật làm tăng năng suất
thu nhận hoạt chất lên hệ thống nuôi cấy cây con
3.3.1 Khảo sát vòng đời in vitro để xác định các giai đoạn tăng
trưởng của D. burmanii
Kết quả theo dõi và ghi nhận vòng đời của D. burmanii nuôi cấy in

vitro giúp lựa chọn được thời gian thích hợp để thu hoạch nguyên
12


liệu: khi thu hoạch cây để cấy chuyền (cây đang trong giai đoạn tăng
trưởng), thời gian thích hợp nhất là khi cây 4-6 tuần tuổi; khi thu
hoạch để thu nhận hợp chất (cây đã bước vào giai đoạn trưởng
thành), thời gian thích hợp nhất là khi cây 8-10 tuần tuổi; và thời
điểm thích hợp để cảm ứng việc tăng sinh tổng hợp hoạt chất (cây bắt
đầu giảm tăng trưởng) là khi cây 6 tuần tuổi.
3.3.2 Khảo sát điều kiện nuôi cấy thích hợp cho sự tăng trưởng
và sự tích lũy plumbagin trong cây con tái sinh
Hàm lượng khoáng đa lượng: MS1/2 vừa giúp cây tăng trưởng và
tích lũy hàm lượng hoạt chất không kém MS, vừa giảm giá thành
kinh tế hơn so với MS.
Ảnh hưởng của ánh sáng: khi được nuôi trong điều kiện có chiếu
sáng 16 giờ/ ngày: cây tăng trưởng mạnh, trọng lượng tươi nhiều hơn
và phiến lá nở rộng hơn so với khi không được chiếu sáng. Tuy
nhiên, sự tích lũy plumbagin lại trái ngược với sự tăng trưởng của
cây dưới ảnh hưởng của ánh sáng: ánh sáng ức chế khả năng tích lũy
plumbagin trong cây, khi cây được ủ tối hoàn toàn, hàm lượng
plumbagin trong 1g sinh khối cây tăng lên cao hơn so với khi có
chiếu sáng. Điều này có thể được lý giải là do plumbagin cũng như
những hợp chất có nhóm chức hoạt động khác, chúng thường dễ
tham gia phản ứng và không ổn định trong điều kiện nuôi có ánh
sáng. Tóm lại, để sử dụng điều kiện chiếu sáng thích hợp trong nuôi
cấy cây con D. burmanii cho mục tiêu thu nhận plumbagin, có thể
cần tác động theo hai giai đoạn khác nhau: trong giai đoạn tăng
trưởng, cây cần được chiếu sáng đầy đủ để có thể nhân sinh khối tối
đa dưới sự hỗ trợ của ánh sáng; nhưng sau đó khi cây bước vào giai

đoạn trưởng thành, có thể cần ngắt nguồn cung cấp ánh sáng để hạn
chế yếu tố làm chuyển hóa hợp chất plumbagin.
13


Ảnh hưởng của pH môi trường: pH5,2 là thích hợp nhất cho việc
cải thiện khả năng tăng trưởng của cây mặc dù không có tác động
nhiều lên sự tích lũy plumbagin so với pH thông thường của thành
phần MS (pH5,8)
Ảnh hưởng của mật độ cá thể nuôi cấy: với mật độ nuôi cấy thấp,
cây có đầy đủ dưỡng chất để tăng trưởng và phát triển nên trọng
lượng tươi trung bình của một cá thể tăng cao; song khi môi trường
có đầy đủ dinh dưỡng để cung cấp cho quá trình chuyển hóa tạo sản
phẩm bậc 1 (cung cấp cho sự tăng trưởng và hoạt động phân chia của
tế bào) thì các con đường sinh tổng hợp sản phẩm bậc 2 bị hạn chế
[Miyanaga K., 2000] nên ở nghiệm thức 5mẫu/100ml, 10mẫu/100ml
mặc dù cây tăng trưởng mạnh nhưng sự tích lũy plumbagin lại thấp
hơn so với các nghiệm thức có mật độ cá thể cao hơn. Với mật độ
nuôi cấy cao (20mẫu/100ml, 25mẫu/100ml), có sự cạnh tranh dinh
dưỡng xảy ra, cá thể nào đủ mạnh sẽ tăng trưởng và phát triển song
sẽ ức chế sự tăng trưởng của cá thể yếu làm giảm trọng lượng tươi
trung bình của một mẫu hơn so với các nghiệm thức còn lại, nhưng
chính do sự thiếu dinh dưỡng mà những cá thể bị ức chế tăng trưởng
có thể đã được cảm ứng con đường sinh tổng hợp sản phẩm thứ cấp
làm gia tăng hàm lương plumbagin hơn so với các nghiệm thức có
mật độ nuôi cấy ban đầu thấp. Kết quả khảo sát cho thấy mật độ cá
thể thích hợp nhất cho cả sự tăng trưởng lẫn tích lũy plumbagin ở
D.burmanii trong loạt nghiệm thức tiến hành là 15mẫu/100ml.
3.3.3 Khảo sát tác động của NAA lên sự tăng trưởng và tích lũy
hoạt chất

Kết quả cho thấy NAA không những có tác động lên sự tăng trưởng,
làm thay đổi đáng kể hình thái rễ: rễ dưới tác động của NAA có xu
hướng to hơn, dài và dày hơn mẫu đối chứng; mà còn lên hàm lượng
14


plumbagin tích lũy, NAA (0,5mg/l) có thể tăng hàm lượng plumbagin
lên gấp 1,23 lần so với đối chứng.
3.3.4 Khảo sát tác động của việc bổ sung tiền chất phenylalanine
và tyrosine lên sự tăng trưởng và sự tích lũy plumbagin
Việc bổ sung tiền chất tyrosine và phenylalanine (ở các nồng độ đã
thiết kế) vào môi trường nuôi cấy cây con D. burmanii nhìn chung
không ảnh hưởng nhiều lên khả năng tăng trưởng và phát triển của
cây (giá trị khối lượng tươi cây con ở tất cả các nghiệm thức có cùng
phân hạng khi thống kê). Nhưng cả tyrosine và phenylalanine đều cải
thiện được khả năng tích lũy plumbagin cao hơn so với đối chứng.
Trong đó phenylalanine; với nồng độ thích hợp là 0,4mM
(66,08mg/l); có khả năng làm tăng tích lũy plumbagin trong cây lên
gấp 1,43 lần; còn tyrosine với nồng độ 0,2mM (36,24mg/l) có thể
làm tăng tích lũy plumbagin lên gấp 1,23 lần so với đối chứng không
bổ sung tiền chất.
3.3.5 Khảo sát tác động của việc sử dụng chất cảm ứng (elicitor)
lên sự tăng trưởng và tích lũy hoạt chất
3.3.5.1 Khảo sát ảnh hưởng của việc sử dụng acid salicylic
Kết quả cho thấy để tăng tích lũy plumbagin trong hệ thống nuôi cấy
cây con D. burmanii, trong loạt nghiêm thức đã thiết kế, việc sử dụng
acid salicylic ở nồng độ 1mg/l và cảm ứng trong 15 ngày là tối ưu khi
có thể làm tăng hàm lượng lên gấp 1,72 lần so với đối chứng.
3.3.5.2 Khảo sát ảnh hưởng của việc sử dụng cao nấm men
Kết quả cho thấy: để cảm ứng tăng tích lũy plumbagin ở D. burmanii,

trong loạt nghiệm thức đã khảo sát, nồng độ cao nấm men sử dụng
thích hợp nhất là 0,5mg/l và thời gian cảm ứng thích hợp nhất là 20
ngày. Với nghiệm thức này, hàm lượng plumbagin được cảm ứng bởi
cao nấm men có thể tăng lên gấp 1,94 lần so với đối chứng. Rõ ràng,
15


đối với D. burmanii, nấm men có thể tác động lên tế bào thực vật
nhằm mục đích cảm ứng tăng sinh tổng hợp hợp chất thứ cấp một
cách hiệu quả. Nhiều nghiên cứu cho rằng cao nấm men có thể tác
động bằng các polypeptid hay các peptid ngắn của chúng lên tế bào
thực vật như một elicitor [Namdeo A.G., 2007]. Tuy nhiên, cơ chế
tác động của các peptide cho đến nay vẫn chưa được sáng tỏ, các
nghiên cứu về vấn đề này vẫn còn đang là mối quan tâm lớn đối với
các nhà nghiên cứu về tương tác giữa vi sinh và thực vật.
3.3.6 Khảo sát tác động cảm ứng của việc gây stress nitrogen lên
sự tăng trưởng và tích lũy hoạt chất
Kết quả cho thấy rõ sự tăng sinh hàm lượng plumbagin khi môi
trường thiếu nitrogen: nghiệm thức A1 (môi trường không có thành
phần ion ammonium chỉ có ion nitrate) cho thấy hàm lượng của
plumbagin ở lá tăng lên khoảng 1,69 lần so với đối chứng, và rễ tăng
1,03 lần so với đối chứng, nghiệm thức A2 (môi trường không có
nguồn nitrogen nào) cho thấy sự gia tăng hàm lượng ở lá khoảng
1,91lần. Khi thực vật bị stress do môi trường thiếu dinh dưỡng (chủ
yếu là đạm), lập tức sẽ có sự gia tăng các nhóm oxy hóa [Kovacik B.,
2007] cũng như sẽ có cơ chế để bảo vệ mình không bị tổn thương
như gia tăng hoạt tính của enzym phenylpropanoid ammonium lyase
(PAL)…Ion ammonium được giải phóng từ PAL có thể thông qua hệ
thống GS/GOGAT [Razal R. A., 1996] để tạo ra arogenate,
phenylalanine và tyrosine; những tiền chất tổng hợp nên quinone. Do

vậy, ở D. burmanii, việc gây stress dinh dưỡng, cụ thể là stress
nitrogen cũng làm tăng sinh tổng hợp quinone. Song, để duy trì khả
năng sống và phát triển của cây, việc loại bỏ chỉ một thành phần đạm
chính như nghiệm thức A1 (không có NH
4
NO
3
, chỉ có KNO
3
) là
thích hợp hơn.
16


3.3.7 Kiểm chứng hiệu quả làm tăng năng suất thu nhận hoạt
chất lên hệ thống nuôi cấy cây con tái sinh của các kỹ
thuật đã khảo sát
Ở mỗi kỹ thuật tăng sinh đã khảo sát, nuôi cấy đồng loạt hệ thống cây
in vitro theo quy trình nuôi cấy đã xác định đem xác định hàm lượng
plumbagin. Kết quả chứng minh được hiệu quả của các kỹ thuật tăng
sinh đã khảo sát. Trong đó, việc sử dụng cao nấm men làm tác nhân
cảm ứng trong thời gian 20 ngày là hiệu quả nhất cho hệ thống nuôi
cấy D. burmanii in vitro khi thu nhận plumbagin.
Bảng 3.2. Kết quả định lượng plumbagin trong cây con D. burmanii
in vitro đã được ứng dụng các kỹ thuật làm tăng năng suất thu nhận
plumbagin bằng HPLC
Nghiệm
thức
Tên mẫu
Hàm lƣợng plumbagin

(mg/kgFW)
(0)
Đối chứng không ứng dụng kỹ thuật tăng
sinh
314,6
(1)
Cây được nuôi trong điều kiện thích hợp
(hàm lượng khoáng đa lượng +ánh sáng
+pH+ mật độ cá thể nuôi)
458,1
(2)
Cây được nuôi trong trong điều kiện (1) +
bổ sung phenylalanine
489,9
(3)
Cây đƣợc nuôi trong trong điều kiện
(1) + cảm ứng bằng cao nấm men
560,9
(4)
Cây được nuôi trong trong điều kiện (1) +
cảm ứng bằng stress nitrogen
462,1
3.4 Khảo sát việc ứng dụng một số kỹ thuật làm tăng năng suất
thu nhận hoạt chất lên hệ thống nuôi cấy dịch huyền phù tế
bào
3.4.1 Tạo dịch huyền phù tế bào
Ảnh hưởng của nền khoáng và nồng độ đường lên khả năng sống
của lớp mỏng tế bào: nền khoáng thích hợp cho mẫu cấy lớp mỏng là
Gamborg’s B5 và nồng độ đường thích hợp là 20g/l.
17

Ảnh hưởng của hormone tăng trưởng (2,4-D, NAA, KN) lên sự
cảm ứng tạo mô sẹo từ lớp mỏng tế bào lá và tế bào rễ Drosera:
trong loạt thí nghiệm đã thiết kế, nồng độ hormone tối ưu để cảm ứng
tạo mô sẹo là 0,2mg/l 2,4-D; 0,2mg/l NAA và 0,1mg/l KN.
Tạo dịch huyền phù tế bào từ mô sẹo: sau 1 tuần, dịch huyền phù tế
bào được tạo thành từ mô sẹo lá và rễ đều có dấu hiệu tăng trưởng,
các tế bào quan sát dưới kính hiển vi đa số đều có nhân to, hạt tinh
bột mịn.
Thử nghiệm tạo dịch huyền phù trực tiếp từ lớp mỏng tế bào: sau 2
tuần, dịch huyền phù tế bào được tạo thành trực tiếp từ lớp mỏng tế
bào có chứa nhiều cụm tế bào không nhân và hạt tinh bột lớn và một
ít cụm tế bào có nhân to, hạt tinh bột mịn.
Kiểm tra khả năng sống của tế bào trong các dịch huyền phù tế bào
tạo thành bằng phương pháp nhuộm TTC: dịch huyền phù tế bào
D. burmanii được tạo thành từ cả hai phương pháp thông qua mô sẹo
và trực tiếp từ lớp mỏng tế bào đều có chứa những tế bào bắt màu
hồng khi được nhuộm TTC.
Kết quả HPLC đã chứng minh được đối với D. burmani nuôi cấy in
vitro. sự tích lũy plumbagin trong rễ cao hơn gấp 3 lần so với trong
lá. Do đó, dịch huyền phù tế bào được tạo thành từ mô rễ (theo
phương pháp trực tiếp hay gián tiếp thông qua mô sẹo) được chọn
làm nguồn vật liệu đầu cho các thí nghiệm tăng năng suất thu nhận
plumbagin ở bước tiếp theo.
3.4.2 Ứng dụng một số kỹ thuật tăng năng suất thu nhận hoạt
chất lên hệ thống nuôi cấy dịch huyền phù tế bào
3.4.2.1 Khảo sát đường cong tăng trưởng của dịch huyền phù tế
bào có mật độ tế bào nuôi ban đầu khác nhau

B
18



Hình 3.1. Đường cong tăng trưởng của các dịch huyền phù tế bào
D. burmanii có mật độ tế bào ban đầu khác nhau
0
5
10
15
20
25
0
4
8
12
16
số tế bào×10
4
/ ml
5_40
10_40
15_40
20_40
25_40

Mật độ tế bào nuôi cấy ban đầu thích hợp là (15:40) tương ứng với số
tế bào ban đầu là 2,6×10
4
tế bào/ml. Để chọn thời điểm khảo sát sự
tích lũy hoạt chất trong tế bào D. burmanii, chúng tôi chọn khoảng
thời gian nuôi cấy đủ để quá trình biến dưỡng thứ cấp của tế bào đã
xảy ra là 12 ngày từ khi bắt đầu cấy chuyền huyền phù vào môi
trường mới; và thời điểm cảm ứng tăng tích lũy hợp chất thích hợp
nhất là khoảng 8-12 ngày.
3.4.2.2 Khảo sát điều kiện ánh sáng và tốc độ lắc thích hợp cho sự
tăng trưởng và tích lũy hoạt chất
Kết quả ảnh hưởng của ánh sáng lên dịch huyền phù tương tự như lên
cá thể cây con. Còn về ảnh hưởng của tốc độ lắc, kết quả cho thấy tốc
độ lắc thấp sẽ ức chế mọi hoạt động biến dưỡng làm cho tế bào tăng
trưởng và tích lũy plumbagin kém nhất. Tuy nhiên, tốc độ lắc cao
(175 vòng/phút) lại trở thành một tác động cơ học làm tổn thương tế
bào, giảm khả năng tăng sinh tế bào cũng như khả năng tích tũy
plumbagin. Với thí nghiệm này, điều kiện chiếu sáng và tốc độ lắc
thích hợp cho thu nhận plumbagin từ huyền phù tế bào D. burmanii
là ủ tối và lắc với tốc độ 125 vòng/phút.
19


3.4.2.3 Khảo sát ảnh hưởng của 2,4-D trong môi trường nuôi cấy
dịch huyền phù lên sự tăng trưởng và tích lũy hoạt chất

Kết quả đã chứng minh trong thành phần chất điều hòa tăng trưởng
thực vật bổ sung vào môi trường nuôi cấy huyền phù D. burmanii
(NAA, KN, 2,4-D), 2,4-D là auxin giữ vai trò chính trong việc cảm
ứng tế bào phân chia song nó lại gây ức chế sinh tổng hợp
plumbagin. Có thể do có tác động cảm ứng tế bào phân chia, 2,4-D
đã huy động hầu hết năng lượng và các tiền chất có liên quan vào quá
trình biến dưỡng sơ cấp của tế bào, gây thiếu hụt năng lượng cần
thiết cũng như các tiền chất của con đường biến dưỡng thứ cấp. Do
đó, trong giai đoạn tăng trưởng của tế bào (từ khi chuyển huyền phù
vào môi trường mới cho đến ngày thứ 8) cần bổ sung 2,4-D vào môi
trường nuôi; nhưng khi bước vào giai đoạn giảm tăng trưởng để đi
vào pha ổn định (từ ngày thứ 8 trở đi), cần loại bỏ 2,4-D ra khỏi môi
trường nuôi để có thể tăng tích lũy hợp chất plumbagin.
3.4.2.4 Khảo sát tác động của việc bổ sung tiền chất lên sự tăng
trưởng và tích lũy hoạt chất
Việc bổ sung phenylalanine 0,3mM (49,56mg/l) cho hàm lượng
plumbagin tích lũy cao nhất, gấp 1,79 lần so với đối chứng không bổ
sung. Tyrosine 0,3mM (54,36mg/l) có thể cho hàm lượng plumbagin
trong dịch huyền phù tế bào D. burmanii sau 12 ngày nuôi cấy tăng
gấp 1,69 lần so với đối chứng. Trong một số nghiên cứu trước đây,
nhóm tác giả Randolf Durand and Meinhart H. Zenk cũng đã chứng
minh khả năng tương hợp rất cao của C có gắn đồng vị phóng xạ
trong phân tử tyrosine với phân tử plumbagin được tạo thành ở lá
non của Drosophyllum, một loài cây cùng họ với Drosera, và họ cho
rằng plumbagin được chủ yếu tạo thành từ tyrosine bằng cách
methyl hóa juglone theo con đường homogentisate. Rõ ràng, hai tiền
20


chất mà chúng tôi lựa chọn trong tăng sinh plumbagin ở dịch huyền

phù tế bào D. burmanii là thích hợp và khả thi. Trong đó, với tiền
chất tyrosine, kết quả khả quan này đồng nghĩa với giả thuyết của
nhóm tác giả Durand R. về con đường sinh tổng hợp của plumbagin
ở họ cây Droceracea là có thể, tyrosine sẽ chuyển hóa thành
plumbagin thông qua từng đơn vị acetate.
3.4.2.5 Khảo sát tác động của việc sử dụng chất cảm ứng phi sinh
học acid salicylic lên sự tăng trưởng và tích lũy hoạt chất
Kết quả cho thấy khả năng cảm ứng tăng tích lũy plumbagin trên hệ
thống nuôi cấy dịch huyền phù tế bào D. burmanii của acid salicylic
cũng tương tự với kết quả trên hệ thống nuôi cấy cây in vitro: acid
salicylic làm tăng hàm lượng plumbagin cao hơn so với đối chứng,
cao nhất khi nồng độ acid salycilic là 1,5mg/l với thời gian cảm ứng
cố định là 4 ngày; khi vượt qua ngưỡng nồng độ này, acid salicylic
gây ức chế tăng trưởng tế bào. Với nồng độ thích hợp, chỉ trong vòng
4 ngày acid salicylic có thể cải thiện hàm lượng plumbagin tăng lên
1,78 lần so với đối chứng trong hệ thống nuôi cấy dịch huyền phù tế
bào D. burmanii.
3.4.2.6 Kiểm chứng hiệu quả làm tăng năng suất thu nhận hoạt
chất lên hệ thống nuôi cấy dịch huyền phù tế bào của các
kỹ thuật đã khảo sát
Ở mỗi kỹ thuật tăng sinh đã khảo sát, nuôi cấy đồng loạt dịch huyền
phù tế bào D. burmanii theo quy trình nuôi cấy đã xác định và theo
các nghiệm thức được xác định là thích hợp cho tăng sinh plumbagin
đem xác định hàm lượng hoạt chất đích. Kết quả cho thấy ở hệ thống
nuôi cấy dịch huyền phù tế bào D. burmanii, việc loại bỏ 2,4-D ra
khỏi môi trường nuôi cấy khi tế bào bước vào giai đoạn giảm tăng
21


trưởng là một kỹ thuật hiệu quả nhất trong việc tăng sinh thu nhận

plumbagin.
Bảng 3.3. Kết quả định lượng plumbagin trong dịch huyền phù tế bào
D. burmanii in vitro đã được ứng dụng các kỹ thuật làm tăng năng
suất thu nhận plumbagin bằng phương pháp HPLC
Nghiệm
thức
Tên mẫu
Hàm lƣợng plumbagin
(mg/l)
(1)
Dịch huyền phù tế bào được nuôi trong điều
kiện thích hợp (ánh sáng + tốc độ lắc + mật độ
tế bào nuôi cấy ban đầu) làm đối chứng
74,1
(2)
(1)+ Dịch huyền phù tế bào được nuôi trong môi
trường loại bỏ 2,4-D ở giai đoạn sau
190,9
(3)
(1)+Dịch huyền phù tế bào được bổ sung
0.3mM phenylalanine
99,9
(4)
(1)+Dịch huyền phù tế bào được cảm ứng
1.5mg/l acid salicylic
96,1
4 KẾT LUẬN – ĐỀ NGHỊ
4.1 Kết luận
Luận án đã đạt được một số kết quả mới, chưa thấy công bố bởi các
tác giả khác ở Việt Nam như sau:

Nhân giống in vitro hai loài D. indica và D. burmanii
Nhân giống bằng chồi bên: bổ sung BA (0,5mg/l đối với D.
indica và 2mg/l đối với D. burmanii) có thể tạo 18,2 chồi/mẫu đốt
thân (D. indica) và 10,7 chồi/mẫu đốt thân (D. burmanii) trong 4-5
tuần nuôi cấy.
Tạo chồi bất định: lớp mỏng tế bào của đoạn ngọn phát hoa có thể
khởi tạo chồi bất định bằng môi trường có bổ sung BA (1mg/l đối với
D. indica, 2mg/l đối với D. burmanii), kết quả trong 5 tuần nuôi cấy
từ một mẫu cấy ban đầu có thể cung cấp 11,5 chồi (D. indica) và 20,1
chồi con (D. burmanii). Việc tạo chồi bất định ở Drosera là một kết
quả chưa thấy được công bố trong các nghiên cứu từ trước đến nay
trên thế giới.
22


Cải thiện khả năng nhân chồi: cần áp dụng quy trình nuôi cấy hai
bước thay cho quy trình thông thường trước đây: 2 tuần đầu cảm ứng
nhân chồi hay tạo chồi bất định bằng môi trường rắn có bổ sung BA,
sau đó chuyển sang môi trường lỏng không bổ sung BA trong 3 tuần.
Quy trình nuôi cấy hai bước có thể cải thiện được khả năng nhân chồi
của D.indica lên gấp 1,6 lần; D. burmanii lên gấp 2,0 lần so với đối
chứng nuôi cấy bằng quy trình thông thường. Đây là hướng nghiên
cứu cải thiện khả năng nhân chồi của thực vật mà chưa từng được áp
dụng lên hai loài Drosera này trên thế giới.
Sàng lọc và thu nhận hoạt chất từ nguồn nguyên liệu in vitro
Phân lập và xác định được cấu trúc của quercetin là hợp chất
chính quyết định tác dụng chống oxy hóa trong phân đoạn cao
chloroform của D. indica.
Phân lập và xác định được cấu trúc của plumbagin là hợp chất
chính quyết định tác dụng ức chế tăng sinh tế bào ung thư ruột kết

DLD-1 trong phân đoạn chloroform của D. burmanii.
Trong đó, việc nghiên cứu khả năng ức chế sinh tổng hợp protein
và ức chế sự biểu hiện của protein mTOR (protein giữ vai trò chính
trong sự tăng sinh và phát triển tế bào) của plumbagin là nghiên cứu
chưa thấy có công bố trên thế giới. Kết quả cho thấy tác động của
plumbagin tương tự rapamycin nhưng protein đích của hợp chất này
không phải S6K như rapamycin.
Ứng dụng kỹ thuật tăng năng suất thu nhận plumbagin
Khái quát con đường sinh tổng hợp plumbagin ở D. burmanii và
những tác động có thể làm tăng năng suất thu nhận đã được nghiên
cứu trong luận án:

23



Hình 4.1. Sinh tổng hợp plumbagin ở Drosera và một số yếu tố tác
động lên quá trình sinh tổng hợp
Đối với tác động trên hệ thống nuôi cấy cây con D. burmanii:
Điều kiện nuôi cấy thích hợp: chiếu sáng trong 4 tuần đầu, sau 4
tuần ủ tối; mật độ cá thể ban đầu 15 chồi con/ 100ml; pH=5,2
Bổ sung auxin (NAA 1mg/l), tiền chất (phenyalanine
0,4mM=66,08mg/l hay tyrosine 0,2mM=36,24mg/l), chất cảm ứng
(acid salysilic 1mg/l trong 15 ngày hay cao nấm men 0,5mg/l cảm
ứng trong 20 ngày) và stress nitrogen (loại bỏ NH
4
NO
3
) đều giúp gia
tăng plumbagin. Trong đó, cao nấm men là tác nhân cảm ứng có hiệu

quả nhất (có thể làm gia tăng hàm lượng plumbagin trong cây con D.
burmanii lên gấp 1,78 lần).
Đối với tác động trên hệ thống nuôi cấy dịch huyền phù tế bào D.
burmanii: việc nghiên cứu tạo dịch huyền phù tế bào và tác động
tăng sinh hợp chất lên hệ thống tế bào D. burmanii là hướng nghiên
cứu mới, chưa tìm thấy tài liệu nào có liên quan trên thế giới.