Nghiên cứu tăng cường khả năng chịu mặn bằng chuyển gen Coda trên mô hình cây xoan ta ( Melia Azedarach L.)

i
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên


ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC






NGUYỄN TH HIỀN





NGHIÊN CƢ́ U TĂNG CƢỜ NG KHẢ NĂNG CHỊ U MẶ N
BẰ NG CHUYỂ N GEN CODA TRÊN MÔ HÌ NH CÂY XOAN TA
(MELIA AZEDARACH L.)

Chuyên ngành: Công nghệ sinh học
Mã số: 60 42 02 01




ii
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

LỜ I CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan số liệ u và kế t quả nghiên cƣ́ u trong luậ n văn là trung thƣ̣ c
v chƣa đƣc s dng đ bảo v mt hc v no.


Tc giả luận văn



Nguyễ n Thị Hiề n

iii
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên


LỜ I CẢ M ƠN
Để hoà n thnh luậ n văn ny, tôi xin trân trọ ng cả m ơn PGS. TS. Chu Hoà ng Hà –
Ph Vin trƣởng Vin Công ngh Sinh hc, Trƣở ng phò ng Công nghệ tế bà o thƣ̣ c vậ t –
Việ n Công nghệ Sinh họ c – Việ n Khoa hc và Công ngh Vit Nam. Đ tận tnh hƣng
dẫ n, ch bảo v gip đ tôi trong suố t quá trình thực hin và hon chnh luận văn.
Qua đây, tôi cũ ng xin bà y tỏ lò ng biế t ơn sâu sắ c tớ i tậ p thể cá n bộ phò ng
Công nghệ Tế bà o thƣ̣ c vậ t – Việ n công nghệ sinh họ c , đ nhit tnh gip đ, góp ý
v đng viên tôi trong thời gian thực tập tại phòng.
Tôi cũ ng xin đƣợ c trân trọ ng cả m ơn Ths Bù i Văn Thắ ng -Trƣờ ng Đạ i họ c
Lâm nghiệ p đ c nhiều đng gp gip tôi hoà n thà nh luậ n văn nà y.
Tôi xin cả m ơn sƣ̣ giú p đỡ và tạ o điề u kiệ n vô cù ng quý bá u củ a Ban Giá m
hiệ u, cc thy cc cô trong khoa Khoa hc Sự sng , phòng Sau đạ i họ c Trƣờ ng Đạ i
hc khoa hc – Đạ i họ c Thá i Nguyên để tôi có thể hoà n thà nh tố t khó a họ c.
Cuố i cù ng tôi xin by tỏ lòng biết ơn đến nhƣ̃ ng ngƣờ i thân trong gia đì nh và
bạn b , đồ ng nghiệ p đã tạ o điề u kiệ n , quan tâm, gip đ, chia sẻ, đng viên và
khch l tôi trong sut qu trnh hc tập , thƣ̣ c hiệ n nghiên cƣ́ u đề tà i và thƣ̣ c hiệ n
thnh công luận văn ny.
Tc giả luận văn



Nguyễ n Thị Hiề n

iv
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên


MỤC LỤC
MỞ ĐẦ U 1
1. Đt vn đề 1
2. Mc tiêu nghiên cƣ́ u 2
3. Ni dung nghiên cƣ́ u 3
Chƣơng 1 TNG QUAN TI LIU 4
1.1. Gii thiu về cây Xoan ta (Melia azedarach L.) 4
1.1.1. Nguồn gc v phân b của cây Xoan ta 4
1.1.2. Đc đim sinh hc 4
1.1.3. Gi tr s dng 5
1.1.4. Tình hình nghiên cứu ứng dng công ngh sinh hc đ cải tiến ging Xoan ta 6
1.2. Cơ chế chng chu cc điều kin bt li của môi trƣờng ở thực vật 6
1.2.1. Cơ chế chu mn của thực vật 8
1.2.2. Vai trò của glycine betain đi vi tnh chng chu ở thực vật 12
1.2.3. Cơ chế sinh tổng hp glycine betaine 13
1.2.4. Nguồn gc v đc đim của gen codA 15
1.3. S dng gen codA trong cải tạo ging cây trồng 15
Chƣơng 2 VẬT LIU V PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 19
2.1. Vật liu nghiên cƣ́ u 19
2.1.1. Vật liu 19
2.1.2. Ha cht 20

2.1.3. Môi trƣờ ng nuôi cấy 21
2.1.4. Thiết b - Máy móc 22
2.2. Phƣơng php nghiên cƣ́ u 22
2.2.1. Thiết kế cu trc vector chuyn gen pBI121 mang gen codA 22
2.2.2. Tạo chủng vi khun Agrobacterium tumefaciens mang vector chuyể n gen 29
2.2.3. Tạo cây Xoan ta chuyn gen mang gen codA 30
Chƣơng 3 KẾT QUẢ V THẢO LUẬN 34
3.1. Kết quả nhân dòng gen codA từ vector tch dòng pBluesript II SK - codA 34

v
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên


3.2. Kết quả thiết kế cu trc vector v tạo chủng vi khun mang vector chuyn gen 35
3.2.1. Kết quả thiết kế cu trc vector chuyn gen pBI121- codA 35
3.2.2. Kết quả biến nạp vector ti tổ hp (pBI121-codA) vào E. coli DH5α 36
3.2.3. Kết quả sng lc dòng vi khun E. coli DH5α mang vector ti tổ hp 37
3.2.4. Kết quả biến nạp vector chuyn gen (pBI121-codA) vào A. tumefaciens 39
3.2.5. Kết quả sng lc dòng A. tumefaciens mang vector chuyn gen 40
3.3. Kết quả tạo dòng Xoan ta mang cu trc gen codA 42
3.3.1. Kết quả chuyn gen v ti sinh chồi Xoan ta chuyn gen 42
3.3.2. Kết quả tạo cây chuyn gen hon chnh (ra rễ) 45
3.3.3. Kế t quả ra cây v kim tra cây chuyn gen ngoi nh lƣi 46
3.3.4. Kế t quả đá nh giá sơ b cc dòng Xoan ta chuyể n gen trên môi trƣờ ng mui . 47
KẾT LUẬN V KIẾN NGHỊ 51
TI LIU THAM KHẢO 52
PH LC 57


vi

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên


DANH MỤ C CÁ C CHƢ̃ VIẾ T TẮ T
AS
bp
BAP
C:I
Acetosyrigone
Cp base (base pair)
6-benzyl adenin purine
Chloroform : Isoamyl alcolhol
CodA
DNA
Gen mã hóa Choline oxydase
Deoxyribonucleic acid
dNTPs
Gus
Deoxynucleotide triphosphate
β-Glucuronidase gene = Gen m ho β- Glucuronidase
E. coli
EDTA
Escherichia coli
Ethylene Diamin Tetra Acetate
IBA
Indole 3 - butyric acid
kb
LB
MS
kilo base (1 kb = 1000 base)

Luria – Bertani
Murashige and Skoog
OD
PCR
Mật đ quang hc (Optical density)
Polymerase Chain Reaction - Phản ứng chuỗi polymerase
SDS
T-DNA
TAE
Ti-Plasmid
TE
WT
Sodium doecyl sulphate
Transfer – DNA = DNA chuyn
Tris base – Acetic acid – EDTA
Tumor inducing plasmid = Plasmid gây khi u thực vật
Tris-EDTA
Cây không chuyn gen







vii
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên


DANH MỤ C BẢ NG

Bảng 2.1. Trnh tự cc mồi nhân gen codA 20
Bảng 2.2. Thnh phn dung dch tch plasmid 20
Bảng 2.3. Môi trƣờng nuôi cy vi khun 21
Bảng 2.4. Môi trƣờ ng nuôi và chn lc cây Xoan ta chuyn gen 21
Bảng 2.5. Thnh phn cc loại môi trƣờng gây nhiễm mn nhân tạo 22
Bảng 2.6. Thnh phn phản ứng PCR nhân gen codA 23
Bảng 2.7. Thnh phn phản ứng xƣ̉ lý enzyme giớ i hạ n 24
Bảng 2.8.
Thnh phn phản ứng ghép ni gen codA vi vector pBI121 26
Bảng 2.9.
Thnh phn phản ứng PCR kiể m tra plasmid 28
Bảng 2.10.
Thnh phn phản ứng cắt plasmid ti tổ hp bằ ng enzyme giớ i hạ n 29
Bảng 2.11. Thnh phn dung dịch tá ch chiế t DNA 32
Bảng 2.12. Thnh phn phản ứng PCR kim tra DNA tổng s. 33
Bảng 3.1. Kết quả ti sinh chồi Xoan ta chuyn gen sau hai ln chn lc 42
Bảng 3.3. Khả năng chịu mặ n củ a cc dòng Xoan ta chuyể n gen codA. 48




viii
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên


DANH MỤ C CÁ C HÌ NH
Hnh 1.1. Rừng, cây Xoan ta trƣởng thnh 4
Hình 1.2. Dạng hoa v quả xoan 5
Hnh 1.3. Chu trnh sinh tổng hp GB ở thực vật 14
Hình 1.4. Chu trình sinh tổng hp GB ở vi khun E.coli 14

Hình 3.1. Hnh ảnh đin di sản phm PCR nhân gen codA từ vector tách dòng 35
Hình 3.2. Hnh ảnh đin di sản phm tinh sạch gen codA từ sản phm PCR 35
Hnh 3.3. Hnh ảnh đin di gen codA và vector pBI121-gus cắt bằng cp enzyme gii
hạn XbaI và SacI 36
Hnh 3.4. Hnh ảnh đin di sản phm thôi gel gen codA v vector pBI12 mở vòng 36
Hnh 3.5. Hnh ảnh khun lạc vi khun E. coli DH5α đƣc biến nạp plasmid tá i tổ hợ p
mc trên môi trƣờng LB bổ sung 50 mg/l kanamycin 37
Hnh 3.6. Hnh ảnh plasmid ti tổ hp tch từ vi khun E. coli 38
Hnh 3.7. Hnh ảnh đin di sản phm PCR nhân gen codA từ plasmid ti tổ hp. 39
Hnh 3.8. Hnh ảnh đin di plasmid ti tổ hp pBI121-codA cắt bằng XbaI và I. 39
Hnh 3.9. Khun lạc Agrobacterium tumefacies EHA101 biến nạp vector pBI121-codA
mc trên môi trƣờng LB bổ sung 50 mg/l kanaSacmycin, 50 mg/l rifamycin 40
Hình 3.10. Hnh ảnh đin di plasmid ti tổ hp (pBI121- codA) tch chiết từ A. tumefaciens . 41
Hình 3.11. Hnh ảnh đin di sản phm PCR nhân codA từ plasmid ti tổ hp tch từ A.
tumefaciens. 41
Hnh 3.12. Mẫ u Xoan ta lây nhiễ m trong dịch huyề n phù A. tumefacien 43
Hnh 3.13. Mẫ u Xoan ta trên môi trƣờng đồng nuôi cy CCM 43
Hnh 3.14. Mảnh l chuyn gen trên môi trƣờng SM sau 1 tun nuôi cy 43
Hnh 3.15. Đoạ n thân chuyn gen trên môi trƣờng SM sau 1 tun nuôi 43
Hnh 3.16. Chồi ti sinh từ đoạn thân chuyn gen trên môi trƣờng SM ln 1 sau 2 tun
nuôi cy 43
Hnh 3.17. Chồi ti sinh từ đoạn thân chuyn gen trên môi trƣờng SM ln 1 sau 3 tun
nuôi cy 43

ix
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên


Hnh 3.18. Chồi ti sinh từ mảnh l chuyn gen trên môi trƣờng SM ln 1 sau 4 tun
nuôi cy 44

Hnh 3.19. Chồi ti sinh từ đoạn thân chuyn gen trên môi trƣờng SM ln 1 sau 4 tun
nuôi cy 44
Hnh 3.20. Chồi Xoan ta chuyn gen ti sinh trên môi trƣờng SM ln 2 sau 4 tun nuôi
cy. 44
Hnh 3.21 Mảnh l không chuyn gen (ĐC) trên môi trƣờng SM sau 4 tun nuôi cy . 44
Hnh 3.22. Đoạn thân không chuyn gen (ĐC) trên môi trƣờng SM sau 4 tun nuôi cy 44
Hình 3.23. Hnh ảnh chồi Xoan ta chuyn gen ra rễ trên môi trƣờng PSM 45
Hình 3.24. Hnh ảnh chồi Xoan ta không chuyn gen (ĐC) trên môi trƣờng PSM 46
Hnh 3.25. Hnh ảnh cây xoan ta chuyể n gen trồ ng trong nhà lƣớ i. 46
Hnh 3.26. Hnh ảnh đin di sản phm PCR nhân gen codA từ DNA genome tch chiết
từ cây Xoan ta chuyn gen v cây không chuyn gen 47
Hnh 3.27. Đồ th sinh trƣởng của cc 3 dòng Xoan ta chuyn gen v đi chứng
trên môi trƣờng ti sinh c cc nồng đ NaCl khc nhau 49
Hình 3.28. Sinh trƣởng của dòng Xoan ta XT20 chuyn gen codA v dòng WT không
chuyn gen trên môi trƣờng ti sinh c nồng đ NaCl khc nhau 50






1
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên


MỞ ĐẦ U
1. Đt vn đề
Trên thế gii, các nghiên cứu nâng cao tính chng chu đi vi cc điều kin
bt li từ môi trƣờng (hạn hán, nhiễm mn, nhit đ cao, nhit đ thp…) đ v
đang đƣc tiến hành trên nhiều đi tƣng cây trồng khác nhau. Trong lâm nghip,

loi cây đƣc s dng nhƣ l mt loại cây mô hình cho các nghiên cứu trên thế gii
l cây dƣơng (Populus sp.). Tuy nhiên, hạn chế duy nht của loi cây ny đ l kh
sinh trƣởng trong điều kin khí hậu của Vit Nam. Vì vậy, vic tìm kiếm mt loài
cây dễ thích ứng và phổ biến đ làm cây mô hình cho các nghiên cứu theo hƣng
quan tâm trên đi tƣng cây lâm nghip trở nên cn thiết. Cây Xoan ta đƣc đnh
giá là mt trong những cây trồng quan trng trong chiến lƣc phát trin lâm nghip
ở nƣc ta. Hơn nữa, những kết quả nghiên cứu bƣc đu trong vic xây dựng
phƣơng php chuyn gen ở đi tƣng cây xoan ta là rt có trin vng [3], [4], [8],
[9], [23], [36], [37], cho phép các nhà khoa hc có th tiến hành các nghiên cứu cải
thin ging, đc bit là nâng cao tính chng chu của loài cây này và có th s dng
nhƣ mt mô hình cho các loài cây lâm nghip đc hữu của Vit Nam.
Những tc đng bt li từ môi trƣờng nhƣ: hạn hán, ngập mn, ngập úng,
nhit đ cực đoan đ tc đng mạnh mẽ đến sự sinh trƣởng và phát trin của các
loài cây trồng. Cũng nhƣ cc loài sinh vật khác, khi gp cc điều kin bt li từ môi
trƣờng, thực vật có khả năng sinh ra cc cơ chế thch nghi khc nhau đ có th tồn
tại, sinh trƣởng và phát trin bnh thƣờng. Cơ chế thƣờng gp nht khi cây gp các
điều kin bt li về nƣc đ l tăng cƣờng khả năng duy tr sức căng của các mô, tế
bào thông qua vic tăng cƣờng tổng hp các cht nhƣ cc loại đƣờng tan, các loại
acid amin,… đ tăng p sut thm thu. Glycine betaine và proline là hai trong s
những cht trao đổi đƣc quan tâm do sự tích lũy hm lƣng cao các hp cht này
khi cây gp cc điều kin bt li từ môi trƣờng, đc bit là những yếu t liên quan
đến áp sut thm thu ni bào.
Ở mt s loài thực vật bậc cao, glycine betaine đƣc tổng hp thông qua mt
chuỗi gồm hai phản ứng từ choline đƣc chuyn hóa thành betaine aldehyde nhờ

2
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên


xúc tác bởi choline monooxygenase và từ betain aldehyde đƣc chuyn hóa thành

glycine betaine nhờ xúc tác bởi betaine aldehyde dehydrogenase. Tuy nhiên, đ chủ
đng tăng cƣờng tổng hp glycine betain trong cây, các nhà khoa hc đ s dng
gen codA mã hóa cho choline oxidase phân lập từ vi khun Arthrobacter
globiformis có khả năng chuyn hóa trực tiếp choline thành glycine betain. Các
công trình công bố cho thấ y: cây Arabidopsis thaliana chuyể n gen codA tăng cƣờ ng
khả năng chu lạnh , nhiệ t độ cao và mặ n [15], [28], cây cả i bẹ (Brassica juncea)
chuyể n gen codA c khả năng chịu mặ n , hạn tt hơn cây đi chứng không chuyn
gen [24], cây lúa chuyể n gen codA tăng cƣờ ng kh ả năng chịu lạ nh , mn [28], cây
Salanum lycopersium chuyể n gen codA cũng tăng cƣờng kh ả năng chị u lạ nh và
mặ n v cây B ạch đn (Eucalyptus globules) chuyn gen codA c kh ả năng chịu
mặ n cao hơn hẳ n so vớ i cây đố i chƣ́ ng không chuyể n gen [15], [24], [28], [29],
[41]. Những bằng chứng khoa hc trên đây cho thy tính khả thi của vic s dng
phƣơng php ny đi vi nghiên cứu nâng cao tính chng chu cc điều kin bt li
từ môi trƣờng cho cá c loà i cây trồ ng.
Việ t Nam là mộ t trong cc quố c gia đang chị u ả nh hƣở ng mạ nh mẽ củ a việ c
biế n đổ i khí hậ u , đặ c biệ t là vấ n đề nƣớ c biể n dâng , dẫ n đế n nhiề u vù ng bị xâm
nhậ p mặ n gây ả nh hƣở ng đế n năng s uấ t và chấ t lƣợ ng cây trồ ng . V vậy, việ c triể n
khai cá c nghiên cƣ́ u nhằ m tạ o ra đƣợ c cá c giố ng cây trồ ng có khả năng chố ng chịu
đƣợ c cá c điề u kiệ n bấ t lợ i củ a môi trƣờ ng nhƣng vẫ n đả m bả o đƣợ c năng s uấ t và
chấ t lƣợ ng tố t đang là vấ n đề cấ p bá ch và cầ n thiế t nhấ t hiệ n nay.
Xuấ t phá t tƣ̀ nhƣ̃ ng l do trên , tôi tiế n hà nh thƣ̣ c hiệ n đề tà i “Nghiên cứ u
tăng cườ ng khả năng chị u mặ n bằ ng chuyể n gen codA trên mô hì nh cây xoan ta
(Melia azedarach L.)”.
2. Mục tiêu nghiên cƣ́ u
- Thiết kế đƣc vector mang gen codA, nhằm mc đch tạo ging cây trồng có
khả năng chng chu tt cc điều kin bt li của môi trƣờng;
- Tạo đƣc mt s dòng cây Xoan ta chuyn gen mang gen codA có khả năng
chu mn.

3

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên


3. Nội dung nghiên cƣ́ u
- Nhân dòng gen codA từ vector tách dòng pBluesript II SK và thiết kế cu
trúc mang gen codA đƣc điều khin bởi promoter 35S.
- Nghiên cứu tạo cây Xoan ta chuyn gen mang cu trúc gen codA;
- Trồ ng, chăm só c cây chuyể n gen ngoà i nhà lƣớ i v k im tra sự có mt của
gen codA ở các dòng cây Xoan ta chuyn gen;
- Đnh gi khả năng chu mn, sinh trƣởng và phát trin của các dòng cây
Xoan ta chuyn gen bằng phƣơng php nhiễm mn nhân tạo.



4
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên


Chƣơng 1
TỔ NG QUAN TÀ I LIỆ U
1.1. Giới thiệu về cây Xoan ta (Melia azedarach L.)
1.1.1. Nguồn gốc và phân bố của cây Xoan ta
Cây Xoan ta có tên khoa hc (Melia azedarach L.) thuc h Xoan
(Meliaceae) hay còn gi là h Dái ngựa, b Bồ hòn (Sapindales), ngành Ngc lan
(Magnoliophyta). H Xoan có khoảng 50 chi và 550 loài, phân b khắp miền nhit
đi; mt chi (Toona) phát trin ti tận vùng ôn đi phía Bắc của Trung Quc và về
phía Nam ti Đông nam Australia, mt chi khác gn nhƣ phân b hu hết ở các
vùng phía Bắc [1].
Ở Vit Nam, cây Xoan ta đƣc gây trồng thành rừng hoc phân b ở hu hết
các tnh từ Bắc đến Nam, trên nƣơng rẫy cũ hoc ven sông mt s tnh vùng Tây

Bắc có th gp cc đm cây Xoan ta thun loài do nhân dân trồng.








Hình 1.1. Rừng, cây Xoan ta trƣởng thnh
1.1.2. Đc điểm sinh học
Xoan ta là cây gỗ ln, chiều cao có th đạt ti 30m v đƣờng kính gn
100cm. Thân cây khá thẳng, tn l thƣa, vỏ màu xám nâu, nứt hoc rạn dc, lúc non
thƣờng c đm xếp vòng quanh thân. Lá kép lông chim 2-3 ln, mc cách. Lá chét
mép c răng cƣa. Hoa đều, lƣng tính, màu tím nhạt, hp thành cm hình chùy ở
nch l pha đu cnh, c mùi thơm hắc, bu nhy có 5-6 ô. Quả hạch dài 1-2cm khi

5
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên


chn mu vng, qua đông trên cnh sang mùa xuân mi rng, vỏ trong hóa gỗ cứng
có 5-6 ô, mỗi ô chứa mt hạt [1].

Hình 1.2. Dạng hoa v quả xoan
Xoan ta là cây nguyên sản ở các vùng nhit đi và á nhit đi châu Á. Cây
ƣa sng, sinh trƣởng nhanh, sau khi trồng 6-8 năm c th s dng đƣc. Xoan ta
không chu bng, ƣa kh hậu nóng m, sinh trƣởng đƣc trên nhiều loại đt khác
nhau, nhƣng thch hp nht l đt ct pha, đt phù sa ven sông c đ phì cao và sâu
m. Xoan có th chu đƣc mui, lƣng mui trong đt từ 0,4-0,5%. Những nơi đt

bạc màu, khô hạn hoc ng nƣc đều không thích hp vi cây Xoan ta. Cây Xoan ta
có h rễ ngang khá phát trin, thƣờng ăn nông v lan rng, rễ cc ăn sâu. Xoan ta
thƣờng phân cành sm, khả năng đâm chồi mạnh nên có th li dng tái sinh chồi
đƣc [1].
1.1.3. Giá trị sử dụng
Xoan ta là loài cây thân gỗ ln, đa tc dng, cây Xoan ta có th đƣc trồng
rừng đ ly gỗ ln hay trồng đ che bóng và phòng h. Gỗ xoan ta thuc nhóm V,
có lõi màu hồng hay nâu nhạt, giác xám trắng, gỗ nhẹ mềm. Gỗ Xoan sau khi ngâm
khá bền, khó b mi mt, cho nên thƣờng đƣc dùng trong xây dựng, đng đồ gia
dng, trang trí ni tht v điêu khắc,… Ngoi ra, l v rễ còn có th s dng làm
phân xanh, thuc sát trùng, hạt có th ép ly du đ chữa mt s bnh, than củi xoan
cho nhit lƣng cao. Loi cây ny cũng c cht theraupic và mt s hp cht
limonoids [1], [16], [17].

6
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên


1.1.4. Tình hình nghiên cứu ứng dụng công nghệ sinh học để cải tiến giống Xoan ta
Cây Xoan ta l loi cây đa tc dng, c gi tr cao. Trên thế gii v ở Vit
Nam đ c nhiều công trnh nghiên cứu về đc đim lâm sinh hc, công dng của
chng đi vi con ngƣời v môi trƣờng sinh thi. Tuy nhiên, cc nghiên cứu ứng
dng công ngh sinh hc đ cải tiến cht lƣng ging Xoan ta lại chƣa đƣc quan
tâm nhiều. Đ c mt s công trnh trong v ngoi nƣc nghiên cứu về ti sinh
Xoan ta [2], [4], [8], [9], [31], [32], [35], [39], [40]. Tuy nhiên, cc nghiên cứu ny
mi ch tập trung vo vic xây dựng qui trình tái sinh in vitro phc v bảo tồn, nhân
ging vô tnh, chn lc biến d soma v phc v chuyn gen. S lƣng công trnh
công b về chuyn gen cải thin ging Xoan ta còn t. Trên thế gii mi ch c duy
nht mt công trnh công b về chuyn gen GFP vào cây Xoan ta, ở Vit Nam c 5
công trnh công b về chuyn gen vo cây Xoan ta: Chuyn gen gus v bar [8];

Chuyn gen 4Cl [37]; Chuyn gen GA20 [3], [4].
Ở Vit Nam, trong những năm gn đây cây Xoan ta đƣc đnh gi l mt
trong những cây trồng quan trng trong 6/9 vùng sinh thái lâm nghip trng đim
[7]. Mt s trung tâm nghiên cứu nhƣ Trung tâm Ging và công ngh sinh hc
thuc Đại hc Lâm nghip, Vin Khoa hc Lâm nghip,… cũng đ tiến hành nhân
ging in vitro loài cây này từ các dòng cây tri đ sản xut ging cht lƣng cao.
Đc bit, trong chƣơng trnh trng đim phát trin và ứng dng công ngh sinh hc
trong lĩnh vực Nông nghip và phát trin nông thôn đến năm 2020. B Nông nghip
và Phát trin nông thôn đ giao cho Trƣờng Đại hc Lâm nghip chủ tr đề tài
“Nghiên cứu tạo ging Xoan ta biến đổi gen có sức sinh trƣởng nhanh, cht lƣng
gỗ tt”, kết quả bƣc đu đ xây dựng đƣc kỹ thuật chuyn vào cây Xoan ta và thu
đƣc mt s dòng Xoan ta sinh trƣởng nhanh [4], đây l tiền đề quan trng đ cải tiến
cht lƣng ging Xoan ta hin nay.
1.2. Cơ chế chống chịu các điều kiện bt lợi của môi trƣờng ở thực vật
Điều kin bt li từ môi trƣờng sng - stress (điều kin bt li phi sinh hc:
mn, hạn, lạnh, nhit đ cao,…) dẫn đến hàng loạt cc thay đổi về hình thái, tính
cht vật lý, hóa sinh, phân t, điều đ ảnh hƣởng xu đến sự sinh trƣởng và phát

7
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên


trin của thực vật [19]. Đ đảm bảo tính toàn vẹn và sng còn của chúng, nhiều loài
thực vật có các chiến lƣc đi phó vi những bt li phi sinh hc khác nhau. Những
yếu t cực đoan khc nhau (mn, hạn, lạnh, nhit đ cao,…) đều gây ra hin tƣng
mt nƣc trong tế bào. Sự phản ứng của cơ th sng ph thuc vào từng loài, kiu
gen, thời gian tc đng và tính khc lit của yếu t cực đoan, đ tuổi v giai đoạn
phát trin, dạng đc thù của cc cơ quan hoc tế bào và phn ngoại vi của chúng [41].
Khi gp các tc đng bt li của môi trƣờng, thực vật sẽ tạo ra mt s cht kích
thích, protein giải đc, hoc hoormon giúp chúng có khả năng thch ứng [5], [6].

Hin nay, các nghiên cứu về cơ chế chng chu cc điều kin bt li từ môi
trƣờng (mn, hạn, lạnh, nhit đ cao, ) ở thực vật đang đƣc tập trung vo hƣng
nghiên cứu lm tăng cƣờng các cht giúp bảo v áp sut thm thu của tế bào khỏi
sự mt cân bằng nƣc gây chết. Sự tăng cƣờng các cht điều chnh áp sut thm
thu đƣc phát hin trong nhiều trƣờng hp môi trƣờng bt li nhƣ hạn hán, mui
mn và lạnh giá. Khả năng điều chnh áp sut thm thu là mt đc tính rt quan
trng của tế bào khi b mt nƣc do lạnh, mui hoc hạn. Những thực vật sng trong
môi trƣờng thiếu nƣc b mt cân bằng về áp sut thm thu trong tế bo đòi hỏi phải
có khả năng chng chu lại điều kin khắc nghit đ [12], [13], [30], [33], [34].
Mt trong những phƣơng thức của thực vật chng lại sự mt cân bằng áp
sut thm thu đ l dựa trên sự thay đổi trong chuyn hóa tế bào cht dẫn đến sự
xut hin v tch lũy cc cht hòa tan, protein, hoc cc amino acid đc hiu [10].
Hin tƣng này xảy ra rt nhanh khi b mt nƣc. Sự tch lũy các cht này không
làm ảnh hƣởng đến hoạt đng bnh thƣờng của các enzyme ni bo. Ngƣc lại, sự
tch lũy lƣng ln các cht hòa tan trong tế bào sẽ điều chnh áp sut thm thu
bằng tc đng tổng th mà chúng có khả năng giữ và ly nƣc vào tế bào. Ngoài ra,
chúng có th thay thế v tr nƣc nơi xảy ra các phản ứng ha sinh, tƣơng tc vi
lipid hoc protein trong mng, ngăn chn sự phá hủy màng tế bào và các phức h
protein. Về mt hóa hc, chng thƣờng là những phân t trung hòa về đin, có kích
thƣc rt nhỏ, đng vai trò quan trng giúp các phân t protein và màng tế bào

8
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên


chng lại sự biến tnh dƣi tc đng của cc điều kin bt li phi sinh hc (abiotic
stress) [5], [24].
Cht bảo v áp sut thm thu hay các cht hòa tan tƣơng thch thuc các
nhóm cht sau đây:
(1). Glycine betaine (là dẫn xut methyl ha nhm nitơ của amino acid);

(2). Proline và ectoine (amino acid);
(3). Polyols và trehalose (là mt hp cht polyme không phải đƣờng);
(4). Các loại đƣờng tan: glucose, sucrose, fructan, manitol, pinitol.
Glycine betaine, proline v cc nhm đƣờng thực hin chức năng nhƣ cc
cht điều chnh áp sut thm thu và bảo v tế bào khỏi b mt nƣc. Quá trình này
liên quan đến mt s enzyme chức năng đ đƣc phân lập và phân tích về mt sinh
ha nhƣ: cc enzyme sinh tổng hp và chuyn hóa proline, các enzyme giải đc, các
enzyme chủ cht tổng hp các cht điều hòa áp sut thm thu và các loại protease
khác. Protein vận chuyn nƣc qua màng, cht vận chuyn các đƣờng đơn, proline
v glycine betaine đƣc xem nhƣ c chức năng chuyn nƣc, proline, glycine
betaine, các cht đƣờng đơn qua mng nguyên sinh cht v mng không bo đ điều
chnh áp sut thm thu khi gp điều kin cực đoan. Những enzyme giải đc nhƣ
glutathione S-transferase, superoxide dismutase, catalase,… tham gia vo qu trnh
bảo v tế bào khỏi b oxy hóa [5], [11], [19].
1.2.1. Cơ chế chịu mn của thực vật
Khi môi trƣờng sng có nồng đ các ion Na
+
, Cl
-
, sulfate, borate, lithium,
cao sẽ gây đc cho tế bào thực vật. Mt trong những hƣng thay đổi trong thực vật
đ thích nghi vi điều kin sng là chuyn đổi h quang hp từ h C3 sang h
quang hp CAM ở loài Mesembryanthemum crytallium, hoc phát trin tuyến mui
ở loài Limonium sp., hoc phát trin tế bào mô biu bì chứa không bào dự trữ mui
ở loài M. crytallium. Những thay đổi ny đ dẫn đến tăng cƣờng lƣng nƣc s
dng có hiu quả khi phát trin theo cách quang hp C4. Ở cây la nƣc, khi môi
trƣờng c đ mn cao, cây sẽ điều chnh đ thích ứng bằng cách làm giảm din tích lá.

9
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

Mui tích t ở các lá già, lá già cun lại, héo và chết dn mang theo lƣng mui nht
đnh. Những cây lúa chu mn ch còn lại những l non c hm lƣng mui t hơn [5].
Môi trƣờng sng c đ mn cao sẽ làm ức chế sự hp th nƣc vào trong ni
bo, thay đổi khả năng đng mở của khí khổng v lm thay đổi khả năng hp th CO
2

vào tế bào lá cây, gây tổn thƣơng mô tế bào thực vật. Những thay đổi trong trao đổi
cht thƣờng dẫn đến sự gia tăng mt s cht liên quan đến điều chnh áp sut thm thu
nôi bo nhƣ glycine betain, proline, ectoine hoc pylol, Tuy nhiên, thông thƣờng sự
điều chnh này ch đòi hỏi tăng cƣờng của mt trong những enzyme trong con đƣờng
tổng hp hoc chuyn hóa các cht đ [5].
Trong các vùng b nhiễm mn kéo dài (ven bin), những cây có khả năng chu
mn thích nghi vi môi trƣờng sng đều có những thay đổi sâu sắc trong trao đổi cht
cũng nhƣ c cc cơ chế chng chu thích hp [5]. Các biến đổi đ thƣờng đi theo cc
hƣng sau:
(1) Loại bỏ các dạng oxy hoạt hóa – ROS (reactive oxygen species) sinh ra
trong điều kin mn.
(2) Tăng cƣờng các cht điều chnh áp sut thm thu.
(3) Kim soát sự hp th ion Na
+
, K
+
, Ca
2+
và hp th nƣc.
(4) Sinh tổng hp mt s protein có khả năng chng chu mn.
1.2.1.1. Loại bỏ các dạng oxy hoạt hóa – ROS sinh ra trong điều kiện mặn
Trong trƣờng sng b nhiễm mn, tế bào thực vật b mt nƣc và tạo ra nhiều

dạng oxy hoạt hóa – ROS trong tế bo nhƣ Ozon (O
3
), superoxide anion (O
2
*-
),
hydrogen peroxide (H
2
O
2
), gc pehydroxyl tự do (O
2
H
*
), Khi nồng đ ROS cao
làm giảm tc đ quanq hp, gây tổn thƣơng cho l, hạn chế tc đ sinh trƣởng của
mm và rễ, đy nhanh sự già cỗi dẫn đến giảm năng sut cây trồng.
ROS gây tổn thƣơng cho cc đại phân t nhƣ lipid v protein trên mng tế bào,
tạo ra các gc tự do, làm tổn thƣơng mng tế bào cht dẫn đến lm thay đổi sự lƣu
chuyn các ion, ức chế hoạt tnh bơm H
+
, tăng đ thm của màng, suy giảm khả năng
kim soát của mng v tăng lƣng ion Ca
2+
vào tế bào. C th: ROS làm biến đổi
những đim đc bit nhạy cảm, các v trí amino acid quyết đnh của hoạt tích protein,

10
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

làm ngắt đoạn chuỗi peptide, thay đổi đin tích. Các protein mt đi chức năng sinh
hc và cui cùng chúng b các protease nhận biết và phân hủy. Ngoài ra, ROS còn tác
đng gây tổn thƣơng phân t DNA. ROS lm đi biến DNA nhƣ mt đoạn hoc
những hiu ứng di truyền bt li khác. ROS có th tc đng lên các gc glycosyl hoc
gc base ở những v trí mẫm cảm trên phân t DNA. ROS tc đng lên lc lạp và h
quang hp bằng cách làm giảm cƣờng đ phiên mã và dch mã của RUBISCO.
Khi nồng đ ozon cao, tế bào thực vật sẽ đng kh khổng đ ozon không xâm
nhập thêm vo mô l, đồng thời hoạt hóa các h thng chng oxy hóa. Chúng hoạt
hóa tổng hp ethylene v tch lũy salicylic acid, cc cht này có vai trò hoạt hóa h
thng bảo v của tế bào. H thng bảo v tế bào nhằm loại bỏ ROS đƣc thực hin
nhờ các cht chng oxy hóa tồn tại trong các bào quan. Các cht này gồm các enzyme
(catalase, superoxide dismutase, ascorbate peroxidase, monodehydroascorbate reductase,
glutathione reductase, ) và các hp cht chng oxy hóa không có bản cht enzyme
(ascorbate, glutathione dạng kh, α-tocopherol và carotenoid).
1.2.1.2. Tăng cường các chất điều chỉnh áp suất thẩm thấu.
Sự tăng cƣờng tch lũy cc cht điều chnh áp sut thm thu đƣc phát hin
thy ở nhiều loài thực vật khi sng trong môi trƣờng bt li nhƣ mn, hạn, lạnh giá.
Nếu nồng đ mui bên ngoi môi trƣờng ngoại bào cao, môi trƣờng sẽ giữ lại nƣc
v nƣc sẽ không đƣc hp th vào bên trong ni bào, ngây ra khan hiếm nƣc
trong tế bào. Đ thích ứng tế bào thực vật tăng cƣờng tổng hp v tch lũy cc cht
điều chnh áp sut thm thu nhƣ proline, các loại đƣờng tan (glucose,
fructose, ), Các cht ny thƣờng có 2 chức năng: Sự tch lũy cc cht này trong
tế bào sẽ điều chnh áp sut thm thu bằng tc đng tổng th mà chúng có khả
năng giữ và ly nƣc vào tế bào hoc ngăn chn sự xâm nhập của ion Na
+
. Ngoài ra,
chúng có th thay thế v tr nƣc nơi xảy ra các phản ứng ha sinh, tƣơng tc vi
lipid hoc protein trong màng nhằm bảo v màng tế bào cht không b phá hủy và
bảo v các phức protein.

Đc bit trong điều kin môi trƣờng mn, mt s loài thực vật còn tăng
cƣờng tổng hp cht glycine betaine và pinitol. Glycine betaine có th tăng đến

11
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên


nồng đ 45 mM đ chng chu mn. Glycine betaine đƣc tổng hp từ choline qua
hai phản ứng đƣc xúc tác bằng choline monooxygenase và betaine aldehyde
dehydrogenase. Tuy nhiên, glycine betaine tích trữ và tổng hp ở h
Plumbaginaceae, Chenopodiaceae và rong tảo bin, mà không tích trữ trong nhiều
cây trồng có giá tr kinh tế. Vì vậy, có th ứng dng công ngh gen đ cải tiến cây
trồng chu mn theo hƣng này.
1.2.1.3. Kiểm soát sự hấp thụ ion Na
+
, K
+
, Ca
2+
và hấp thụ nước.
Đi vi cây chu mn, vic kim sot đƣc sự hp th cc ion v nƣc đng
vai trò then cht trong vic hạn chế sự xâm nhập của các ion Na
+
và Cl
-
. Vận
chuyn nƣc, ion qua mang đều do các protein hoc các phức h protein đảm
nhim. Cơ chế kim soát vic gia tăng sƣ biu hin cũng nhƣ hoạt hóa các protein
và phức h protein rt phức tạp và tiến hành theo nhiều bƣc. Trên màng tế bào có
h thng các cht làm nhim v vận chuyn các ion và các cht hữu cơ c trong

lƣơng phân t nhỏ qua màng. Các cht vận chuyn đ bao gồm cc bơm, cc cht
mang và các kênh vận chuyn. Cc bơm l cc enzyme dạng ATPase vận chuyn
các proton H
+
và Na
+
qua màng tế bo, thƣờng chuyn đƣc 10
2
phân t/giây. Cht
mang là các protein hoc phức h protein thƣờng chuyn đƣc 10
3
phân t/giây.
Các kênh vận chuyn nƣc và các cht ion K
+
, Ca
+
và anion thành dòng, thƣờng
chuyn đƣc 10
8
phân t/giây.
1.2.1.4. Sinh tổng hợp một số protein có khả năng chống chịu mặn.
Khi gp cc điều kin cực đoan, mt s gen liên quan đến tính chng chu
thƣờng đƣc biu hin vi tc đ nhanh đ tổng hp các protein/enzyme có khả
năng chng chu mn nhƣ P5CS, protein LEA, Protein COR, Speroxide
dismutase,
Ở cây Arabidopsis, các gen phản ứng vi điều kin lạnh chiếm từ khoảng 4 -
20% genome. Protein COR đƣc cảm ứng bởi điều kin lạnh thông qua yếu t
CRT/DRE trên promoter. Yếu t phiên m CBF1 điều khin sự biu hin của mt
loạt các gen chu lạnh nhƣ cor 6.6, cor 15a, cor 47, cor 78. Còn CBF3 tăng cƣờng
biu hin các gen chu lạnh liên quan đến sự điều chnh áp sut thm thu nhƣ tăng

12
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên


lƣng proline thông qua tổng hp enzyme P5CS và các dạng đƣờng tan nhƣ
sucrose, raffinose glucose v fructose. CBF4 điều khin các gen cảm ứng vi ABA
ở điều hạn và lạnh. Yếu t phiên m CBF điều hòa sự biu hin của nhiều nhóm
enzyme khc nhau nhƣ enzyme tham gia trao đổi cht phosphoinositide, enzyme
sinh tổng hp các cht điều hòa áp sut thm thu, giải đc do ROS, vận chuyn các
cht qua mng, trao đổi cht hormon và chuyền tín hiu phản ứng chng chu vi
cc điều kin ngoại cảnh bt li nhƣ mn, hạn, lạnh, Ví d: enzyme CDPK
(calcium-dependent protein kinase) c vai trò điều chnh nồng đ ion Ca
2+
, bằng
cách gắn vi 4 ion Ca
2+
khi nồng đ ion này ở trong tế bào từ 0,1 -1 µM, dẫn đến
cây có th chng chu đƣc cc điều kin cực đoan.
1.2.2. Vai trò của glycine betain đối với tính chống chịu ở thực vật
Glycine betaine là mt hp cht amine bậc bn, cht ny đƣc tìm thy phổ
biến ở các loài vi sinh vật, thực vật bậc cao và ở đng vật [14]. Vic tăng cƣờng tích
lũy glycine betaine ở thực vật đng vai trò sinh l quan trng trong vic làm giảm
stress liên quan đến áp sut thm thu. Glycine betaine đƣc biết đến là mt cht
bảo v thực vật chng lại mui mn, hạn, lạnh và nhit đ cao liên quan đến áp sut
thm thu bởi khả năng: (1) Duy tr cân bằng áp sut thm thu, (2) n đnh mt s
đơn v chức năng nhƣ: phức h quang hp II (oxygen evolving photosystem II
complex), (3) Bảo v cu trúc enzyme nhƣ: ribulosebiphosphate carboxylase,
protease,…, (4) Duy tr tnh ton vẹn cu trúc của màng sinh cht [24]. Nhƣ vậy,
cht này thuc về nhóm hp cht đƣc biết đến nhƣ cc cht hòa tan tƣơng thch.

Glycine betaine xut hin nhƣ mt yếu t quyết đnh ti khả năng chng chu
điều kin bt li ở thực vật. Cht này là cht có hiu quả ln, liên quan mật thiết
đến khả năng sinh trƣởng của cây trồng trong điều kin môi trƣờng nhiễm mn,hạn
hán, lạnh giá và nhit đ cao. Sự tch lũy của glycine betaine trong tế bào làm giảm
hoàn cảnh bt li. Sự tổng hp v tch lũy glycine betaine trong tế bào có hiu quả
hơn cc hp cht tƣơng thch khác trong quá trình làm ổn đnh cu trúc bậc bn của
enzyme và các phức h protein, cũng nhƣ trạng thái ổn đnh của màng sinh cht
trong điều kin nồng đ mui cao hay ở nhit đ cực đoan [22], [24].

13
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên


Ở nồng đ cao, glycine betaine không gây cản trở chức năng của tế bào cht
mà có tác dng đảm bảo tính ổn đnh cu trúc và chức năng của cc đại phân t. Mức
đ tch lũy glycine betaine tƣơng quan vi khả năng chng chu điều kin bt li.
Glycine betaine đƣc tch lũy chủ yếu trong lc lạp, đng vai trò quan trng trong điều
chnh và duy tr mng thylacoid do đ duy tr hiu quả quang hp [15], [26], [29].
Trong nhiều loài cây trồng, sự tch lũy tự nhiên của glycine betaine đủ đ cải
thin tc đng tiêu cực của tình trạng mt nƣc gây ra bởi những vn đề môi trƣờng
khác nhau. Bên cạnh đ, mt s loài cây trồng nhƣ: la, thuc lá, Arabidopsis…
trong tự nhiên không tổng hp glycine betaine trong điều kin stress (điều kin môi
trƣờng cực đoan) hoc không stress. Các ứng dng của glycine betaine ngoại sinh
có th giúp giảm thiu tc đng tiêu cực của môi trƣờng bên ngoài. Glycine betaine
ngoại sinh có th thâm nhập qua l v đƣc vận chuyn đến cc cơ quan nơi n sẽ
góp phn tăng cƣờng khả năng chu đựng stress. Tuy nhiên, phƣơng php ny cho
hiu quả không cao. Ứng dng công ngh chuyn gen thực vật, các nhà khoa hc đ
tạo ra nhiều ging cây trồng có khả năng chng chu cc điều kin bt li của môi
trƣờng bằng cách chuyn các gen codA giúp cây tự tổng hp v tch lũy glycine
betaine [19].

1.2.3. Cơ chế sinh tổng hợp glycine betaine
1.2.3.1. Sinh tổng hợp glycine betain ở thực vật
Trong s các hp cht amine bậc bn đƣc biết đến ở thực vật bậc cao,
glycine betaine đƣc tổng hp nhiều nht trong đp ứng vi điều kin căng thẳng mt
nƣc [43]. Glycine betaine đƣc làm giàu chủ yếu ở lc lạp, nơi có vai trò quan trng
trong vic điều chnh và bảo v màng thylacoide, do đ, tăng cƣờng hiu quả hoạt
đng của b máy quang hp [11], [29]. Ở thực vật bậc cao, glycine betaine đƣc tổng
hp từ serine qua ethanolamine, choline và betaine aldehyde [20]. Quá trình sinh tổng
hp glycine betaine ở thực vật trải qua hai bƣc nhƣ sau:
(1). Đu tiên, tiền cht choline đƣc chuyn thành betaine aldehyde (mt hp
cht trung gian đc vi thực vật) nhờ sự xúc tác của choline monooxygenase (CMO).

14
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên


(2). Tiếp theo, betaine aldehyde đƣc chuyn thnh glycine betaine dƣi hoạt
đng của betaine aldehyde dehydrogenase (BADH).
Mc dù, con đƣờng tổng hp glycine betaine trực tiếp từ sự N-methyl hóa
glycine cũng đƣc biết đến, nhƣng sự tch lũy glycine betaine ở tt cả các loài thực
vật bậc cao đƣc xc đnh l con đƣờng tổng hp từ choline [19] nhƣ sơ đồ sau:

Hình 1.3. Chu trnh sinh tổng hp GB ở thực vật
1.2.3.2. Sinh tổng hợp glycine betain ở vi khuẩn E. coli
Cũng ging nhƣ thực vật bậc cao, ở vi khun E. coli và ở mt s đng vật,
con đƣờng sinh tổng hp glycine betaine cũng trải qua hai bƣc là kh choline
thành betaine aldehyde và oxy hóa betaine aldehyde thành glycine betaine. Tƣơng
ứng, hai bƣc đ đƣc xúc tác bởi choline dehydrogenase (CDH) và betaine
aldehyde dehydrogenase (BADH) [19], [26] theo sơ đồ sau:

Hình 1.4. Chu trnh sinh tổng hp GB ở vi khun E.coli
1.2.3.3. Sinh tổng hợp glycine betain ở vi khuẩn Arthrobacter globiformis và
Arthrobacter panescens
Ngƣc lại, con đƣờng sinh tổng hp GB ở mt s vi khun nhƣ Arthrobacter
globiformis và Arthrobacter panescens, ch đƣc xúc tác bởi choline oxydase

15
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên


(COD). Kết quả là từ tiền cht choline chuyn hóa thành sản phm trực tiếp là
glycine betaine không thông qua hp cht trung gian [19] theo sơ đồ sau:

Hình 1.5. Chu trình sinh tổng hp GB ở vi khun Arthrobacter globiformis
1.2.4. Nguồn gốc và đc điểm của gen codA
Quá trình sinh tổng hp glycine betaine đƣc tìm thy ở nhiều sinh vật khác
nhau: vi khun, đng vật và thực vật hạt kín. Tuy nhiên, gen codA ch đƣc tìm
thy và phân lập trong h gen của vi khun Arthrobacter globiformis và
Arthrobacter panescens. Vi khun Arthrobacter thuc nhóm vi khun gram dƣơng
sng trong đt. Khi môi trƣờng đt nhiễm mn, vi khun này s dng gen codA nhƣ
mt vũ kh li hại đ bảo v giúp chúng sng sót [19].
Gen codA c kch thƣc phân t là 1.641 bp, mã hóa cho choline oxidase có
kch thƣc phân t 547 amino acid, trng lƣng 60kDa. Choline oxidase là mt
enzyme chìa khóa giữ vai trò quan trng đi vi quá trình sinh tổng hp glycine
betaine ở Arthrobacter. Choline oxidase c khả năng xc tc phản ứng oxi hóa 4
electron của choline đ tạo ra sản phm trực tiếp là glycine betaine mà không qua
các hp cht trung gian. Enzyme ny c  nghĩa quan trng bởi v khi tch lũy hm
lƣng cao glycine betaine trong tế bào giúp cho tế bào chng lại sự kh nƣc và
hin tƣng co nguyên sinh trong điều kin môi trƣờng bt li [38].

1.3. Sử dụng gen codA trong cải tạo giống cây trồng tăng cƣờng khả năng chống
chịu điều kiện bt lợi của môi trƣờng
Nhiều nghiên cứu chủ yếu tập trung vào tạo dòng và phân lập các gen liên
quan đến sinh tổng hp glycine betaine nhƣ: CMO, BADH, codA từ những cơ th
sinh vật có khả năng tch lũy glycine betaine mt cách tự nhiên. Gen mã hóa cho
CMO v BADH đƣc phân lập từ mt s loài thực vật bậc cao. Gen codA đƣc

16
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên


phân lập từ vi khun A. globiformis. Sau khi phân lập, những gen ny đƣc thiết kế
vi các promoter mạnh, đc hiu (CaMV35S promoter, rd29A promoter,…) v
chuyn thành công vào mt s loài thực vật nhờ kỹ thuật gen. Mt s nghiên cứu
công b đ thu đƣc cây chuyn gen có khả năng tăng cƣờng chng chu cc điều
kin bt li của môi trƣờng. Cc đi tƣng thực vật đƣc chuyn gen ny thƣờng là
những đi tƣng không có khả năng tự tch lũy glycine betaine cả trong điều kin
căng thẳng (stress) v không căng thẳng (non-stress) nhƣ: Arabidopsis thaliana,
thuc lá (Nicotiana tabaccum), cải bẹ, lúa, Bạch đn,…[13], [15], [19].
Năm 1997, Hayashi v cng sự đ chuyn gen codA phân lập từ vi khun A.
globiformis vào cây Arabidopsis thaliana. Trong nghiên cứu này, gen codA đƣc
thiết kế thêm đoạn peptide tín hiu (transit peptide) dẫn vo trong đch l lc lạp.
Nồng đ glycine betaine đƣc tch lũy trong lc lạp lên đến 50 – 100 mM. Kết quả
thu đƣc là hạt của cây chuyn gen có khả năng chu đƣc nồng đ mui cao trong
sut quá trình nảy mm và quá trình phát trin tiếp theo của cây. Gen codA cũng
đƣc chuyn vo trong cây la v tch lũy glycine betaine ở lc lạp, kết quả cho
thy cây lúa chuyn gen cũng c khả năng chu mn cao hơn so vi cây đi chứng
[18], [28]. Tuy nhiên, khi không thiết kế thêm đoạn transit peptide tín hiu vi mc
đch biu hin gen codA trong tế bào cht th lƣng glycine betaine tch lũy trong tế
bào cht tăng lên từ 3 – 5 ln so vi trong lc lạp. Từ kết quả này, mt s tác giả

đƣa ra giả thuyết rằng trong tế bào cht chứa lƣng cơ cht l choline cao hơn trong
lc lạp, do đ, đây c th là v trí tổng hp choline trong tế bào [25], [42]. Khi các
nhà khoa hc tiếp tc kim tra cây Arabidopsis thaliana chuyn gen codA trong các
điều kin bt li khc nhƣ: nhit đ thp, nhit đ cao, khô hạn th thu đƣc kết quả
tƣơng tự. Nghĩa l, cây chuyn gen codA có khả năng chng chu đƣc cc điều
kin bt li từ môi trƣờng: mn, lạnh, hạn và nhit đ cao [19].
Ngoài ra, không dừng lại ở cây mô hình A. thaliana, nhiều tác giả đ nghiên cứu
chuyn gen codA vào mt s loài cây trồng nhƣ: cây hồng Nhật bản (Diospyros kaki),
cây cải bẹ, cây cà chua, cây bạch đn, cây ngô, cây đậu tƣơng, cây thuc lá, [19], [44].
Các kết quả thu đƣc đều chứng minh rằng vic tăng tch lũy glycine betaine giúp cây