nghiên cứu tăng cường khả năng chống chịu các điều kiện bất lợi của môi trường trên đối tượng cây xoan ta (melia azedazach l.) bằng công nghệ gen thực vật

1

MỞ ĐẦU
1. Tính cấp thiết của đề tài
Bii khí hu ngày càng din ra mnh m ng
bt li t ng, n s ng và phát trin ca nhiu loài cây
trng. Do s i khí quyn vi hiu ng nhà kính, nhi ca khí quyn m
d hai cc s to s ngp lt  t tht, hn hán và
s xâm nhp mn s tr thành v ln gây ng nghiêm trn phát trin
nông lâm nghip thích ng vi nhng bii khí hu và nhng h qu ca
chúng, chic chung ca ngành nông lâm nghip  tiên to ra nhng ging
cây trng chng chu c khô hn, mn, ngp úng, lnh và chng chu vi t có
v u lân, ng c st, ng c nhôm.
Nhng bt li t môi tr khô h t nhim mn, ngp
úng, nhi  c  ng làm mt cân bng v áp sut thm thu gây nh
ng nghiêm trt và chng ca nhiu loài cây trng (Linhui
et al., 2012). Mt trong nhng phn ng gp nht khi cây gu kin
bt li v là ng tng ht chuy
lo ng áp sut thm thu cho t bào. Proline
c bin là mt trong nhng ch quan trng
u chnh áp sut thm thu ni bào khi thc vt sng trong các
u kin bt lkhô hn, mn, lnh (Sávio et al., 2012). Trong t bào thc vt,
glycine betaine (GB) c tng hp t choline thông qua hai phn ng liên tip
c xúc tác bi choline monooxygenase (CMO) và betain aldehyde
dehydrogenase (BADH) (Rathinasbapathi et al.,     c vt
bc cao,  vi khun E. coli và  mt s ng vng sinh tng h
tr   c là kh choline thành betaine aldehyde và oxy hóa betaine
aldehyde thành GB (Takabe et al., 1998). c lng sinh tng hp GB 
vi khun Arthrobacter globiformis và Arthrobacter panescens li rn, t
choline chuyn hóa thành sn phm trc tip là GB ch cn xúc tác bi choline
oxydase (COD) (Ikuta et al., 1977). Sinh tng hp proline  thc vt bc cao có th

c thc hing hoc t glutamate hoc t ng
sinh tng hp proline t  c ch  u tiên  vi khun bi
 nhiu loài sinh vn
2

khác nhau.  thc vt bc cao, chu trình này ch nh sau khi các nhà
khoa hc thành công trong vic phân ln cDNA ca gen mã hóa cho
enzyme pyrroline-5-carboxylate synthetase (P5CS) (Hu et al., 1992). P5CS là mt
enzyme gi hai ch nht enzyme hot hóa glutamate tr thành dng hot
ng phn  to ra
pyrroline-5-carboxylate. Dn xu b kh bng phn ng xúc tác bi
enzyme pyrroline-5- to proline.
T nhng hiu bit sâu sc v ng sinh tng hp glycine betaine và
proline  sinh vt, cùng vi s phát trin mãnh m cc công ngh c
bit là k thut to cây trng bii gen. Các nhà khoa hc các
gen: codA (COD), COX, BADH, betA (CDH), CMO, GSMT, SDMT, P5CS và P5CR
t nhiu ngun khác nhau, mã hóa cho các enzyme tham gia vào quá trình sinh tng
hp GB c thit k vi các promoter biu hic
hiu, mnh và chuyn thành công vào nhiu loài cây trng, các loài cây trng bin
ng kh ng chu kin bt li cng (Amudha
& Balasubramani, 2011). Các kt qu  : Cây Arabidopsis thaliana


codA,COX, GSMT/SDMT 








 , 



,
chu 

    (Ali et al., 1998a, 1998b; Hayashi et al., 1997, 1998;
Sakamoto et al., 2000; Huang et al., 2000), 



(Brassica juncea) 


codA  





(Waditee et al., 2005,
cây lúa (Oriza sativa) chuyn gen codA, betA,COX, CMO, cây cà chua, cây hng,
cây b 

 codA 

  




 , hn, 

 và
oxy hóa (Sakamoto et al., 1998, Takabe et al., 1998; Su et al., 2006; Shirasawa et
al., 2006; Mohanty et al., 2002; Park et al., 2004, 2007a; Yu et al., 2009). Cây thuc
lá chuyn gen COX, betA, CMO, BADH (Lilius et al., 1996; Nuccio et al., 1998;
Yang et al., 2008), cây cà rt chuyn gen BADH (Kumar et al., 2004); cây bông và
ngô chuyn gen betA           c
chng minh là chng chu tu kin cn cng. Kt
qu nghiên cu chuyn gen P5CS, P5CR,

-OAT tham gia sinh tng hp proline
vào cây thuc, lúa mì, cà rt, chanh, Arabidopsis cho thy
cây chuyn gen chng chu tu king sng b mn, hn, oxy
hóa, nhit cao 
3

2000; Anoop et al., 2003; Su & Wu, 2004; Sawahel & Hassan, 2002; Han &
Hwang, 2003; Hur et al., 2004; Molinari et al., 2004; De Ronde et al., 2004).
Vit Nam là mt trong nhng quc gia b ng mnh m ca vic bin
i khí ht nhim m
 là mt trong nhng nguyên nhân chính làm git và chng cây
trng nông lâm nghip và thu hp din tíct canh tác. , 















 nông lâm nghip 




























 







. Trên
th gii, các nghiên cu to cây trng bii gen ng chng chu
kin ng bt li ch yu tp chung vào nhóm cây nông nghip, còn nhóm
cây lâm nghip (cây g) mi ch có mt vài công trình công b (Yu et al., 2009, Yu
et al., 2010). Trong lâm nghip, cây dPopulus sp.) c s dcây
mô hình cho các nghiên cu chuyn gen. Tuy nhiên, hn ch duy nh


u kin khí hu ca Vit Nam. Vì vy, vic tìm
kim mt loài cây d thích ng và ph bin  Vit Nam  làm cây mô hình cho các
nghiên cng cây lâm nghip tr nên rt cn thit.
t trong nhng cây trng quan trng trong chin
c phát trin lâm nghip  c ta. Nó có mt  6/9 vùng sinh thái lâm nghip,
        ng bng Sông Hng và vùng Nam
Trung b u trong danh mc các cây trn

theo quy nh s -BNN ngày 15/03/2005 ca B ng B
  a, nhng kt qu nghiên c  u trong vic xây dng
n gen  ng cây Xoan ta là rt có trin vng (Bui Van
Thang et al., 2007a; Nirsatmanto & Gyokusen, 2007; Ngo Van Thanh et al., 2010)
cho phép các nhà khoa hc có th tin hành các nghiên cu ci thin gic bit
là nâng cao tính chng chu ca loài cây này và có th s dt loài cây mô
hình cho các nghiên cu chuyn gen vào cây lâm nghip  Vit Nam. 








 nêu trên, chúng tôi 







 Nghiên cứu tăng
cƣờng khả năng chống chịu các điều kiện bất lợi của môi trƣờng trên đối
tƣợng cây Xoan ta (Melia azedarach L.) bằng công nghệ gen thực vật.

4

2. Mục tiêu nghiên cứu của đề tài

2.1. Mc tiêu chung:
Thông qua công ngh chuy nghiên cu kh ng tính
chng chu king bt li trên ng cây Xoan ta nhm b
 khoa hc và thc tin cho vic to ging cây trng lâm nghip có
kh ng chu tt vu king bt li.
2.2. Mc tiêu c th:
(1) Xây dc quy trình chuyn gen vào cây Xoan ta t hiu su làm
công c nghiên cu;
(2) c hong ca promoter rd29A cm ng hn  các dòng Xoan ta
chuyn gen;
(3) c kh u hn ca các dòng Xoan ta chuyn gen P5CS t
bin loi b hiu ng phn hc (P5CSm);
(4) c kh u hn, mn ca các dòng thuc lá và Xoan ta chuyn
gen codA.
3. Nội dung nghiên cứu
(1) Xây dng và t     n gen vào cây Xoan ta thông qua
Agrobacterium tumefaciens;
(2) To các dòng Xoan ta chuyn gen mang cu trúc gen rd29A::gus intron và 
giá hot ng ca promoter rd29A u khin biu hin gen gus u kin bình
ng và x lý hn nhân to;
(3) To các dòng Xoan ta chuyn gen mang cu trúc gen rd29A:: P5CSm và 
giá kic tính sinh lý, sinh hóa ca cây chuyu kin x lý
hn nhân to;
5

(4) To các dòng thuc lá và Xoan ta chuyn gen mang cu trúc gen 35S::TP-
codA/35S::codA và  kic tính sinh lý, sinh hóa ca cây chuyn
u kin x lý hn, mn nhân to.
4. Đóng góp mới của luận án
Luu tiên  Vit  gii xây dng

c quy trình chuy      t hiu sut cao thông qua
Agrobacterium tumefaciens. Lun án là công trình u tiên tc các dòng cây
Xoan ta chuyn gen P5CSm/codA và chc kh  ng tính
chu hn và chu mn  các dòng cây chuyn gen. Luu
tiên s dng gen codA c thích ng mã di truyn  thc vt  chuyn vào cây
thuc lá và cây Xoan ta, kt qu cho thy cây chuyn gen sinh tng h
t nhiu ln so vi các công trình công b c
n n b  lý lun và thc tin cho vic ng
dng công ngh chuyn gen trong to ging cây trng nông lâm nghip nói chung
và cây Xoan ta nói riêng chng chu tt vu king bt li.










6

Chƣơng 1
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1.  
Thc vm v trng thái sc thù bám tr t ti
mt ch, không di chuyn t sng  sng khác trong sut quá trình
phát tring vt, thc vi mt trc tip vi
u kin ngoi cnh bt lng và phát trin.
Nhng bt li t ng có th gây ra nhng bii sinh lý, hóa sinh

và hình thái; t  t và chng cây trng.
1.1.1. Tác hại của hạn đến sinh trƣởng và phát triển của cây trồng
Hn hán là mt nguyên nhân quan trng làm git và chng
sn phm ca cây trng hn hán cây b stress mt c dn
nhiu hu qu nghiêm trng (Abdullah et al., 2011; Belkheiri & Mulas, 2013): (i)
Gây nên hing co nguyên sinh và làm cho cây b héo. S co nguyên sinh cht
xy ra khi t bào b stresc trong t bào tht thoát ra ngoài nên
khi nguyên sinh cht ca t bào co li, th tích không bào b thu hp. Khi cây sng
trong ng thic kéo dài, t bào mc dn các mô tr nên mm
yu và s héo xy ra. Mô thc vt b héo tm th n nu
s thic xy ra nghiêm trng và trong thi gian dàing sng b
khô hn cn tr s vn chuyc trong mch g. Khi thic do khô hn s
cung cc cho r   thy  thic ban
ngày, d n các lông hút b t  lp ngoài vùng v b ph cht sáp
(suberin) làm gim áp sut r nên nh y cc lên cao trong mch
gc bit khi thic s hình thành nhiu bt khí trong mch g dn phá
v tính liên tc ca cc nên cc trong mch g y lên liên
tc. (iii) Hn hán làm dày lp cutin trên b mt lá làm gim s c qua
biu bì. (iv) S thic làm gi quang hc
7

trong lá còn khong 40 -50% quang hp ca lá b . c bit, hn hán cn
tr s ng ca cây trng. Thic n các hong sinh lý,
nht là quang hp nên làm ging t cây trng nghiêm trng.
1.1.2. Tác hại của đất nhiễm mặn đến sinh trƣởng và phát triển của cây trồng
t mn là lot chng mui cao (>0,2%) có nhic. Nu
hng mui t cao, áp sut thm thu ca dung dt rt cao, có th
t 200 - t nhim mn có áp sut thm thu cao nên cây không th
  c t  ng gây nên hi ng hn sinh lý   ng
không th sng có áp sut thm thu trên 40 atm. Ngoài ra, trong

t nhim mn còn cha nhic. Các ion này cnh tranh vi chng
trong quá trình hút ca r làm cho r khó hút chng dn cây trng
 ng chm và gi  t m  t nhim mn có các mui
NaCl, Na
2
SO
2
, Na
2
SO
4
, Na
2
CO
3
, MgCl
2,
, v.v. các mui này ng cao trong
t c vào trong t bào s gây ra ri lon
 i cht ca t c s c ch hong ca các
enzyme, các chng dn làm ri lon các i
cht và các hong sinh lý ng ca t  c còn làm nh
ng bt ln nguyên sinh cht, làm gim m nht, tính thm ca nguyên
sinh cht làm cho t bào mt chng. Các hong sinh lý ca t bào
   ng nghiêm trng khi cây b  ng ca mui mn. Quá trình
quang hp gim mnh do lá kém phát trin, sc t quang hp ít do các chc c
ch quá trình tng hp các sc t quang hp. Quá trình hô h
cht b phân hy mu qu tng thp do phn lng
ca các quá trình d hóa b thi dng nhit làm cho t bào thing
 duy trì các hong ng. Phân hy mnh, tng hp li yu nên

 ng vt cht do hô hp phân hy, dn các cht d tr b hao ht
mnh,  ng hong chm, còi cc và t
8

thp. Cây s b cht nu b tác ng cng nhim mn cao hay nhim mn
trong thi gian dài (Jouyban, 2012).
1.1.3. Tác hại của nhiệt độ cao đến sinh trƣởng và phát triển của cây trồng
Thc vt là sinh vt bin nhit nên nhi ng có ng ln
hong sng c nhi sinh lý ca cây khong 1  45
o
C. Stress
nhit do nhi ng xung quanh cao là mt ma nghiêm tri
vi cây trng sn xut trên toàn th gii (Hall, 2001; Harrison et al., 2011). Nhi
n hoc liên tc là nguyên nhân gây ra mt loi v hình thái gii
phu, sinh lý và sinh hóa  thc vt, n s ng và phát trin ca
thc vt và có th dn suy gim sng.
S tip xúc ca thc vt ti nhi cao, ht ging có th y nhanh quá trình
lão hóa, làm gim s u qu, trng ht ging và làm gitu
này là do thc vng chuyn ng các ngu chng li
stress do nhin ch ng và sinh sn. Mt ng khác ca
stress do nhit cao cho nhiu loài thc vt là gây ra vô sinh khi nhit cao tác dng
c hoc trong khi n hoa. Cây h c bit nhy cm vi stress do nhit
 n n hoa, ch có mt vài ngày tip xúc vi nhi cao (30  35
o
C) có th
gây ra tn tht nt thông qua ging hoa hoc tình trng không
phát tri ca v qu.  nhi rt cao gây t bào nghiêm trng
và thm chí làm cho t bào b cht trong vòng vài phút, dn s s nhanh
chóng ca các t chc t bào (Schoffl et al., 1999).  nhi cao va phi, tn
c cht ch có th xy ra sau khi tip xúc lâu dài. Tn c tip do

nhi cao bao gm s bin tính protein và s kt t, ng ca màng
lipid. Tp hoc tt chm bt hot các
enzyme trong lc lp và ty th, c ch tng hp protein, suy thoái protein và màng
t bào mt tính linh hot (Howarth, 2005).
9

Stress nhit cao n t chc ca các cu trúc vi ng bng
cách chia tách và/hoc kéo dài ca chúng, hình thành các th sao hình ng trong các
t bào phân bào và kéo dài ca vi ng ht vách. Ti cùng dn ti
c ch s ng, gim dòng ion, to ra hp chc hi và các loi ôxy phn
ng (reactive oxygen species = ROS) c cho t bào (Howarth, 2005).
ng ca cây trng gim sút là kt qu chính ca vic cây ng
u kin nhi cao. Nguyên nhân ch yu là do nhi cao làm gim
t quang hp, ng to ra gim sút nghiêm trng. Có gi thit cho
rng trong các phn ng ca pha sáng, nhi cc tng hp
ATP liên tc (bng quá trình vn chuyn t có tính chu trình) n khi cân
bng vng ATP tiêu th (Bukhov et al., 1999). Trong các phn ng pha ti ca
quá trình quang hp, s honh
c trung gian, s hot hóa này b c ch  3540C dn vic gim tiêu
th CO
2
và gim to ra các carbohydrates (Dubey, 2005; Wahid et al., 2007). Trong
ty thu kin bt lng s là nguyên nhân phá hy NAD+, ATP tiêu
th t tri và vic hô hp s c phá v NAD+ mt phn do nguyên
nhân ca vi  ng ho ng ca poly(ADP-ribose) polymerase (PARP),
cht s d tng hp ADP-ribose. Quá trình poly(ADP)
u hòa sau dch mã cc
c khu bi s oxi hóa và các dng khác ca vic phá hng DNA. S suy yu
gây ra bu kin bt li mang li s suy yu cng khi mà các phân t
 tái tng hp NAD+ (Zidenga, 2005). Cui cùng, có th nói rng

vic chng chu nhi ca cây là mt quá trình tiêu tn nhing ni bào
   i phó nhi cao. Nói chung các phn   
ng sn xut ROS, rt cuc có th gây cht t bào, mô và c th
(De Block et al., 2005).


10

1.1.4. Tác hại của nhiệt độ thấp đến sinh trƣởng và phát triển của cây trồng
Nhi thp làm cho lá cây b héo mng v c do nhit
 thp c ch s c ca h r và s vn chuyc ca h mch. Nhi
thc ch quá trình quang hp ca lá, làm gim hô hp, c ch các quá
trình tng hp nht là tng hp các phân t protein do các enzyme hong yu. 
nhi thp làm cho màng nguyên sinh cht b ti
thm nên tht thoát ch ng ca t bào ra bên ngoài. Nhi thp nh
n cu trúc và cha h r. S c và cht khoáng b gim
mnh làm cho cây thic và chng. Nhi thp còn làm tn hi
màng lc lp, ty th dn ng nghiêm trng n các quá trình sinh lý ca
p, hô hp. Nói chung nhi thp làm gim mnh sinh
t và chng sn phm ca cây trng (Gulzar et al., 2011).
1.1.5. Phản ứng của thực vật đối với các điều kiện môi trƣờng bất lợi
Các yu t c           
ng lên lá. Hn, úng và mn mung lên b r. Các yu
t cng gây ra din rng v các phn ng ca thc vt, t vii
biu hii cht trong t n nhi ln
t t cây trng. Nhng bii ln m
i cht khi gp các yu t cng s làm thay
i s biu hin cu t vic nhn bit tín hiu  m t bào,
lan truyn tín hiu này trong t bào và tin kh sinh vt.
S biu hin ca các gen phn i vi các yu t c hiu tiên là

 mc  t n m toàn b , tip theo là s i v hình
ng, phát trin và cui cùng làm n kh t
và chng sn phm ca cây trng (Trn Th 
S biu hin các gen phn ng vi các yu t cc ng ph
thuc vào kh n bit chúng. Bng chng các chu khin
11

nhng phn ng ca cây tri vi các yu t ct hin abscisic
 xut hin các phn ng th cp
t hin Ca
2+
(Shinozaki et al., 2007). M biu hin ca mt s 
hn lên, mt s khác yu hu hòa vic biu hin các gen này khi gp các
yu t c   c nhiu nhà khoa hc quan tâm
nghiên cu  c khi phiên mã, sau phiên mã, dch mã,
sau dch mã và tc làm sáng t d phân t n tích chng
chu kin cn ca thc vy, khi gp các yu t ct
ngt, thc vt phu ch thích ng vi s ng sng nhm
kéo dài kh n tng và phát trin. Phn ng ca thc vt khi gp
u kin, mn, v.v. gây mc t ng biu
hin các g   n tng hp các cht th c    ng tan,
 ng áp sut thm thu ca t bào (Khan et
al., 2009; Szabados & Savoure´, 2009) hoc biu hin các gen mã hóa cho các
protein chu hn, m i vi hing
nhi cao, chúng s ng m biu hin các gen mã hóa cho các protein
sc nhit (Hsp  heat shock protein) (Simões-Araújo et al., 2003).
Thi gian, m khc lit ca các yu t cnh hn
kh n ng ca cây trng. Hing mc cc b ch gây thit hi cho
mt nhóm nhn hán, nhim mn kéo dài s gây thit hi cho nhiu loài cây
trng trên mt vùng rng ln, t và chng sn phm cây

trng (Trn Th  bào khác nhau
s phn ng vi các yu t cng nhau. Các loài thc vt khác nhau
s có kh ng chu khác nhau vi các yu t cng ph
thuc vào bn cht di truyn (h gen) ca chúng. Vì vi mt trc tip vi các
yu t bt li cng có loài cây có th chng ch tn ti, sinh
ng và phát trin, có loài cây s b cht. Ngay trong cùng mt loài cây, các cá th
khá phn ng khác nhau vi yu t cng
(Buchanan et al., 2000).
12

1.2. TÍNH CHNG CHU VU KING BT LI CA
THC VT
1.2.1. Cơ chế chống chịu các điều kiện môi trƣờng bất lợi
u kin bt li t môi tng sng - u kin bt li phi sinh hc
n, hn, lnh, nhi n hàng loi v
hình thái, tính cht vt lý, hóa sinh, phân tng xn s sinh
ng và phát trin ca thc v m bo tính toàn vn và sng còn, nhiu loài
thc vt có các chii phó vi nhng bt li phi sinh hc khác nhau. S
phn ng c sng vi các yu t c thuc vào tng loài, kiu
gen, thng và tính khc lit ca yu t c tun
phát trin, dc thù cc t bào và phn ngoi vi ca chúng.
Khi b ng bi các yu t bt li cng, thc vt s to ra mt s cht
kích thích, protein gic hoc hoormon giúp chúng có kh ng.
Hin nay, các nghiên cu v  chng chu kin bt li t môi
ng  thc vc tng nghiên cng các
cht giúp bo v áp sut thm thu ca t bào khi s mt cân bng v c. S
 ng các ch u chnh áp sut thm th c phát hin trong nhiu
ng hng bt ln hán, mui mn và lnh giá (Khan et al.,
2009; Szabados & Savoure´, 2009). Kh u chnh áp sut thm thu là mt
c tính rt quan trng ca t bào khi b mc do lnh, mui hoc hn. Nhng

thc vt sng thic b mt cân bng v áp sut thm thu
trong t i phi có kh ng chu lu kin khc nghi
Mt trong nhc ca thc vt chng li s mt cân bng v áp
sut thm tha trên s i trong chuyn hóa t bào cht dn s
xut hic các axít amin c
hiu (Ashraf et al., 2009). Hing này xy ra rt nhanh khi t bào b mc.
S t này không làm n hong ca các
enzyme nc li, s ng ln các cht hòa tan trong t bào s
u chnh áp sut thm thu bng tng th mà chúng có kh  gi và
lc vào t bào. Ngoài ra, chúng có th thay th v y ra các phn
i lipid hon s phá hy
màng t bào và các phc h protein. V mt hóa hng là nhng phân
13

t trung hòa v c rt nhng giúp các phân
t protein và màng t bào chng li s bing cu kin bt
li phi sinh hc (Trn Th t bo v áp sut thm thu hay
các cht hc chia làm 4 nhóm chglycine betaine
(là dn xua axít amin), (2) proline và ectoine (axít amin),
(3) polyols và trehalose (là mt hp cht polyme không phng) và (4) các loi
ng tan: glucose, sucrose, fructan, manitol và pinitol.
 ng thc hin ch
chu chnh áp sut thm thu và bo v t bào khi b mc. Quá trình này
n mt s enzyme chc phân lp và phân tích v mt sinh
 cht tham gia sinh tng hp và chuyn hóa các chu
hòa áp sut thm thu, các enzyme gic và các loi protease khác. Protein vn
chuyc qua màng, cht vn chuybetaine
n c, proline, glycine betaine, các chng
 u chnh áp sut thm thu
khi gu king c

1.2.2. Cơ chế phân tử liên quan đến tính chống chịu điều kiện môi trƣờng bất lợi
ng ca yu t cn cu tiên t bào thc vt s
nhn bit tín hiu, cm ng vu king, tin tng hp các hormone
t hóa các yu t phiên mã  TF (transcrition factor). Phn ln các
protein cm ng vc xp vào nhóm RAB. Tuy nhiên, có mt s gen có th
biu hiu kin thiu ABA.  các gen cm u king bt
lng vi x lý ABA ngoi sinh, mt s khác thì không (Ingram & Barttels,
1996; Shinozaki et al., 1997). Vì vy, s biu hi     c tính
chng chu king bt li không ch ng ph thuc ABA
mà còn có c c lp ABA (không ph thuc ABA).
ABA là mt hormone thc vu chnh s phát trin cây trng, ht ging
ng, ny mm, phân chia t bào và phn ng ca t bào vi các áp lng
n hán, mn mui, lnh giá, các tác nhân gây bnh và bc x UV (Ueno, 1998;
ng thy trong các loài thc vt bc thp và bc cao.
ng sinh tng hp và d hóa cc làm sáng t (Zeevaart, 1999).
ABA ho thc hi i trên nhiu quá trình sinh lý, ví d 
14

 khí khng bng vi t bào bo v, do
 n ch s m c thông qua s   c (Hetherington et al., 1998;
Assmann & Shimazaki, 1999) và bng cách kích hot s biu hic cho là
 tái lp trình các t  chng chc áp lc do mc gây ra (Ingram &
Bartels, 1996; Leung & Giraudat, 1998). Hn phát trit mc
cao nhn phôi mu và d tr ng, sau
m dn (Rock & Quatrano, 1995). Khi mô thc vt b stress (hn, mn,v.v.),
mp nhiu, có th n 40 ln trong vài gi và gim dc
c (Zeevaart, 1999). Các bng chng hin có cho thy, quá trình này ít nht là
do s u khin phiên mã ca các gen sinh tng hp và d hóa ABA (Cutler et al.,
1997; Qin & Zeevaart, 1999).
Khi gu kin cn tính chng chng

biu hin vi t nhanh. Bi vy, v khu trúc
cu khin s biu hin gen thông qua
vic nhn bit và hot hóa quá trình khc bit quan tâm. Trong quá
trình này, có th ng thi tham gia ca nhiu gen tng hp cùng mt lúc nhiu loi
n tính chng
chu. Phn ln các gen cm ng vu kin khô hu cm ng vu
kin lnh, mu kin mc sinh lý). S u hòa biu hiu
khin  nhic khác nhau, t c phiên mã, sau phiên mã và d
nhìn chung, kin nht là  n khc
biu hin khi RNA-polymerase có th liên kt vào vùng promoter (trình t khi
ng) ca nó và tin hành tng hp bn phiên mã mRNA cha vùng mã hóa ca
gen. M biu hin ca gen trong t nh bng mc gn kt (ái
lc) ca RNA-polymerase và các yu t phiên mã vi promoter.
Promoter hay vùng gen khng là trình t DNA rt cn thi biu hin
gen. Phn lc biu hin mnh hay yi s u khin ca các
yu t phiên mã  TF (transcription factor). TF là các protein có kh n bit
các trình t cis c hiu trên promoter và hot hóa s n trình t
cis  yu t cis c gi là các yu t u hòa (regulatory element).
Yu t u hòa phiên mã  TF có rt nhiu loi khác nhau thích hp vi
nhiu lon trình t cis, các nghiên cu  y có trên
15

1.200 loc hiu cho các lou kin ngoi cnh môi
n có trên 180 loc hiu  mô r liên
 n tính chu hn, mn, v.v Khong 5,9% h gen ca cây Arabidopsis
mã hóa cho trên 1.500 loi TF (Trn Th . Các protein tham
u khin biu hin gen có th có chc phn ng vi các
u kin c           
n vi trình t 
CBF4, DREB2, v.v. (Choi, 2000). Các yu t c    ng tác

ng lên các TF, tip theo các TF hot hóa kh n và gn vi trình
t cis trên promoter ca gen tng truyn tín hiu phc tp. T s
nhn bit, cm ng vu kin vic tng h
 t hóa các TF. Phn ln các protein cm ng vc
xp vào nhóm RAB (Choi, 2000). Tuy nhiên, có mt s gen có th biu hin
u kin thiu ABA. Ph thuc vào phn ng vi ABA, nhng yu t
u hòa trên promoter có th chia thành 2 loi (hình 1.1): Các yu t u hòa
ph thuc ABA và không ph thuc ABA (Shinozaki et al., 2007).
















Hình 1.1:   biu hin gen khi thc vt b ng bu king bt
li (Shinozaki et al., 2007).

16

1.2.3. Vai trò của proline và con đƣờng sinh tổng hợp proline ở thực vật

1.2.3.1. Proline đối với tính chống chịu điều kiện môi trƣờng bất lợi ở thực vật
Proline là mt trong nhc quan tâm nghiên cu nhiu nhi
vi tính chng chu king bt li  thc vt.  nhiu loài thc vt khác
nhau hàm t cao khi gu king bt l
hn, mn, lnh, nóng, n cht kim loi cao, nhim các loi bnh, thiu dinh
ng và b chiu tia t ngoi (Hare & Cress, 1997; Saradhi et al., 1995;
Siripornadulsi et al., 2002). M  các loài thc vt khác nhau là
khác nhau và có th n so vi cây su king.
Chính vì vy, s c khnh là có vai trò rt quan trng trong các
 chng chu vi cu king bt li ca thc vc cho
là phn t loi chi thích ng và là ch cây d tr ngun carbon
& Cress, 1997). Proline còn là mt cht có ch các gc oxy
phn ng sinh ra trong t bào khi t bào gu kin bt li oxy hóa (oxidative
stress) (Smirnoff &  ch
trình nh các cu trúc protein và to ra trng thái cân bng pH và oxy hóa kh ca
t bào. Vi nhng chc n
ch truyn tín hiu ca t ng thích ng (Maggio et al., 2002).
Ngoài nhng chng trong
ng và phát trin ca cây trng mc dù proline không phi là mt
trong nhng axít amin không thay th. S c xác nhn  các loi
n ca khá nhiu loài cây, bi vy proline còn có vai trò trong
quá trình phát trin các lon  thc vt. Hai quá trình phát tri
c chng hoa và thi
gian n hoa (Mattioli et al., 2009).
c xem là mt cht thm thu có vai trò bo v các cu trúc ni
i phân t (DNA, protein) khi t bào b ng bi u kin bt
17

li v áp sut thm thu (Szabados & Savoure, 2009). Tuy nhiên, s 
trong t bào có th  chng chu c thc vt theo

nhing khác nhau. Hình 1.2 khái quát v vai trò ci vi c
tính chng chu  thc vt.

Hình 1.2: Vai trò ca proline  thc vât (Szabados & Savoure, 2009)
Vai trò ca proline t chnh hình phân t trong vic bo v các
cu trúc protein và nâng cao hot tính xúc tác ca nhiu loi enzyme khác nhau.
 nh hot tính ca enzyme M4 lactate dehydrogenase
khi t bào b   ng bt li v nhi ; Proline bo v enzyme nitrate
reductase khi t bào b ng bt li v áp sut thm thu và kim loi nng;
      nh hot tính ca enzyme ribonuclease và protease
u kin t bào b ng bi n arsen bên 
cao (Sharma & Dubey, 2005; Mishra & Dubey, 2006). Mt s các công trình
nghiên cng minh rng proline có t cht chng oxy hóa,
vi cht các gc oxy phn ng và làm bt hot các gc oxy t do
(Matysik et al., 2002). Khi nuôi t bào nm men ng b sung proline
cho thy rng n các gc oxy phn ng gim mnh, nên làm chm quá trình
gây cht  nh sn ca t bào (Chen & Dickman, 2005). Proline
có th bo v các t i chng l
18

i vi các t bào to nuôi cy  u kin có n kim loi
nng cao thì proline có th làm gim quá trình phân gii các hp cht béo (Mehta
& Gaur, 1999). Nghiên cu  cây lúa cho thy proline có vai trò làm gic
tính ca thy ngân thông qua quá trình phân ct các gc oxy phn  
hydroperoxide (Wang et al., 2009). Khi nghiên cu trên h màng thylakoid 
nhn thy rng proline có vai trò c ch hiu ng phá hy ca các gc oxy t do
ti b máy quang hp II (Alia & ng tiêu cc ca tia phóng
x n các t bào to và cây thuc lá chuyn gen P5CS ng sinh tng hp
và  gim mnh (Hong et al., 2000; Siripornadulsil et al.,
2002).

Mc dù nhng dn chng v vai trò bo v và phân ct các gc oxy t do
trong t bào cc li nhng bng chng v kh 
duy trình s nh trng thái cân bng ni bào còn rt hn ch. S a các
enzyme P5CS1 và P5CR trong lc lp cho thu kin khc nghit ca
ng, quá trình sinh tng h lp th (Székely et al., 2008).
Khi cây gu kin bt li thì t chu trình Calvin gim m
gim thiu quá trình oxy hóa NADPH và d tr NAPD+. Khi kt hp vi ánh sáng,
n t trong chui vn chuyn t b c ch b ng NADP+,
u này dn s ng sn xut các gc oxy t do  trung tâm h quang
hc oxy phn ng (ROS) (Chaves et al., 2009). Vì quá trình
sinh tng hp proline là quá trình kh và c kh glutamate thành
P5C và t P5C thành proline, nên quá trình này s to ra nhiu phân t NADP+.
Bên c
th ATP và to ra ADP, các phân t  làm ct cho quá
trình sinh tng hp ATP thông qua quá trình quang hp. Chính vì vy n 
ng t sinh tng hp proline trong lc lp khi t bào gu kin bt li
có th giúp duy trì trng thái cân bng cnh dòng
n t, trng thái oxy hóa kh a nhn b máy quang hp
(Hare et al., 1997).  i mã vi P5CR cho thy
19

khi c ch quá trình sinh tng hp proline và phn ng chuyn hóa NADPH -
NADP+ thì các dòng chuyn gen này tr nên nhy cu kin hn,
ng hong ca gen P5CR thì các dòng chuyn gen có tính
kháng ti vi hn, kt qu này cho thy khnh rng quá trình sinh tng
hp proline rt quan tri vi vic duy tng NADP+  trong t bào khi
cây gu kin bt li (De Ronde et al., 2004).
Trong ty th, proline có nhng cho v rt riêng bit. Sau khi cây
gp phu king bt li, s p th 
cho ty th thông qua quá trình oxy hóa proline bi 2 enzyme PDH và P5CDH, cung

cn t cho chui phn ng hô h cây phc
h cho v phc h phn ng II
ca chui vn chuyn t ca ty th u kin mnh các
phn ng hô hp ca ty th. Nhng phát hin g chu trình P5C-proline cho
thy trong mu kic bit chu trình này có th cung cn t cho
chui vn chuyn t ca ty th mà không to ra glutamate. Quá trình d hóa
c xem là nhân t u hòa quan tri vi trng thái cân
bng các gc oxy phn ng ca t bào và có th n nhiu
hoàn khác ca ty th (Szabados & Savoure, 2009).
Sinh tng hp và c chng minh rng c
hiu cho mi loài. Tuy nhiên, liu s n tính thích ng
ca mi loài hay không vn còn là câu hi i vi các nhà khoa hc. Hai loài cây
chu mn Thellungiella halophila và Lepidium crassifolium nhiu
n so vi cây Arabidopsis  u kin mn, mc dù chúng có h hàng
vi nhau. S  cây Thellungiella halophila là kt qu ca s 
ng hong ca gen P5CS và gim hong ca gen PDH (Taji et al., 2004).
Nghiên cu cho thy rng,  n Pancratium maritimum có hng
proline  bào  ci thin tính chu mn thông qua kh n
nh hong ca các enzyme kh c, b máy vn chuyn protein và kích thích
20

s        o v.  các loài cây    
Camphorosma annua và Limonium spp h ng proline   không cao
 các loài cây này lnh nhiu cht thm thu khác
i carbohydrate hay các cht tng hp t betain (Murakeözy et al., 2003).
Các nghiên cu này cho thy rng, s  trong t bào 
vi nhc tính chng chu  các loài cây bi vy có th cho rng quá trình tích
 giúp cây ng tính chng chu vu king bt
li. Tuy nhiên, s không phi là mt yu t quá cn thit cho s
thích ng ca các loài thc vt khác nhau khi sng trong u king bt

li (Szabados & Savoure, 2009).
1.2.3.2. Con đƣờng sinh tổng hợp proline ở thực vật

Hình 1.3: ng sinh tng hp proline  thc vt bc cao (Delauney & Verma, 1993)
ng sinh tng hp proline  thc vt bc cao có th c thc hin
ng hoc t glutamate hoc t ornithine (hình 1.3)c sinh
tng hp t tin cht c coi là mt trong nhng chu trình sinh tng hp
quan trng nht ca thc vt  nhu kin sinh lý nhnh, khi thc vt b
21

gii hn v ngun nithoc sng bt li v áp sut thm thu.
c li, ng sinh tng hp proline thông qua tin cht ng
xy ra khi thc vt sng u kin ng th& Verma,
1993). ng sinh tng hp proline t tin cht c chng minh
u tiên  vi khun (Leisinger, 1987).  thc vt bc cao, chu trình này ch c
 nh sau khi các nhà khoa hc thành công trong vic phân l  n
cDNA ca gen mã hóa cho enzyme pyrroline-5-carboxylate synthetase (P5CS)
(Hu et al., 1992). P5CS là mt enzyme gi hai ch chính, th nht enzyme
hot hóa tin cht glutamate tr thành dng hong ca nó là glutamic-semi-
n  to ra pyrroline-5-
carboxylate (P5C). Dn xu     b kh bng phn ng xúc tác bi
enzyme pyrroline-5- to L-proline.
 thc vt, proline không ch c tng hp t glutamate mà còn t
ornithine. Trong quá trình sinh tng hp này gc amin ca ornithine có th c
chuyn thành glutamic-semi-aldehyde bi s xúc tác ca enzyme ornithine-
aminotransferase (-OAT) ho-keto-aminovalerate (KAV) bi s xúc tác
ca enzyme -   ng th nht glutamic-semi-aldehyde s c
   to pyrroline-5-carboxylate do hot tính ca enzyme pyrroline-5-
carboxylate reductase.  ng th -keto-
to pyrroline-2-carboxylate (P2C) do hot tính ca enzyme pyrroline-2-carboxylate

reductase (P2CR) (Delauney và Verma, 1993). Các phân tích v s biu hin ca
gen -OAT   u cho thy gen này biu hin rt y  u kin môi
ng    u kin  ng bt l   u kin môi
ng thli biu hin rt mnh (Armengaud et al., 2004). Bi
vy, quá trình tng hp proline t tin cht c cho là din ra trong các
u kin ng sng thTrong mt s ng hc bi cây
c ngt và cây Arabidopsis gen -OAT biu hin rt mnh
 u kin ng bt li v áp sut thm thu. Bi vy, các nhà khoa hc
22

ng s ng sinh tng hp t ornithine có vai
 i vi tính chng chu ca mt s loài thc vt khi g  u kin môi
ng bt li v áp sut thm thu (Trovato et al., 2008).
1.2.3.3. Sự điều hòa quá trình trao đổi proline ở thực vật
Vic nghiên cu v i proline  thc vc thc hin
nhiun nay kin thc v  u hòa quá trình i proline vn
còn rt hn ch.  hình 1.4 mô t  và các tác nhân có vai trò trong quá
i proline  thc vt. Quá trình sinh tng hc hot
hóa và quá trình d hóa proline b hn ch khi cây trng b x lý hn. Khi cung cp
 c tr li cho cây trng sau x lý hn thì các quá trình này s hong theo
c lic hot hóa mnh và quá trình
tng hp b hn ch (Xue et al., 2009).

Hình 1.4:  u hòa i proline  thc vt (Szabados & Savoure,
2009). Đường màu xanh lá cây là tổng hợp và đường màu đỏ là dị hóa proline.
Quá trình sinh tng hc kim soát chính bi s biu hin ca 2
gen (P5CS1, P5CS2) mã hóa cho enzyme P5CS. H ng rt
cao v trình t u hin gen li rt khác nhau trong nhu kin
23

 ng khác nhau (Armengaud et al., 2004). Các nghiên cu cho thy  cây
Arabidopsis, gen P5CS2 là mt gen ch cht, hong ca gen P5CS2 ch yu 
các mô phân sinh, nh chi, chóp r,  hoa và các t bào nuôi cy (Székely et
al., 2008). Hai gen P5CS u biu hin  các mô phân sinh ca hoa nhm cung cp
proline cho quá trình phát trin ca hoa (Mattioli et al., 2009).  cây Arabidopsis gen
P5CS1 biu hin rt mnh khi c cm ng bi các yu t bt li v thm thu và
c cm ng bi acid abscisic (ABA). Ngoài ra, mt s nghiên cu cho thy
s biu hin ca gen P5CS1 và s  kích thích bi ánh sáng và
b c ch bi các hp cht brassinosteroid (Hayashi et al., 2000; Abrahám et al.,
2003). Cây sng tu kin ng ng, enzyme phospholipase D
(PLD) gi cht cht tham gia vào quá trình u hòa 
Còn khi cây sng bt li v mn, Ca
2+
và enzyme phospholipase C
(PLC) kích thích quá trình phiên mã ca gen P5CS  tham gia sinh tng hp và tích
c li, kt qu nghiên cu ca Knight 
(1997)  cây Thellungiella halophila chu mn cho thy, PLD li là mt chu hòa
có tác dng kích thích sinh tng h c cho là cht
u hòa có tác dng bt hot s . Ca
2+
có cht cht
truyn tín hii nhân t  hot hóa s biu hin ca
gen P5CS1 khi cây b stress v mui (Szabados & Savoure, 2009).
 u hòa sinh tng h thông qua quá
trình u hòa s biu hin ca các gen P5CS, mà hot tính ca 
c kim soát bi proline. Zhang 1995) nghiên cu cho
thy,   dn s c ch phn
hi c hot tính ca enzyme P5CS. Còn khi enzyme P5CS không b c ch phn
hc bi proline thì s  t mnh trong t bào.
Quá trình chuyn hóa tin cht pyrroline-5-carboxylate (P5C) thành proline không

phc gii hn trong chu trình sinh tng hp proline. Bi vy, s u hòa
hot tính ca enzyme P5CR cho thy s phc t u hòa s biu hin
ca gen P5CR. Kt qu phân tích trình t n promoter u khin hong ca
24

gen P5CR phân lp t cây Arabidopsis c mn trình t có chiu
dài 69 bp quy nh hoc hiu mô ca gen này. n nay, các nhà khoa hc
vc các nhân t ng dng trans liên kt c hiu vn
trình t cis này (Hua et al., 1999).
Quá trình sinh tng hp proline  thc vt b kích hot bi ánh sáng và các
yu t bt li v áp sut thm thu (hn, mc li, quá trình d hóa proline
lc hou kin ng sng u kin
ng. Quá trình di hóa proline c kim soát bi hai enzyme là
proline dehydrogenase (PDH) và pyrroline-5-carboxylate dehydrogenase (P5CDH)
(hình 1.4). Quá trình biu hin ca gen PDH mã hóa cho enzyme PDH c hot
hóa bi chính proline c cung c c sau khi b hn. S phiên mã
ca gen PDH li b c ch khi cây b c m bo proline không b
phân gii khi cây sng b c. S biu hin ca gen PDH
b c ch  li c hot hóa vào bui tng ca
  c vi ho ng ca gen P5CS1. Kt qu phân tích promoter u
khin hong ca gen PDH c nhân t cm ng vi trng thái
thm thu và proline, là nhân t gi vai trò rt quan tri vi quá trình hot hóa
ca gen này (Satoh et al., 2002). Yu t phiên mã liên kt vi u khin
biu hin gen PDH là h protein giàu leucine. Kt qu phân tích hong ca gen
P5CDH  các mô ca cây Arabidopsis cho thy gen này biu hin rt yu và khi b
ng thì s biu hin c. Phân tín
promoter ca gen P5CDH phân lp t cây lúa và Arabidopsis c
các trình t   trên promoter ca gen PDH. Borsani  (2005)
k u hòa sau phiên mã ca gen P5CDH cho thy tn ti các
i mã trong t nhiên to ra các cu trúc c ch RNA nh (24 nucleotides và

21 nucleotides siRNA) hot hóa cho quá trình ct các phân t RNA thông tin ca
gen P5CDH, nên làm gim m biu hin ca gen này khi cây gu kin
bt li t ng. Kt qu này cho thy rng,  c ch hong biu hin
ca gen  m sau phiên mã là rt quan trng trong viu khin hong
25

ca gen P5CDH  thc vt.  cây lanh (Linum usitatissimum) gen FIS1 mã hóa cho
enzyme P5CDH c hot hóa khi cây nhim virus hoc b t
al., 2002).
1.2.4. Vai trò của glycine betaine (GB) và con đƣờng sinh tổng hợp GB ở sinh vật
1.2.4i vi tính chng chu king bt li  thc vt
Glycine betaine (GB) mt hp cht amoni bc bn, là mt trong nhng cht
u qu nhc tìm thy trong mt phm vi rng ca
ng vt, vi khun và mt s loài thc vt ht kín chu hn hán và chu
mn (  xu 
betaine trong các loài thc vt vai trò sinh lý quan trng làm gim bt
ng thm thu (Wyn Jones, 1984). Trong t nhiên, rau bina, ngô, c ci
ng và lúa my ra trong quá trình cây b 
thng (stress) vi mui, hn hán và nhi thp (Bohnert et al., 1995). GB bo v
cây bng cách ho   t cht h     n thm thu
(osmolyte), duy trì cân bc gia các t bào thc vng, nh
i phân t u kin khô hn và n mui cao (Papageorgiou &
Murata, 1995).
 n cao không gây cn tr cha t bào cht và
có tác dm bo tính nh cu trúc và chi phân t. GB
xut hit yu t quynh ti kh ng chu kin bt li  cây
trng. Cht này có hiu qu ln và liên quan mt thin kh ng ca
cây tru king hn hán và nhim mn. M 
tg quan vi kh ng chu kin bt l yu
trong lc lu chnh và duy trì màng thylacoid,

u qu quang hp (Yang et al., 2003).
Trong nhiu loài cây trng, s  nhiên c  ci thin tác
ng tiêu cc ca tình trng mc gây ra bi nhng v ng khác
nhau. Bên ct s loài cây tr, khoai tây, cà chua, thuc lá, v.v.