Nghiên cứu vai trò của gene ST3Gal I bằng kỹ thuật knock down với siRNA trên mô hình tế bào ung thư vú MCF7

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM
VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN



NGUYỄN THỊ CÚC

NGHIÊN CỨU VAI TRÒ CỦA GENE ST3GAL-I
BẰNG KỸ THUẬT KNOCK-DOWN VỚI siRNA
TRÊN MÔ HÌNH TẾ BÀO UNG THƢ VÚ MCF7


LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC







HÀ NỘI – 2012


NGUYỄN THỊ CÚC LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC HÀ NỘI – 2012

25
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM
VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN



NGUYỄN THỊ CÚC


NGHIÊN CỨU VAI TRÒ CỦA GENE ST3GAL-I
BẰNG KỸ THUẬT KNOCK-DOWN VỚI siRNA
TRÊN MÔ HÌNH TẾ BÀO UNG THƢ VÚ MCF7

Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm
Mã số: 60.42.30

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

Ngƣời hƣớng dẫn khoa học: TS. ĐỒ THỊ THẢO




HÀ NỘI – 2012
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

LỜI CẢM ƠN

Để hoàn thành luận văn này, tôi đã nhận được sự chỉ bảo, hướng
dẫn tận tình của các thầy cô, sự giúp đỡ chân thành của các đồng nghiệp.
Với tất cả tấm lòng, tôi xin bày tỏ lòng kính trọng và biết ơn tới TS.
Đỗ Thị Thảo - Phó trưởng Phòng Thử nghiệm sinh học, Viện Công nghệ
sinh học, đã tận tình hướng dẫn tôi trong suốt quá trình làm việc cũng
như trong suốt quá trình nghiên cứu đề tài và hoàn thành luận văn.
Tôi xin gửi lời cảm ơn tới Ban lãnh đạo Viện Sinh thái và Tài
nguyên sinh vật, Phòng Đào tạo sau đại học của Viện Sinh thái và Tài
nguyên sinh vật, Ban lãnh đạo Viện Công nghệ sinh học, Ban giám hiệu
Trường Đại học Thái nguyên và Phòng Thử nghiệm sinh học đã tạo điều
kiện thuận lợi cho tôi được học tập và hoàn thành luận văn.
Tôi xin chân thành cảm các anh, chị đồng nghiệp phòng Thử
nghiệm sinh học - Viện Công nghệ sinh học đã nhiệt tình giúp đỡ tôi
trong quá trình thực hiện đề tài và hoàn thành luận văn.
Cuối cùng tôi xin gửi lời cảm ơn tới gia đình đã luôn ủng hộ và
giúp đỡ tôi trong thời gian qua.

Hà Nội, ngày 12 tháng 12 năm 2012
Học viên






Nguyễn Thị Cúc

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

MỤC LỤC

PHẦN I. MỞ ĐẦ U 1
1.1. Đặt vấn đề 1
1.2. Mục tiêu nghiên cƣ́ u của đề tài 2
PHẦN II. TỔ NG QUAN TÀ I LIỆ U 3
2.1. Ung thƣ 3
2.1.1. Tình hình bệnh ung thư trên thế giới và ở Việt Nam 3
2.1.2. Đc tính và nguyên nhân của ung thư 3
2.1.2.1. Các đc tnh ca bệnh ung thư 3
2.1.2.2. Bệnh ung thư gồm nhiều giai đoạn 3
2.1.3. Phân loại ung thư 4
2.1.4. Tác nhân gây bệnh ung thư 4
2.1.4.1. Tác nhân hóa học 4
2.1.4.2. Tác nhân sinh học 5
2.1.5. Cơ chế di căn của tế bào ung thư 5
2.1.6. Dòng tế bào ung thư vú MCF7 6
2.2. Giới thiệu về RNAi 6
2.2.1. Dòng thông tin di truyền trong tế bào 6
2.2.2. Khái niệm và vai trò của RNAi trong tế bào 7
2.2.2.1. Khái niệm 7
2.2.2.2. Vai trò ca RNAi 7
2.2.2.3. Thành phần RNAi 7
2.2.3. Lịch sử nghiên cứu siRNA 7
2.2.4. Cơ chế của RNAi 9
2.2.4.1. Cơ chế chống lại các virus và gene nhảy ca RNAi 9
2.2.4.2. Cơ chế làm tắt gene bởi siRNA 9
2.2.5. Ứng dụng của việc nghiên cứu các RNAi 10

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

2.2.5.1. Ứng dụng RNAi trong nghiên cứu ung thư 10
2.2.5.2. Ứng dụng RNAi trong việc tạo Hoa Hồng Xanh 10
2.2.5.3. Ứng dụng RNAi trong việc trừ sâu bệnh 11
2.2.5.4.Các ứng dụng khác ca RNAi 11
2.2.6. Ý nghĩa của RNAi 11
2.2.7. Khái niệm về knock-down gene 11
2.3. Những hiểu biết về Enzyme sialyltransferase (ST) 12
2.3.1. Enzyme sialyltransferase đối với sự di căn của tế bào ung thư 12
2.3.2. Khái niệm về Enzyme sialyltransferase ST3Gal-I 16
2.3.3. Phân loại các Enzyme sialyltransferase 17
2.3.4. Mô hình tác động của hệ Enzyme sialyltransferase 18
2.4. Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nƣớc thuộc lĩnh vực đề tài . 19
PHẦN III. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 20
3.1. Vật liệu, hoá chất và thiết bị nghiên cứu 20
3.1.1. Vật liệu 20
3.1.2. Hoá chất 20
3.1.3. Thiết bị 21
3.2. Thời gian và địa điểm nghiên cứu. 21
3.3. Phƣơng pháp nghiên cứu 21
3.3.1. Phương pháp nuôi cấy tế bào in vitro 21
3.3.2. Phương pháp knock-down gene ST3Gal-I bằng siRNA nhờ
lipofectamin 22
3.3.3. Phân tích và so sánh hình thái tế bào sau khi bị knock-down 23
3.3.4. Xác định khả năng sống sót của tế bào sau khi chuyển nhiễm 23
3.3.5. Thu nhận RNA tổng số bằng RNeasy Mini Kit của Qiagen 23
3.3.6. Kiểm tra hiệu quả knock-down gene bằng RT-PCR theo bộ kit của
Applied Biosystem 23
3.3.7. Thu nhận Glycoprotein trên màng tế bào MCF7 24

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

3.3.8. Phương pháp xác định hàm lượng Glycoprotein tổng số 25
3.3.9. Phương pháp điện di trên gel 25
3.3.10. Phƣơng pháp Western blot để xác định mức độ biểu hiện của
các protein 26
3.3.11. Phương pháp nhuộm gel bằng siver staining 26
3.3.12. Phương pháp in-gel digestion 27
3.3.13. Phương pháp phân tích khối phổ 28
PHẦN IV. KẾ T QUẢ VÀ THẢO LUẬN 29
4.1. Hình thái tế bào MCF7 sau khi knock-down gene ST3Gal-I bằng
siRNA 29
4.2. Khả năng phát triển của tế bào MCF7 sau khi chuyển nhiễm
siRNA 30
4.3. Hiệu quả knock-down gene 31
4.4. Biểu hiện của protein tổng số khi gene ST3Gal-I bị knock-down . 34
4.5. Biểu hiện của một số protein khi gene ST3Gal-I bị knock-down
35
4.6. Hàm lƣợng Glycoprotein trên màng tế bào MCF7 sau chuyển nhiễm
37
4.7. Nhuộm bạc 40
4.8. Phân tích khối phổ MALDI-TOF-MS 41
PHẦN V. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 46
1. KẾT LUẬN 46
2. KIẾN NGHỊ 46
TÀI LIỆU THAM KHẢO 47

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 2.1. Giới thiệu một số dạng liên kết giữa phân tử amino acid với phân
tử đường trong tự nhiên 13
Bảng 4.1 .Giá trị OD trung bình ở bước sóng 570 nm 29
Bảng 4.2. Hàm lượng RNA tổng số của các mẫu 30
Bảng 4.3. Hiệu quả knock-down gene ST3Gal-I sau khi chuyển nhiễm
siRNA 32
Bảng 4.4. Hàm lượng Glycoprotein thu được từ tế bào chuyển nhiễm
siRNA 37
Bảng 4.5 Kết quả phân tích khối phổ protein 40



Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 2.1. Vị trí của gene ST3Gal-I 16
Hình 2.2. Mô hình tác động của hệ enzyme ST trong đó có ST3Gal-I 18
Hình 4.1. Hình ảnh tế bào MCF7 sau 3 ngày chuyển nhiễm ở độ phóng đại
20 X gồm: (A) tế bào đối chứng (không chuyển nhiễm siRNA); (B) tế bào
chuyển nhiễm siRNA 28
Hình 4.2. Sự sống sót và phát triển của các tế bào MCF7 sau khi chuyển
nhiễm siRNA 30
Hình 4.3. Định lượng RNA tổng số của các mẫu thu được bằng hệ thống
NanoDrop của Thermo Scientific 31

Hình 4.4. Đồ thị biểu diễn đường chuẩn về tương quan nồng độ BSA và giá
trị OD thu được 33
Hình 4.5. Hình ảnh western-blot glycoprotein màng tổng số của mu đối
chứng (SC) và knock-down gene ST3Gal-I (ST3) 35
Hình 4.6. Ảnh Western-blot các protein Actin, Akt, GSK, P42/44 và
PODCL của mẫu đối chứng (SC) và knock-down gene ST3Gal-I (ST3) . 37
Hình 4.7. Hình ảnh nhuộm bạc silver-staining các glycoprotein màng của
mẫu đối chứng (SC) và knock-down gene ST3Gal-I (ST3) 39










Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên


DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT

Akt
ANKRD46
bp
cDNA
DNA
DMEM
dsRNA

EDTA
FBS
Gal Nac
Hela S3
HT-29
NFkB-p65
MCF7
MDA-MB-231
miR 21
miRNA
mRNA
Neu5Ac
PI3K
RIPA
rpm
RISC
RNA
RNAi
Protein Kinase B
ankyrin repeat domain 46
Base pair
Complementary Deoxyribonucleic acid
Deoxyribonucleic acid
Môi trường nuôi cấy tế bào
RNA sợi đôi
Ethylenediamintetraacetic acid
Phosphate bufer saline (huyết thanh phôi bò)
N-acetylgalactosamin
Dòng tế bào ung thư vú
Dòng tế bào ung thư ruột người

nuclear factor kappa from B cells
Dòng tế bào ung thư vú
Dòng tế bào ung thư vú
microRNA 21
Micro Ribonucleic acid
RNA thông tin (Messenger Ribonucleic acid)
N-acetylneuraminic acid
Rapid Immunofilter Paper Assay
Phosphatidylinositol 3-kinases
Revolutions per minute
RNA – incluced silencing complex
Ribonucleic acid
RNA can thiệp (Ribonucleic acid interference)

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

RNAse III
RT-PCR
ser/ther
siRNA
ssRNA
ST3Gal-I
SW480
TBUT
WHO

Ribonuclease III
phản ứng Real time Polymerase chain reaction
serine/threonine
Small interference RNA/short interference RNA

Single strand RNA
2,3 Sialyltransferase galatose
Dòng tế bào ung thư ruột kết người
Tế bào ung thư
Tổ chức Y tế Thế Giới (World Health Organization)













Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên



Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

PHẦN I. MỞ ĐẦ U
1.1. Đặt vấn đề
Là căn bệnh nan y, gây ra tỉ lệ tử vong cao cho ngườ i bệ nh và rất khó
chữa trị, ung thư đang là mối nguy hiểm cho con người trên toàn thế giới .
Khoảng 7 triệ u ngườ i mỗ i năm bị tử vong do ung thư và ướ c tính khoả ng 9
triệ u ngườ i chế t và o năm 2015 và 11,4 triệ u ngườ i chế t và o năm 2030 do

mắc các bệnh ung thư ().
Có thể nói, việc tìm hiểu các yếu tố liên quan đến cơ chế cũng như đặc
tính di căn của tế bào ung thư là rất phức tạp. Hiện nay, rất nhiều nghiên
cứu tập trung vào tìm hiểu đặc tính cũng như cơ chế di căn của tế bào ung
thư. Tuy nhiên, đặc tính cụ thể cũng như cơ chế di căn của tế bào ung thư
vẫn chưa được làm sáng tỏ. Những nghiên cứu gần đây cho thấy, có sự liên
quan mật thiết giữa các glycoprotein cũng như glycolipid thuộc bề mặt tế
bào tới sự liên kết giữa tế bào với tế bào, tới việc truyền tín hiệu giữa các tế
bào trong cơ thể. Sự sai khác xuất hiện trong quá trình glycosyl hóa các
glycoprotein và glycolipid của màng sẽ khiến cho mối liên kết và quá trình
truyền tín hiệu giữa tế bào bị sai lệch, dẫn tới nhiều căn bệnh của tế bào
hoặc cơ thể, ví dụ như bệnh ung thư. Bên cạnh đó, nhiều nghiên cứu đã báo
cáo về sự tăng cường hoạt động của enzyme ST3 beta-galactoside alpha-
2,3-sialyltransferase 1 hay còn gọi là ST3Gal-I do gene ST3Gal-I mã hóa ở
các bệnh nhân ung thư trong giai đoạn di căn nhưng lại rất ít hoặc hầu như không
hoạt động ở người bình thường hoặc ở bệnh nhân ung thư giai đoạn sớm.
Để nghiên cứu vai trò chức năng của một gene thì việc knock-down
gene bằng siRNA là một công cụ hữu hiệu. siRNA đóng một vai trò nhất
định trong sinh học cơ thể. Đặc tính nổi bật nhất của các siRNA là khả
năng tác động và can thiệp vào sự biểu hiện của một gene đặc trưng nào đó.
Thêm nữa, siRNA còn đóng một vai trò nhất định liên quan đến cơ chế

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

hoạt động của các RNA, ví dụ như liên quan đến cơ chế chống virus của tế
bào, liên quan đến sự tạo hình của các cấu trúc nhiễm sắc thể trong hệ
genome. Có thể nói, vai trò của siRNA là tương đối phức tạp, còn chưa
được hiểu hết nhưng lại rất quan trọng tới các cơ chế sinh học trong cơ thể
(Hamilton A, Baulcombe D, 1999). Hiện nay, siRNA đặc hiệu cho gene
ST3Gal-I đã được hãng INVITROGEN (Mỹ) thương mại hóa và có hiệu

quả cao. Vì thế, với việc knock-down gene ST3Gal-I trên mô hình tế bào
ung thư vú MCF7 của người, chúng tôi mong muốn tìm hiểu mối liên quan
giữa gene ST3Gal-I với đặc tính di căn của các tế bào ung thư nói chung và
của tế bào ung thư vú MCF7 nói riêng.
Xuất phát từ những vấn đề nêu trên, chúng tôi đã tiến hành đề
tài: ‘‘Nghiên cứu vai trò của gene ST3Gal-I bằng kỹ thuật knock-down
với siRNA trên mô hình tế bào ung thư vú MCF7’’
1.2. Mục tiêu nghiên cƣ́ u của đề tài
 Knock-down gene ST3Gal-I bằng siRNA trên mô hình tế bào ung
thư vú MCF7.
 Tìm hiểu mối liên quan của gene ST3Gal-I tới quá trình di căn của tế
bào ung thư.









Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

PHẦN II. TỔ NG QUAN TÀ I LIỆ U
2.1. Ung thƣ
2.1.1. Tình hình bệnh ung thư trên thế giớ i và ở Việ t Nam
Ung thư là một căn bệnh nguy hiểm và khó chữa trị, số lượng người
mắc bệnh ngày càng cao. Theo điều tra của Tổ chức Y tế thế giới (WHO),
ung thư là nguyên nhân gây tử vong hàng đầu trên toàn thế giới. Hiện nay,
số ca mắc ung thư mới vào khoảng 10 triệu người/năm. Ở Việt nam, số

người mắc bệnh ung thư ngày càng tăng. Năm 2000, tỷ lệ mắc ung thư ở
nam giới là 141/100.000 dân, ở nữ giới là 101/100.000; năm 2010 tỷ lệ này
ở nam giới là 181/100.000 dân và ở nữ giới là 134/100.000 dân
().
2.1.2. Đc tính và nguyên nhân của ung thư
Ung thư là tên chung để gọi một nhóm bệnh với hơn 200 loại khác
nhau về nguồn gốc tế bào phát sinh, khả năng di căn nhưng đều có chung
một đặc điểm là sự tăng sinh vô hạn, không tuân theo cơ chế kiểm soát về
phát triển của cơ thể (Đái Duy Ban và cs., 2000; Hanahan D and Weinbeirg
RA, 2000).
2.1.2.1. Các đc tnh ca bệnh ung thư
Tế bào ung thư ác tính có một số tính chất đặc trưng như : km biệt
hoá hơn so với tế bào bình thường; tế bào phân chia nhanh, liên tục, tránh
được apoptosis (chết theo chương trình); tế bào có khả năng phát triển vô
hạn (bất tử); có khả năng di căn, xâm lấn đến các mô xung quanh ; có rất
nhiều nhiễm sắc thể bất thường và không ổ n định . Về hình thái , tỉ lệ
nhân/tế bào chất cao , nhân to, bờ nt không rõ , xuất hiện nhiều sợi phân
bào hơn các tế bào bình thường khác (Darnell J et al., 1990; Hanahan D
and Weinbeirg RA, 2000).
2.1.2.2. Bệnh ung thư gồm nhiều giai đoạn

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

Giai đoạn đầu là quá trình hình thành TBUT khởi phát (do ảnh hưởng
của các tác nhân nội bào hay ngoại bào). Tiếp theo là quá trình phân chia
liên tục không ngừng của TBUT để thành một khối u được gọi là quá trình
phát triển bệnh. Cuối cùng là giai đoạn di căn, khiến bệnh nhân tử vong
(Darnell J et al., 1990).
2.1.3. Phân loại ung thư
Theo nguồn gốc mô phát sinh, ung thư được Hanahan D và Weinbeirg

R A (2000) phân chia thành các dạng:
+ Carcinoma: đây là dạng ung thư phổ biến nhất, phát sinh từ những
tế bào có nguồn gốc từ lá phôi trong và lá phôi ngoài, như ung thư phổi,
ung thư vú, ung thư trực tràng
+ Sarcoma: là dạng ung thư í t gặp, phát sinh từ những tế bào có nguồn
gốc lá phôi giữa, những tế bào thuộc hệ thống chống đỡ của cơ thể như
xương, sụn, mỡ, mô liên kết và cơ.
+ Lymphoma: là dạng ung thư phát sinh từ các hạch bạch huyết và các
mô thuộc hệ thống miễn dịch của cơ thể như: ung thư Lymphoma Burkitt.
+ Leukemia: là dạng ung thư nguy hiểm, biểu hiện bệnh rất sớm, xuất
hiện ở trẻ em và người trẻ tuổi, phát sinh từ các mô tạo máu, các tế bào
máu non thuộc tuỷ xương, có xu hướng tích tụ thành số lượng lớn trong
máu như ung thư bạch cầu cấp tính (Human Acute Leukemia).
2.1.4. Tác nhân gây bệ nh ung thư
Có rất nhiều nguyên nhân gây bệnh ung thư , mỗ i nguyên nhân lạ i tác
động theo mộ t cơ chế khác nhau , gồm 2 nhóm tác nhân lớn: tác nhân hóa
học và tác nhân sinh học (Nguyễ n Chấn Hù ng, 1994).

2.1.4.1. Tác nhân hóa học
Tác nhân hoá học gây ung thư gồ m khói thuốc lá , các thành phần hoá
học trong thuốc trừ sâu, các sản phẩm phụ gia dùng cho bảo quản thực
phẩm, chất tạo màu không đạt tiêu chuẩn, khí đốt xăng dầu, động cơ, khí

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

thải nhà máy công nghiệp cũng được xem là độc hại và là nguyên nhân
gây bệnh ung thư cao cho con người (Đái Duy Ban và cs, 2000; Pezzuto
JM, 1995).
Cơ chế gây ung thư của tác nhân này là tác động vào cơ thể thông qua
việc tạo ra nhiều gốc tự do như: O

2
2-
, HO
.
, NO
.
Các gốc tự do này đi vào
cơ thể, gây ra phản ứng oxi hoá làm thay đổi cấu trúc của phân tử DNA
dẫn đến bệnh ung thư (Darnell J et al., 1990).
2.1.4.2. Tác nhân sinh học
Tác nhân sinh học bao gồm một số loại virus và vi khuẩn có khả năng
khởi động châm ngòi cho sự phát triển ung thư khi nó lây nhiễm vào tế bào
bình thường (Đái Duy Ban và cs, 2000; Darnell J et al., 1990).
Virus gây ung thư gồm 2 loại: DNA virus (đặc trưng nhất là các
papovavirus, thường gặp là SV40 và polyoma) và RNA virus (Retrovirus).
Cơ chế gây ung thư của các virus là tương đối phức tạp và chưa được hiểu
hết. Virus có thể làm biến đổi các tính chất đặc thù của tế bào chủ (hình
thái, sinh lý, sinh hoá) bằng cách hợp nhất một số gene của mình vào hệ
gene của tế bào khiến cho một số gene của tế bào hoạt động bất thường mở
đầu cho sự hình thành căn bệnh ung thư (Darnell J et al., 1990).
2.1.5. Cơ chế di căn của tế bào ung thư
Các TBUT trong khối ung thư sẽ tiếp tục tăng sinh, tự mất đi các thụ
cảm nhận biết giới hạn phát triển so với các tế bào lân cận, sản xuất ồ ạt
các cytokine (cell signals) và các enzyme protease dẫn tới phá huỷ màng
đệm lót và môi trường ngoại bào bao quanh khiến chúng liên kết lỏng lẻo,
dễ dàng bất ra khỏi khối u mẹ, theo mạch máu và mạch bạch huyết di
chuyển tới các tổ chức và cơ quan mới, bám lại và tiếp tục tăng sinh vô tổ
chức. Quá trình này gọi là sự di căn (Darnell J et al., 1986). Joan Massague
và cộng sự thuộc Trung tâm Ung thư Memorial Sloan-Kettering (Mỹ) nhận
thấy cơ chế di căn trong ung thư phổi cũng giống như cơ chế tế bào di căn

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

trong ung thư đại trực tràng, nhưng nhanh hơn và thích ứng nhanh chóng
khi di căn sang các cơ quan nội tạng khác. Nhóm tác giả đã nhận ra cơ chế
"tín hiệu tế bào WNT" là một trong 6 cơ chế được thử nghiệm về tính hoạt
hóa quá mức trong các khối ung thư phổi khi chúng di căn và không di
căn. Các thử nghiệm sâu hơn trên chuột cho thấy tế bào ung thư phổi với
đột biến gây khối u ở gen KRAS và EGFR phụ thuộc vào cơ chế WNT
hoạt hóa quá mức gây di căn. Các nhà khoa học cũng nhận thấy 2 gen
HOXB9 và LEF1 được hoạt hóa bởi WNT và làm tăng khả năng tế bào
ung thư phổi xâm lấn và tăng sinh khối u.
2.1.6. Dòng tế bào ung thư vú MCF7
Dòng tế ung thư vú MCF7 được phân lập đầu tiên vào năm 1970 từ
một bệnh nhân nữ, da trắng, 69 tuổi có tên là Frances Mallon và dòng tế
bào này được Herbert Soule và cộng sự thành lập, được lưu trữ tại Viện
nghiên cứu ung thư Barbara Ann Karmanos. Đây là dòng ung thư vú đầu
tiên có khả năng sống lâu hơn một tháng. Dòng tế bào ung thư vú này
mang đặc điểm giống các dòng tế bào ung thư vú biểu mô khác.
2.2. Giới thiệu về RNAi
2.2.1. Dòng thông tin di truyền trong tế bào
Mã di truyền trên DNA quy định việc hình thành thông tin di truyền
trong DNA và được sao chp thành RNA, sau đó tổng hợp protein. Dòng
thông tin di truyền từ DNA qua mRNA đến protein được gọi là “Học
thuyết trung tâm” của sinh học phân tử. Bộ gene của con người có khoảng
30.000 gene. Tuy nhiên, không phải mọi thông tin di truyền đều được sử
dụng mà chỉ có một phần thông tin di truyền trong hệ gene được sử dụng
trong mỗi loại tế bào. Việc gene nào được biểu hiện là do cơ chế kiểm soát
của bộ máy sao chp DNA sang mRNA trong quá trình phiên mã. Quá
trình phiên mã cũng bị điều khiển bởi nhiều nhân tố khác mà chúng ta còn

chưa nghiên cứu hết.

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

2.2.2. Khái niệm và vai trò của RNAi trong tế bào
2.2.2.1. Khái niệm
RNAi (RNA interference) là một hệ thống bên trong các tế bào sống,
giúp kiểm soát các gene đang hoạt động hay giúp tế bào ức chế biểu hiện
một gene khi trong tế bào có sự xuất hiện một chuỗi RNA xoắn kp có
trình tự giống với gene này. Đây là hệ thống tự vệ của tế bào nhằm chống
lại sự xâm nhập của siêu vi khuẩn, các phần tử di truyền ngoại lai khác,
những yếu tố sử dụng chuỗi RNA xoắn kp trong chu kỳ sống của tế bào.
2.2.2.2. Vai trò ca RNAi
RNAi có nhiều chức năng quan trọng trong tế bào như: bảo vệ tế
bào chống lại gene ký sinh trùng, virus và các yếu tố di truyền vận động
(Transposon). Điều hoà biểu hiện gene. Điều khiển sự phát triển của tổ
chức. Duy trì hình dạng nhiễm sắc thể và tăng cường phiên mã…
2.2.2.3. Thành phần RNAi
RNAi gồm 2 thành phần siRNA và miRNA
siRNA (small interfeing RNA, short interfering RNA) là các RNA
ngắn có kích thước khoảng 20 - 30 nu, được hình thành từ các RNA sợi
đôi, tham gia vào quá trình tổng hợp protein, siRNA có khả năng điều
khiển protein họ Argomaute tới đích điều hòa (Ghildiyal M and Zamore
PD, 2009).
miRNA (micro RNA) là những đoạn RNA ngắn khoảng từ 19 - 24
nucleotit, không tham gia vào quá trình tổng hợp protein.
2.2.3. Lịch sử nghiên cứu siRNA
Nguồn gốc hình thành siRNA chính là từ kỹ thuật antisense-RNA
(Pestka et al., 1984). Khi phân tử RNA chiều ngược (antisense RNA) được
hình thành thì việc tổng hợp protein beta-galactosidase bị ức chế gần như

hoàn toàn (98%). Tuy nhiên, đến năm 1990 các nhà khoa học mới phát
hiện ra cơ chế gây ra sự ức chế trên là do gene (Napoli et al., 1990; Van

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

der Krol et al., 1990). Đó là nghiên cứu trên loài hoa dạ yến thảo (petunia).
Các nhà khoa học đã cố gắng tạo màu tím trên cánh hoa petunia bằng cách
chuyển gene quy định màu tím Chalcone synthase (CHS) dưới sự điều
khiển của promoter 35S. Gene CHS là gene có liên quan đến chu trình
hình thành chất anthocyanin trong hoa petunia. Tuy nhiên, cánh hoa lại thể
hiện các đốm màu khác nhau và cho ra màu trắng chứ không phải là màu
tím. Năm 1994, Cogoni và các cộng sự đã tiến hành một thí nghiệm nhằm
phát triển màu cam của nấm Neurospora crassa thông qua việc chuyển
một gene có chức năng tạo ra carotenoid. Tuy nhiên, nấm lại không có
màu cam. Hiện tượng này được các nhà khoa học đặt tên là "quelling".
Năm 1995, Guo và Kemphues đã đưa ra bằng chứng đầu tiên trên tuyến
trùng Caenorhabditis elegans, đó là hiện tượng RNA sợi sense và antisen
có hiệu quả ức chế biểu hiện gene như nhau (Guo S and Kemphues KJ,
1995).
Hiện tượng RNAi được khám phá đầu tiên trên giun tròn
Caenorhabditis elegans do việc ức chế biểu hiện gene bởi RNA sợi đôi
(Fire A et al., 1998). Timmons L và Fire A đã dùng antisense RNA để ức
chế biểu hiện gene. Hiệu quả tác động của hỗn hợp sense và antisense
RNA gấp ít nhất 10 lần so với chỉ là dùng sợi sense hay antisense
(Timmons L and Fire A, 1998).
Trong các tế bào người sự kích hoạt gene được tìm thấy đầu tiên do
các siRNA kích hoạt các promoter của E-cadherin và p21, làm tăng mức
độ biểu hiện của mRNA và protein (Morris KV and Vogta PK, 2010).
Trong in vivo, siRNA đóng vai trò quan trọng trong việc hạn chế lây nhiễm
virus vì nó làm bất hoạt RNA được tạo ra trong chu kỳ sống của virus

(Klattenhoff C and Theurkauf W, 2008).
Quá trình hình thành siRNA diễn ra ở tế bào chất (cytoplasma).
RNAi được kích hoạt bởi dsRNA và được cắt thành những mảnh có độ dài

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

khoảng 21 - 28 cặp bazơ bởi một enzyme Dicer ở ngoài tế bào chất. Những
mảnh dsRNA bị cắt được gọi tắt là siRNA, các siRNA này sẽ liên kết với
protein và gây nên sự ức chế.
2.2.4. Cơ chế của RNAi
2.2.4.1. Cơ chế chống lại các virus và gene nhảy ca RNAi
RNAi đóng vai trò quan trọng trong việc chống lại sự xâm nhiễm
của các virus vào cơ thể vật chủ. Khi virus xâm nhiễm vào tế bào, nó
truyền thông tin di truyền vào tế bào vật chủ, RNA virus lập tức bị cắt bởi
enzyme Dicer, phức hợp RISC được kích hoạt và RNA virus bị phân hủy,
tế bào vật chủ thoát khỏi xâm nhiễm.
Gene nhảy (trasposon) là các trình tự DNA có thể di chuyển trong
bộ gene. Gene nhảy hoạt động bằng cách sao chp DNA thành RNA, sau
đó RNA phiên mã ngược thành DNA và gắn vào vị trí khác trên bộ gene.
RNAi sẽ bảo vệ bộ gene chống lại các gene nhảy.
2.2.4.2. Cơ chế làm tắt gene bởi siRNA
Trong tế bào, sự biểu hiện của RNA sợi kp là kết quả của sự bắt
cặp giữa mạch mang mã và mạch đối mã. Các đoạn RNA sợi kp dài được
cắt bởi enzyme Dicer tạo ra những đoạn RNA ngắn (siRNA) khoảng 21-28
nucleotit. Sau đó các siRNA được tháo xoắn dưới tác dụng của enzyme
helicase và một mạch được nạp vào phức hợp protein một cách chọn lọc
gọi là phức hợp cảm ứng bất hoạt RISC. Sự xuất hiện của mạch đơn
siRNA sẽ hoạt hoá RISC thành trạng thái hoạt động (ký hiệu là RISC*).
Cuối cùng phức hợp siRNA-RISC* này sẽ tìm kiếm các sản phẩm của quá
trình phiên mã (transcriptome) một cách đặc hiệu.

Cơ chế tắt gene phụ thuộc vào mức độ tương đồng giữa siRNA và
mRNA đích. Nếu sự tương đồng giữa siRNA và mRNA đích là hoàn toàn
thì phân tử mRNA có xu hướng bị cắt và phân giải (do hoạt tính nuclease
của RISC), do vậy không có mRNA mã hoá cho protein đó.

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

Cơ chế tắt gene bởi siRNA có hiệu quả rất cao, chỉ cần một lượng
nhỏ siRNA được đưa vào tế bào có thể đủ để làm tắt hoàn toàn sự biểu
hiện của một gene nào đó (vốn có rất nhiều bản sao trong cơ thể đa bào).
2.2.5. Ứng dụng của việc nghiên cứu các RNAi
2.2.5.1. Ứng dụng RNAi trong nghiên cứu ung thư
Tế bào ung thư phát sinh từ sự tích lũy các đột biến liên tiếp có lợi
cho sự phân chia và tồn tại của chúng. Những biến đổi vật chất di truyền
(epigenetic) giúp tế bào ung thư vượt qua sự kiểm soát của hệ miễn dịch cơ
thể và cơ chế chết theo chương trình của tế bào (apoptosis) hay các tín hiệu
kìm hãm phân chia (antiproliferative signals). Sự khám phá ra cơ chế can
thiệp RNA chính là công cụ cần thiết để dò tìm các cơ chế phân tử bị thay
đổi trong tế bào ung thư. Do tính đặc hiệu của quá trình can thiệp RNA nên
có thể dễ dàng tiến hành thực nghiệm trên hàng ngàn gene hoặc toàn bộ hệ
genome trong một thí nghiệm. Từ đó, các khía cạnh của bệnh ung thư sẽ
được giải mã và sẽ tìm ra thuốc điều trị ung thư đặc hiệu.
2.2.5.2. Ứng dụng RNAi trong việc tạo Hoa Hồng Xanh
Trong cây trồng phân tử anthocyanin dihydrokaempferol (DHK)
được coi là sắc tố chủ đạo trên hoa, trái cây và các mô tế bào khác. Thông
thường các màu chính của hoa bắt nguồn từ DHK với sự có mặt của một ít
các chất carotenoid. Ngoài ra, DHK lại là một enzyme chi phối cho cả 3
chu trình hình thành sắc tố trên cây trồng bao gồm: cyanidin, pelargonidin
và delphinidin. Gene cyanidin mã hóa enzyme DHK làm biểu hiện các
màu đỏ, hồng hay màu tím hoa cà. Một loại enzyme khác có tên gọi là

dihydroflavinol reductase (DFR) sẽ hỗ trợ các màu chỉ chị trong cả ba chu
trình trên, enzyme này tạo màu trên các cánh hoa. Chính vì vậy, mà các đột
biến gene DFR đều cho ra những hoa có màu trắng. Chu trình
delphinidin có thể hình thành màu đỏ hoặc xanh trên hoa dưới sự tác
động của DRF và pH.

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

Để tạo ra bông hồng xanh, các nhà khoa học đã áp dụng một bộ 3
gene. Một gene nhân tạo được dùng cho kỹ thuật RNAi nhằm ức chế gene
DFR của hoa hồng làm cho hoa hồng không biểu hiện màu. Sau đó chuyển
gene delphinidin từ loài hoa păng-xê và gene DFR từ loài hoa iris sẽ tạo ra
hoa hồng có hàm lượng delphinidin rất cao trong cánh hoa. Khi nồng độ
pH tế bào mang tính kiềm thì sắc tố của anthocyanin thường trở nên xanh
hơn. Nồng độ pH tế bào cánh hoa thường mang tính di truyền. Vì vậy các
nhà khoa học đã ức chế gene bằng kỹ thuật RNAi nhằm xác định những
gene ảnh hưởng đến tính axít của cánh hoa.
2.2.5.3. Ứng dụng RNAi trong việc trừ sâu bệnh
Đã có nhiều công trình khoa học nghiên cứu việc chuyển gene Bt
(Bacillus thuringiensis) vào thực vật để kháng lại sâu bệnh.
2.2.5.4.Các ứng dụng khác ca RNAi
Nghiên cứu các RNAi để chống lại sự nhiễm virus, bảo đảm ổn định
hệ gene bằng cách chống lại các gene nhảy, để kiềm chế sự tổng hợp
protein và điều khiển sự phát triển của tổ chức, trong điều trị bệnh di
truyền, các bệnh về gene…
2.2.6. Ý nghĩa của RNAi
Khám phá về RNAi đã góp phần giải thích nhiều hiện tượng sinh lý
quan trọng trong tế bào và cơ thể. Ví dụ như tại sao một số virus không thể
tấn công các tế bào khỏe lành mạnh.
2.2.7. Khái niệm về knock-down gene

Knock-down là thuật ngữ chỉ các quá trình can thiệp làm biến đổi
cấu trúc của một hay nhiều gene đã biết rõ trình tự. Từ đó làm giảm biểu
hiện của một gene đặc thù (Morris KV and Vorgt PK, 2010).
Kỹ thuật knock-down gene (hay còn gọi là kỹ thuật can thiệp RNA
(RNAi) gây bất hoạt gene) là phương pháp sử dụng một đoạn DNA hay

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

RNA có trình tự bổ sung với gene cần tác động hoặc bổ sung với RNA
thông tin (mRNA) của nó. Các đoạn này sẽ kết hợp với các gene cần tác
động hay các mRNA làm giảm biểu hiện của gene. Dựa vào sự thay đổi của
kiểu hình có thể hiểu hơn về chức năng của gene bị tác động. Sử dụng
siRNA là phương pháp được ứng dụng trong knock-down gene (Đỗ Năng
Vịnh, 2007).
Kỹ thuật knock-down gene là một kỹ thuật mới, chỉ cần một vài phân
tử RNA sợi kp (dsRNA) trong một tế bào cũng đủ để phân hủy các mRNA
của một gene đặc thù. Kết quả thực nghiệm cho thấy RNAi có thể gây bất
hoạt gene một cách hiệu quả ở bất kì cơ thể sống nhân thực nào.
2.3. Những hiểu biết về Enzyme sialyltransferase (ST)
2.3.1. Enzyme sialyltransferase đối với sự di căn của tế bào ung thư
Fukuda M (1995), Kannagi R và cộng sự (2004) đã chỉ ra rằng có sự
thay đổi đáng kể đối với quá trình glycosyl hóa của các protein nằm trên bề
mặt tế bào và sự thay đổi này liên quan trực tiếp hoặc gián tiếp đến sự di
căn của tế bào ung thư (Fukuda M, 1995; Kannagi R et al., 2004).
Các phân tử glycan của tế bào như glycoprotein (GP),
glycosphingolipid (GSL) và proteoglycan được gọi chung là glycome đóng
vai trò rất quan trọng đối với các hoạt động sinh học nội và ngoại bào ví dụ
như quá trịnh tự định dạng của tế bào, quá trình gắn kết tế bào, tương tác
giữa các tế bào với nhau và truyền tín hiệu (Haltiwanger RS, Lowe JB,
2004). Trong đó, sự hình thành mối liên kết giữa phân tử đường với các

amino acid là một bước quan trọng trong quá trình sinh tổng hợp phân tử
glycoprotein từ các đơn vị carbohydrate. Đây cũng là một khâu quan trọng
trong một loạt các bước phức tạp của quá trình hậu dịch mã dẫn tới sự hình
thành các phân tử protein gắn kết chuỗi oligosaccharide với chức năng sinh
học cực kì đa dạng. Phản ứng sinh học này xảy ra trong toàn bộ sinh giới từ
sinh vật cổ sinh cho tới các vi sinh vật và giới sinh vật nhân chuẩn. Các
phản ứng gắn kết này còn được gọi chung là phản ứng glycosyl hóa

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

(Kanoelani TP, Mahal LK, 2007; Lowe JB, 2002). Spiro đã chỉ ra rằng
phản ứng glycosyl hóa được xúc tác bởi một hệ thống các enzyme phức tạp
nhằm hình thành các cầu nối glycopeptide cũng như vị trí hoạt động nội
bào hay quyết định ái lực của các phân tử glycoprotein này với các cổng
peptide đặc thù. Báo cáo này cũng chỉ ra 13 phân tử monosaccharide và 8
amino acid khác nhau liên quan đến tới sự hình thành của ít nhất 41 cầu nối
glycoprotein ví dụ như cầu nối N- và O-glycosylation, C-mannosylation,
phosphoglycation và glypiation. Hiện tại các nhà khoa học đã xác định
được ít nhất 16 enzyme liên quan và đã được định dòng. Vị trí hoạt động
của chúng rất khác nhau và đa dạng ví dụ như ở mạng lưới nội chất, ở thể
golgi, cytosol và cả ở trong nhân tế bào (Schauer R, 2000).
Bảng 2.1. Giới thiệu một số dạng liên kết giữa phân tử amino acid với
phân tử đường trong tự nhiên
Dạng liên kết
Liên kết

Xuất hiện trong sinh giới
Ví dụ
Amino
acid

Đƣờng

Sinh vật
nhân
chuẩn
Sinh
vật cổ
Vi sinh
vật
N-glycosyl
Asn
GlcNAc

+
+
+
Ovalbumin, fetuin, insulin
receptor

Asn
Glc

+
+
–
Laminin, Lớp H. halobium S-

Asn
GalNAc

–
+
–
Lớp H. halobium S-

Asn
Rha

–
–
+
Thành tế bào S. sanguis

Arg
Glc

+
–
–
Amylogenein của ngô ngọt
O-glycosyl
Ser/Thr
e

GalNAc

+
–
–
Mucins, fetuin, glycophorin

Ser/Thr
GalNAc

–
+
–
A. thermoaerophilus S-layer

Ser/Thr
GlcNAc

+
–
–
Protein của nguyên sinh chất
và nhân tế bào

Ser/Thr
Gal

+
–
+
Earthworm collagene, B.
cellulosoleum

Ser/Thr
Man

+
–
–
Yeast mannoproteins

Ser/Thr
Man

+
–
+
α-dystroglycan, F.
meningosepticum

Ser/Thr
Fuc

+
–
–
Coagulation và fibrinolytic
factors

Ser/Thr
Pse
f


–
–

+
C. jejuni flagellins

Ser/Thr
DiActrideoxyhexose
g


–
–
+
N. meningitidis pili

Ser
Glc

+
–
–
Coagulation factors

Ser
FucNAc

–
–
+
P. aeruginosa pili

Ser

Xyl

+
–
–
Proteoglycans

Ser
Gal

+
–
–
Cell walls of plants

Thr
Man

–
–
+
M. tuberculosis glycoproteins

Thr
Man

+
–
–
Clamworm collagene

Thr
GlcNAc

+
–
–
Dictyostelium
h
, T. cruzi

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên


Thr
GlcNAc

+
–
–
Rho proteins (GTPases)

Thr
Glc

+
–
–
Rho proteins (GTPases)

Thr
Gal

+
+
–
H. halobium S-layer, vent
worm collagene

Hyl
i

Gal

+
–
–
Collagene, C1q, lectin

Hyp
i

Ara
j


+
–
–
Thành tế bào thực vật

Hyp
Ara

+
–
–
Potato lectin

Hyp
Gal

+
–
–
Wheat endosperm

Hyp
GlcNAc

+
–
–
Dictyostelium proteins

Tyr
Glc

+
–

–
Glycogenein trong cơ và gan

Tyr
Glc

–
–
+
C. thermohydrosulfuricum S-

Tyr
Gal

–
–
+
Lớp T. thermohydrosulfuricus S-
C-
mannosylation
Trp
k

Man

+
–
–
RNase 2, interleukin 12,
properdin

Phosphoglycosyl
Ser
GlcNAc

+
–
–
Dictyostelium proteinase

Ser
Man

+
–
–
L. mexicana acid phosphatase

Ser
Fuc

+
–
–
Dictyostelium proteins

Ser
Xyl

+
–

–
Bề mặt tế bào T. cruzi
Glypiation



+
+
–
T. brucei VSG, Thy-1,
Sulfolobus
acidocaldariusprotein
Glycosyl hóa là một trong số những dạng biến đổi hậu dịch mã phổ
biến nhất xảy ra ở tế bào động vật. Các glycan liên kết hóa trị với các phân
tử protein, giúp hiệu chỉnh chính xác quá trình cuộn gấp của các phân tử
này chống lại sự tác động của các enzyme thủy phân protease, cho phép
liên kết với các cầu nối, domain, hướng đích v.v. Vì thế, những thay đổi
trong quá trình glycosyl hóa sẽ ảnh hưởng nghiêm trọng đến hoạt động
chức năng của các phân tử glycoprotein (Haltiwanger RS, Lowe JB, 2004).
Trong khi đó, đa phần các protein trên bề mặt tế bào đều được
glycosyl hóa nên những thay đổi dù nhỏ cũng sẽ khiến cho hoạt động của tế
bào bị biến đổi theo. Sự chuyển dạng từ tế bào thường thành tế bào ung thư
kèm theo sự thay đổi trong quá trình glycosyl hóa ở các liên kết N- và O-
với phân tử protein. Ví dụ như ở tế bào ung thư thì nhánh 1,6GlcNAc thuộc
chuỗi N-glycans gắn với Asn-X-Ser/Thr thường xuất hiện nhiều hơn bình
thường; trong khi dạng mucin-O- nối với các phân tử glycan gắn kết với
Ser hoặc Thr thường bị giảm (Cazet A et al., 2010; Kanoelani TP, Mahal
LK, 2007).