Nghiên cứu xây dựng qui trình tạo sinh khối thông qua hệ thống nuôi cấy rễ tơ của cây bá bệnh (Eurycoma longifolia)

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên























BỘ GIÁO DỤC
VÀ ĐÀO TẠO
VIỆN KHOA HỌC VÀ
CÔNG NGHỆ VIỆT NAM
VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT


HOÀNG HÀ






NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG QUY TRÌNH TẠO SINH KHỐI
THÔNG QUA HỆ THỐNG NUÔI CẤY RỄ TƠ CỦA
CÂY BÁ BỆNH (Eurycoma longifolia)




LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC










Hà Nội - 2012

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên























BỘ GIÁO DỤC
VÀ ĐÀO TẠO
VIỆN KHOA HỌC VÀ
CÔNG NGHỆ VIỆT NAM
VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT





LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC





NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG QUY TRÌNH TẠO SINH KHỐI
THÔNG QUA HỆ THỐNG NUÔI CẤY RỄ TƠ CỦA
CÂY BÁ BỆNH (Eurycoma longifolia)




Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm
Mã số: 624230



Học viên: Hoàng Hà
Hƣớng dẫn khoa học: PGS. TS. Chu Hoàng Hà

Hà Nội - 2012

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên


LỜI CẢM ƠN

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành đến những người đã hướng dẫn, giúp
đỡ tận tình để tôi hoàn thành luận văn này:
Người thầy của tôi, PGS. TS. Chu Hoàng Hà, Phó Viện trưởng Viện công
nghệ sinh học, trưởng phòng Công nghệ Tế bào Thực vật - Viện Công nghệ Sinh
học, đã hướng dẫn và hỗ trợ tận tình, truyền đạt kiến thức, những kinh nghiệm quý
báu trong suốt quá trình thực hiện đề tài.
GS. TS. Lê Trần Bình, TS Lê Văn Sơn, TS. Phạm Bích Ngọc, CN. Nguyễn
Đình Trọng và cán bộ phòng Công nghệ Tế bào Thực vật đã chỉ bảo tận tình về
chuyên môn, luôn theo sát thí nghiệm của tôi để có những lời khuyên bổ ích và kịp
thời.
Trong những năm học tập và nghiên cứu tại phòng Công nghệ tế bào thực
vật, tôi đã nhận được rất nhiều sự quan tâm giúp đỡ, động viên chân thành của tập
thể cán bộ phòng. Các thực tập sinh luôn thân thiện, nhiệt tình, tạo nên một môi
trường nghiên cứu chủ động, hăng say. Tôi xin chân thành cảm ơn sự giúp đỡ quý
báu này.
Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành đến phòng Tổng hợp hữu cơ Viện Hóa học
- Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam, phòng Sắc ký khối phổ phân giải cao -
khoa Hóa học - Đại học Khoa học tự nhiên đã tạo mọi điều kiện cho tôi hoàn thành
đề tài.
Tôi cũng xin bày tỏ lòng biết ơn đến các thầy cô giáo tại cơ sở viện Sinh thái
và Tài nguyên sinh vật đã truyền đạt cho tôi những kiến thức quý báu trong thời
gian học tập vừa qua.

Bằng tình cảm chân thành, tôi xin gửi lời cảm ơn đến gia đình và bạn bè đã
luôn ở bên, động viên, giúp đỡ tôi trong suốt thời gian thực hiện luận văn này.

Hà Nội, tháng 8 năm 2012
Học viên

Hoàng Hà

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên


NHỮNG KÍ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT
API Atmospheric Pressure Ionization
Bp Base pairs
CTAB Cetyl trimethylammonium bromide
COI Cytochrome c oxidase subunit I
dNTP 2‟- deoxyribonucleoside - 5‟triphosphate
EDTA Ethylene diamine tetra acetic acid
ITS Internal Transcribed Spacer
Kb Kilobase
MS Mass Spectrometry
MS Murashige and Skoog
WPM Woody Plant Medium

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên


MỤC LỤC
MỞ ĐẦU 1
Chương 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 4
1.1. TỔNG QUAN VỀ CÂY BÁ BỆNH 4
1.1.1. Giới thiệu và phân bố địa lý 4
1.1.2. Phân loại 4
1.1.3. Hình thái 5
1.1.4. Tác dụng dƣợc lý của cây bá bệnh 5
1.1.5. Tính cấp thiết nghiên cứu, bảo tồn và sản xuất bền vững cây bá
bệnh 6
1.2. NUÔI CẤY SINH KHỐI RỄ TƠ - GIẢI PHÁP TẠO NGUỒN DƢỢC
PHẨM SẠCH PHỤC VỤ SỨC KHỎE CỘNG ĐỒNG 6

1.2.1. Giới thiệu về nuôi cấy sinh khối tế bào 6
1.2.2. Giới thiệu về Agrobacterium rhizogenes - phƣơng pháp tạo rễ tơ ở
tế bào thực vật 8
1.2.3. Cơ chế chuyển các gen vùng T-DNA vào tế bào thực vật 8
1.2.4. Nuôi cấy sinh khối rễ tơ 10
1.3. CÁC NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG CHỈ THỊ DNA VÀO VIỆC ĐỊNH
DANH LOÀI 13
1.4. PHƢƠNG PHÁP KHỐI PHỔ (MASS SPECTROMETRY-MS) 15
Chương 2: VẬT LIỆU - PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 18
2.1. VẬT LIỆU 18
2.2. DỤNG CỤ - HÓA CHẤT 18
2.3. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 18
2.3.1. Thu thập và định danh loài bằng chỉ thị phân tử 18
2.3.2. Phƣơng pháp khử trùng hạt và đƣa mẫu vào nuôi cấy in vitro 19
2.3.3. Phƣơng pháp chuyển gen thông qua Agrobacterium rhizogenes 20
2.3.4. Đánh giá các dòng rễ tơ chuyển gen trong phòng thí nghiệm 20
Chương 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 26
3.1. THU THẬP VÀ ĐỊNH DANH LOÀI BÁ BỆNH BẰNG CHỈ THỊ DNA 26
3.1.1. Thu thập mẫu 26
3.1.2. Định danh loài bằng chỉ thị DNA 27
3.2. KẾT QUẢ KHỬ TRÙNG HẠT VÀ ĐƢA CÁC MẪU BÁ BỆNH VÀO
NUÔI CẤY IN VITRO LÀM NGUYÊN LIỆU CHO NUÔI CẤY MÔ TẾ BÀO
VÀ CHUYỂN GEN TẠO RỄ TƠ 31
3.3. TỐI ƢU HÓA QUY TRÌNH CHUYỂN GEN VÀ TIẾN HÀNH CHUYỂN
GEN TẠO RỄ TƠ THÔNG QUA Agrobacterium rhizogenes 33
3.3.1. Tối ƣu hóa quy trình chuyển gen thông qua A. rhizogenes 33
3.3.2. Kết quả chuyển gen tạo rễ tơ thông qua vi khuẩn Agrobacterium
rhizogenes 35
3.3.3. Kết quả thử nghiệm các môi trƣờng nuôi cấy rễ tơ bá bệnh 37
3.3.4. Các hình thái của rễ tơ bá bệnh 39

3.3.5. Kiểm tra các dòng rễ tơ chuyển gen 40

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên


3.3.6. Kết quả nuôi sinh khối rễ tơ cây bá bệnh trên môi trƣờng WPM
lỏng 42
3.4. KẾT QUẢ PHÂN TÍCH CÁC HỢP CHẤT THỨ CẤP CÓ TRONG DÒNG
RỄ TƠ BẰNG PHƢƠNG PHÁP SẮC KÝ BẢN MỎNG VÀ KHỐI PHỔ KẾ 42
3.4.1. Kết quả sắc ký bản mỏng 42
3.4.2. Kết quả phân tích hợp chất tự nhiên của rễ bá bệnh 43
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 46
TÀI LIỆU THAM KHẢO 47

Luận văn Thạc sỹ Hoàng Hà
1

MỞ ĐẦU
1. Đặt vấn đề
Cây bá bệnh (Eurycoma longifolia Jack) hay Tongkat Ali là cây thảo dƣợc
phân bố chủ yếu ở khu vực Đông Nam Á. Cây Bá bệnh là cây thuốc quý hiếm với
khả năng trị bách bệnh, đã đƣợc tìm thấy ở Việt Nam tại Vƣờn quốc gia Bái Tử
Long từ năm 2000, mọc tự nhiên ở hầu hết các diện tích đất rừng tại đây.
Trên thế giới, từ lâu cây này đã đƣợc biết đến nhƣ là nhân sâm Malaysia,
cũng nhƣ tại nhiều nƣớc Đông Nam Á nhƣ Indonesia, Brunei, Thái lan, Cămpuchia,
Lào… với tác dụng giúp nam giới tăng cƣờng chức năng sinh lý và sức khoẻ tình
dục. Các bộ phận của cây đƣợc sử dụng nhiều trong các bài thuốc truyền thống chữa
các bệnh sốt rét, bệnh tiểu đƣờng, kháng lại các bệnh do vi sinh vật và tăng cƣờng
chức năng sinh lý và sức khoẻ tình dục, bổ sung năng lƣợng cho cơ thể, giúp giảm
stress, mệt mỏi, tăng cƣờng miễn dịch, ngăn ngừa khối u và phòng chống lão hoá.
Các hợp chất có hoạt tính sinh học đã đƣợc tìm thấy từ các bộ phận khác nhau của
cây nhƣ eurycomaoside, eurycolactone, eurycomalactone, eurycomanone, và
pasakbumin-B, cùng với các alkaloid và quassinoid. Cây Bá bệnh đã đƣợc sản xuất
và sử dụng dƣới dạng thực phẩm chức năng tại nhiều nƣớc ở châu Á, Tây Âu và
Hoa Kỳ.
Ở Việt Nam, các kết quả nghiên cứu ban đầu của các nhà khoa học trƣờng
Đại học Dƣợc Hà Nội vào năm 2006 cho thấy cây bá bệnh tại Việt Nam cũng có tác
dụng không thua kém các nƣớc trong khu vực.
Hiện nay, giá trị y dƣợc quý của cây Bá bệnh đã đƣợc nhiều ngƣời biết đến;
do đó cần quản lý và sử dụng các phƣơng pháp khoa học để khai thác bền vững

nguồn tài nguyên này. Trƣớc tình hình trên, bên cạnh việc nghiên cứu giá trị của
cây Bá Bệnh ở Việt Nam, phân tích tác dụng dƣợc lý để đƣa ra những hƣớng dẫn
chiết xuất, sử dụng phù hợp với sức khoẻ cộng đồng, cần sớm nghiên cứu áp dụng
nuôi cấy sinh khối tế bào thực vật tạo nguồn nguyên liệu ổn định, đáp ứng nhu cầu
làm thuốc.
Những năm gần đây, cùng với xu hƣớng chung trên thế giới, ở nƣớc ta
hƣớng nghiên cứu công nghệ sinh khối tế bào thực vật để sản xuất các sản phẩm thứ
cấp đã bắt đầu đƣợc quan tâm đầu tƣ phát triển. Tuy nhiên quá trình nuôi cấy tạo
sinh khối tế bào thực vật nhằm làm giảm hoặc mất tính biệt hóa ở các mô tế bào
Luận văn Thạc sỹ Hoàng Hà
2

nuôi cấy cần bổ sung các chất điều hòa sinh trƣởng vào trong môi trƣờng nuôi cấy.
Vấn đề này là một trong những trở ngại lớn do tồn dƣ của các chất điều hòa sinh
trƣởng trong sinh khối tế bào nuôi cấy ảnh hƣởng trực tiếp đến sản phẩm và sức
khỏe ngƣời sử dụng. Việc này hoàn toàn có thể khắc phục trong nuôi cấy sinh khối
từ rễ tơ. Rễ tơ là một bệnh ở thực vật đƣợc gây ra bởi quá trình tƣơng tác giữa vi
khuẩn Agrobacterium rhizogenes và tế bào vật chủ. Rễ tơ có khả năng sinh trƣởng
nhanh, phát triển tốt trên môi trƣờng không cần bổ sung các chất điều hòa sinh
trƣởng và có thể nuôi cấy tạo sinh khối liên tục điều này có ý nghĩa trong dây
chuyền sản xuất các hợp chất thứ cấp hay các dƣợc phẩm sinh học tái tổ hợp. Rễ tơ
có thể sản xuất một lƣợng lớn các hợp chất thứ cấp và là cơ quan biệt hóa nên rễ tơ
có sự di truyền ổn định hơn nuôi cấy tế bào huyền phù và mô sẹo. Xuất phát từ các
ƣu điểm trên và do hợp chất dƣợc lý quý của Bá bệnh chủ yếu thu đƣợc từ rễ, chúng
tôi đã thực hiện đề tài: “Nghiên cứu xây dựng qui trình tạo sinh khối thông qua
hệ thống nuôi cấy rễ tơ của cây bá bệnh (Eurycoma longifolia)”. Công trình này
đƣợc thực hiện tại phòng Công nghệ Tế bào Thực vật, Viện Công nghệ Sinh học,
Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam.
2. Mục đích nghiên cứu
Mục tiêu tổng quát: Nghiên cứu cơ sở khoa học và thực nghiệm của việc tạo sinh

khối cây bá bệnh làm nguyên liệu dƣợc và thực phẩm chức năng bằng công nghệ
nuôi cấy rễ tơ.
Mục tiêu cụ thể:
- Thu thập đƣợc mẫu cây Bá Bệnh làm nguyên liệu cho nuôi cấy mô tế bào và
chuyển gen tạo rễ tơ.
- Tối ƣu hóa đƣợc quy trình chuyển gen thông qua Agrobacterium rhizogenes và tạo
đƣợc các dòng rễ tơ.
- Đánh giá điều kiện nuôi cấy và chọn lọc đƣợc một số dòng rễ tơ có khả năng sinh
trƣởng nhanh để nuôi cấy tạo sinh khối.
- Bƣớc đầu đánh giá hàm lƣợng hoạt chất của sản phẩm nuôi cấy thu đƣợc so với
dƣợc liệu tự nhiên.
3. Nội dung nghiên cứu
- Thu thập và định danh mẫu cây bá bệnh bằng chỉ thị phân tử
- Đƣa mẫu cây bá bệnh vào nuôi cấy in vitro
Luận văn Thạc sỹ Hoàng Hà
3

- Nghiên cứu tối ƣu quy trình chuyển gen sử dụng Agrobacterium rhizogenes, tạo rễ
tơ bá bệnh và xác định các điều kiện môi trƣờng thích hợp cho sinh trƣởng
- Đánh giá sơ bộ hàm lƣợng hoạt chất của sản phẩm nuôi cấy thu đƣợc so với dƣợc
liệu tự nhiên .

4. Ý nghĩa khoa học
Làm cơ sở cho việc sản xuất quy mô công nghiệp sinh khối rễ tơ cây bá bệnh
cho mục đích làm nguyên liệu dƣợc và thực phẩm chức năng.

Luận văn Thạc sỹ Hoàng Hà
4

CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Tổng quan về cây bá bệnh
1.1.1. Giới thiệu và phân bố địa lý
Cây bá bệnh (Eurycoma longifolia Jack) hay Tongkat Ali là cây thảo dƣợc
phân bố chủ yếu ở khu vực Đông Nam Á. Bá bệnh là một cây thuốc đƣợc sử dụng
trong dân gian từ rất lâu, nó còn đƣợc gọi với những cái tên khác đó là: cây mật
nhân, hay cây bách bệnh. Tại Việt Nam bá bệnh có mặt trong vƣờn quốc gia Bái Tử
Long, khu Bảo tồn thiên nhiên Đồng Sơn- Kỳ Thƣợng, Hoành Bồ, Quảng Ninh,
một số rừng ở Tây Nguyên .
Cây Bá bệnh từ lâu đã đƣợc biết đến nhƣ là nhân sâm Malaysia, cũng nhƣ tại
nhiều nƣớc Đông Nam Á nhƣ Indonesia, Brunei, Thái lan, Cămpuchia, Lào… với
tác dụng giúp Nam giới tăng cƣờng chức năng sinh lý và sức khoẻ tình dục. Các bộ
phận của cây đƣợc sử dụng nhiều trong các bài thuốc truyền thống chữa các bệnh

sốt rét, bệnh tiểu đƣờng, kháng lại các bệnh do vi sinh vật [21] và tăng cƣờng chức
năng sinh lý và sức khoẻ tình dục, bổ sung năng lƣợng cho cơ thể, giúp giảm stress,
mệt mỏi, tăng cƣờng miễn dịch, ngăn ngừa khối u và phòng chống lão hóa.
1.1.2. Phân loại

Giới: Plantae
Ngành: Magnoliophyta
Lớp: Magnoliopsida
Bộ: Sapindales
Họ: Simaroubaceae
Chi: Eurycoma
Loài: E. longifolia


Tên hai phần: Eurycoma longifolia Jack


Hình 1. Cây Bá bệnh
Luận văn Thạc sỹ Hoàng Hà
5

1.1.3. Hình thái
Bá bệnh là loại cây trung bình, cao khoảng 8 m, thƣờng mọc dƣới tán lá của
những cây lớn. Có lông ở nhiều bộ phận. Là loại cây mọc hoang trong những cánh
rừng thƣa vùng Đông Nam Á. Thân nhỏ, ít phân cành, lá kép lông chim một lần lẻ,
mọc so le. Cây bá bệnh là loài đơn tính khác gốc nên mỗi cây chỉ trổ hoa đực hoặc
hoa cái. Mỗi lá kép gồm từ 21 – 41 lá chét, mọc đối, hình bầu dục, cuống lá rất
ngắn, gốc lá thuôn, đầu nhọn, mặt trên bóng, mặt dƣới có lông màu xám. Hoa chùm
kép mọc ở thân hoặc đầu cành, cuống có lông màu rỉ sắt. Hoa màu vàng, đơn tính
khác gốc. Đài hoa có 5 -6 lá đài nhỏ hình tam giác, có tuyến ở lƣng. Tràng hoa 5,

cũng có tuyến. Bầu có 5 noãn, hơi dính ở gốc. Quả hạch, hình trứng dài 1 – 2cm,
rộng 0,5 – 1cm, vỏ nhẵn có rãnh dọc, khi chín quả màu đỏ sẫm chứa 1 hạt [22].
1.1.4. Tác dụng dƣợc lý của cây bá bệnh
Tác dụng dƣợc lý của cây bá bệnh đã đƣợc chứng nhận và công bố rộng rãi
với nhiều đề tài nghiên cứu khoa học trên thế giới nhƣ: Kardono, Angerhofer et al.
1991; Ang, Chan et al. 1995; Ang and Cheang 1999, 2000; Ang, Ikeda et al. 2001;
Osman, Jordan et al. 2003; Chan, Choo et al. 2004; Kuo, Damu et al. 2004;
Nurhanan, Azimahtol Hawariah et al. 2005; Farouk and Benafri 2007…. Các hợp
chất có hoạt tính sinh học đã đƣợc tìm thấy từ các bộ phận khác nhau của cây nhƣ
eurycomaoside, eurycolactone, eurycomalactone, eurycomanone, and pasakbumin-
B, cùng với các alkaloid và quassinoid [12]. Cây Bá bệnh đã đƣợc sản xuất và sử
dụng dƣới dạng thực phẩm chức năng tại nhiều nƣớc ở châu Á, Tây Âu và Hoa Kỳ.
Tác dụng dƣợc lý vƣợt trội của cây Bá bệnh là khả năng tăng cƣờng sức khoẻ
tình dục cho Nam giới, kích thích cơ thể tăng tiết hormon giới tính nam
(testosteron) một cách tự nhiên, chính là chìa khóa duy trì sự hƣng phấn và phong
độ tình dục ở nam giới thƣờng có dấu hiệu suy giảm khi bƣớc vào độ tuổi trung
niên, làm giảm sự ham muốn, chất lƣợng sinh hoạt tình dục suy yếu, xảy ra hiện
tƣợng xuất tinh sớm, … thƣờng gọi chung là yếu sinh lý hay chứng bất lực [5].
Ở Việt Nam, cây bá bệnh mới đƣợc phát hiện trong những năm gần đây nên
chƣa có nhiều nghiên cứu khoa học trong nƣớc về cây này. Tuy nhiên, các bƣớc
nghiên cứu ban đầu cho thấy cây bá bệnh của Việt Nam có tác dụng không kém, có
phần vƣợt trội so với xuất xứ từ các nƣớc khác. Vừa qua Trung tâm Nam học- bệnh
viện Việt Đức đã tiến hành nghiên cứu lâm sàng về “Tính hiệu quả và an tòan của
Luận văn Thạc sỹ Hoàng Hà
6

sản phẩm Khang Dƣợc trong điều trị mãn dục nam” do GS.TS Trần Quán Anh làm
chủ nhiệm đề tài. Kết quả nghiên cứu trên 30 bệnh nhân sau thời gian sử dụng 8
tuần bƣớc đầu cho thấy: Sản phẩm Khang Dƣợc gồm bá bệnh, Linh chi và Nhân
sâm có tác dụng đối với nam giới sau 40 tuổi: gia tăng ham muốn tình dục, nâng

cao thể trạng chất lƣợng cuộc sống và tình dục một cách tự nhiên. Trƣờng hợp rối
loạn cƣơng, Khang Dƣợc có tác dụng hỗ trợ cùng nhóm điều trị đặc hiệu, làm tăng
khoái cảm, tăng khả năng cƣơng cứng dƣơng vật, tăng hiệu quả điều trị. Thuốc an
toàn khi sử dụng, các chỉ số sinh hóa về gan, tụy, thận,tiểu đƣờng bình thƣờng sau
điều trị. Bá bệnh cũng là vị thuốc chính trong bài thuốc “Ông uống bà khen” danh
bất hƣ truyền của các Vua Voi huyền thoại vùng Tây Nguyên bấy lâu nay [1].
1.1.5. Tính cấp thiết nghiên cứu, bảo tồn và sản xuất bền vững cây bá bệnh
Do giá trị y dƣợc quý của cây bá bệnh hiện nay đã đƣợc nhiều ngƣời biết
đến, do đó cần quản lý và sử dụng các phƣơng pháp khoa học để khai thác bền
vững nguồn tài nguyên. Vƣờn quốc gia Bái Tử Long đã đề xuất đề tài nhân giống
bảo tồn cây bá bệnh và nhận đƣợc sự ủng hộ của Sở Khoa học Công nghệ tỉnh
Quảng Ninh. Đến nay tại Vƣờn quốc gia Bái Tử Long đã thực hiện thành công
việc nhân giống và trồng thử nghiệm thành công loài cây bá Bệnh bằng hai
phƣơng pháp cây giâm hom và cây mọc từ hạt. Một quy trình tạm thời gieo ƣơm
và trồng cây bá bệnh bƣớc đầu đã thành công, mở ra cho nguồn tài nguyên phát
triển bền vững và lâu dài. ().
Trƣớc tình hình trên, bên cạnh việc nghiên cứu giá trị của cây bá bệnh ở Việt
Nam, phân tích tác dụng dƣợc lý để đƣa ra những hƣớng dẫn chiết xuất, sử dụng
phù hợp với sức khoẻ cộng đồng, cần sớm nghiên cứu áp dụng nuôi cấy sinh khối
tế bào thực vật tạo nguồn nguyên liệu ổn định, đáp ứng nhu cầu làm thuốc.
1.2. Nuôi cấy sinh khối rễ tơ - giải pháp tạo nguồn dƣợc phẩm sạch phục vụ
sức khỏe cộng đồng
1.2.1 Giới thiệu về nuôi cấy nuôi cấy sinh khối tế bào
Trên thế giới công nghệ sinh khối tế bào thực vật dựa trên cơ sở tính toàn
năng và tính biệt hóa của tế bào thực vật đã đƣợc ứng dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh
vực: dƣợc phẩm, sản phẩm chức năng, chất phụ gia thực phẩm, nông nghiệp, lâm
nghiệp,… vừa tạo ra nguyên liệu, vừa giúp bảo tồn nguồn gen quý hiếm.
Luận văn Thạc sỹ Hoàng Hà
7

Cho đến nay, rất nhiều hoạt chất nguồn gốc thực vật có giá trị kinh tế cao là
sản phẩm của sinh khối tế bào thực vật:
i) các hoạt chất dùng trong dƣợc phẩm nhƣ caffein thu đƣợc từ nuôi cấy tế
bào (Coffea arabica) [29], betalain từ mô sẹo củ cải đƣờng, berberin từ cây (Coptis
japonica) (loài cây này phải trồng từ 4-6 năm mới thu đƣợc hàm lƣợng Berberin
đáng kể trong rễ, trong khi hàm lƣợng này có thể thu đƣợc sau 4 tuần nuôi cấy [32].
ii) Các chất khác nhƣ chất dùng trong thực phẩm bao gồm các chất tạo màu
(Anthocyanin, crocin), các chất tạo mùi (vani, mùi hành và mùi tỏi)
iii) Các chất khác nhƣ shikonin – chất có khả năng diệt khuẩn và Paclitaxel.
Một ví dụ điển hình về ứng dụng hệ thống bioreactor 10.000 lít trong sản xuất
reserpine (alkaloid chiết xuất từ cây Ba gác có tác dụng chữa bệnh cao huyết áp và
các bệnh rối loạn tuần hoàn máu) có thể sản xuất đƣợc 3500 kg resperin trong thời
gian 30 ngày, tƣơng đƣơng với lƣợng hàng năm cả thế thu đƣợc từ cây rễ đó.
Với nhân sâm đã có rất nhiều các nghiên cứu về tạo sinh khối sâm từ tế bào
huyền phù, mô sẹo, từ nuôi cấy rễ hay rễ tơ để thu hoạch các hoạt chất quý
(Kawaguchi, Hirotani et al. 1990; Asada, Saito et al. 1993; Yoshikawa, Asada et al.
1993; Zhao, Ding et al. 2001; Jeong, Park et al. 2002; Palazon, Mallol et al. 2003;
Liu, Ding et al. 2004; Woo, Song et al. 2004; Jeong, Park et al. 2005). Hiện nay,
một số nƣớc tiêu thụ và xuất khẩu sâm lớn nhƣ Nhật Bản, Hàn Quốc, Trung Quốc
đã ứng dụng nuôi cấy sinh khối tế bào từ nhân sâm trong sản xuất các sản phẩm
chức năng hay làm thuốc bổ, thuốc phòng chống bệnh tim mạch, chống gốc tự do,
tăng cƣờng chức năng hệ thần kinh trung ƣơng, các loại mỹ phẩm [2, 23, 37, 38].
Trong khi đó, có rất ít nghiên cứu về nuôi cấy sinh khối tế bào cây bá bệnh. Gần
đây, nhóm nghiên cứu của Maziah và cs (2009) đã thành công trong nuôi cấy cảm
ứng tạo hoạt chất chống ung thƣ 9-methoxycanthin-6-one từ mô sẹo [30].
Trong quá trình nuôi cấy tạo sinh khối tế bào thực vật nhằm giảm hoặc mất
tính biệt hóa ở các mô tế bào nuôi cấy cần thiết bổ sung các chất điều tiết sinh
trƣởng vào trong môi trƣờng nuôi cấy. Vấn đề này là một trong những trở ngại lớn
làm nản lòng các nhà nghiên cứu do tồn dƣ của các chất điều tiết sinh trƣởng trong
sinh khối tế bào nuôi cấy ảnh hƣởng trực tiếp đến sản phẩm và sức khỏe ngƣời sử

dụng. Tuy nhiên việc này này hoàn toàn có thể khắc phục trong nuôi cấy sinh khối
từ rễ tơ sẽ đƣợc đề cập ở mục tiếp theo.
Luận văn Thạc sỹ Hoàng Hà
8

1.2.2 Giới thiệu về Agrobacterium rhizogenes – phƣơng pháp tạo rễ tơ ở tế bào
thực vật
Agrobacterium rhizogenes, tên khoa học khác là Rhizobium rhizogenes, là
một loài vi khuẩn đất gram âm, thuộc họ Rhizobiaceae nằm trong bộ Rhizobiales cố
định đạm. Chúng có khả năng nhận biết đƣợc các phân tử tín hiệu từ các tế bào
thực vật bị tổn thƣơng và tấn công vào vị trí đó. Mô tế bào thực vật bị nhiễm bởi vi
khuẩn Agrobacterium rhizogenes cảm ứng và phát triển mạnh mẽ các rễ. Do đó
Agrobacterium rhizogenes là một yếu tố cần đƣợc quan tâm đến trong việc cảm ứng
tạo rễ bất định từ tế bào thực vật in vitro [13].
Agrobacterium đƣợc biết đến từ rất lâu trong nông nghiệp với vai trò là các
vi khuẩn cố định đạm, cung cấp nguồn nitơ cho cây trồng. Trong những thập kỉ gần
đây thì các nhà khoa học đã chú ý đến vai trò của hai loài vi khuẩn Agrobacterium
rhizogenes và Agrobacterium tumefaciens trong mục đích chuyển gen vào thực vật.
Chúng đƣợc xem nhƣ là các “kĩ sƣ trao đổi chất”, đƣợc áp dụng để chuyển gene vào
tế bào thực vật nhằm mục đích đẩy mạnh quá trình sinh tổng hợp ra các hợp chất
thứ cấp cần thiết. Trong đó, Agrobacterium tumefaciens đƣợc biết đến với vai trò
cảm ứng tạo ra các khối u (mô sẹo) và Agrobacterium rhizogenes thì đƣợc biết đến
với vai trò cảm ứng tạo ra các rễ bất định ở thực vật hai lá mầm [13, 46].

Hình 2. Khuẩn Agrobacterium rhizogenes
1.2.3 Cơ chế chuyển các gen vùng T-DNA vào tế bào thực vật
Khi các vi khuẩn A.rhizogenes nhiễm vào vết thƣơng của thực vật thì chúng
sẽ chuyển gen của chúng vào các tế bào thực vật tại vị trí đó. Các gen đƣợc chuyển
Luận văn Thạc sỹ Hoàng Hà
9

từ A.rhizogenes vào trong bộ gen của tế bào thực vật đƣợc gọi tên là T-DNA
(transfer DNA). T-DNA sau khi chuyển vào thì sẽ đƣợc gắn ổn định vào bộ gen của
thực vật. Tuy các gen mã hóa T-DNA có nguồn gốc từ vi khuẩn nhƣng nó có mang
các trình tự điều tiết ở Eukaryote nên có thể biểu hiện đƣợc trong tế bào thực vật.
Vùng T-DNA này nằm trong một plasmid lớn của A. rhizogenes và plasmid này
đƣợc đặt tên là Ri- plasmid (root inducing plasmid) do A.rhizogenes có khả năng
cảm ứng tạo rễ bất định [27].
Ri-plasmid đƣợc chia thành 2 nhóm chính là agropine and mannopine, vi
khuẩn A. rhizogenes chứa Ri-plasmid thuộc loại agropine đƣợc sử dụng chủ yếu
cho quá trình chuyển gen vào tế bào thực vật để cảm ứng tạo rễ tơ. Ri-plasmid
đƣợc chia thành nhiều vùng nhƣ vùng gây độc (gọi tắt là vùng vir), vùng chuyển
gene (T-DNA), vùng ori, vùng phiên mã Chỉ có đoạn T-DNA của plasmid mới
đƣợc chuyển vào bộ gen của thực vật và việc chuyển gen này thông qua sự hỗ trợ
bởi các đoạn gen trong vùng vir của Ri-plasmid. Vùng vir chiếm khoảng 35 kb
trong Ri-plasmid và mã hóa sáu locus phiên mã (vir A, B, C, D, E, G), có chức
năng quan trọng trong quá trình chuyển gen [37]. Sự phiên mã của vùng vir đƣợc
cảm ứng với nhiều hợp chất thuộc nhóm phenol, điển hình là acetosyringone - hợp
chất liên quan đƣợc xác định là có vai trò làm tăng tần số của quá trình chuyển gen
thông qua Agrobacterium ở nhiều loài thực vật. Nhiều loại đƣờng cũng đóng vai
trò nhƣ chất bổ trợ hoạt động cho acetosyringone để cảm ứng sự biểu hiện của gene
vir ở mức độ cao.

Nhìn chung cơ chế quá trình xâm nhiễm và cơ chế phân tử của quá trình vận
chuyển T-DNA vào tế bào vật chủ của vi khuẩn A. tumefaciens và A.rhizogenes
đƣợc chứng minh là tƣơng tự nhau [46]. Tuy nhiên, sự hình thành khối u ở vi khuẩn
A.tumefaciens do gen mã hóa sinh tổng hợp auxin quy định. Trong khi đó, các gen
mã hóa sinh tổng hợp auxin ở vi khuẩn A. rhizogenes có vai trò rất nhỏ trong quá
trình hình thành rễ tơ ở thực vật [14, 46].
T-DNA ở Ri-plasmid của nhóm agropine bao gồm 2 vùng chính là vùng biên
trái TL-DNA và biên phải TR-DNA. Hai vùng này đều có kích thƣớc khoảng 15 -
20 kb và đƣợc xen kẽ bởi 1 đoạn DNA, đoạn DNA này sẽ không đƣợc chuyển vào
hệ gen của tế bào vật chủ. Vùng TR-DNA mang các gen mã hóa sinh tổng hợp
auxin (tms1 and tms2), vùng TL-DNA bao gồm 18 khung đọc (ORFs), trong đó có
4 loci 10, 11, 12 và 15 mã hóa cho rolA, B, C và D (root locus). Các Ri-plasmid của
Luận văn Thạc sỹ Hoàng Hà
10

các chủng A.rhizogenes thuộc nhóm mannopine, cucumopine and mikimopine chứa
vùng T-DNA đơn, có cấu trúc giống nhƣ vùng TL-DNA của các chủng thuộc nhóm
agropine nhƣng khuyết gen rolD [17, 18]. Các gen rolA, rolB và rolC đóng vai trò
quan trọng trong quá trình cảm ứng tạo rễ tơ ở mô tế bào thực vật. Sự biểu hiện
đồng thời của ba gen này gây nên kiểu hình rễ tơ ở mô tế bào thực vật bị xâm
nhiễm. Các rễ tơ này có khả năng sinh trƣởng và phát triển nhanh hơn rất nhiều so
với rễ bình thƣờng [40]. Trong 3 gen rol trên, gen rolB đóng vai trò quan trọng hơn
cả, khi gen rolB đƣợc biểu hiện, mô tế bào thực vật đã cảm ứng tạo kiểu hình rễ tơ,
trong khi đó khi bất hoạt gen rolB không tạo đƣợc kiểu hình rễ tơ [13].

Hình 3. Mô hình chung của Ri - plasmid
1.2.4. Nuôi cấy sinh khối rễ tơ
Rễ tơ là tên gọi dùng để chỉ các lông rễ đƣợc sản sinh ra mạnh mẽ tại vị
trí bị nhiễm bởi vi khuẩn Agrobacterium rhizogenes. T-DNA từ A. rhizogenes sau
khi chuyển vào tế bào thực vật thì chúng sẽ đƣợc gắn vào bộ gene của thực vật, từ

đó tế bào thực vật sẽ làm nhiệm vụ biểu hiện các gene rol và gen aux (tổng hợp ra
IAA) làm tăng khả năng tạo các lông rễ một cách mạnh mẽ ngay tại vị trí bị tổn
thƣơng ở mô thực vật đó. Số lƣợng các lông rễ đƣợc tạo ra khá nhiều, phát triển
thành một hệ thống lông rễ, hay còn gọi là hệ thống rễ tơ.
Tại Hàn Quốc, một số công ty đang sản xuất rễ tơ nhân sâm với bioreactor có
dung tích 10.000 đến 20.000 lít. Sản phẩm này đƣợc làm nguyên liệu cho các dạng
Luận văn Thạc sỹ Hoàng Hà
11

thực phẩm chức năng và thực phẩm khác nhau trên thị trƣờng. Đã có rất nhiều
nghiên cứu thành công trong tạo các hoạt chất từ nuôi cấy sinh khối rễ tơ [3, 4].
Hình ảnh một số rễ tơ đƣợc nuôi cấy trong các môi trƣờng lỏng và môi trƣờng
đặc:


Hình 4. Các hệ rễ tơ đƣợc nuôi cây
1. Rễ tơ Beta vulgaris phát triển trên môi trƣờng agar
2. Rễ tơ của cây đậu phộng (Arachis hypogaea)
3. Rễ tơ G. glabra nuôi trong môi trƣờng lỏng
4. Nuôi cấy rễ tơ G.glabra bằng hệ thống bioreactor (a); thu hoạch
sinh khối rễ sau 30 ngày nuôi cấy (b,c)
Điểm đặc trƣng nổi bật của hệ thống rễ tơ là chúng có khả năng phát triển
nhanh và ổn định trên môi trƣờng nuôi cấy không cần bổ sung chất điều hòa sinh
trƣởng thực vật (CĐHSTTV). Với sự chuyển gene của A. rhizogenes vào tế bào,
Luận văn Thạc sỹ Hoàng Hà
12

rễ tơ có khả năng tổng hợp ra nhiều loại hợp chất tự nhiên với hiệu suất cao mà các
tế bào không phân hóa và các rễ bất định không chuyển gen không tổng hợp đƣợc
hay tổng hợp với hàm lƣợng không đáng kể. Rễ tơ đƣợc xem nhƣ là một nguồn

nguyên liệu có giá trị trong sản xuất các hợp chất tự nhiên có lợi nhƣ dƣợc phẩm,
các chất phụ gia trong ngành mỹ phẩm và thực phẩm. Vào năm 2002, Sevon đã
tổng kết lại những hợp chất alkaloid quan trọng nhất trong ngành dƣợc đƣợc sản
xuất bởi các hệ thống rễ tơ, bao gồm A. tropabelladonna L., Catharanthus
tricophyllus L., và Datura candida L [19, 36]. Nhờ vào những đặc điểm nhƣ phát
triển nhanh, dễ duy trì ổn định và khả năng tổng hợp một số lƣợng lớn hợp chất
tự nhiên, hệ thống rễ tơ thể hiện tiềm năng lớn trong việc sản xuất các hợp chất tự
nhiên thông qua các hệ thống nuôi cấy liên tục. Điều này có ý nghĩa lớn trong việc
sản xuất các sản phẩm hợp chất tự nhiên trên quy mô công nghiệp với hiệu xuất
cao, giảm chi phí trong quá trình sản xuất từ đó giảm giá thành sản phẩm. Bên cạnh
việc chuyển T-DNA của A. rhizogenes vào tế bào thì ta còn có thể chuyển các
gene ngoại lai vào trong tế bào thông qua việc tái tổ hợp đoạn gen đó vào trong
đoạn T-DNA của A. rhizogenes. Các gene này có thể là gen biểu hiện ra các hợp
chất mục tiêu hay có thể là các gene mã hóa các enzyme chìa khóa trong con
đƣờng sinh tổng hợp ra hợp chất tự nhiên mong muốn. Phƣơng pháp này có thể
giúp ta điều khiển hay định hƣớng cho quá trình sinh tổng hợp hợp chất tự nhiên ở
rễ tơ để tổng hợp ra một loại hợp chất tự nhiên với hàm lƣợng cao. Nghiên cứu
của Lodhi (1996) đã chứng minh rằng hàm lƣợng anthraquinone và alizarin trong hệ
thống nuôi cấy rễ tơ của Rubia peregrina L. tăng cao khi gắn đoạn gen mã hóa ra
enzyme isochorismate synthase vào đoạn T-DNA; và theo Banerjee (2002) thì rễ
tơ của A. belladonna đƣợc chuyển gen P450 2E1 thể hiện khả năng tổng hợp
chất tự nhiên với mức độ rất cao [39].
Với tiềm năng to lớn của hệ thống rễ tơ, các hệ thống rễ tơ của nhiều loài thực
vật đã đƣợc nghiên cứu rộng rãi cho mục đích sản xuất hợp chất tự nhiên in vitro.
Đặc biệt là những cây thuốc có ứng dụng lớn cho việc chữa bệnh.




Luận văn Thạc sỹ Hoàng Hà

13

Bảng 1: Sản xuất hợp chất thứ cấp bằng kỹ thuật nuôi cấy mô rễ tơ từ một số loài
cây thuốc
Họ thực vật
Cây thuốc
Hợp chất
chính
Tác dụng
Araliaceae
Panax ginseng
Các
ginsenosid
Bổ, tăng lực, chống
stress
Apocynaceae
Rauwolfia
micrantha
Ajmalicin,
Ajmalin
Hạ huyết áp
Asteraceae
Saussurea
medusa
Jaceosidin
Kháng ung thƣ
Cucurbitaceae
Gynostemma
pentaphyllum
Gypenosid

(Saponin)
Một số tác dụng sinh học
Fabaceae
Pueraria
phaseoloides
Puerarin
Hạ nhiệt, co thắt, hạ áp,
chống loạn nhịp
Ginkgoaceae
Gingko biloba
Ginkgolid
Phòng chống bệnh tim
mạch và tuổi già
Linaceae
Linum favum
Coniferin
(Lignan)
Kháng ung thƣ
Nyssaceae
Camptotheca
acuminate
Camptothecin
Kháng ung thƣ, kháng
virus
Papaveraceae
Papaver
somniferum
Morphin,
sanguinarin,
codein

Giảm đau
Solanaceae
Solanum
chrysotrichum
Saponin
Kháng virus
Verbenaceae
Gmelina
arborea
Verbascosid
Phòng chống bệnh đau
bao tử, sốt và bệnh ngoài
da
1.3. Các nghiên cứu ứng dụng chỉ thị DNA vào việc định danh loài
Trong nghiên cứu này, việc thu thập các nguồn mẫu bá bệnh ngoài tự nhiên
làm nguyên liệu cho nuôi cấy là một đòi hỏi cần thiết. Tuy nhiên, nguồn nguyên
liệu ngoài tự nhiên nếu chỉ dựa vào hình thái và kinh nghiệm dân gian đôi khi dễ
nhầm lẫn với những đối tƣợng cây có hình thái tƣơng tự tại sống cùng một khu vực.
Điều này có ảnh hƣởng không nhỏ đến nghiên cứu. Do đó việc định danh các mẫu
Luận văn Thạc sỹ Hoàng Hà
14

cây ngoài tự nhiên bằng phƣơng pháp sinh học phân tử sẽ mang ý nghĩa rất quan
trọng.
Trong vài thập kỷ gần đây, sự phát triển mạnh mẽ của các phƣơng pháp và
kỹ thuật sinh học phân tử đã tạo ra các công cụ hữu hiệu cho nghiên cứu sự sống ở
mức độ phân tử. Các kỹ thuật sinh học phân tử cũng nhanh chóng đƣợc ứng dụng
trong nghiên cứu và bảo tồn đa dạng sinh học, định dạng loài, tạo ra các lĩnh vực
khoa học mới nhƣ tiến hóa phân tử, di truyền bảo tồn loài. Đặc biệt, đối với lĩnh vực
phân loại học, việc sử dụng các DNA chỉ thị để định danh loài đang đƣợc các nhà

khoa học trên thế giới tập trung nghiên cứu và có những đóng góp đáng kể trong
việc phân loại loài. Định danh loài bằng chỉ thị DNA hay „DNA barcoding‟ là một
khái niệm tƣơng đối mới mẻ. Đó là một công cụ phục vụ định danh loài một cách
chính xác, nhanh chóng, tự động hóa bằng cách sử dụng một vùng DNA chuẩn hay
còn gọi là chỉ thị DNA hay mã vạch DNA (DNA barcode) [44]. Xác định loài bằng
DNA chỉ thị sẽ cho mức độ chính xác cao và đặc biệt hữu dụng với các loài gần gũi
mà những quan sát hình thái, sinh trƣởng và phát triển chƣa đủ cơ sở để định danh
hoặc phân biệt loài [44]
Hiện nay trên thế giới, phƣơng pháp này đang đƣợc sử dụng chủ yếu bởi các
nhà phân loại học và nhiều nhà khoa học ở các lĩnh vực khác nhƣ khảo cổ học, công
nghiệp sinh học và chế biến thực phẩm…Một chỉ thị DNA lý tƣởng dùng để định
danh loài cần có những yêu cầu sau. Thứ nhất, đoạn DNA chỉ thị phải đủ độ biến
thiên để phân biệt giữa các loài nhƣng cũng phải không khác nhau quá mức giữa
các cá thể trong cùng loài. Thứ hai, hệ thống định danh bằng DNA phải đƣợc chuẩn
hóa, với cùng một vùng DNA có thể đƣợc sử dụng cho các nhóm phân loại khác
nhau. Thứ ba, đoạn DNA chỉ thị cần chứa đủ thông tin phát sinh loài để có thể dễ
dàng định danh loài vào các nhóm phân loại (chi, họ,…). Thứ tƣ, có khả năng áp
dụng với các mẫu vật thô, với vị trí cặp mồi nhân gen có độ bảo thủ cao, dễ dàng
thực hiện phản ứng khuếch đại và đọc trình tự DNA. Điều này đặc biệt quan trọng
khi DNA tách chiết từ mẫu phân tích là một hỗn hợp DNA của nhiều loài cần nhận
dạng trong cùng một thời điểm. Thứ năm, đoạn DNA chỉ thị cần có chiều dài vừa
phải (400-800 bp) để có thể đƣợc khuếch đại từ DNA khuôn là các DNA bị đứt gãy
[44].
Đối với động vật, phần lớn các nghiên cứu sử dụng một vùng DNA ngắn của
gen ty thể mã hóa cytochrome c oxidase subunit I (COI) làm chỉ thị DNA. Mặc dù
Luận văn Thạc sỹ Hoàng Hà
15

có vài trƣờng hợp ngoại lệ, COI đƣợc coi là một chỉ thị DNA điển hình và chung
cho các loài động vật ().

Đối với thực vật, quá trình tìm kiếm một chỉ thị DNA chung cho các loài
thực vật gặp nhiều khó khăn. Hệ gen ty thể ở thực vật thƣờng quá bảo thủ nên
không đƣợc dùng cho chỉ thị DNA, trong khi đó hệ gen lục lạp lại mang nhiều đặc
điểm mong muốn đối với chỉ thị DNA nhƣ ở hệ gen ty thể ở động vật [47]. Ở hệ
gen nhân, vùng DNA nằm giữa các gen hay còn gọi ITS (Internal Transcribed
Spacer) cũng đƣợc sử dụng làm DNA chỉ thị trong một số nghiên cứu. Trong vòng
5 năm qua, nhiều vùng gen đã đƣợc nghiên cứu và đề xuất là chỉ thị DNA cho thực
vật, tuy nhiên chƣa có chỉ thị DNA nào đƣợc đa phần các nhà phân loại học thực vật
hoàn toàn chấp nhận [44,47]. Mặc dù vậy, các nhà nghiên cứu cũng đã đi tới một
quan điểm thống nhất là sẽ cần không chỉ một mà nhiều vùng DNA chỉ thị để định
danh loài đối với thực vật và hệ gen lục lạp là nơi chứa các vùng DNA chỉ thị tiềm
năng, trong đó một số vùng DNA lục lạp đã đƣợc nhiều nhà nghiên cứu đề xuất là
chỉ thị DNA .
1.4. Phƣơng pháp khối phổ (Mass Spectrometry-MS)
Phƣơng pháp khối phổ (Mass Spectrometry-MS) là phƣơng pháp nghiên cứu
các chất bằng cách đo, phân tích chính xác khối lƣợng phân tử của chất đó dựa trên
sự chuyển động của các ion nguyên tử hay ion phân tử trong một điện trƣờng hoặc
từ trƣờng nhất định. Tỉ số giữa khối lƣợng và điện tích (m/z) có ảnh hƣởng rất lớn
đối với chuyển động này của ion. Nếu biết đƣợc điện tích của ion thì ta dễ dàng xác
định đƣợc khối lƣợng của ion đó [45].
Nhƣ vậy, trong nghiên cứu khối phổ của bất kỳ chất nào, trƣớc tiên nó phải
đƣợc chuyển sang trạng thái bay hơi, sau đó đƣợc ion hoá bằng các phƣơng pháp
thích hợp. Các ion tạo thành đƣợc đƣa vào nghiên cứu trong bộ phân tích khối của
máy khối phổ. Tùy theo loại điện tích của ion nghiên cứu mà ngƣời ta chọn kiểu
quét ion dƣơng (+) hoặc âm (-). Kiểu quét ion dƣơng thƣờng cho nhiều thông tin
hơn về ion nghiên cứu nên đƣợc dùng phổ biến hơn.Tuy nhiên, sự phát triển của kỹ
thuật hiện nay cũng đã cho phép tích hợp hai kiểu quét này thành một nhằm tạo điều
kiện thuận lợi nhất cho các nhà nghiên cứu, tuy nhiên thƣờng độ nhạy không cao
bằng từng kiểu quét riêng lẻ.Trong rất nhiều năm, các nhà nghiên cứu kỹ thuật sắc
ký lỏng ghép khối phổ phải đối mặt với rất nhiều khó khăn trong việc tìm cách giải

Luận văn Thạc sỹ Hoàng Hà
16

quyết đƣợc sự tƣơng thích giữa hệ thống sắc ký lỏng và đầu dò khối phổ. Nguyên
nhân là do quá trình phân tích với đầu dò MS đòi hỏi mức độ chân không cao, nhiệt
độ cao, các chất khảo sát phải ở trạng thái khí, vận tốc dòng chảy nhỏ; trong khi hệ
thống LC lại hoạt động ở áp suất cao với một lƣợng dung môi tƣơng đối lớn, nhiệt
độ tƣơng đối thấp, các chất phân tích ở thể lỏng.Để khắc phục những khó khăn trên,
cần phải có một kỹ thuật trung gian gọi là giao diện. Rất nhiều kỹ thuật giao diện
(interface technology) nhƣ chùm tia hạt (FB), bắn phá nguyên tử nhanh dòng liên
tục (CF-FAB),… đã đƣợc nghiên cứu và ứng dụng, nhƣng mãi cho đến cuối thập
nhiên 80, mới có sự đột phá thật sự với kỹ thuật ion hóa tại áp suất khí quyển
(Atmospheric Pressure Ionization – API). Ƣu điểm nổi bật của API là khả năng
hình thành ion tại áp suất khí quyển ngay trong buồng ion hóa. Điều này khác biệt
với các kiểu ion hóa sử dụng trƣớc đó cho LC/MS nhƣ bắn phá nguyên tử nhanh với
dòng liên tục (continuous flow- fast atom bombardment CF-FAB) hay nhƣ tia nhiệt
(thermospray – TS) đều đòi hỏi áp suất thấp. Một thuận lợi nữa của API là sự ion
hóa mềm (soft ionization), không phá vỡ cấu trúc của hợp chất cần phân tích nhờ đó
thu đƣợc khối phổ của ion phân tử. Ngoài ra, với kỹ thuật này, ngƣời ta có thể điều
khiển đƣợc quá trình phá vỡ ion phân tử để tạo ra những ion con tùy theo yêu cầu
phân tích [45].
Có ba kiểu hình thành ion ứng dụng cho nguồn API trong LC/MS:
 Ion hóa tia điện (electrospray ionization – ESI).
 Ion hóa hóa học tại áp suất khí quyển (atmospheric pressure chemical
ionization – APCI).
 Ion hóa bằng photon tại áp suất khí quyển (Atmospheric Pressure
Photoionization – APPI).
Trong đó, hai kỹ thuật APCI và ESI, đặc biệt là ESI đƣợc sử dụng nhiều hơn
cả.
Cấu tạo của một khối phổ kế gồm có các bộ phận chính sau: Đầu vào, buồng

ion hóa, bộ phận phân tích khối, detector và máy tính ghi nhậ xử lý, lƣu trữ kết quả
và điều khiển hệ thống. Tùy theo từng kỹ thuật phối khổ mà cấu và nguyên lý hoạt
động của từng bộ phận có thể khác nhau.

Luận văn Thạc sỹ Hoàng Hà
17



Hình 5. Máy phổ khối lƣợng



Hình 6. Sơ đồ máy khối phổ
Luận văn Thạc sỹ Hoàng Hà
18

CHƢƠNG II. VẬT LIỆU - PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Vật liệu
- Thực vật: Giống cây Bá bệnh (mẫu hạt) lấy từ vƣờn Quốc gia Bái Tử Long, khu
Bảo tồn thiên nhiên Đồng Sơn - Kỳ Thƣợng, Hoành Bồ, Quảng Ninh.
- Chủng A. rhizogenes ATTC 15834 do Viện Dƣợc học và Sinh học phân tử, trƣờng
Đại học Heidelberg cung cấp
2.2. Dụng cụ - hóa chất
- Box cấy vô trùng, các loại thiết bị trong phòng nuôi cấy vô trùng ( giấy thấm, pank
dao kéo,ống ly tâm, ống cooling ) tủ tối, tủ 37
0
C.
- Dụng cụ nghiên cứu và máy móc thiết bị của Phòng Công nghệ tế bào thực vật -
Viện Công nghệ sinh học

Thành phần các loại môi trƣờng cơ bản nuôi cấy tế bào thực vật nhƣ WPM
(Woody Plant Medium), MS (Murashige and Skoog); các chất điều tiết sinh trƣởng
(BAP, Kinetin, 2,4-D, ); kháng sinh (cefotaxime, kanamycin, vanco, ). Nƣớc cất,
javen, ethanol 70%. Ngoài ra còn có các hóa chất thông dụng khác (agar, gellam
gum ) của các hãng Sigma, Fermentas, Duchefa.
2.3. Phƣơng pháp nghiên cứu
2.3.1. Thu thập và định danh loài bằng chỉ thị phân tử
Thu thập ngoài thực địa:
Dựa vào những đặc điểm của Bá bệnh và vùng phân bố chúng tôi tiến hành
thu thập tại vƣờn quốc gia Bái Tử Long.
Phƣơng pháp xác định loài bằng chỉ thị DNA
Việc định loài giúp ta tránh việc sử dụng nhầm đối tƣợng nghiên cứu. Qui
trình xác định loài bằng chỉ thị phân tử gồm các bƣớc:
i) Tách chiết và tinh sạch DNA
Các mẫu lá bá bệnh sau khi thu thập sẽ đƣợc tiến hành tách chiết và tinh sạch
theo phƣơng pháp sử dụng CTAB (theo Dellaporta, 1989, có cải tiến). DNA sau khi
tách chiết và tinh sạch đƣợc điện di kiểm tra trên gel agarose 0,8%.
ii) Tinh sạch và giải trình tự sản phẩm PCR
Luận văn Thạc sỹ Hoàng Hà
19

Sau khi tách chiết DNA, chúng tôi tiến hành xác định nhiệt độ gắn mồi tối ƣu
của các cặp mồi sử dụng matK, rbcL (bảng 1). Hỗn hợp phản ứng PCR (tổng thể
tích 50 µl bao gồm: 4 µl DNA, 5 µl buffer Tag polymerase, 5 µl MgCl
2
, 25 mM,
5µl dNTP 2,5 mM, 2 µl mồi mỗi loại, 2 µl Tag polymerase 1 U, 25 µl H20). Phản
ứng PCR đƣợc thực hiện theo chu trình nhiệt: 94
o
C/ 3‟; 35x (94

o
C/30‟‟; 50-54
o
C;
72
o
C/50‟‟); 72
o
C/10‟. Sản phẩm PCR đƣợc tinh sạch sử dụng bộ kit AccuPrep Gel
Purification Kit theo hƣớng dẫn của nhà sản xuất.
Sản phẩm PCR đã tinh sạch đƣợc xác định trình tự bằng máy phân tích trình
tự tự động ABI PRISM 3100 Avant Genetic Analyzer theo nguyên lí của Sanger
với bộ kit BigDye Terminator v. 3.2 Cycle Sequencing (Macrogen Inc. Hàn Quốc).
Trình tự DNA đã giải đƣợc xử lý và phân tích bằng phần mềm BioEdit và DNAstar.

Đoạn
gen
nhân
bản
Trình tự mồi
Ký hiệu
mồi
Kích
thƣớc
đoạn
gen
Tm
rbcL

ATGTCACCACAAACAGAAAC

P2F
740 bp
54
TCGCATGTACCTGCAGTAGC
P2R
matK
ATCCATCTGGAAATCTTAGTTC
P5F
990 bp
55
CTTCCTCGTAAGAATTC
P5R

2.3.2. Phƣơng pháp khử trùng hạt và đƣa mẫu vào nuôi cấy in vitro
Bƣớc 1: Tách phần vỏ ngoài của hạt bá bệnh để dễ dàng tách phôi hạt trong
quá trình vào mẫu.
Bƣớc 2: Chuyển hạt đã tách vỏ vào trong bình pyrex (25 ml) đã khử trùng,
bổ sung nƣớc cất khoảng 300 ml/lần lắc đều trong khoảng thời gian 2-3 phút. Bƣớc
này đƣợc lặp lại 3 lần liên tiếp trong box cấy vô trùng,.
Bƣớc 3: Sử dụng ethanol 70% (Pha 70 ml ethanol 100% - cồn tuyệt đối +
30ml nƣớc cất khử trùng). Bổ sung ethanol 70% vào trong bình hạt đã lắc với nƣớc
cất trƣớc đó. Bổ sung 300 ml ethanol 70
o
và lắc nhẹ trong thời gian 2-3 phút. Đổ bỏ
ethanol 70% và lắc lại với nƣớc cất khử trùng 2-3 lần (mỗi lần từ 3-4 phút).