Phân lập và tuyển chọn một số chủng Lactobacillus có khả năng sinh axit Lactic cao từ các sản phẩm lên men tại khu vực thành phố Thái Nguyên

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

1

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC
*




NGUYỄN MẠNH TUẤN




PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN MỘT SỐ CHỦNG
LACTOBACILLUS CÓ KHẢ NĂNG SINH AXÍT LACTIC CAO
TỪ CÁC SẢN PHẨM LÊN MEN
TẠI KHU VỰC THÀNH PHỐ THÁI NGUYÊN



LUẬN VĂN THẠC SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

2
Thái Nguyên - 2012


MỞ ĐẦU
Trong những năm gần đây, với xu hướng đa dạng và sản xuất hàng hoá
ngành chăn nuôi trong phạm vi của cả nước nói chung đã có những bước phát triển
khá mạnh. Cho đến nay, các sản phẩm của ngành chăn nuôi không những đã đáp
ứng nguồn thực phẩm cho nhu cầu tiêu dùng trong nước mà còn xuất khẩu thu
ngoại tệ cho kinh tế quốc dân [56]. Tuy nhiên, cùng với sự phát triển chăn nuôi thì
dịch bệnh ở vật nuôi cũng phát sinh và phát triển, đặc biệt là bệnh đường ruột làm
tăng tỷ lệ chết, giảm năng suất và là nguồn nhiễm tiềm tàng cho các sản phẩm, gây
ngộ độc thực phẩm cho người tiêu dùng.
Với phát hiện khoa học về hoạt chất có khả năng kháng khuẩn của Alex
Fleming (1929) [57] việc sử dụng kháng sinh trong chăn nuôi đã mở ra một kỷ
nguyên mới trong điều trị các bệnh truyền nhiễm và nhanh chóng đã được áp
dụng ở thế giới. Ngoài ra, kháng sinh còn được bổ sung vào thức ăn chăn nuôi từ
những năm 1950 của thế kỷ 20 [56]. Tuy nhiên, việc lạm dụng thuốc kháng sinh
trong điều trị bệnh cho vật nuôi đã nảy sinh ra tính kháng thuốc của các vi sinh
vật gây bệnh và tồn dư lượng thuốc kháng sinh trong thực phẩm, gây ảnh
hưởng đến sức khỏe con người. Chính vì vậy, nên nhu cầu tìm ra các giải pháp
nhằm hạn chế tồn dư kháng sinh trong sản phẩm động vật để bảo vệ vật nuôi là
vấn đề ngày càng trở nên cấp bách [37].
Trong tự nhiên quá trình cạnh tranh sinh học xảy ra thường xuyên giữa các
loài sinh vật với nhau dẫn tới các sinh vật yếu hơn bị giảm số lượng hoặc là sẽ bị
tiêu diệt trong khu vực cư trú [20], [45]. Probiotic là chế phẩm sinh học chứa các vi

khuẩn sống, có tác động làm cân bằng hệ vi sinh vật trong đường ruột, từ đó ảnh
hưởng tốt cho động vật. Cách thức hoạt động của probiotic là cạnh tranh, qua đó tạo
nên hàng rào vật lý bảo vệ sự tấn công của các vi sinh vật gây bệnh. Ngoài ra,
chúng cũng sinh ra các hoạt chất kháng khuẩn và men kích thích hệ thống miễn dịch
của vật nuôi [29].

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

3
Lactobacillus là nhóm vi khuẩn được sử dụng rộng rãi nhất trong chế tạo
probiotics. Các chủng Lactobacillus được tìm thấy và phân lập nhiều ở trong đường
tiêu hóa của động vật, trong các phế phụ công nghiệp sản xuất bia, rượu, đường và
sản phẩm lên men, Các sản phẩm này có chứa hàm lượng axít lactic rất cao là
tiềm năng để sản xuất probiotics [42].
Các sản phẩm probiotic dùng trong chăn nuôi ở nước ta hiện nay còn hạn
chế, do vậy ngành chăn nuôi đang sử dụng phần lớn các sản phẩm probiotic nhập
khẩu. Tuy nhiên, tác dụng tích cực cho vật nuôi chưa được khẳng định rõ ràng. Các
nhà khoa học cho rằng có thể là các vi sinh vật không phù hợp với hệ vi sinh vật
đường ruột của vật chủ bản địa. Mặt khác, các nghiên cứu chế tạo probiotics dùng
trong chăn nuôi ở nước ta còn rất hạn chế.
Xuất phát từ thực tế trên, chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài “Phân lập,
tuyển chọn một số chủng Lactobacillus có khả năng sinh axít lactic cao từ các
sản phẩm lên men tại khu vực thành phố Thái Nguyên” với mục tiêu tuyển chọn
được một số chủng Lactobacillus có khả năng sinh axít lactic cao, chống chịu tốt
trong các điều kiện in vitro làm cơ sở cho việc chế tạo probiotic dùng trong chăn nuôi.
Nội dung nghiên cứu:
- Phân lập các chủng Lactobacillus
- Định lượng axít lactic sinh ra của các chủng Lactobacillus phân lập được
- Đánh giá một số đặc tính probiotic của các chủng Lactobacillus phân lập được
trong điều kiện in vitro.

- Phân loại một số chủng Lactobacillus phân lập được.
Ý nghĩa khoa học của đề tài:
Kết quả nghiên cứu của đề tài sẽ là cơ sở cho việc lựa chọn một số chủng vi
khuẩn lactic phân lập được có hoạt tính sinh học cao để tạo chế phẩm sinh học.

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

4
CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1. Đặc điểm hình thái, sinh lý, sinh hóa của vi khuẩn lactic
1.1.1. Đặc điểm hình thái
Vi khuẩn lactic được xếp chung vào họ Lactobacillaceae, thuộc bộ
Eubacteriales. Nhóm này không đồng nhất về mặt hình thái, song về mặt sinh lý
chúng tương đối đồng nhất. Tất cả đều có đặc điểm chung là những vi khuẩn Gram
dương, không sinh bào tử, không di động. Chúng thu nhận năng lượng nhờ chuyển
hóa hydrat cacbon và sinh ra axít lactic. Khác với một số vi khuẩn khác như vi
khuẩn đường ruột cũng sinh ra axít lactic, tất cả các vi khuẩn lactic đều là vi khuẩn
lên men bắt buộc, không chứa các cytocrom và enzyme catalaza, sinh trưởng tùy
tiện. Hình dạng tế bào của vi khuẩn lactic hình cầu hay hình que. Kích thước của
chúng thay đổi tùy từng loài khác nhau. Tất cả sự khác nhau về hình thái tế bào này
phụ thuộc vào môi trường, thời gian và sự có mặt của oxy cũng như các điều kiện
nuôi cấy khác [12].
1.1.2. Đặc điểm sinh lý, sinh hóa
1.1.2.1. Nhu cầu dinh dưỡng cacbon
Cacbon là thành tố chính trong hợp chất hữu cơ xây dựng lên cơ thể của mọi
loài sinh vật. Vì vậy sự chuyển hóa nguồn dinh dưỡng cacbon thành các chất cần
thiết cho tế bào vi sinh vật chiếm vị trí hàng đầu trong quá trình dinh dưỡng của tế
bào vi sinh vật.
Vi khuẩn lactic sử dụng được rất nhiều loại hydratcacbon, từ các hexose như

glucose, fructose, manose, galactose; các loại đường đôi như saccarose, lactose,
maltose cho đến các polysaccarit như tinh bột, dextrin.
Nguồn năng lượng quan trọng nhất cho vi khuẩn lactic là các monosaccarit và
disaccarit. Các nguồn cacbon này được dùng để cung cấp năng lượng, xây dựng cấu
trúc tế bào và sinh ra các axít hữu cơ như axít citric, malic, pyruvic, fumaric, axetic
Một số loài vi khuẩn lactic lên men dị hình phân lập từ các sản phẩm thực
phẩm có thể sử dụng các axít gluconic và galacturonic tạo thành CO
2
, axít axetic và

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

5
axít lactic như Lactobacterium lycopersici, Streptobacterium hassice fermentatae.
Trong quá trình lên men các cơ chất chứa cacbon, vi khuẩn lactic có thể sử dụng cả
các axít amin như axít glutamic, arginin, tirozin làm nguồn cung cấp năng lượng.
Khi đó tạo ra quá trình decacboxyl và tạo ra CO
2
. Các loại vi khuẩn khác nhau
đòi hỏi các nguồn cacbon khác nhau. Sự phát triển vi khuẩn lactic với mỗi loại
đường khác nhau sẽ tạo ra các tế bào có đặc điểm hình thái và sinh lý khác nhau
và vì vậy cũng sẽ có khả năng chống chịu khác nhau trước những áp lực của các
quá trình xử lý sau này. Khả năng sống sót của L. bulgaricus trong và sau sấy
đông khô phụ thuộc vào loại đường được bổ sung trong quá trình nuôi cấy và thu
hồi chế phẩm, nếu lên men từ manose thì tỉ lệ tế bào chết nhiều hơn hẳn so với
lên men từ fructose và lactose. Tuy nhiên, việc lựa chọn loại đường nào cũng cần
quan tâm đến vấn đề kinh tế nhằm giảm thiểu chi phí đầu vào [12].
1.1.2.2. Nhu cầu về dinh dưỡng nitơ
Nitơ cũng là một nguyên tố cần thiết cho sự sống tất cả các sinh vật. Những
vật chất cơ bản của tế bào như protein, axít nucleic… đều chứa nitơ, vì vậy nitơ

đóng vai trò hết sức quan trọng trong quá trình sinh trưởng và phát triển của vi
khuẩn. Vi khuẩn lactic đòi hỏi rất nhiểu axít amin khác nhau do đó chúng cần môi
trường có sẵn nguồn nitơ nhằm đảm bảo sự phát triển của mình. Axít amin có thể
được đồng hóa dưới dạng peptit nhờ vào tác dụng của enzyme protease ngoại bào
hay nội bào.
Mỗi loài vi khuẩn khác nhau lại có nhu cầu về nguồn nitơ khác nhau. Phần lớn vi
khuẩn lactic không thể sinh tổng hợp được các chất hữu cơ phức tạp có chứa nitơ nên
chúng đòi hỏi nguồn nitơ có sẵn trong môi trường. Chỉ có một số ít loài vi khuẩn lactic
có khả năng sinh tổng hợp các hợp chất hữu cơ có từ nguồn nitơ vô cơ như L. helveticus
chúng có thể bị kích thích bởi sự có mặt của muối amoni trong môi trường.
Để sinh trưởng và phát triển bình thường, ngoài nitơ dưới dạng hỗn hợp các
axít amin, vi khuẩn lactic còn cần những hợp chất hữu cơ chứa nitơ như các sản
phẩm thủy phân protein từ pepton, peptit, dịch nấm men thủy phân, dịch chiết thịt,
trypton… Đây cũng là nguồn nitơ thường xuyên được sử dụng để chuẩn bị môi
trường nuôi cấy. Tuy nhiên ở qui mô công nghiệp ta cần nghiên cứu những nguồn

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

6
nitơ thích hợp để sản xuất giúp giảm giá thành sản phẩm mà nâng cao hiệu quả sản
xuất. Trong đó nấm men thủy phân được sử dụng khá nhiều [12].
1.1.2.3. Nhu cầu về dinh dưỡng vitamin
Các vi khuẩn lactic, đặc biệt là giống Lactobacillus, rất cần vitamin cho sự
sinh trưởng. Axít nicotinic và axít pantotenic rất cần cho sự sinh trưởng của tất cả
các loài vi khuẩn lactic. Tuy nhiên vitamin bị ảnh hưởng bởi nhiều yếu tố như nhiệt
độ nuôi cấy, pH, lượng CO
2
ban đầu và thế oxy hóa khử của môi trường [12], [32].
1.1.2.4. Các chất hữu cơ khác cần thiết cho sự sinh trưởng của vi khuẩn lactic
Axít axetic và axít xitric ảnh hưởng đến tốc độ sinh trưởng của vi khuẩn

lactic được sử dụng rộng rãi làm thành phần môi trường để nuôi cấy, phân lập và
bảo quản các chủng vi khuẩn lactic.
Axetat có tác động quan trọng đến sự sinh trưởng của tế bào. Axetat được
dung làm chất đệm cho môi trường khi nuôi cấy nhiều loài vi khuẩn lactic. Một loại
axít hữu cơ quan trọng có ảnh hưởng lớn đến sự sinh trưởng của hầu hết các loài vi
khuẩn lactic là axít oleic, một dẫn xuất của axít oleic được sự dụng là Tween 80
trong thành phần môi trường phân lập và nuôi cấy vi khuẩn lactic. Một vài loài vi
khuẩn lactic (Lactobacillus acidophilus và Lactobacillus bulgaricus) rất cần axít
béo không no cho sự phát triển [12], [50].
1.1.2.5. Nhu cầu về các muối khoáng
Để đảm bảo cho sự sinh trưởng vi khuẩn lactic rất cần các hợp chất vô cơ đa
lượng và vi lượng như đồng, sắt, natri, kali, photpho, lưu huỳnh, mangan và magiê. Đặc
biệt là mangan có tác dụng ngăn cản quá trình tự phân hủy của tế bào và rất cần thiết cho
quá trình sống bình thường của vi khuẩn này. Đối với Lactobacillus thì mangan, magiê
và sắt có tác động tích cực lên sự sinh trưởng của vi khuẩn lactic [12], [45].
1.1.3. Đặc điểm phân loại của vi khuẩn lactic
Theo khóa phân loại vi khuẩn của Bergey’s [21] Lactobacillus được phân
loại như sau:
Ngành: Firmicutes
Lớp: Bacilli

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

7
Bộ: Eubacteriales
Họ: Lactobacillaceae
Giống: Lactobacillus
Lactobacillus thuộc nhóm các vi khuẩn lactic. Vi khuẩn lactic gồm một số
giống trong ngành Firmicutes, chúng có chung đặc tính là các vi khuẩn Gram
dương và lên men carbohydrate thành năng lượng và axít lactic.

Giống Lactobacillus rất đa dạng. Sự đa dạng của chúng có thể được đánh giá
bằng hàm lượng G+C trong ADN của các loài, thường chiếm 32-53 mol% Điểm
đặc trưng phổ biến nhằm phân biệt chúng với phần lớn các giống khác là dạng hình
que và khả năng tạo ra axít lactic như một sản phẩm cuối cùng chủ yếu. Bên cạnh
đó, Lactobacillus còn là vi khuẩn Gram dương, không hình thành bào tử và hiếm
khi di động. Người ta thấy rằng tế bào Lactobacillus điển hình có dạng hình que,
với kích thước biến đổi trong khoảng (0,5-1,2)×(1-10) m, đôi khi trông chúng có
thể gần giống như hình cầu (coccoid) trong điều kiện nào đó và thường hình thành
dạng chuỗi hoặc tồn tại đơn độc Khuẩn lạc của vi khuẩn Lactobacillus trên môi
trường agar có kích thước 2-5mm, dạng lồi, mờ đục và không nhuộm màu. Những
tế bào này đòi hỏi môi trường nuôi cấy phức tạp, có khả năng lên men và phân hủy
saccharose. Ít nhất một nửa sản phẩm lên men từ nguồn cacbon là lactose [25].
Về nhu cầu ôxy, chúng là những vi khuẩn kỵ khí tùy tiện, nhưng phát triển
tốt hơn trong điều kiện không có ôxy. Nhìn chung, các loài trong giống này sẽ phát
triển tốt hơn trong điều kiện có 5% CO
2
[22]

Về nhu cầu dinh dưỡng, Lactobacillus cần chế độ dinh dưỡng đặc biệt.
Chúng phát triển tốt trong môi trường nhiều phức chất. Nhiệt độ phát triển tối ưu
của chúng là 30-40
0
C, nhưng cũng có thể sinh trưởng trong phạm vi từ 5-53
0
C.
Chúng có khả năng chịu đựng được môi trường có tính axít, pH tối ưu cho sự phát
triển là 5,5-5,8 nhưng nhìn chung có thể sinh trưởng ở pH 5 [12]

1.1.4. Một số yếu tố ảnh hưởng đến quá trình trao đổi chất của vi khuẩn lactic
1.1.4.1 Ảnh hưởng của oxy

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

8
Vi khuẩn lactic là nhóm vi khuẩn hô hấp tùy tiện, không có hệ enzyme hô
hấp xitocrom cũng như hệ catalaza. Tuy vậy, chúng có khả năng oxy hóa rất nhiều
hệ FAD (Flavin Adenin Dinuclecotit).
Các nghiên cứu cho thấy, một số chất trong môi trường chỉ có thể được sử
dụng khi có mặt oxy. Chẳng hạn Pediococcus sp. và L. plantarum có thể đồng hóa
được glyxerin trong điều kiện hiếu khí. Một số loài Leuconostoc có thể cần sự có
mặt của oxy trong giai đoạn đầu để đồng hóa hexoase. L. brevis và L. buchneri
phát triển tốt ở 30
o
C trong điều kiện yếm khí, trong khi ở 37
o
C chủng chỉ phát
triển trong điều kiện hiếu khí hoặc kị khí tùy tiện. Hiện tượng tương tự cũng gặp
ở một số chủng thuộc loài S. pyogenes. Các nghiên cứu cho thấy, hệ enzyme
peroxylase có trong vi khẩn lactic có thể thực hiện các chức năng thay cho hệ
enzyme dehydrogenase, khi đó oxy được sử dụng như là chất nhận hydro. Quá
trình oxy hóa ở vi khuẩn lactic thường kèm tlợn việc tạo thành H
2
O
2
. Đồng thời
một số vi khuẩn lactic (S. brevis, L. mesenteroides) có thể khử được H
2
O
2
thành

nước cùng với sự tham gia cùng một số chất oxy hóa. Như vậy, vi khuẩn lactic
có hệ peroxydase sử dụng NADH
2
làm chất nhận điện tử và phân giải H
2
O
2
.
Phương trình phản ứng như sau:
NADH
2
+ H
+
+ H
2
O
2
→

NAD
+
+ 2H
2
O
Trong điều kiện hiếu khí, năng lượng sinh ra cũng lớn hơn rất nhiều so với
trong điều kiện yếm khí (hơn 20 lần khi cùng phân hủy 1 mol glucose). Quan hệ với
oxy giữa các loài vi khuẩn khác nhau có sự khác nhau. Trong điều kiện kị khí
nghiêm ngặt, các trực khuẩn lên men dị hình chậm sinh trưởng. Các vi khuẩn
lactic lên men dị hình khi lên men arabinoase đạt tối ưu trong điều kiện kị khí,
còn các loài khác không sử dụng được pentose lại sinh trưởng rất kém trong điều

kiện này. Trong quá trình lên men lactic, lượng oxy vượt quá giới hạn sẽ làm bất
hoạt lactate dehydrogenazase, do vậy quá trình tạo thành axít lactic không xảy
ra. Trong quá trình lên men bảo quản các loại thực phẩm tươi sống (tôm, cá,
thịt,…), các vi khuẩn yếm khí lên men lactic đồng hình thường được sử dụng,

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

9
nhất là trong bảo quản bằng bao gói chân không. Hình thức bảo quản này, một
mặt tránh sự oxy hóa các sản phẩm, mặt khác tránh sự sinh trưởng của các vi
sinh vật hiếu khí gây hỏng sản phẩm. Trường hợp này vi khuẩn lactic sẽ ức chế
tốt với vi khuẩn hiếu khí nhờ các sản phẩm trao đổi chất của nó [12], [18].
1.1.4.2 Ảnh hưởng của nhiệt độ
Bảng 1.1. Nhiệt độ thích hợp cho các giống vi khẩn lactic [12].
Nhóm vi
khuẩn lactic
Nhiệt độ sinh trƣởng (
0
C)
Giống
Bình thƣờng
Tối ƣu
Ưa lạnh
0 - 27
10 - 15
Enterococcus, Pediococcus,
Bifidobacterium
Ưa ấm
5 - 45
20 - 40

Leuconostoc, Vogococcus,
Lactococcus
Ưa nhiệt
20 - 60
40 - 45
Str Streptococcus
Nhiệt độ có ảnh hưởng rất lớn đến hoạt động của của vi khuẩn lactic.
Khoảng nhiệt độ sinh trưởng của vi khuẩn khá rộng, một số loài có thể sinh trưởng
ở 55
o
C trong khi một số khác có thể sinh trưởng được ở 5
0
C. Tuy nhiên đa số vi
khuẩn lactic sinh trưởng trong một khoảng nhiệt độ từ 15 – 40
0
C (Bảng 1.1).
1.1.4.3 Ảnh hưởng của pH
Hoạt động của vi khuẩn lactic, đặc biệt là của hệ enzyme của chúng, chịu tác
động mạnh của sự thay đổi pH môi trường. Mỗi enzyme đều có vùng pH tối ưu mà
tại đó hoạt tính sinh học cao nhất.
Bảng 1.2. Khoảng pH thích hợp của các chi vi khuẩn lactic [12].
Chi
pH tối thích
pH sau lên men
Lactobacillus
5,6 - 6,2
3,2 - 3,5
Lactococcus
5,6 - 6,5
4,0 - 4,5

Leuconostoc
5,6 - 6,5
5,0
Enterococcus
7,0
4,0 - 4,6
Pediococcus
5,6 - 6,5
3,2 - 3,5
Tuy nhiên, pH nội bào của các vi khuẩn lactic lại không tương ứng với pH
tối ưu của các enzyme nội bào của chính nó. Giá trị pH tối ưu cho sự sinh trưởng
của Lactobacillus, Pediococcus và Leuconostoc lần lượt là 5,6 - 6,2; 5,6 - 6,5 và 5,6

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

10
- 6,5. Giá trị pH thấp nhất mà mỗi giống vi khuẩn lactic có thể chịu được là khác
nhau. Chẳng hạn Lactobacillus chịu được pH = 3,2 - 3,5, Pediococcus chịu được
pH = 3,2 - 3,5 trong khi đó, Leuconostoc chịu được pH = 5,0 (Bảng 1.2). Trong quá
trình lên men lactic, axít lactic sinh ra đầu tiên có tác dụng ức chế các hoạt động của
vi sinh vật khác. Sau đó, khi lượng axít tích lũy đủ lớn thì chính vi khuẩn lactic
cũng bị ức chế, sự axít hóa tế bào chất gây ra do sự tích lũy nội bào axít lactic [12].
1.1.4.4 Ảnh hưởng của nồng độ NaCl
Nồng độ NaCl ảnh hưởng đến màng tế bào chất của vi khuẩn. Với nồng độ
NaCl lớn hơn hoặc bằng 5%, sự sinh trưởng của phần lớn các chủng vi khuẩn lactic
bị ức chế. Nồng độ muối cao làm chênh lệch giữa áp suất thẩm thấu nội bào và
ngoại bào của vi khuẩn lactic tăng, đồng thời ức chế hoạt tính enzyme của tế bào.
Các vi khuẩn Gram âm dễ mẫn cảm với NaCl hơn vi khuẩn Gram dương, nguyên
nhân là do các enzyme của vi khẩn bị ức chế bởi ion Cl
-

. Một số chủng P.
pentosaceus sinh trưởng ở nồng độ NaCl 9-10% [12], [45].
1.1.4.5 Ảnh hưởng của nồng độ glucose
Đường là nguồn cacbon chủ yếu cho vi khuẩn lactic sinh tổng hợp axít lactic.
Nồng độ đường trong môi trường càng cao thì lượng axít sinh ra càng nhiều. Tuy
nhiên, nồng độ đường quá cao làm cho áp suất thẩm thấu môi trường cao gây ra
hiện tượng co nguyên sinh ảnh hưởng đến sự sinh trưởng tế bào vi khuẩn lactic do
đó giảm axít lactic tạo ra [12], [18].
1.1.5 Lên men lactic ở Lactobacillus
Lên men lactic là quá trình chuyển hóa đường thành axít lactic nhờ vi sinh
vật, điển hình là vi khuẩn lactic. Lactobacillus có khả năng lên men nhiều loại
đường đơn và đường đôi nhưng không có khả năng lên men các loại glucid phức tạp
và tinh bột. Sự phát triển của chúng cần có sự có mặt của peptone, axít amin hay
muối amôn. Vi khuẩn Lactobacillus có yêu cầu đặc biệt về chất dinh dưỡng là giàu
vitamin, axít amin và khoáng chất. Quá trình lên men xảy ra tốt nhất trong môi
trường axít pH từ 5,5÷6, khi pH 5,5 quá trình lên men bị dừng lại. Nhiệt độ thích

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

11
hợp cho quá trình lên men từ 15÷50
0
C. Tuy nhiên, mỗi loài có khoảng nhiệt độ thích
hợp khác nhau, nếu nhiệt độ lớn hơn 80
0
C vi khuẩn lactic bị tiêu diệt hoàn toàn.
Quá trình lên men lactic diễn ra trong tế bào vi khuẩn. Đầu tiên, đường sẽ
được vi khuẩn lactic đưa vào bên trong tế bào nhờ cơ chế vận chuyển đặc trưng của
màng tế bào. Nếu phân tử đường là đường đơn như glucose thì sẽ vào thẳng chu
trình chuyển hóa, còn nếu phân tử đường là đường đôi hay các dạng đường khác thì

sẽ bị thủy phân thành các monosaccharide rồi mới vào chu trình chuyển hóa. Sau đó
phân tử đường này sẽ đi vào các chu trình chuyển hóa khác nhau và cuối cùng cho
sản phẩm là axít lactic, axít axetic, CO
2
…
Dựa vào sản phẩm tạo thành của quá trình lên men mà người ta chia chúng ra
làm hai nhóm là vi khuẩn lactic lên men đồng hình hay vi khuẩn lactic lên men dị
hình [5], [18].
1.1.6 Sự phân bố vi khuẩn Lactobacillus trong tự nhiên
Lactobacillus phân bố tương đối rộng rãi trong tự nhiên đặc biệt là trong các
sản phẩm lên men, chúng giữ vai trò quan trọng trong công nghiệp thực phẩm: các
sản phẩm chế biến từ sữa và rượu bia. Người ta có thể tìm thấy Lactobacillus ở cả
động vật và thực vật. Ở người, Lactobacillus thường tìm thấy ở ruột và âm đạo [12].

1.2. Một số đặc tính probiotic của Lactobacillus
1.2.1. Khả năng ức chế các vi khuẩn gây bệnh
Lactobacillus có khả năng sinh ra các chất ức chế với cả vi khuẩn Gram
dương, Gram âm, kể cả nấm và có khả năng sinh ra các chất kháng khuẩn bao gồm
các axít hữu cơ, hydrogen peroxit, cacbondioxit, và diaxetyl cũng như bacteriocin và
các hợp chất giống bacteriocin [34], [40].
Axít hữu cơ có tác dụng ức chế sự phát triển của vi khuẩn gây bệnh, được
sản sinh bởi vi khuẩn lactic như acetic, lactic, axít probionic. Một vài vi khuẩn
chi Lactobacillus có khả năng ngăn chặn sự phát triển của E. coli, M. luteus,
Salmonella typhi và Shigella flexneri bằng cách sinh ra ra axít lactic [8]. Cả axít
lactic và axít axetic đều có khả năng hạn chế sự phát triển của các vi sinh vật
khác bởi chúng làm giảm pH bên trong đường ruột và chính điều này đã ảnh
hưởng đến quá trình trao đổi chất của các vi sinh vật khác [40].

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

12
Ngoài ra, Lactobacillus còn có khả năng sinh ra bacteriocin, một loại protein
có khả năng tiêu diệt các vi khuẩn khác do sự tạo thành các kênh làm thay đổi tính
thấm của màng tế bào, nhiều loại bacteriocin còn có khả năng phân giải ADN, ARN
và tấn công vào peptidoglycan để làm suy yếu thành tế bào. Bacteriocin sẽ tấn công
các vi khuẩn gây bệnh và ức chế sự phát triển của chúng, trong đó có các vi khuẩn
gây bệnh như: E.coli, Samonella, Vibrio, Campylobacter, Shigella, Clostridium, Candida
albicans, và một số virus khác [40].
1.2.2. Khả năng chịu mặn
Khả năng chịu mặn của Lactobacillus có vai trò quan trọng vì đây là yếu tố
đầu tiên quyết định sự tồn tại của probiotic trong môi trường nước biển. Khả năng
chịu mặn là đặc tính quý khi sử dụng các chủng này chế tạo chế phẩm sử dụng cho
nuôi trồng thủy sản ở các vùng khác nhau. Một số chủng Lactobacillus đã được
biết với khả năng chịu độ mặn cao, cao hơn rất nhiều so với độ mặn trung bình từ
3,1‰ tới 3,8‰ của nước biển như L. amylovorus DCE 471 có thể tồn tại và sinh ra
bacteriocin trong môi trường 3 % (w/v) NaCl [41].
1.2.3. Khả năng tồn tại trong đường tiêu hóa
Trong các điều kiện in vitro, nhiều chủng Lactobacillus đã được tuyển chọn với
khả năng tồn tại ở trong điều kiện bất lợi của đường ruột động vật thủy sản như môi
trường axít HCl ở dạ dày, môi trường kiềm của ruột, lyzozyme, dịch tụy, dịch mật [50].
Khả năng tồn tại trong các điều kiện khắc nghiệt của đường tiêu hóa giúp
cho các vi sinh vật probiotic có thể cạnh tranh được vị trí bám dính và các nguồn
dinh dưỡng, năng lượng với các vi khuẩn gây hại. Một số chủng Lactobacillus có
khả năng tồn tại tốt trong đường tiêu hóa đã được phân lập như: L. curvatus, L.
reuteri, L. plantarum, L. parapentarum, L. pentosus, L. keferi, L. fermentum, L.
animalis, L. mucosae, L. Aviaries, L. hilgardii, và L. Panis [50], [54].
1.3. Probiotic
1.3.1. Định nghĩa probiotic
“ Probiotic là chất trợ sinh học gồm các vi sinh vật sống khi đưa vào đường
tiêu hóa với một lượng thích hợp sẽ có lợi cho sức khỏe” [28]. Trái với kháng sinh,

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

13
“Probiotic” là các chất do vi khuẩn tiết ra có tác dụng kích thích sự phát triển các vi
khuẩn có lợi khác (Kollath, 1953, là người đầu tiên đưa ra từ này).
Probiotic là thuật ngữ có nguồn gốc từ Hy Lạp bao gồm có hai từ: “pro” có ý
nghĩa là vì, “biosis” có nghĩa là sự sống. Probiotic được định nghĩa lần đầu tiên bởi
Parker (1974) “là những sinh vật và các chất giúp cân bằng hệ sinh vật đường ruột”.
Năm 1989, Fuller [29] đã định nghĩa lại probiotic: “là những vi sinh vật sống khi bổ
sung vào thức ăn, chúng có tác động tốt đến sức khoẻ của động vật chủ bằng cách
tạo cân bằng hệ sinh vật đường ruột”. Bifidobacteria và Lactobacilli là những chi
được sử dụng rộng rãi nhất trong sản xuất probiotic. Nấm men (Saccharomyces
cerevisiae), một vài chủng Bacilllus spp. cũng đã được sử dụng như một probiotic.
Đến năm 1992, probiotic được Havenaar và Huis Int Veld định nghĩa là: “Probiotic
là một hoặc sự kết hợp của các vi sinh vật sống, ảnh hưởng có lợi đến vật chủ, hoàn
thiện hệ vi sinh vật đường ruột”. Nhóm các nhà khoa học làm việc tại Châu Âu
thuộc Viện Khoa học quốc tế năm 1998 đã định nghĩa probiotic là vi sinh vật sống
bổ sung vào thức ăn tác động có lợi đến vật chủ”. Theo Tổ chức Thực phẩm, Nông
nghiệp và Sức khỏe thế giới cho rằng “probiotic là những vi sinh vật sống khi sử
dụng một lượng đầy đủ sẽ mang lại sức khỏe tốt cho vật chủ” [39].
1.3.2. Lịch sử nghiên cứu probiotic
Những nghiên cứu về probiotic mới chỉ bắt đầu vào thế kỷ 20, Henry
Tisser một bác sỹ người Pháp năm 1900 đã quan sát và thấy phân của những trẻ
em mắc bệnh tiêu chảy có ít vi khuẩn lạ hình trứng hoặc hình chữ Y hơn những
đứa trẻ khỏe mạnh [30].
Sau đó, đến năm 1907, Elie Metchnikoff – người Nga, đạt giải Nobel – đã
chứng minh rằng việc tiêu thụ Lactobacillus sẽ hạn chế các nội độc tố của hệ vi sinh
vật đường ruột. Ông giải thích được điều bí ẩn về sức khỏe của những người Cô-đắc
ở Bulgary, họ sống rất khỏe mạnh và có thể sống tới 115 tuổi hoặc hơn. Nguyên

nhân có thể do họ tiêu thụ rất lớn các sản phẩm sữa lên men, điều này đã được Ông
mô tả trong sách “Kéo dài cuộc sống” [30].
Có thể nói Tisser và Metchnikoff là người đầu tiên đưa ra những đề xuất mang
tính khoa học về probiotic, làm cơ sở cho những nghiên cứu tiếp theo về probiotic [29].
Năm 1930, nhà khoa học người Nhật Minoru Shirota đã phân lập được các
vi khuẩn lactic từ phân của các em thiếu nhi khỏe mạnh. Cùng năm đó, các nhà

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

14
nghiên cứu Hoa Kỳ đã chứng minh là Lactobacillus acidophilus có khả năng làm
giảm bệnh táo bón thường xuyên. Nhiều nhà khoa học của đại học Havard phát
hiện ra các vi khuẩn đường ruột đóng một vai trò quyết định trong quá trình tiêu
hóa, giúp tiêu hóa thức ăn, cung cấp một số vitamin và các chất dinh dưỡng khác
nhau mà cơ thể vật chủ không tự sinh ra được. Sau đó 5 năm, một trong các đồ
uống lên men – đặt tên là “Yakult” từ sữa được cho là có khả năng hỗ trợ sức
khỏe đường ruột (intestinal health) được sản xuất. Khái niệm chung probiotic
được chấp nhận ở Châu Á trong nhiều năm khi các sản phẩm lên men từ sữa
probiotic đầu tiên được giới thiệu ở Châu Âu những năm của thập niên 80 [29].
Ngày nay, các sản phẩm probiotic có chứa Bifidobacteria hoặc Lactobacillus
đã được tiêu thụ rộng rãi và phổ biến khắp nơi trên thế giới như những nguồn thực
phẩm chính giúp tăng cường sức khỏe cho con người cũng như vật nuôi.
1.3.3. Vai trò của probiotic
Cho đến nay, vẫn còn có ít tài liệu chứng minh được việc bổ sung probiotic
có thể thay thế hoàn toàn quần thể vi sinh vật tự nhiên trong đường ruột. Tuy nhiên,
người ta hy vọng rằng probiotic có thể hình thành những tập đoàn vi khuẩn có lợi,
có thể hỗ trợ cho cơ thể động vật mà vẫn duy trì được những chức năng như những
VSV đường ruột tự nhiên (trong trường hợp tập đoàn vi sinh vật tự nhiên này bị suy
yếu và phải sau một thời gian mới hồi phục được). Từ đó, probiotic được xem như
là yếu tố điều hoà cho hệ sinh thái nội quan. Một vài tác dụng có lợi của probiotic

được liệt kê dưới đây:
- Điều hoà trường hợp không dung nạp lactose: có những cá thể không dung
nạp được lactose, nhưng nhờ chủng vi khuẩn tích cực có trong probiotic giúp cơ thể
chịu đựng được lactose tốt hơn.
- Đề phòng được ung thư kết tràng: một số chủng vi khuẩn lactic có tác dụng
kháng chất gây đột biến, có khả năng đính vào các amin khác vòng và các chất gây
ung thư, thấy rõ ở loài gặm nhấm. Đối với người, có những chủng có tác dụng kháng
ung thư do giảm hoạt tính enzyme β-glucuronidase (enzyme xúc tác hình thành chất
gây ung thư đường ruột).
- Làm giảm cholesterol: nhiều chủng lactic làm giảm cholesterol huyết thanh ở
động vật bằng cách phân ly mật trong ruột, nhờ đó ức chế quá trình tái hấp thu mật
(mật vào trong máu có vai trò như cholesterol).

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

15
- Cải thiện chức phận miễn dịch và phòng ngừa nhiễm trùng: các vi khuẩn
lactic có thể ngăn ngừa những mầm bệnh bằng sự ức chế cạnh tranh (cạnh tranh
sinh trưởng).
- Giảm viêm: probiotic có các vi khuẩn lactic điều hoà được quá trình
viêm và những đáp ứng quá mẫn nhờ điều hoà chức năng cytokin, ngăn ngừa
tái phát viêm ruột.
- Cải thiện hấp thu khoáng: vi khuẩn lactic trong probiotic có thể vô hiệu hoá
chứng suy hấp thu các khoáng vi lượng.
- Vi khuẩn trong probiotic có tác dụng ngăn ngừa sự phát triển vi khuẩn gây
bệnh viêm ruột (đặc biệt đối với bệnh viêm ruột hoại tử ở gà) [1], [44].
1.3.4. Cơ chế tác động của probiotic
Đã có nhiều nghiên cứu giải thích cơ chế tác động của probiotic, song vẫn còn
có nhiều ý kiến khác nhau. Sau đây là tóm tắt những kiểu tác động của probiotic được
nhiều nhà khoa học chấp nhận [7], [14].

1.3.4.1. Probiotic sản sinh các chất ức chế
Sự có mặt của các vi khuẩn sản sinh các chất ức chế trong ruột của vật chủ,
trên bề mặt hoặc trong môi trường nuôi đã tạo ra một rào ngăn chặn sự sinh sôi của
các tác nhân gây bệnh cơ hội. Các chất diệt khuẩn hay ức chế hoạt động của vi khuẩn
gây bệnh do vi khuẩn probiotic sinh ra có thể tác động đơn độc hoặc phối hợp với
nhau bao gồm: các chất kháng sinh, bacteriocin, siderophores, lysozyme, protease,
hydro peroxit và các axít hữu cơ (làm biến đổi độ pH). Ngoài ra, gần đây amoni và
diaxetyl cũng được đưa thêm vào danh sách này. Các nhà vi sinh học đã cho biết:
Lactobacillus spp. có thể sản sinh bacterocin là chất ức chế sinh trưởng của các vi
khuẩn khác (chủ yếu là vi khuẩn Gram dương). Các vi khuẩn biển sản sinh enzyme
phân giải vi khuẩn chống lại Vibrio parahaemolyticus. Alteromonas sp. dòng B-10-
31 phân lập từ nước biển gần bờ biển của Nhật Bản sản sinh monastatin có tác dụng
ức chế hoạt tính protease của Aermonas hydrophila và V. anguillarum [7], [14].
1.3.4.2. Cạnh tranh hóa chất/năng lượng với những vi khuẩn khác
Tất cả các vi khuẩn đều cần sắt để tăng trưởng. Siderophore là chất có
khối lượng phân tử thấp, có khả năng gắn với các ion sắt. Siderophore có thể hòa
tan sắt kết tủa thành dạng dễ sử dụng cho vi sinh vật, do đó nó là một công cụ

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

16
chuyển hóa sắt rất quan trọng đối với các vi sinh vật. Các vi sinh vật vô hại sinh
siderophore có thể được sử dụng như probiotic để cạnh tranh sắt với các vi
khuẩn gây hại. Bản thân vi khuẩn có hại bị loại bỏ thì cũng có nghĩa là loại bỏ
được đối thủ cạnh tranh các chất dinh dưỡng và năng lượng dùng cho vi khuẩn
probiotic và cho vật chủ. Sử dụng Pseudomonas fluorescens như probiotic trong
nuôi cá hồi nước ngọt và cá hồi đại dương có tác dụng hạn chế A. salmonicida
theo cơ chế này [7], [14].
1.3.4.3. Cạnh tranh vị trí bám dính với vi khuẩn có hại
Vi khuẩn probiotic có thể ngăn cản sự khu trú của các vi khuẩn gây bệnh

bằng cạnh tranh giành vị trí bám trên niêm mạc ruột hay trên bề mặt các mô
khác. Vi khuẩn bám dính trên niêm mạc ruột nhờ cơ chế đặc trưng (dựa vào
fimbritae bám dính của vi khuẩn và các phân tử thụ thể của thượng bì ruột) và cơ
chế không đặc trưng dựa vào những yếu tố hóa lý học. Người ta đã chứng minh
được khả năng bám dính và phát triển trên bề mặt hoặc bên trong ruột hoặc niêm
mạc ngoài của chủng Carnobacterium K
1
làm cho chủng này cạnh tranh vượt
trội và ngăn cản được sự lan rộng của các vi khuẩn gây bệnh ở cá như V.
anguillarum và A. hydrophila [7], [14].
1.3.4.4. Tăng cường đáp ứng miễn dịch
Kháng nguyên của probiotic kích thích tế bào niêm mạc ruột sản sinh kháng
thể chống lại tác nhân gây bệnh. Chất ức chế của probiotic tiếp tục nâng cao hiệu quả
kháng thể của vật chủ. Trong thực nghiệm, người ta thấy động vật thí nghiệm được
bổ sung vi khuẩn lactic đã tăng khả năng chống lại bệnh truyền nhiễm đường ruột khá
rõ rệt. Tôm không có khả năng tạo kháng thể vì không có đáp ứng miễn dịch thể dịch.
Probiotic có tác dụng tăng cường đáp ứng miễn dịch tự nhiên [7], [14].
1.3.5. Các tiêu chuẩn chọn vi khuẩn probiotic
Việc lựa chọn các chủng vi sinh vật sử dụng chế tạo probiotic tiêu chuẩn
đầu tiên là phải an toàn cho quá trình sản xuất và ứng dụng, có khả năng tồn tại
và chiếm lĩnh (colonization) trong đường tiêu hóa vật chủ. Các tiêu chuẩn lựa

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

17
chọn này được hợp lý hóa thông qua các thí nghiệm in vitro qua đó người ta sẽ
tuyển chọn được các chủng có tiềm năng như là nguồn probiotic [7], [30].
Các chủng vi sinh vật probiotic được lựa chọn theo các tiêu chuẩn chủ yếu sau:
- Hoạt tính kháng khuẩn chống lại các vi khuẩn gây bệnh: Lựa chọn được
các chủng có khả năng sản sinh các chất kháng khuẩn là đặc tính quan trọng nhất

trong phát triển probiotic. Các chủng probiotic cần có hoạt tính ức chế vi khuẩn
gây bệnh như E. coli, Salmonella và Campylobacteria. Hoạt tính kháng khuẩn
của chúng có thể theo nhiều cơ chế khác nhau như:
+ Sản sinh ra các chất bacteriocin.
+ Làm giảm độ pH bởi tạo ra axít lactic.
+ Tạo ra H
2
O
2
.
+ Làm giảm độc tố theo các cơ chế khác nhau.
+ Khả năng làm giảm sự bám dính của các vi khuẩn gây bệnh trên bề mặt.
+ Cạnh tranh dinh dưỡng với các vi khuẩn gây bệnh.
- Khả năng tồn tại trong môi trường axít dạ dày: Khoang miệng và dạ dày
của vật chủ là nơi có môi trường axít pH từ 2-3 và có mặt các enzyme tiêu hóa
(amylase, protease, lysozyme…). Các chủng vi sinh vật được coi là nguồn probiotic
phải tồn tại được trong điều kiện này. Hiện nay, các công ty đã khuyến cáo dùng vỏ
bọc (microcapsule) với chế phẩm probiotic nhằm tăng khả năng sống của vi khuẩn
probiotic khi đi qua khoang miệng và dạ dày.
- Khả năng chịu muối mật: thông thường, muối mật trong ruột của động vật
trung bình là 0,3% [35]. Để tồn tại và phát triển, các chủng probiotic phải có khả
năng tồn tại và phát triển với nồng độ muối mật trung bình khoảng 0,3%, ngoài ra
một số chủng probiotic (Nấm men, Bacillus và Lactobacillus) có khả năng sinh
enzyme tiêu hóa như: amylase, xenlulase và protease, lipase và phytase có vai trò
làm tăng khả năng tiêu hóa thức ăn và hấp thu chất dinh dưỡng của vật chủ.
1.3.6. Các vi sinh vật probiotic
Vi khuẩn lactic: gồm 2 chi vi khuẩn chủ yếu là Lactobacillus và
Bifidobacterium.

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

18
Các loài thuộc chi Lactobacillus: L. acidophilus, L. amylovorus, L. brevis, L.
casei, L. rhamnosus, L. caucasicus, L. crispatus, L. delbrueckii, L. bulgaricus, L.
fermentum, L. gasseri, L. helveticus, L. johnsonii, L. lactis, L. leichmannii, L.
paracasei, L. plantarum, L. reuteri, L. rhamnosu.
Các loài thuộc chi Bifidobacterium: B. adolescentis, B. bifidum, B. breve, B.
infantis, B. lactis (B. animalis), B. licheniformis, B. longum.
Một số vi sinh vật probiotic khác không phải vi khuẩn lactic Lactobacillus
và Bifidobacterium: Bacillus subtilis, Enterococcus faecium, Saccharomyces
boulardii, Saccharomyces cerevisiae [14].
1.3.7. Tính an toàn của probiotic trên động vật
Việc nghiên cứu, phát triển chế phẩm probiotic và sử dụng trong chăn nuôi bắt
đầu từ khâu nghiên cứu sản xuất và tiêu thụ, sử dụng trên đàn gia súc, gia cầm. Các
chủng vi sinh vật đã qua nhiều khâu tiếp xúc với con người, môi trường trước khi
vào cơ thể động vật. Điều này cho thấy yêu cầu an toàn đối với chủng vi sinh vật là
vấn đề quan trọng nhất đối với vật nuôi, con người và môi trường.
Đối với động vật cần có thời gian thử nghiệm từ 1-3 tháng, kiểm tra các chỉ
tiêu tăng trọng, phản ứng cơ thể, theo dõi các bệnh tiêu hóa, bệnh nhiễm khuẩn và
các phản ứng phụ. Ngoài ra, cần có những thông số phân tích sinh hóa về máu và
đánh giá chỉ số Coliform trong phân [19].
Đối với con người, cần thiết phải thử nghiệm như trên động vật nhưng cần chú
ý các phản ứng phụ như dị ứng với da, mũi, mắt [19], [34]. Với môi trường cần đảm
bảo là vi sinh vật không có hại đối với con người và động vật, không mang gen lạ.
Nói chung các chủng vi sinh vật probiotic có nguồn gốc tự nhiên (từ hệ vi sinh vật
đường ruột vật nuôi) là các chủng được khuyến cáo sử dụng. Tổ chức FAO (2002)
[28] đưa ra hướng dẫn với việc tuyển chọn các chủng probiotic, ngoài các đặc tính
probiotic và đảm bảo an toàn thì các chủng này phải được cụ thể hóa các thông tin
về nguồn gốc chủng, tên phân loại đến chi và loài.

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

19
Đối với vấn đề an toàn probiotic, cộng đồng Châu Âu đã lập Ủy ban khoa học
về dinh dưỡng động vật đưa ra những quy định đánh giá an toàn đối với sản phẩm
và những khuyến cáo cho vấn đề này qua các điều luật và kỹ thuật trực tuyến [48].
Tổ chức FAO [28] khuyến cáo các chủng probiotic không những cần được phân
loại chính xác mà còn phải được cung cấp và lưu giữ tại các bảo tàng vi sinh vật đạt
tiêu chuẩn quốc tế. Quy trình sản xuất phải theo tiêu chuẩn GMP (Good
Manufacturing Practices).
1.4. Một số ứng dụng của vi khuẩn Lactobacillus
Vi khuẩn lactic được ứng dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực khác nhau như
công nghiệp, nông nghiệp, môi trường, y dược và nhiều nhất là trong chế biến bảo
quản thực phẩm [1], [30]
1.4.1. Trong công nghệ thực phẩm
Lactobacillus được tìm thấy trong một số sản phẩm thực phẩm (sữa lên
men, rau củ lên men, phomat ) với vai trò bảo quản, cung cấp chất dinh dưỡng
hoặc mùi vị cho sản phẩm. Trong các sản phẩm từ sữa, chúng có thể hoạt động
một mình hoặc kết hợp với các vi khuẩn lactic khác. Sữa acidophilus là một ví
dụ điển hình về các sản phẩm lên men từ sữa này với sự tham gia của L.
acidophilus. Ngoài ra, sự kết hợp L. bulgaricus với Streptococcus thermophilus
có thể tạo nên sản phẩm sữa chua [1].
Rau củ lên men là một món ăn phổ biến của nhiều nước trên thế giới như:
dưa cải chua, dưa cải bắp và nhiều loại rau củ lên men khác là những món ăn
thường ngày trong các gia đình ở Việt Nam; Kimchi là một sản phẩm lên men lactic
khác của hơn 100 loại rau củ và là một món ăn truyền thống nổi tiếng của Hàn
Quốc… Trong quá trình muối chua rau củ, các vi khuẩn Lactobacillus trong rau củ
tươi tạo ra một lượng axít lactic đáng kể góp phần làm chua rau củ và ức chế sự
phát triển của các vi khuẩn gây hư hỏng thực phẩm [30], [48].
Ngoài ra, Lactobacillus còn đóng vai trò quan trọng trong quá trình làm bánh

mì. Nhiều loài Lactobacillus được tìm thấy trong bột chua làm bánh mì gồm: L.

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

20
acidophilus, L. farciminis, L. casei, L. plantarum, L. rhammosus, L. brevis, L.
sanfrancisco và L. fermentum. Vi khuẩn lactic được sử dụng như một chất bảo
quản sinh học vì một số sản phẩm trao đổi chất của các vi khuẩn lactic có hiệu
quả kháng khuẩn như: các axít hữu cơ, các axít béo, hydrogen peroxide,
diacetyl… người ta đặc biệt chú ý đến các bacterioxin, là các chất tạo bởi một số
vi khuẩn lactic có khả năng ức chế nhiều tác nhân gây bệnh như: Listeria,
Clostridium, Staphylococcus, Bacillus, Enterococcus… Do đó các bacterioxin
được nhận định là có hiệu quả cao và an toàn trong quá trình bảo quản các loại
thực phẩm. Các nhà nghiên cứu nhận thấy Lactobacillus là một trong những vi
khuẩn lactic có khả năng tạo ra nhiều loại bacterioxin. Các bacterioxin của
Lactobacillus có thể đưa vào thực phẩm để ngăn chặn sự phát triển của nhiều
loài vi khuẩn, đặc biệt là các vi khuẩn gây bệnh [48].
1.4.2. Trong công nghiệp
Vi khuẩn lactic được sử dụng để lên men thu axít lactic. Axít lactic là axít
hữu cơ đầu tiên được sản xuất bởi vi sinh vật vào năm 1880. Có vị chua dễ chịu và
có đặc tính bảo quản nên có thể làm gia vị đối với các loại nước uống nhẹ, tinh dầu,
dịch quả, mứt. Chúng được dùng để axít hóa rượu vang và hoa quả nghèo axít,
ngoài ra còn được sử dụng trong công nghiệp thuộc da, dệt, nhuộm, sơn và chất dẻo.
Người ta có thể sử dụng các loài Lactobacillus lên men tự nhiên các loại cơ chất
khác nhau để tạo ra axít lactic, như: L. bulgaricus có thể tạo ra axít lactic bằng cách
lên men nước sữa (whey). Axít lactic là một trong những axít hữu cơ được dùng đầu
tiên trong thực phẩm. Axít lactic được sử dụng theo một số cách như dùng trong
đóng gói ô liu Tây Ban Nha nhằm ngăn chặn sự hư hỏng và sự lên men, giúp bảo
quản bột trứng khô, cải thiện vị của dưa chua khi thêm vào giấm, làm chua nước ép
trái cây trong quá trình làm rượu vang… [1], [58].

1.4.3. Trong nông nghiệp và môi trường
Vi khuẩn lactic có khả năng hạn chế sự phát triển của Fusarium- loại nấm
gây bệnh quan trọng trong nông nghiệp. Nấm Fusarium khi phát triển sẽ làm cây

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

21
yếu và là cơ hội gây bệnh cho cây trồng. Chế phẩm EM (effective microorganism)
hay chế phẩm vi sinh hữu hiệu bao gồm 80 chủng vi sinh trong đó có sự góp phần
của vi khuẩn lactic. Hiệu quả của chế phẩm này là cải tạo đất, tăng năng suất cây
trồng và giải quyết vấn đề ô nhiễm môi trường [37].
1.4.4. Trong chăn nuôi thú y
Lactobacillus có hiệu quả trong phục hồi sự cân bằng hệ vi sinh vật đường
ruột và giúp hình thành hệ vi sinh vật dạ cỏ. Nhờ vào sự giảm nồng độ NH
3
và hạn
chế vi sinh vật gây thối nhiễm vào đường ruột, Lactobacillus có hiệu quả kích thích
tăng trưởng ở thú nuôi. Ngoài ra, người ta còn dùng L. casei và L. plantarium để ủ
rơm, rau, cỏ cho gia súc ăn. Trong quá trình lên men vi khuẩn lactic sản sinh ra một
số sản phẩm có giá trị như vitamin, chất thơm, kháng sinh làm cho thức ăn gia súc ủ
chua có giá trị dinh dưỡng cao làm tăng năng suất vật nuôi [37], [58].

1.4.5. Probiotic
Ngày nay, vai trò probiotic của Lactobacillus trong các loại thực phẩm và
dược phẩm rất được quan tâm. Nhiều chủng Lactobacillus có đặc tính probiotic
đã được nghiên cứu gồm : L. acidophilus NCFM, L. acidophilus DDS-1,
L.acidophilus SBT-2062, L. acidophilus LA-1 và L.acidophilus LA-5, L. casei
Shirota (Yakult, Nhật), L. casei immunitas (Danone, Pháp), L. fermentum RC-14
(Urex Biotech, Canada), L. Johnsonii LA1 và L. Johnsonii Lj1 (Neestle, Thụy
Sĩ), L. paracasei CRL 431 (Chr. Hansem, Inc.), L. plantarum 299V (Probi AB,

Thụy Điển) Bên cạnh đó, nhiều lợi ích liên quan đến sức khỏe của các chủng
Lactobacillus cũng đã và đang được công bố như: tăng cường khả năng miễn
dịch, ngăn ngừa rối loạn đường ruột, giảm tiêu chảy do virus Trong thực tế,
phần lớn các chủng Lactobacillus cho thấy có khả năng sống trong đường ruột
và tạo nên những tác động tích cực lên hệ vi sinh vật đường ruột, kể cả việc ngăn
chặn sự tồn tại của các vi khuẩn gây bệnh và làm giảm bệnh lý của một số bệnh.
Khả năng định cư của Lactobacillus có tác dụng kìm hãm sự phát triển của
các vi sinh vật gây bệnh. Sự kìm hãm được thực hiện theo những phương thức sau:

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

22
cạnh tranh chất dinh dưỡng, sản sinh ra độc tố và các sản phẩm trao đổi (các axít
béo bay hơi, các chất giống kháng sinh ), cạnh tranh vị trí bám dính ở niêm mạc
ruột và kích thích hệ thống miễn dịch ruột [29].
1.5. Hệ vi sinh vật đƣờng ruột và tác động của hệ vi sinh vật tới sức khỏe vật chủ
Bên cạnh sự hấp thụ các chất dinh dưỡng, đường tiêu hóa của động vật còn
đóng vai trò quan trọng như là cơ quan miễn dịch trong cơ thể, do là hệ thống bảo
vệ và là hàng rào quan trọng chống lại các tác nhân gây bệnh xâm nhiễm. Thêm vào
các cơ chế bảo vệ chung, hệ thống miễn dịch với các phản ứng đặc hiệu và không
đặc hiệu, giúp chống lại các vi sinh vật gây bệnh. Khu hệ vi sinh vật đường ruột
cũng được coi là một trong các yếu tố chống lại các tác nhân gây bệnh.
Khi còn ở trong bào thai, đường tiêu hóa của vật nuôi ở trạng thái vô trùng,
nhưng chỉ vài giờ sau khi vật nuôi được sinh ra các vi sinh vật đã bắt đầu cư trú và
trở thành những “cư dân” bình thường trong đường tiêu hóa [27]. Theo thời gian, do
tiếp xúc trực tiếp với môi trường, đặc biệt là qua thức ăn và nước uống, số lượng và
tính đa dạng sinh học của các vi sinh vật cộng sinh không ngừng tăng lên. Số lượng
tế bào vi sinh vật cư trú trong đường tiêu hóa của vật nuôi có thể cao gấp mười lần
số lượng tế bào cấu tạo nên cơ thể chúng. Số lượng loài có thể lên tới từ 400-500.
Tuy nhiên, mật độ vi sinh vật ở các phân đoạn khác nhau của đường tiêu hóa (dạ

dày; tá tràng; ruột non và ruột già) ở loài động vật dạ dày đơn rất khác nhau
(khoảng 10
1
-10
3
; 10
1
-10
4
; 10
5
-10
8
và 10
9
-10
12
CFU/ml chất chứa tương ứng) [7].
Sức khỏe của vật nuôi phụ thuộc vào 3 yếu tố chính là: trạng thái sinh lý của
vật chủ, khẩu phần thức ăn và hệ vi sinh vật. Các yếu tố này chịu tác động của môi
trường, của các stress và tác động qua lại lẫn nhau. Trong số các nhân tố trên, hệ vi
sinh vật đường tiêu hóa đóng vai trò trung tâm, chỉ một biến động bất lợi cả một
trong hai yếu tố còn lại cũng ảnh hưởng xấu tới hệ vi sinh vật. Sự cộng sinh của các
loài vi sinh vật trong đường tiêu hóa của vật nuôi (chủ yếu là trong ruột) tạo nên
một hệ sinh thái mở và mối cân bằng của quần thể vi sinh vật được xác lập chỉ sau
một thời gian rất ngắn sau khi sinh [7], [27].

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

23

Có nhiều ý kiến khác nhau về mối tương quan cân bằng của hệ vi sinh vật
ruột. Theo Jans (2005), để đánh giá trạng thái cân bằng, các vi sinh vật ruột được
chia thành 3 nhóm: (1) nhóm chủ yếu (main flora) gồm các loài vi khuẩn kị khí
(Clostridium; Lactobacillus; Bifidobacteria; Bacteroides, Eubacteria); (2) nhóm vệ
tinh (Satellite flora), gồm chủ yếu là Enterococcus và E. coli, và (3) nhóm còn lại
(Residual flora) gồm các vi sinh vật có hại như Proteus, Staphylococcus và
Pseudomonas… Một quần thể vi sinh vật được coi là cân bằng khi tỷ lệ của các
nhóm trên dao động trong khoảng tương ứng là 90; 1,0 và 0,01%. Trạng thái mà các
nhóm này hình thành một tỷ lệ 90:1:0,01 được gọi là trạng thái “eubiosis” (tiếng Hy
Lạp có nghĩa là sự chung sống có lợi giữa các vi khuẩn với nhau và với vật chủ). Ở
trạng thái “eubiosis”, vật chủ cung cấp các điều kiện sống lý tưởng như nhiệt độ ổn
định, pH trung tính, dinh dưỡng và sự đào thải khi các chất chuyển hóa. Đổi lại, hệ
vi sinh vật sẽ mang lại lợi ích cho vật chủ thông qua tăng cường tiêu hóa các chất
dinh dưỡng, giải độc, tổng hợp các vitamin nhóm B và vitamin K, loại trừ các vi
sinh vật có hại, tăng cường đáp ứng miễn dịch của vật chủ. Sự cân bằng của hệ vi
sinh vật trong đường tiêu hóa bị tác động bởi một số nhân tố vô sinh và hữu sinh
như: sinh lý vật chủ, khẩu phần ăn và cơ cấu nội tại của bản thân hệ vi sinh vật.
Thức ăn là nền dinh dưỡng cơ bản của vi sinh vật, bởi vậy sự thay đổi thành phần
khẩu phần, thức ăn không đảm bảo vệ sinh, phương pháp cho ăn không hợp lý…
đều làm tổn hại đến trạng thái cân bằng hệ vi sinh vật ruột. Tương tự như vậy, các
chất bài tiết của hệ tiêu hóa (dịch mật, các enzyme, chất đệm và chất nhầy…) cũng
như kiểu và tần số của đường ruột cũng tác động trực tiếp đến hệ vi sinh vật. Kiểu
và tần số của đường ruột bị tác động rất lớn bởi các stress (sinh đẻ, cai sữa, dồn
chuồng, vận chuyển…). Khi quan hệ cân bằng của hệ vi sinh vật ruột bị phá vỡ sẽ
tạo nên trạng thái “dysbiosis” (trạng thái “chung sống có hại”). Biểu hiện của trạng
thái “dysbiosis” ở vật chủ thường là thể trạng kém, sinh trưởng chậm và mắc các
bệnh đường tiêu hóa như tiêu chảy, viêm ruột hoại tử…(tóm tắt trạng thái eubiosis
và dysbiosis có trong bảng 2.1). Để cải thiện quan hệ cân bằng của hệ vi sinh vật

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

24
ruột ở vật nuôi, một phương pháp thường được áp dụng là bổ sung vào khẩu phần
thức ăn một số loại kháng sinh liều thấp như những chất kích thích sinh trưởng.
Tuy nhiên, việc sử dụng kháng sinh trong thức ăn một cách không có kiểm
soát đã và đang gây ra những hậu quả đáng lo ngại về vệ sinh an toàn thực phẩm và
đặc biệt là gây nên tình trạng kháng thuốc ngày càng gia tăng của các vi khuẩn gây
bệnh trên người và vật nuôi. Chính vì vậy, từ năm 2006 các nước thuộc EU cấm
hoàn toàn việc sử dụng kháng sinh trong thức ăn chăn nuôi. Việc cấm sử dụng
kháng sinh trong thức ăn chăn nuôi cũng đặt ra những thách thức lớn về kỹ thuật,
đặc biệt đối với chăn nuôi gia súc, gia cầm non hoặc trong điều kiện vệ sinh kém và
vật nuôi chịu nhiều stress. Để vượt qua những thử thách thức đó, đã có rất nhiều
những nghiên cứu nhằm tìm ra tác nhân vừa để thay thế kháng sinh, vừa an toàn với
vật nuôi. Một trong những tác nhân tìm ra đó là probiotic [27], [28].
1.6. Tình hình nghiên cứu trên thế giới và ở Việt Nam
1.6.1. Trên thế giới
Trên thế giới đã có nhiều nghiên cứu về các đặc tính probiotic của các chủng
Lactobacillus làm cơ sở để sản xuất các sản phẩm probiotic phục vụ cho con người
và các động vật.
Năm 2008, Srikanjana Klayraung và cs đã nghiên cứu về khả năng chống
chịu của 2 chủng lactic là Lactobacillus oris và Lactobacillus fermentum ở ngưỡng
pH=3, nồng độ muối mật 0,3% và khả năng kháng khuẩn gây bệnh (như Salmonella
thyphimurium, Escherichia coli) [50].
Trong năm 2010, cũng có nhiều nghiên cứu liên quan đến vấn đề này trong đó có
thể kể đến là nghiên cứu của Hoque và cs đã cho thấy Lactobacillus spp. có khả năng
chống chịu với các nồng độ NaCl (1% - 9%), muối mật (0,05% - 0,1% - 0,15% - 0,3%),
có khả năng chống chịu ở pH khác nhau (2,2 và 6,6) và mẫn cảm với nhiều loại kháng
sinh (như amoxicillin, gentamicin, tetracyclines, clindamicins, kanamycin, axít nalidixic,
metronidazole, azithromicin và cefradine) [35].
Nghiên cứu của Tambekar và cs cũng đã chỉ ra rằng Lactobacillus sp. có khả

năng chống chịu trong môi trường axít (pH= 2, 3, 4, 5), trong môi trường muối mật

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

25
(0,5%; 1%; 1,5%; và 2%), có khả năng kháng khuẩn tốt (với Enterobacter aerogenes,
Klebsiella pneumoniae, Proteus vulgaris, Salmonella typhi và Shigella flexneri) và mẫn
cảm với nhiều loại kháng sinh (như ampicillin, cephalothin, co-trimoxazole,
gentamicin, axít nalidixic, nitrofurantoin, norfloxacin và tetracycline) [51].
Nghiên cứu của Xiao-Hua Guo và cs đã cho thấy Lactobacillus có khả năng
kháng khuẩn (với E. coli, Salmonella typhimurium và Staphylococcus aureus),
chống chịu ở ngưỡng pH axít (pH = 2 và pH= 3) và đặc biệt giữa các chủng lựa
chọn không có sự đối kháng lẫn nhau [52]. Đồng quan điểm với Xiao-Hua Guo
nghiên cứu của Sameh H.M và cs cũng đề cập đến sự kháng khuẩn của
Lactobacillus acidophilus và khảo sát khả năng sinh trưởng của chủng này trong
các điều kiện như: ở pH=1, 2 và 3; ở nhiệt độ là 37
o
C, 40
o
C, 45
o
C, 50
o
C, 55
o
C và
60
o
C; ở nồng độ muối mật là 1%, 2% và 4% [47]. Năm 2011, nghiên cứu của
Sahadeva và cs sự đã chỉ ra một số đặc tính probitoic của chủng Lactobacillus như

khả năng sống sót ở pH thấp (1,5 – 3 – 7,2 (đối chứng) và trong dịch mật (0% -
0,3% và 2%) [49].
1.6.2. Ở Việt Nam
Hiện nay, việc nghiên cứu chế phẩm probitoic ngày càng trở nên phổ biến
ở Việt Nam. Lê Hoàng Bảo Vi và cs đã nghiên cứu thành công các chủng
Lactobacillus, Bacillus, Aspergillus, Saccharomyces mang đặc tính probiotic
được đề cập đó là: sự đề kháng với kháng sinh; khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ,
pH, NaCl tới khả năng tăng trưởng của vi khuẩn; xác định khả năng chịu muối
mật, chịu pH thấp; xác định độ kháng khuẩn; xác định vi sinh vật gây bệnh. Dựa
trên sự nghiên cứu này tạo cơ sở sản xuất chế phẩm probiotic sử dụng trong thức
ăn chăn nuôi [16].
Nghiên cứu của Mai Thị Đàm Linh và cs; Nguyễn Thúy Hương và cs đã chỉ
ra rằng bằng việc ra bacteriocin chủng vi khuẩn lactic có khả năng kháng được
nhiều vi khuẩn gây bệnh như Bacillus sp., E. coli, [6], [8].
Hồ Trung Thông và cs đã đánh giá khả năng sống của các chủng vi sinh vật
trong đường tiêu hóa ở điều kiện in vitro bao gồm các điều kiện như khả năng sống
trong môi trường có pH thấp, trong môi trường có pepsine, trong môi trường
pancreatine và trong môi trường có muối mật 0,3% [15].