phân lập và tuyển chọn một số chủng xạ khuẩn có hoạt tính kháng sinh chống nấm gây bệnh thực vật từ các mẫu đất ở khánh hòa

1
Mục Lục
Danh mục các chữ viết tắt i
Danh mục các bảng ii
Danh mục các hình iii
MỞ ĐẦU 1
CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2
1.1. Giới thiệu về chất kháng sinh 2
1.1.1. Chất kháng sinh (CKS) 2
1.1.2. Sơ lược lịch sử nghiên cứu chất kháng sinh 3
1.2. Cơ chế tác động của CKS 5
1.2.1.Ức chế tổng hợp thành tế bào. 6
1.2.2. Ức chế tổng hợp protein 6
1.2.3. Phá hủy màng sinh chất. 6
1.2.4. Ức chế tổng hợp AND 7
1.2.5. Ức chế cạnh tranh 7
1.3. Xạ khuẩn và sự hình thành CKS từ xạ khuẩn. 7
1.3.1. Định nghĩa xạ khuẩn 7
1.3.2. Một số đặc điểm chung của xạ khuẩn 7
1.3.3. Phân lập và tuyển chọn các chủng xạ khuẩn sinh CKS từ tự nhiên 10
1.3.4. Quá trình hình thành CKS của xạ khuẩn 11
1.3.4.1. Các pha sinh trưởng của vi sinh vật 11
1.3.4.2.Các con đường tổng hợp chất kháng sinh 11
1.4. Phân loại xạ khuẩn 12
1.4.1. Phân loại theo phương pháp truyền thống 12
1.4.2. Phân loại theo phương pháp hiện đại 13
1.5. Một số bệnh do nấm gây ra đối với thực vật 15
1.5.1. Bệnh đạo ôn 15
1.5.2. Bệnh thối rễ 15
1.5.3. Bệnh khô vằn 16
1.5.4. Bệnh mốc sương ở khoai tây và cà chua 16

2
1.6. Sử dụng CKS và xạ khuẩn trong bảo vệ thực vật 16
1.6.1. Sử dụng xạ khuẩn chống nấm gây bệnh thực vật 16
1.6.2. Ứng dụng của các CKS trong bảo vệ thực vật 17
CHƯƠNG 2 NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 19
2.1. Nguyên liệu 19
2.1.1. Chủng giống 19
2.1.2. Hóa chất và dụng cụ 19
2.1.2.1. Hóa chất 19
2.1.2.2. Dụng cụ 20
2.2. Phương pháp nghiên cứu 20
2.2.1. Phương pháp phân lập và tuyển chọn 20
2.2.1.1. Phân lập xạ khuẩn theo phương pháp Vinograski 20
2.2.1.2. Phương pháp xác định hoạt tính kháng sinh (HTKS) 20
2.2.1.3. Tuyển chọn các chủng xạ khuẩn sinh CKS 21
2.2.2. Bảo quản giống 21
2.2.3. Phương pháp xác định trọng lượng sinh khối khô 21
2.2.4. Nghiên cứu đặc điểm sinh học và phân loại 21
2.2.4.1. Đặc điểm nuôi cấy 21
2.2.4.2. Đặc điểm sinh lý, sinh hóa 21
2.2.4.3. Đặc điểm hình thái 22
2.2.5. Phân loại các chủng xạ khuẩn bằng phương pháp xác định trình tự AND
22
2.2.5.1. Tách chiết ADN từ xạ khuẩn 22
2.2.5.2. Phản ứng khuếch đại ADN 23
2.2.5.3. Phản ứng khuếch đại ADN cho giải trình tự 24
2.2.5.4. Xây dựng cây phát sinh chủng loại 24
2.2.6. Xác định các yếu tố ảnh hưởng tới sinh tổng hợp CKS 24
2.2.6.1. Ảnh hưởng của pH 24
2.2.5.2. Ảnh hưởng của nhiệt độ 25

2.2.5.3. Ảnh hưởng của thời gian 25
3
2.2.5.4. Ảnh hưởng của nguồn cacbon 25
2.2.6.5. Ảnh hưởng của nguồn nitơ 25
2.2.7. Tách chiết chất kháng sinh từ dịch lên men bằng dung môi hữu cơ 25
2.2.8. Tìm hiểu khả năng ứng dụng của chủng xạ khuẩn XK5 26
2.2.8.1. Ảnh hưởng của dịch nuôi cấy của chủng XK5 đến khả năng nảy
mầm của hạt 26
2.2.8.2. Ảnh hưởng của dịch nuôi cấy đến khả năng nảy mầm, sinh trưởng
và phát triển của cây 26
CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 27
3.1. Phân lập và tuyển chọn 27
3.1.1. Xác định số lượng xạ khuẩn sinh CKS phân lập được 27
3.1.2. Tuyển chọn các chủng xạ khuẩn sinh CKS chống nấm có hoạt tính cao
29
3.1.3. Hoạt tính enzyme của 10 chủng xạ khuẩn. 30
3.1.4. Hoạt tính kháng sinh của chủng XK5 32
3.2. Đặc điểm sinh học và đặc điểm phân loại chủng xạ khuẩn XK5 33
3.2.1 Đặc điểm nuôi cấy 33
3.2.2. Đặc điểm hình thái 34
3.2.3 Đặc điểm sinh lý, sinh hóa 34
3.3. Xác định trình tự gen mã hóa ARNr 16S 35
3.4. Phân loại 37
3.5. Khả năng tổng hợp CKS của chủng XK5 39
3.5.1. Ảnh hưởng của pH ban đầu 39
3.5.2. Ảnh hưởng của nhiệt độ 40
3.5.3. Ảnh hưởng của thời gian 41
3.5.4. Ảnh hưởng của nguồn cacbon khác nhau lên sinh tổng hợp CKS của
chủng xạ khuẩn XK5 42
3.5.5. Ảnh hưởng của nguồn nitơ khác nhau lên sinh tổng hợp CKS của chủng

xạ khuẩn XK5 43
3.5. Tách chiết CKS bằng dung môi hữu cơ 45
4
3.5.1. Tách chiết CKS 45
3.5.2. Lựa chọn dung môi thích hợp để tách chiết CKS 45
3.6. Tìm hiểu khả năng ứng dụng của CKS XK5 46
3.6.1. Ảnh hưởng của CKS từ dịch nuôi đến khả năng nảy mầm của hạt 46
3.6.2. Ảnh hưởng của CKS XK5 đến khả năng sinh trưởng của cây. 47
CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT Ý KIẾN 48
I KẾT LUẬN : 48
II. ĐỀ XUẤT Ý KIẾN 48
TÀI LIỆU THAM KHẢO 49
PHỤ LỤC
1
MỞ ĐẦU
Hàng năm, trên thế giới các bệnh ở cây trồng đã gây ra những tổn thất to lớn
đối với nền sản xuất nông nghiệp. Theo thống kê của Tổ chức Nông Lương Liên
Hiệp Quốc (FAO), thiệt hại trong nông nghiệp do các bệnh vi nấm gây ra tới 537,3
triệu tấn các loại nông sản, chiếm khoảng 11,6% tổng sản lượng nông nghiệp thế
giới. Trong đó chiếm 83% là bệnh do vi nấm gây ra, và chủ yếu là các bệnh như:
đạo ôn, khô vằn, thối cổ rễ, mốc sương…[7].
Việc sử dụng các hóa chất trong bảo vệ thực vật (BVTV) nhằm tăng sản
lượng nông nghiệp từ lâu đã phổ biến ở Việt Nam với các chủng loại thuốc bảo vệ
thực vật rất đa dạng. Mỗi năm Việt Nam sử dụng khoảng 25.000 tấn thuốc hóa học
diệt sâu bệnh. Theo thống kê năm 2004, ở Việt Nam có tới 436 loại hóa chất với
1231 tên thương phẩm [7]. Tuy nhiên, mặt trái của việc sử dụng các hóa chất bảo vệ
thực vật này là nỗi lo của toàn xã hội. Các chất này thường rất độc và khi tồn dư
trong đất, nước và nông sản sẽ ảnh hưởng nghiêm trọng tới sức khỏe con người, gây
ô nhiễm môi trường và làm mất cân bằng sinh thái. Chính vì vậy việc tìm hiểu các
hợp chất tự nhiên, có hoạt tính sinh học, dễ phân giải nên không để lại dư lượng

trong đất làm ô nhiễm môi trường, vừa có khả năng chữa bệnh cho cây trồng là mục
tiêu phấn đấu của một nền nông nghiệp sạch và bền vững. Chất kháng sinh do vi
sinh vật sinh ra là một chất như vậy.
Xuất phát từ mục tiêu trên, chúng tôi tiến hành: “Phân lập và tuyển chọn
một số chủng xạ khuẩn có hoạt tính kháng sinh chống nấm gây bệnh thực vật
từ các mẫu đất ở Khánh Hòa”. Đồng thời, tiến hành nghiên cứu các yếu tố ảnh
hưởng đến khả năng sinh tổng hợp chất kháng sinh của các chủng xạ khuẩn đã được
tuyển chọn, nghiên cứu ảnh hưởng của chất kháng sinh đối với sự nảy mầm của một
số loại hạt và sự phát triển của cây. Bước đầu tiến hành lựa chọn dung môi thích
hợp để tách chiết phục vụ cho những nghiên cứu về khảo sát cấu trúc và bản chất
hóa học của các chất kháng sinh đó.
2
CHƯƠNG 1
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Giới thiệu về chất kháng sinh
1.1.1. Chất kháng sinh (CKS)
Chất kháng sinh (antibiotic) là bất kỳ sản phẩm vi sinh nào mà ngay ở nồng độ
thấp (µg/ml) cũng có khả năng ức chế hoặc tiêu diệt các VSV khác (vi khuẩn, nấm
men, nấm mốc ) một cách chọn lọc [1], [7], [22].
CKS là một trong các sản phẩm trao đổi chất bậc hai quan trọng nhất, là nhóm
hợp chất thiên nhiên đa dạng về thành phần hóa học. Chúng có thể là một chất
kiềm, axit, trung tính, dễ bay hơi hay một polypeptit, sản phẩm này có thể tiết ra
ngoài môi trường sống hay tích luỹ trong tế bào. Trước đây việc sử dụng CKS
trong điều trị các bệnh nhiễm trùng thường có nguồn gốc từ VSV (như vi khuẩn,
nấm, xạ khuẩn). Những năm gần đây với những tiến bộ về khoa học kỹ thuật, nhiều
CKS đã được tạo ra theo con đường bán tổng hợp (ampixillin) hoặc tổng hợp mới
hoàn toàn (chloramphenicol) [3], [26].
Bảng 1.1. Tỷ lệ các loài có khả năng sinh CKS [11]
Sinh vật sinh CKS
Số lượng loài

Tỷ lệ (%)
Vi khuẩn
950
9
Xạ khuẩn
4.600
43
Nấm
1.600
15
Tổng số VSV
7.150
67
Địa y
100
1
Tảo
250
2
Thực vật bậc cao
2.500
23
Động vật
700
7
Tổng số SV bậc cao
3.550
33
Tổng số
10.700

100
Việc nghiên cứu sử dụng có hiệu quả CKS đã mang lại hiệu quả lớn lao
trong lĩnh vực y học, hơn thế nữa nó còn có thể ứng dụng trong cả lĩnh vực bảo vệ
thực vật nhằm ức chế tiêu diệt các VSV khác gây bệnh cho cây trồng. CKS có thể
do nhiều VSV tạo ra nhưng chủ yếu vẫn là xạ khuẩn, vi khuẩn, nấm sợi.
3
Cách đây 1/4 thế kỷ, số lượng CKS biết đến chỉ có vài trăm loại nhưng cho
đến năm 1993 số lượng này đã lên đến 6.000, trong đó 67% do xạ khuẩn sinh ra
(90% có nguồn gốc từ chi Streptomyces), 13% từ nấm, 12% từ vi khuẩn, 1% tách
được từ địa y. Song, con số này đến nay đã tăng lên trên 10.000 trong đó 7000 CKS
có nguồn gốc từ VSV. Đầu thập kỷ này đã phát hiện thêm 2000 các sản phẩm trao
đổi chất có hoạt tính sinh học được tách chiết từ VSV. Ước tính số lượng thực sự
của các chất này phải lên đến trên 15.000 chất [20], [30].
1.1.2. Sơ lược lịch sử nghiên cứu chất kháng sinh
Vào mùa thu năm 1928, tại St Mary’s Hospital London, Alexander Fleming -
một nhà vi sinh vật học trở lại phòng thí nghiệm sau thời gian nghỉ hè. Quan sát các
hộp nuôi cấy vi sinh cũ còn sót lại trên bàn, ông phát hiện một hộp cấy tụ cầu
Staphylococcus bị nhiễm vi nấm Penicillium, và lấy làm ngạc nhiên vì nấm đã ức
chế sự phát triển của tụ cầu. Fleming nhận thức ngay hiện tượng mới lạ này và sau
một loạt thử nghiệm đã thấy nấm Penicillium ức chế sự phát triển của nhiều vi nấm
gây bệnh như:
- Liên cầu khuẩn Streptococcus (thường trú ở họng).
- Phế cầu khuẩn Diplococcus pneumoniae gây viêm phế quản, viêm phổi,
viêm tai mũi họng.
- Vi khuẩn bạch hầu Corynebacterium diphteriae.
- Cả xoắn khuẩn giang mai Treponema pallidum lây lan qua đường tình dục.
Ông đặt tên hoạt chất được chiết từ nấm là Penicillin.
Nhưng sau đó, công trình của Fleming đã bị lãng quên. Cho đến chiến tranh thế
giới thứ hai, do sự nỗ lực hợp tác của nhiều nhà khoa học Anh- Mỹ, đứng đầu là
Abraham, Chain, Florey thí nghiệm của Fleming đã được lặp lại, đồng thời đã tiến

hành chiết rút thành công và khẳng định giá trị to lớn của Penicillin “loại thuốc thần
kỳ” này đã mở ra một kỷ nguyên mới - kỷ nguyên kháng sinh trong lịch sử y học
của loài người.
4
Hình 1.1. Bức ảnh lịch sử này được A.Fleming chụp vào năm 1928
Vào hè 1942, ở Hoa Kỳ, 129 bệnh nhân bị nhiễm khuẩn lậu cầu (Neisseria
gonorrhoeae) đã được chữa lành khi được điều trị với penicillin. Từ đây, penicillin
thực sự trở thành một dược phẩm.
Năm 1945, Alexander Fleming, E.Chain và H.W.Florey đã được nhận giải
thưởng Nobel vì sự khám phá ra giá trị to lớn của penicillin mở ra một kỷ nguyên
mới trong y học – kỷ nguyên kháng sinh.
Streptomycin - dược phẩm kháng lao được tìm ra vào năm 1943. Những năm
1945-1965, được coi là thời kì hoàng kim của việc nghiên cứu chất kháng sinh.
Hàng loạt chất kháng sinh được phát hiện trong giai đoạn này có ứng dụng trong y
học như: chloramphenicol (Erhlich,1947) chỉ định cho bệnh thương hàn; tetracyclin
cho bệnh nhiễm trùng tai, mũi, họng, phổi, phế quản, vancomycin, gentamicin…
Các kháng sinh ngăn chặn được các bệnh bạch cầu, giang mai, bệnh sốt phát ban và
đã cứu sống được cả triệu người. Penicillin được coi là thuốc thần kỳ chữa được rất
nhiều bệnh.
Giờ đây, nhiều vi khuẩn đã kháng với penicillin, do thuốc bị lạm dụng, sử
dụng quá mức hay không đúng yêu cầu, một số vi khuẩn không còn nhạy cảm với 8
hoặc 10 kháng sinh khác nhau. Bệnh lao, một thời bị streptomycin khống chế, nay
đã trỗi dậy với đại dịch AIDS và giết hại hàng năm cả 3 triệu người. Hiện nay,
Vùng ức chế sự sinh
trưởng của vi khuẩn
Khuẩn lạc tụ cầu vàng S.aureus
Khuẩn lạc Penicillium
5
muốn tránh được tình trạng kháng thuốc, cần phối hợp 2 hay 3 kháng sinh hoặc phải
có liên tục những kháng sinh mới. Tiếc thay, từ 1970, sáng kiến lụi dần.

Ngày 15.6.2005, một kháng sinh mới- Tygacil – của công ty Wyeth, sản xuất
từ sự lên men vi khuẩn được chào đón và hoan nghênh nhiệt liệt. Tygacil được chỉ
định cho các bệnh nhiễm trong khoang bụng và nhiễm trùng da.
Một trong những nguyên nhân kháng thuốc là sử dụng ồ ạt kháng sinh trong
chăn nuôi để chữa bệnh và bổ sung vào thức ăn tăng trưởng gia súc nên năm 1974,
châu Âu đã cấm sử dụng penicillin, tetracyclin, và nhiều kháng sinh khác để nuôi
thúc súc vật. Sự xuất hiện ngày càng nhiều các vi khuẩn đa kháng thuốc và sự thiếu
hụt các nhóm kháng sinh mới làm cho chúng ta đang phải đối mặt với thời kì “ hậu
kháng sinh”,[16]. Chính vì thế nhiệm vụ đặt ra của ngành công nghệ sản xuất kháng
sinh là: một mặt cải biến các chất kháng sinh cũ để tránh tình trạng kháng thuốc,
mặt khác phải thúc đẩy nghiên cứu và phát triển ( R$ D) để tìm ra chất kháng sinh
mới với cơ chế tác động mới hoàn toàn [27].
Như vậy sau hơn 70 năm kể từ khi khám phá ra chất kháng sinh, đến nay số
lượng chất kháng sinh được phát hiện lên tới trên 17.000 chất [21]. Tuy nhiên chỉ có
1-2% CKS được sử dụng rộng rãi trong thực tiễn y học. Thị trường CKS trên thế
giới, theo thống kê năm 2002 đã đạt doanh số 26 tỷ đôla [35], và sẽ vẫn còn tăng
khoảng 0,6%, từ năm 2002-2008. Con số này cho thấy tiềm năng to lớn của CKS
của ngành công nghệ kháng sinh trong nền kinh tế quốc dân. Có thể nói ngành công
nghệ sản xuất CKS vẫn đang là một trong những hướng phát triển mạnh mẽ nhất
trong công nghệ sinh học. Cùng với sự phát triển mạnh mẽ của các ngành Vi sinh
vật học, Hoá sinh học, Di truyền học phân tử và đặc biệt là sự ra đời của CNSH
(1975) đã đạt được những thành tựu lớn lao.
1.2. Cơ chế tác động của CKS
Cơ chế tác dụng của CKS là những cách thức mà CKS tác động lên những vị
trí đích khác nhau trong tế bào, qua đó ảnh hưởng đến sự sinh trưởng của VSV. Sự
tác động của các CKS lên tế bào vi sinh vật phụ thuộc vào bản chất hóa học, nồng
độ CKS và cấu trúc hiển vi của tế bào vi sinh vật . Ngoài ra cùng một CKS như
6
nhau nhưng trong các điều kiện khác nhau thì cơ chế cũng có thể khác nhau. Nhìn
chung CKS có các cơ chế tác động sau [1].

1.2.1.Ức chế tổng hợp thành tế bào.
Các CKS tác động theo cơ chế này đặc hiệu cao với các vi khuẩn Gram (+) bởi
chúng ức chế quá trình tổng hợp peptidoglycan, là đơn vị cấu tạo nên thành tế bào
vi khuẩn Gram (+). Các vi khuẩn Gram (-) thì không bị sự tác động của các CKS
này, trong đó:
 Nhóm - lactam với đại diện là penicillin và cephalosporil ức chế hình thành
liên kết giữa các chuỗi Tetrapeptit trong thành phần peptidoglycan. Ở vi
khuẩn Gram(+) các CKS này gắn vào Transpeptidase qua đó thực hiện việc
gắn enzyme này vào D-Alanin-D-Alanin. Hiệu quả tác động của - lactam
còn được xác định bởi các protein có khả năng liên kết với các CKS- lactam
gọi là PBP.
 Cycloserin có cấu trúc tương tự D-Alanin vì vậy có thể ngăn cản việc gắn D-
Alanin vào chuỗi Tetrapeptit theo kiểu ức chế canh tranh.
 Vancomicin và Bacitraxin ngăn cản sự tạo thành liên kết giữa N-
Acetylglucosamin (NAG) và A.N-Acetylmuramic (NAM).
1.2.2. Ức chế tổng hợp protein
Các CKS ức chế tổng hợp protein có thể tiêu diệt được các sinh vật kể cả
Gram (-) và Gram (+), đích tác dụng của chúng là ribosome 70S.
 Một số CKS tác động vào tiểu phần 30S dẫn đến sinh tổng hợp protein bất
thường. Nhóm aminoglycozit làm đọc mã sai, tetracilin ngăn cản kéo dài
chuỗi peptit.
 Một số CKS tác động vào tiểu phần 50S làm phong bế tổng hợp protein.
Nhóm chloramphenicol ngăn cản quá trình gắn giữ các aminoacid –tARN
vào các vị trí gắn tạo liên kết peptit trong ribosome do đó liên kết peptit
không được hình thành. Nhóm macrolit ức chế việc giải phóng acid amin ra
khỏi phúc hệ amino acid –tARN – ribosome - mARN .
1.2.3. Phá hủy màng sinh chất.
7
Một số CKS làm chết tế bào bằng cách thay đổi tính thấm của màng sinh
chất. Polymixin phá vỡ photpholipit tạo lên cấu trúc màng sinh chất và làm cho các

chất rò rỉ ra ngoài tế bào, tế bào chết. Các CKS nhóm polyen tác động lên thành
phần sterol và estergosterol của màng hơn là photpholipit tạo lên các lỗ trên màng
làm thất thoát các phân tử nhỏ gây chết tế bào, cho nên các CKS thuộc nhóm polyen
có hiệu quả rất lớn trong việc chống nấm.
1.2.4. Ức chế tổng hợp AND
Các CKS tác động theo cơ chế này có thể gắn với acid nucleic tạo thành
phức phân tử bất hoạt, ngăn chặn sự sao chép của các phân tử acid nucleic. Các
CKS như là actynomixin, mitomixin-D,nhóm quinoton.
1.2.5. Ức chế cạnh tranh
Một số CKS về mặt cấu trúc gần giống với chất trao đổi chất bình thường
nên chúng có thể tranh chấp enzyme hoặc có thể thay thể chất trao đổi, do đó ảnh
hưởng đến trao đổi chất của vi sinh vật. Chất CKS này gọi là chất kháng sinh trao
đổi chất, tác động theo kiểu ức chế cạnh tranh.
1.3. Xạ khuẩn và sự hình thành CKS từ xạ khuẩn.
1.3.1. Định nghĩa xạ khuẩn
Xạ khuẩn(Actinomycetes) là nhóm vi khuẩn Gram (+), đặc biệt khác với
VSV nhân sơ là có tỷ lệ G+C cao (69-78%), trong khi đó ở vi khuẩn là 25- 45%.
1.3.2. Một số đặc điểm chung của xạ khuẩn
Xạ khuẩn là một nhóm vi sinh vật đơn bào, phân bố rộng rãi và đóng vai trò
quan trọng trong tự nhiên. Chúng phân bố rộng rãi trong môt gam đất nói chung
gồm có trên 1 triệu mầm xạ khuẩn [2]. Phần lớn xạ khuẩn là các vi khuẩn Gram (+);
hiếu khí hoại sinh, có cấu tạo dạng sợi phân nhánh (khuẩn ty), không có vách ngăn
ngang. Các vách ngăn thường chia hệ sợi thành các tế bào dài (20

m hoặc hơn)
chứa một số nhân, đường kính thay đổi trong khoảng 0,2-1nm đến 2-3nm, chỉ bằng
một phần mười lần khuẩn ty của nấm [5]. Đôi khi tạo ra các đám tế bào giống mô
gọi là tản (thallus). Khoảng 60-70% xạ khuẩn phân lập từ đất có khả năng sinh
CKS. Trong số 17.000 CKS được phát hiên trên thế giới thì có trên 80% có nguồn
gốc từ xạ khuẩn [1],[2].

8
Xạ khuẩn thuộc cơ thể dị dưỡng, phần lớn ưa khí, ưa ẩm, phát triển tốt ở môi
trường không khí hoặc môi trường trung tính hoặc hơi kiềm. Nguồn các bon sử
dụng thường là tinh bột, đường lipit, rượu, acid amin, protein…nguồn nito vô cơ là
muối natri, muối amoni …nguồn nito hữu cơ như bột đậu tương, peptone, cao nấm
men. Đa số xạ khuản chứa α-amylase nên có khả năng phân giải tinh bột. Xạ khuẩn
thuộc nhóm vi khuẩn nhưng có cấu tạo dạng sợi như vi nấm, tiết diện của sợi có tiết
diện như vi khuẩn. Thành tế bào không chứa cellulose và kitin, tế bào phân chia
theo kiểu phân bào vô ti (anitosis).
Khuẩn lạc xạ khuẩn rất đặc biệt, thường xù xì, khô ráp, dạng phấn, không
trong suốt, có các nếp tỏa ra theo hình phóng xạ. Khuẩn lạc gồm ba lớp: lớp vỏ
ngoài bền chặt dùng que cấy không di đi được, lớp trong xốp và lớp giữa có cấu tạo
tổ ong.
Hệ sợi của xạ khuẩn chia làm hai loai khuẩn ti cơ chất (KTCC) và khuẩn ty
khí sinh (KTKS).
KTCC cắm sâu vào môi trường để lấy chất dinh dưỡng. KTKS hướng ra
ngoài không khí, phần cuối biến thành cuống sinh bào tử. Hình dạng của cuống sinh
bào tử và bào tử là đặc điểm rất quan trọng để phân loại xạ khuẩn. Những khuẩn ty
của một số chủng xạ khuẩn như Streptomyces không mang bào tử được gọi là khuẩn
ty dinh dưỡng (KTDD).
Màu sắc khuẩn ty xạ khuẩn hết sức phong phú, có thể gặp màu trắng, vàng,
da cam, đỏ, lục, lam, đen tuỳ từng loài và tuỳ môi trường dinh dưỡng. KTCC có
thể tiết sắc tố ra môi trường, có sắc tố tan trong nước, có sắc tố tan trong dung môi
hữu cơ.
Cấu tạo màng xạ khuẩn khá phức tạp, gồm 2 phần chính là thành tế bào và
màng nguyên sinh chất.
 Thành tế bào có cấu tạo dạng lưới, dày từ 10-20nm chứa rất nhiều các thành
phần khác nhau gồm axit amin, lipit và phần lớn là PG (peptidoglycan).
Năm 1970, Lechevalier và Lechevalier đã đưa ra tiêu chuẩn phân chia thành tế
bào của xạ khuẩn điển hình ra làm 4 typ.

9
Bảng 1.2. Các loại typ thành tế bào khác nhau ở Actinomycetes
Typ
thành
tế bào
Meso-
DAP
LL-
DAP
Glyxin
Arabinoza
Galactoza
Chi đại diện
I
+
+ *
Streptomyces
II
+
+ **
Micromonospora,
Actinoplane
III
+
Actinomadura,
Microbispora
IV
+
+ ***
+***

Nocardia,
Mycobacterium
DAP, diaminopimelic acid, Alanin và glutamic đều có mặt ở +
* Glyxin là amino axit duy nhất không chứa carbon đối xứng trong phân tử của
chúng. Do đó, glyxin không có cấu hình dạng D hay L.
** Trong họ Micromonospora thì L-alanin tại vị trí số 1 của phần peptit đổi thành
glyxin (tức là loại mất nhóm –CH3).
*** Trong nhóm xạ khuẩn có chứa axit mycolic như Norcadia và Mycobacterium,
thì thành tế bào có chứa arabinogalactan (cấu tạo bởi arabinoza và galactoza).
 Màng tế bào chất chứa nhiều enzym tham gia vào quá trình trao đổi chất và
vận chuyển các chất qua màng, lớp này dày từ 7,5 - 10nm. Cấu tạo chủ yếu
từ 2 thành phần là photpholipit và protein.
 Dựa vào nhiệt độ sinh trưởng tối ưu người ta chia xạ khuẩn thành 2 loại:
* Loại ưa nhiệt: nhiệt độ phát triển tốt nhất là 50-55
0
C
* Loại ưa ấm : nhiệt độ phát triển tốt nhất là 25-30
0
C
Phần lớn xạ khuẩn ưa khí, ưa ẩm, phát triển tốt ở môi trường trung tính và
hơi kiềm. Hình thức sinh sản chủ yếu là tạo bào tử vô tính từ hệ sợi của KTKS, các
bào tử thành mỏng được gọi là conidia hoặc conidiaspore ở cuối sợi khuẩn ty. Nếu
các bào tử được bọc trong các nang thì được gọi là bào tử nang (sporangiospores).
Bào tử có hình dạng rất khác nhau, được hình thành do sự xuất hiện các vách ngăn
ngang ở đầu khuẩn ty khi nguồn dinh dưỡng bắt đầu cạn kiệt. Cuống sinh bào tử có
10
nhiều hình dạng: thẳng, lượn sóng hoặc xoắn Hình dạng bào tử có thể là hình trụ,
hình cầu, hình bầu dục hay hình que, bề mặt có dạng trơn nhẵn, xù xì, có gai hoặc
gai phát triển thành lông [15].
Xạ khuẩn thuộc về lớp Actinobacteria, bộ Actinomycetales, bao gồm 10 dưới

bộ, 35 họ, 110 chi và 1000 loài. Hiện nay, 500 loài đã được công bố thuộc chi
Streptomyces và hơn 500 loài thuộc tất cả các chi còn lại và được xếp vào nhóm xạ
khuẩn hiếm.
Streptomyces là một chi lớn, gồm khoảng 500 loài, là chi có tầm quan trọng
về mặt sinh thái và dược học, là nhóm xạ khuẩn có khả năng tổng hợp CKS mạnh
nhất. Chúng phân bố rộng rãi trong đất, đóng vai trò quan trọng trong quá trình
khoáng hoá các hợp chất hữu cơ. Có khả năng phân huỷ pectin, lignin, kitin, keratin
và các hợp chất vòng thơm. Đa phần các loài thuộc chi này không gây hại, trừ một
số gây bệnh cho thực vật và động vật. Ví dụ, S. scabies gây bệnh sùi ở khoai tây và
củ cải, S. somaliensis là loài duy nhất gây bệnh cho người. Các loài này được tập
trung vào một nhóm được gọi là Actinomycetoma. Chúng gây bệnh tại các mô dưới
da làm tổn thương dẫn tới tạo thành khối u, áp-xe, thậm trí gây tổn thương tới cấu
trúc của xương nếu không điều trị kịp thời [3].
1.3.3. Phân lập và tuyển chọn các chủng xạ khuẩn sinh CKS từ tự nhiên
Tuyển chọn xạ khuẩn sinh kháng sinh bao gồm các bước sau: [7]
 Thu thập các mẫu đất, bùn, nước, lá, cát,… từ các loại môi trường khác
nhau, phân lập và thuần khiết các chủng từ các mẫu đó.
 Thử khả năng ức chế hoặc tiêu diệt vi sinh vật kiểm định của các chủng đã
thuần khiết.
 Chọn lựa các chủng thuần khiết có hoạt tính sinh học: kháng khuẩn, kháng
nấm, kháng u dùng trong y học, trong nông nghiệp, và trong thú y. Để định
hướng cho các nghiên cứu tiếp theo.
11
1.3.4. Quá trình hình thành CKS của xạ khuẩn
1.3.4.1. Các pha sinh trưởng của vi sinh vật
 Pha tiềm phát: Là pha thích ứng của vi khuẩn đối với môi trường nuôi cấy.
Các enzyme cảm ứng được hình thành để phân giải cơ chất, tế bào vi khuẩn
được hoạt hóa để chuẩn bị cho pha sinh trưởng.
 Pha sinh trưởng (trophophase): VSV sử dụng các thành phần dinh dưỡng của
môi trường để tăng sinh khối. Cuối pha này VSV bắt đầu tổng hợp CKS.

 Pha sinh tổng hợp (idiophase): Quá trình sinh trưởng ở trạng thái cân bằng.
số lượng tế bào đạt cực đại và không thay đổi. Ở pha này sinh tổng hợp CKS
diễn ra mạnh mẽ.
 Pha suy vong: VSV bắt đầu bị chết đi do nguồn dinh dưỡng cạn kiệt, do đó
số lượng tế bào giảm nhanh và chất kháng sinh cũng giảm.
1.3.4.2.Các con đường tổng hợp chất kháng sinh
Quá trình sinh trưởng của vi sinh vật diễn ra theo các giai đoạn khác nhau,
trong đó CKS là sản phẩm trao đổi chất bậc hai, được tạo thành gần vào lúc kết thúc
pha sinh trưởng thường là vào giữa hoặc chính pha cân bằng. Trong trao đổi chất
bậc hai có hai pha trao đổi chất khác nhau được gọi là pha sinh trưởng
(Troptophase) và pha sản xuất (Idiophase) và các hệ enzyme điều hòa hai pha độc
lập với nhau [1] .
Có nhiều quan điểm khác nhau về khả năng hình thành chất kháng sinh và
vai trò của chúng đối với bản thân xạ khuẩn trong tự nhiên. Một số tác giả cho rằng
sự hình thành CKS là cơ chế giúp cho vi sinh vật tồn tại trong điều kiện môi trường
tự nhiên [4]. Một số khác lại cho rằng sự hình thành chất kháng sinh do cạnh tranh
môi trường dinh dưỡng [12]. Một số khác lại có quan điểm cho rằng CKS chỉ là sản
phẩm thải ra của quá trình trao đổi chất của tế bào [39].
Mặc dù chất kháng sinh có cấu trúc hóa học khác nhau và vi sinh vật sinh ra
chúng rất đa dạng, tuy nhiên quá trình tổng hợp chúng dường như theo một số con
đường nhất định [1].
- CKS được tổng hợp theo con đường trùng hợp từ các acid amin: penicillin,
vancomyxin, actinomixin…
12
- CKS được tổng hợp từ đường: streptomycin, canamycin A, neomycin…
- CKS được tổng hợp từ các đơn vị cấu trúc là acetate: tetarxyclin.
- CKS được tổng hợp từ các nucleotide: các CKS nhóm nucleotide.
- CKS được tổng hợp từ propionate và đường: nhóm macrolit.
Sản phẩm CKS sinh ra từ VSV phụ thuộc nhiều vào: nhiệt độ, pH, độ thông khí,
hình thức len men, nguồn dinh dưỡng. Như vậy việc tối ưu hoá các điều kiện nuôi

cấy là một khâu hết sức quan trọng trong lĩnh vực nghiên cứu và sản xuất CKS.
1.4. Phân loại xạ khuẩn
Trong phân loại xạ khuẩn người ta dựa trên các đặc điểm hình thái, đặc điểm sinh
lý, sinh hóa.
1.4.1. Phân loại theo phương pháp truyền thống
Hệ thống phân loại chi Streptomyces dùng trong đề tài
Đó là hệ thống phân loại và định danh các loài Streptomyces của đề án phân
loại xạ khuẩn quốc tế ISP (Intenational Streptomyces Project). Hệ thống phân loại
của ISP dựa trên các tiêu chuẩn sau:
 Màu sắc khuẩn lạc: Màu sắc khuẩn lạc được chia thành các màu: màu trắng
(White-W), màu xám (Gray-Gy), màu đỏ (Red-R), màu vàng (Yellow-Y),
màu xanh lá cây (Green-Gn), màu xanh da trời (Blue-B), màu tím (Violet).
Trong trường hợp mà màu sắc khuẩn lạc rơi vào giữa hai màu thì cả hai màu
đó đều được ghi nhận (chẳng hạn, GyW).
 Sắc tố melanin: Xạ khuẩn được chia thành hai nhóm có hoặc không có khả
năng sinh melanin.
 Sắc tố khuẩn ty cơ chất: Cũng được chia thành hai nhóm là nhóm xác định
được và nhóm không xác định được. Trường hợp mà màu sắc nhạt như vàng
nhạt, vàng dầu hoặc là xám vàng được xếp vào nhóm không xác định.
 Sắc tố hòa tan: Các loại xạ khuẩn được chia thành hai nhóm, nhóm sinh sắc
tố hoà tan và nhóm không sinh sắc tố hòa tan.
 Hình thái cuống sinh bào tử: Các loài trong chi Streptomyces được chia thành
ba nhóm: Rectiflexibiles (RF)-cuống bào tử thẳng hay lượn sóng,
13
Retinaculiaperti (RA)-cuống bào tử xoắn đơn hình móc câu, và Spirales (S)-
cuống bào tử xoắn lò xo.
 Bề mặt bào tử: Dựa trên kết cấu bề mặt bào tử, xạ khuẩn được phân thành
các nhóm: nhẵn (Smooth-Sm), gai (Spiny-Sp), mụn cóc (Warty-Wa), và lông
(Hairy-Ha).
 Khả năng sử dụng nguồn cacbon: Có khả năng sử dụng nguồn cacbon là

dương (+), không có khả năng sử dụng là âm (-), và có thể sử dụng hoặc
không sử dụng thì ký hiệu là (±). Ngoài ra khi cần thiết có thể quan tâm đến
các đặc điểm sinh lý sinh hoá khác như khả năng khử nitrat, khả năng sinh
chất kháng sinh…
1.4.2. Phân loại theo phương pháp hiện đại
Để phân loại xạ khuẩn người ta sử dụng các tiêu chuẩn như trình tự gen mã hoá
ARNr 16S, lai ADN, hình thái, sinh lý sinh hóa và hóa phân loại. Hiện nay, đại đa
số các nhà khoa học đồng ý với quan niệm hai chủng được coi là hai loài riêng biệt
nếu chúng giống nhau dưới 70% khi tiến hành lai ADN. Keswani và cộng sự đã
chứng minh rằng nếu sự tương đồng giữa hai trình tự ADNr 16S là 98.6% thì xác
suất để mức độ giống nhau trong phép lai ADN thấp hơn 70% sẽ là 99%. Vì thế giá
trị tương đồng 98.6% của gen mã hoá ARNr 16S được coi là ngưỡng để phân biệt
hai loài khác nhau. Tuy nhiên, cũng có nhiều nhà khoa học lấy giá trị này là 98%.
Các nhà khoa học trên thế giới đều cho rằng mức độ tương đồng về trình tự
ARNr phản ánh mối quan hệ tiến hóa giữa các cá thể VSV. Tất cả các loài VSV
trong sinh giới đều sử dụng cùng một cách tổng hợp protein nhờ các riboxom. Vì
vậy người ta đã tiến hành so sánh trình tự nucleotit của gen mã hoá ARNr ở các
VSV khác nhau để xác định mối quan hệ giữa chúng. ARNr là phân tử lý tưởng cho
các nghiên cứu về tiến hoá của VSV và mối quan hệ giữa chúng bởi chúng là thành
phần cơ bản có trong mọi tế bào VSV. Vai trò và chức năng của chúng là giống
nhau ở tất cả các riboxom. Người ta nhận thấy cấu trúc không gian của phân tử
ARNr rất giống nhau giữa các loài VSV khác nhau. Nghĩa là cấu trúc của chúng
thay đổi rất chậm theo thời gian, hay nói cách khác các gen mã hoá cho chúng được
bảo tồn rất tốt trong quá trình tiến hoá. Tốc độ thay đổi các gen này trong quá trình
14
tiến hoá là rất chậm, có lẽ là bởi vì sự ổn định là tính chất quan trọng của chúng.
Nói chung các gen mã hoá cho ARNr rất bảo thủ, tuy nhiên ngay trong bản thân các
gen bảo thủ cũng chứa những vùng có mức độ bảo thủ cao hơn và cũng có những
vùng có mức độ bảo thủ thấp hơn (vùng biến đổi). Điều này có lẽ là do các vùng
gen đó mã hoá cho những vùng không gian khác nhau của phân tử ARNr. Trong

quá trình tiến hoá, các vùng gen đó có thể có những đột biến nhất định, nhưng chọn
lọc tự nhiên chỉ giữ lại những đột biến trung tính, ít ảnh hưởng tới sự tổng hợp
protein của sinh vật, còn những đột biến trong những vùng không gian quan trọng
làm ảnh hưởng đến quá trình sinh tổng hợp protein của cơ thể thì ngay lập tức sẽ bị
chọn lọc tự nhiên đào thải.
Dựa vào những vùng bảo thủ trong gen mã hoá cho ARNr các nhà khoa học đã
thiết kế các cặp mồi vạn năng để có thể khuếch đại các vùng biến đổi. So sánh sự
khác biệt giữa các vùng này, người ta có thể chỉ ra được những sự khác biệt giữa
các loài gần gũi [15].
Theo các nhà khoa học thì dung lượng phát sinh loài của phân tử ARNr 23S là
lớn hơn so với phân tử ARNr 16S. Tuy nhiên trình tự đã được xác định hoàn chỉnh
của gen ARNr 23S là rất ít trong khi đó trình tự của gen ARNr 16S là khá phong
phú và được công bố rộng rãi trên ngân hàng gen quốc tế. Chính vì vậy phương
pháp giải trình tự gen mã hoá ARNr 16S đã làm sáng tỏ mối quan hệ phát sinh
chủng loại của VSV vẫn là lý tưởng nhất. Lần xuất bản thứ nhất của cả “Bergey’s
Manual of Systemmatic Bacteriology” và “The Prokaryote” đều dựa vào tiêu chuẩn
ARNr 16S làm tiêu chuẩn phát sinh loài tương ứng của VSV. Chính vì vậy có thể
nói phương pháp xác định trình tự ARNr 16S là phương pháp phân tử phổ biến nhất
được dùng để định loại vi khuẩn [32].
Cây phát sinh chủng loại (cây phả hệ) được xây dựng dựa trên các khoảng cách
đã tính toán. Nó đang trở thành một công cụ đắc lực cho nghiên cứu phân loại ở các
cấp độ cao hơn chi [16]. Sự tương đồng giữa phép phân loại dựa trên các đặc điểm
kiểu hình (phenotyp) và cây phát sinh đã và đang được nghiên cứu một cách rộng
rãi. Nhìn chung các đặc điểm hoá phân loại đã đề cập ở trên cho thấy mối tương
quan tốt với cây phát sinh chủng loại.
15
Đặc biệt hóa phân loại là rất quan trọng trong việc phân loại xạ khuẩn. Chúng
rất có ích trong phân loại ở mức độ đến chi. Đó là những đặc điểm sau: đường, loại
acetyl, axit mycolic trong thành tế bào, menaquinone, photpholipit, axit béo và tỷ lệ
GC trong ADN.

1.5. Một số bệnh do nấm gây ra đối với thực vật
Các bệnh cây hàng năm đã gây ra cho nền nông nghiệp thế giới tổn thất hàng
trăm triệu tấn nông sản, trong các loại bệnh cây thì bệnh do nấm gây ra chiếm
khoảng 83% [7]. Theo kết quả nghiên cứu khoa học bảo vệ thực vật 1971 – 1976
của Viện bảo vệ thực vật trong số 24 bệnh hại cây lúa của Việt Nam có 13 bệnh do
nấm gây ra, 34 bệnh ở ngô có 26 bệnh do nấm và 21 bệnh ở khoai tây thì 8 bệnh do
nấm gây ra. Cũng theo một báo cáo khác thì trong 8 bệnh hại trên nhãn có 6 bệnh là
do nấm gây ra, 8 bệnh ở vải có 7 bệnh do nấm gây ra, 10 bệnh ở lạc thì có 9 bệnh do
nấm gây ra [1]. Những bệnh chủ yếu là: đạo ôn, khô vằn, mốc sương, thối rễ, đốm
quả…
1.5.1. Bệnh đạo ôn
Là bệnh do nấm Pyricularia oryzae đây là bệnh thường gây hại trên cây lúa.
Bệnh phân bố rộng rãi và thường gặp ở 70 nước trên thế giới [21]. Pyricularia
oryzae gây ra các đốm hoặc các vết thương trên lá, đốt và các hạt phấn của bông
hay hạt. Bệnh đạo ôn trổ bông làm cho cả bông lúa khô đi và toàn bộ hạt bị lép.
Bệnh có thể phát sinh từ thời kỳ mạ đến lúa chín. Bệnh đạo ôn phát triển phụ thuộc
vào khí hậu từng vùng và được xảy ra do các nơi khác nhau, ở các vùng khác nhau
[11].
1.5.2. Bệnh thối rễ
Bệnh do nhiều loại nấm gây ra: Fusarium spp, Phytophtora spp, Botrytis
cinerecinera, Rhizoctonia solani nhưng chủ yếu là do Fusarium spp gây ra. Chúng
xâm nhập vào cây qua vết thương thường là phần thân dưới và rễ ngang. Cây bị
bệnh thối rễ sẽ chết héo do không hút được nước. Fusarium là loại nấm phân bố
rộng rãi ở tất cả các vùng địa lý trên thế giới, sống hoại sinh trong đất, trên xác thực
vật và ký sinh trên cây. Nó có khả năng gây bệnh cao đối với nhiều loại cây, mặt
khác nó còn sản sinh độc tố gây những bệnh nguy hiểm cho động vật hoang dã, vật
16
nuôi và con người [12]. Fusarium oxysporum ký sinh trên hệ rễ gây thối rễ. Ở khoai
tây thiệt hại do Fusarium oxysporum gây ra cả trên đồng ruộng và trong bảo quản
chiếm tới 20% sản lượng thu hoạch.

Ngoài ra, Fusarium oxysporium còn gây bệnh khác như bệnh héo vàng trên
cây chuối, cà chua, cây dưa và bầu bí, bệnh mốc hồng và bệnh thối thân ở cây ngô
[13]. Nấm Fusarium oxysporum còn gây bệnh chết héo và bệnh thối rễ ở nhiều loại
cây lương thực, cây công nghiệp và cây rau.
1.5.3. Bệnh khô vằn
Bệnh do nấm Rhizoctonia solani, địa bàn phân bố của nấm khá rộng rãi ở các
nước trồng lúa vùng châu Á và các châu lục khác. Lúa có thể giảm năng suất từ 20
– 25 % khi bị bệnh phát triển lên đến lá đòng (Hori, 1969). Bệnh khô vằn gây hại
chủ yếu ở một số bộ phận của cây như bẹ lá, phiến lá, và cổ bông.
1.5.4. Bệnh mốc sương ở khoai tây và cà chua
Bệnh có nguồn gốc phát triển đầu tiên ở Nam Mỹ, do nấm Phytophthora
infestans gây ra. Bệnh cũng phá hoại nghiêm trọng, gây thiệt hại kinh tế khá lớn đối
với nhiều nước trồng khoai tây trên thế giới. Bệnh mốc sương gây hại ở tất cả các
bộ phận của cây [14].
1.6. Sử dụng CKS và xạ khuẩn trong bảo vệ thực vật
1.6.1. Sử dụng xạ khuẩn chống nấm gây bệnh thực vật
Sự đối kháng của các vi sinh vật trong đất là cơ sở của biện pháp đấu tranh
sinh học phòng chống bệnh cây. Do vậy, đã từ lâu các nhà khoa học trên thế giới đã
nghiên cứu và tuyển chọn các chủng xạ khuẩn có khả năng ức chế nấm gây bệnh
thực vật. Nơi nào có mặt vi sinh vật đối kháng trong đất thì tỷ lệ cây bị bệnh giảm
đi rõ rệt. Sự có mặt của xạ khuẩn đối kháng trong đất làm giảm rõ rệt tỷ lệ mắc bệnh
của cây [13]. Khi điều tra về xạ khuẩn đối kháng trong đất ở Nhật Bản Kuradu nhận
thấy nơi nào có nhiều xạ khuẩn trong đất thì ở đó các chủng Fusarium bị biến mất
nhanh chóng [35].
Thông thường một loài xạ khuẩn đối kháng có thể ức chế, hoặc tiêu diệt một
vài loại nấm gây bệnh, nhưng cũng có loài có phổ rộng. Tuy nhiên việc sử dụng các
17
chủng có phổ rộng phải thận trọng để tránh làm ức chế các khu hệ vi sinh vật có lợi
trong vùng rễ.
Xạ khuẩn chống nấm ngoài việc tiết ra các CKS, còn tác động lên khu hệ vi

sinh vật thông qua các enzyme dung giải [39]. Ngoài ra, nhiều xạ khuẩn còn tiết ra
các chất kích thích sinh trưởng thực vật cũng như kích thích các vi sinh vật có lợi
trong vùng rễ.
1.6.2. Ứng dụng của các CKS trong bảo vệ thực vật
Các chất kháng sinh được sử dụng trong bảo vệ thực vật chậm hơn so với
việc dùng trong y học và chăn nuôi thú y. Tuy nhiên chúng có triển vọng rất lớn
trong thực tế sản xuất bởi CKS có nhiều ưu thế so với thuốc hóa học dùng trong bảo
vệ thực vật, chúng tiêu diệt vi sinh vật gây bệnh ngay ở nồng độ thấp, có tác dụng
nhanh, thời gian phân hủy ngắn và có tác dụng chọn lọc cao, độ độc thấp, có khả
năng ức chế vi sinh vật đã kháng thuốc hóa học và con người cũng đã nhận thức rõ
mặt trái của việc sử dụng những chất hóa học trong bảo vệ thực vật. Việc áp dụng
các biện pháp phòng trừ sinh học là rất cần thiết để tạo nên một nền nông nghiệp an
toàn.
Ngày nay, các CKS trong bảo vệ thực vật đã được sử dụng có hiệu quả
thường được dùng dưới dạng các chế phẩm như là: thuốc chống nấm blastixidin,
kasugamyxin…; thuốc chống vi khuẩn streptomyxin, oxytetracylin…; thuốc trừ sâu
avermectin – B, milbemctins…; thuốc diệt cỏ bilanafos và các chất điều hòa sinh
trưởng của cây như là gibberellin [39]. Ở Nhật Bản, người ta đã có những chế phẩm
chống đạo ôn và khô vằn rất có hiệu quả như: blastixidin S chiết từ S.
griseochromogenes, kasugamixin từ S. kaysugaensis, và validamixin từ S.
hygroscopicus. Ở Ấn Độ sử dụng aureofulvin chống bệnh thối cổ rễ. Ở Anh và một
số nước châu Âu cũng đã sử dụng griseofulvin trong nông nghiệp để chống các
bệnh ở cây trồng [21]. Tại Việt Nam, hiện nay có sử dụng nhiều loại thuốc như:
validamycin chống bệnh khô vằn, polyoxin complex chống bệnh đen lá,
streptomycin chống bệnh bạc lá hại lúa… Mặc dầu đã thu được những thành tựu từ
việc sử dụng CKS trong bảo vệ thực vật, song việc sử dụng CKS trong lĩnh vực này
còn ở mức độ thấp. Bởi do thói quen chỉ dung một số loại thuốc BVTV đã quen
18
dùng, thường là những loại thuốc có độ độc cao đã bị cấm hoặc hạn chế sử dụng
như: Furadan 3G, sát trùng linh 15EC, Aldrin, DDT… [7],[ 9] hơn nữa giá của các

chế phẩm sinh học còn đắt. Do đó cần có sự phối hợp một cách có kế hoạch trong
việc tìm kiếm CKS mới và xây dựng biện pháp đấu tranh sinh học, phối hợp với các
biện pháp hóa học để đem lại những hiệu quả to lớn trong phòng chống bệnh và
nâng cao hiệu suất cây trồng, bảo vệ môi trường, sức khỏe cộng đồng cũng như
nâng cao hiệu quả kinh tế.
19
CHƯƠNG 2
NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP
2.1. Nguyên liệu
2.1.1. Chủng giống
Các chủng xạ khuẩn được phân lập từ các mẫu đất ở Khánh Hòa: Hồ cá Trí
Nguyên, suối nước nóng Ninh Hòa, hòn Chồng, bãi Dương, Trường Xuân- Ninh
Hòa, hòn Mun, hòn Một.
Các chủng VSV kiểm định: Fusarium moniliform; Shigella flexneri;
P.enteridis; Pseudomonas aeruginosa; Rhizoctonia solani; Bacillus subtilis; Sarcina
lutea; Pyricularia oryzae; Klebsiella sp; Ralstonia solanacearum; E.coli; Candida
albicans; Staphylococcus aureus; Fusarium oxysporum; Proteus mirabilis;
Salmonella typhi; Phytopthra capcisi của Bảo tàng Giống chuẩn VSV, Trung tâm
Công nghệ Sinh học- ĐHQGHN và Viện Bảo vệ Thực vật cung cấp.
- Nội dung nghiên cứu
1. Phân lập và tuyển chọn một số chủng xạ khuẩn có hoạt tính kháng sinh từ
môi trường tự nhiên ở Khánh Hòa.
2. Nghiên cứu các đặc điểm sinh học của các chủng đã tuyển chọn.
3. Thăm dò khả năng ứng dụng của một số chủng có hoạt tính kháng sinh nhằm
định hướng nghiên cứu trong bảo vệ thực vật.
4. Bước đầu tiến hành lựa chọn dung môi thích hợp để tách chiết chất kháng
sinh.
2.1.2. Hóa chất và dụng cụ
2.1.2.1. Hóa chất
 Các hóa chất làm môi trường: pepton, tinh bột tan, thạch, cao men, các loại

đường chuẩn: glucoza, xyloza, fructoza, inositol, mannitol, arabinoza,
raffinoza (Sigma).
 Các hóa chất dùng làm thuốc thử hoạt tính enzyme: iot tinh thể, KI, acid
acetic (Sigma).
 Các hóa chất dùng trong phân loại: Tris-HCl; EDTA; SDS; isoamyl alcohol;
agaroza; ethilium bromid (Sigma).
20
 Các dung môi: n-butanol, ethyl-acetat, iso-propanol, methanol, chloroform,
n- hexan của Trung Quốc, ethanol của Việt Nam.
2.1.2.2. Dụng cụ
Máy lắc ổn nhiệt, máy đo pH, máy li tâm; máy ly tâm lạnh, tủ cấy vô trùng,
tủ ấm, tủ sấy, cân điện tử, lò vi sóng, tủ lạnh, nồi hấp khử trùng.
2.2. Phương pháp nghiên cứu
2.2.1. Phương pháp phân lập và tuyển chọn
2.2.1.1. Phân lập xạ khuẩn theo phương pháp Vinograski
Cân 10g mẫu đất cho vào bình tam giác có chứa 90ml nước máy đã vô trùng
sau đó lắc trong 15 phút cho tan đều. Chuẩn bị các ống nghiệm chứa 9ml nước máy
đã vô trùng để pha loãng mẫu: từ 10
-2
đến 10
-7
. Dùng pipet man hút 0.1ml dung dịch
đã pha loãng ở các nồng độ trên 10
-3
nhỏ vào các đĩa thạch chứa môi trường ISP
4
có
pH 6.5 – 7. Dùng que gạt vô trùng trang đều trên bề mặt thạch, sau đó nuôi trong tủ
ấm ổn nhiệt ở 37
o

C. Sau 3-5 ngày lấy ra quan sát và tách các khuẩn lạc mọc riêng rẽ
(tinh sạch), rồi cấy chuyền sang các ống nghiệm chứa môi trường thạch nghiêng
ISP
4
và tiếp tục nuôi ở điều kiện trên trong 10- 14 ngày. Theo ISP màu sắc khuẩn ty
khí sinh của các chủng xạ khuẩn được chia thành 8 nhóm màu: nhóm trắng (W),
nhóm xám (G
y
), nhóm đỏ (R), nhóm vàng (Y), nhóm lục (G
n
), nhóm xanh da trời
(B), nhóm tím (V), và nhóm không xác định (X) [23]
2.2.1.2. Phương pháp xác định hoạt tính kháng sinh (HTKS)
a. Phương pháp thỏi thạch để sơ tuyển xạ khuẩn [7]
Xạ khuẩn được nuôi trên ISP_4 trong các đĩa Petri. Sau 7 ngày, dùng khoan
nút chai khoan các thỏi thạch đặt vào môi trường đã cấy VSV kiểm định. Để trong
tủ lạnh từ 4-8 giờ cho CKS khuếch tán vào môi trường, rồi đặt vào tủ ấm. Vi khuẩn
kiểm định nuôi ở 37
0
C, nấm men và nấm mốc nuôi ở 28- 30
0
C, đọc kết quả sau một
ngày đối với vi khuẩn, 3 ngày đối với nấm. HTKS được xác định bằng kích thước
vòng vô khuẩn (D-d, mm). D là kích thước vòng vô khuẩn, d là kích thước thỏi
thạch.
21
b. Phương pháp đục lỗ - xác định HTKS trong môi trường dịch thể
Dùng khoan nút chai đục các lỗ trên môi trường thạch đã cấy VSV kiểm định
trong đĩa Petri. Nhỏ dịch lọc sau nuôi cấy. Các bước tiếp theo tiến hành như phương
pháp thỏi thạch.

2.2.1.3. Tuyển chọn các chủng xạ khuẩn sinh CKS
Từ ống thạch nghiêng giống đã hoạt hóa được cấy chuyền sang các bình tam
giác dung tích 250ml chứa 100ml môi trường ISP_4 dịch thể và nuôi lắc 220v/ph
trong 120 giờ. Sau đó thử HTKS trong dịch lọc.
2.2.2. Bảo quản giống
Các chủng xạ khuẩn đã được lựa chọn cấy trên môi trường thạch nghiêng
ISP_4, để vào tủ ấm 37
0
C. sau 10-14 ngày khi xạ khuẩn đã mọc tốt, các ống giống
được bảo quản trong tủ lạnh ở 4-6
0
C. sau 2-3 tháng cấy chuyền lại một lần
Để bảo quản được lâu giống được giữ trong ống cát, trong paraffin lỏng vô
trùng giữ lạnh sâu trong glycerin hoặc đông khô, bảo quản được từ 6 tháng đến 2
năm.
2.2.3. Phương pháp xác định trọng lượng sinh khối khô
Giấy lọc được sấy khô ở 105
0
C trong 2 giờ đến trọng lượng không đổi, cân
nhanh trên cân điện tử. Lọc dịch nuôi, lại đem sấy khô đến trọng lượng không đổi.
Cân lại giấy lọc. Trọng lượng sinh khối khô của tế bào (P) được tính theo công thức
P= P2- P1 (P2: trọng lượng khô của giấy lọc và tế bào, P1: trọng lượng của giấy
lọc).
2.2.4. Nghiên cứu đặc điểm sinh học và phân loại
2.2.4.1. Đặc điểm nuôi cấy
Các chủng xạ khuẩn được nuôi trên môi trường: Gause I, Gause II, ISP_4, 79
ở nhiệt độ thích hợp (25- 30
O
C), sau 7, 14, 21 ngày lấy ra quan sát một số đặc điểm
về khả năng sinh trưởng, màu sắc KTKS, KTCC và sự hình thành sắc tố hòa tan

[23].
2.2.4.2. Đặc điểm sinh lý, sinh hóa
- Khả năng hình thành enzym ngoại bào: Các chủng xạ khuẩn được nuôi cấy lắc
trên môi trường thích hợp, sau 3 ngày lọc dịch nuôi và xác định hoạt tính enzym