nghiên cứu chuyển nạp gen hiv-1 p24 tạo protein kháng nguyên vào lục

ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP.HCM
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
NCS. PHAN TƯỜNG LỘC
NGHIÊN CỨU CHUYỂN NẠP GEN
HIV-1 p24 TẠO PROTEIN KHÁNG
NGUYÊN VÀO LỤC LẠP CÂY THUỐC
LÁ (Nicotiana tabacum L.) BẰNG
PHƯƠNG PHÁP BẮN GEN
Chuyên ngành: Hóa Sinh học
Mã số chuyên ngành: 62 42 30 15
TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC
Tp. Hồ Chí Minh – Năm 2013
Công trình được hoàn thành tại: Phòng Công nghệ Gen,
Viện Sinh học Nhiệt đới.
Người hướng dẫn khoa học: TS. Nguyễn Thị Thanh
TS. Nguyễn Hữu Hồ
Phản biện 1: PGS.TS. Trần Văn Minh
Phản biện 2: PGS.TS. Bùi Văn Lệ
Phản biện 3: TS. Vương Đình Tuấn
Phản biện độc lập 1: PGS.TS. Phạm Xuân Hội
Phản biện độc lập 2: PGS.TS. Chu Hoàng Hà
Luận án sẽ được bảo vệ trước Hội đồng chấm luận
án cấp cơ sở đào tạo họp tại:
Trường Đại học Khoa học Tự Nhiên
vào hồi giờ ngày tháng năm
Có thể tìm hiểu luận án tại thư viện:
1. Thư viện Tổng hợp Quốc gia Tp.HCM
2. Thư viện trường Đại học Khoa học Tự Nhiên-HCM
CHƯƠNG 1. MỞ ĐẦU
Đề tài “Nghiên cứu chuyển nạp gen HIV-1 p24 tạo protein kháng
nguyên vào lục lạp cây thuốc lá (Nicotiana tabacum L.) bằng phương pháp

bắn gen” đã được thực hiện tại Phòng Công nghệ Gen, Viện Sinh học Nhiệt
đới.
1.1. Mục đích nghiên cứu
Tính cấp thiết
HIV là một đại dịch mà cho đến thời điểm này vẫn chưa có một liệu
pháp triệt để nào để phòng ngừa hoặc loại bỏ hoàn toàn virus HIV ra khỏi
cơ thể người đã nhiễm bệnh. Cách điều trị lý tưởng hiện nay là kết hợp
nhiều liệu pháp kháng virus để kéo dài và cải thiện chất lượng cuộc sống
người bệnh. Tạo vaccine phòng chống HIV được xem là hướng nghiên cứu
có nhiều tiềm năng và khả thi.
Protein capsid HIV-1 p24 là một marker sớm có thể gây tạo đáp ứng
miễn nhiễm dịch thể và tế bào. Do đó, protein này được xem là một kháng
nguyên thích hợp, để phát triển thành các vaccine HIV đa thành phần và đã
bước đầu được thử nghiệm chữa trị. Ngoài ra protein p24 cũng được ứng
dụng trong công nghệ tạo các kit chẩn đoán HIV trong giai đoạn nhiễm
sớm và muộn.
Biểu hiện protein HIV-1 p24 tái tổ hợp, có đặc điểm miễn nhiễm như
nguyên bản, ổn định, bền vững với số lượng lớn, qua con đường thực vật là
rất thiết thực và có ý nghĩa nhằm đáp ứng các nhu cầu nêu trên.
Mục đích của đề tài là nghiên cứu chuyển gen HIV-1 p24 vào lục lạp
giống thuốc lá Virginia có năng suất cao, được thuần hóa và trồng phổ biến
ở Việt Nam; kiểm tra, đánh giá sự sinh trưởng và phát triển của cây chuyển
gen, sự biểu hiện của protein tái tổ hợp HIV-1 p24.
Tính mới của đề tài
- Xây dựng quy trình chuyển gen vào lục lạp bằng phương pháp bắn gen
trên giống thuốc lá Virginia đã được thuần hóa tại Việt Nam.
- Chuyển thành công gen HIV-1 p24 vào lục lạp cây thuốc lá Virgnia.
1
- Cây thuốc lá Virginia chuyển gen HIV-1 p24 biểu hiện protein p24 ổn
định và có kiểu hình bình thường.

1.2. Nội dung và phạm vi của vấn đề nghiên cứu
- Chuẩn bị nguồn plasmid dùng để chuyển gen lục lạp thuốc lá.
- Ứng dụng các phương pháp nuôi cấy mô để tạo nguồn nguyên liệu in
vitro phục vụ chuyển gen, xây dựng hệ thống tái sinh, khảo sát các yếu tố
chọn lọc đối với mô, cây thuốc lá.
- Xây dựng qui trình chuyển gen vào lục lạp cây thuốc lá bằng phương
pháp bắn gen.
- Chọn lọc và thu nhận cây chuyển gen.
- Phân tích sinh học phân tử về di truyển cây thuốc lá chuyển gen lục
lạp.
- Phân tích biểu hiện protein HIV-1 p24 tái tổ hợp trong cây thuốc lá
chuyển gen lục lạp.
1.3. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn
- Công trình tạo ra cây thuốc lá Virginia chuyển gen biểu hiện protein
HIV-1 p24 ở lục lạp với thành công bước đầu có thể làm cơ sở để phát triển
các chiến lược biến nạp gen tiên tiến hơn để nâng cao hàm lượng protein tái
tổ hợp tích lũy.
- Protein HIV-1 p24 tái tổ hợp có thể được dùng để nghiên cứu trong
các hướng phối hợp tạo vaccine phòng chống bệnh cũng như các kit chẩn
đoán HIV.
- Đối với công tác nghiên cứu khoa học tại cơ sở thực hiện, đề tài đóng
góp xây dựng hoàn thiện các quy trình chuyển gen lục lạp ở thuốc lá nói
riêng và ở thực vật nói chung, kiện toàn các điều kiện phân tích sinh học
phân tử như PCR, Southern blot, Western blot, ELISA. Bên cạnh đó đề tài
cũng bước đầu xây dựng được các mô hình cơ bản về ly trích, tinh sạch
protein từ thuốc lá chuyển gen lục lạp.
CHƯƠNG 2. TỔNG QUAN
Dược liệu sinh học như kháng thể và kháng nguyên vaccine tái tổ hợp
2
flank

flank
Prrn
TrbcL
Hiv-1 p24
TpsbA
aadA
Prrn
trnG
trnfM
đã được sản xuất ở vi khuẩn, nấm men hoặc tế bào động vật. Thực vật và tế
bào thực vật đã tham gia như một nhóm chuyên biệt trong nền tảng sản
xuất này khá trễ, nhưng cho thấy có nhiều ưu điểm tiềm năng so với các hệ
thống đã được thành lập, đặc biệt trong góc độ kinh tế, quy mô, thời gian
đáp ứng và các tùy chọn mô hình. Trong đó biểu hiện protein tái tổ hợp
thông qua chuyển gen lục lạp là hướng tiên tiến nhất.
CHƯƠNG 3. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP
3.1. VẬT LIỆU
3.1.1. Giống thuốc lá
Cây thuốc lá giống Virginia TBE2 (V2) được vô mẫu in vitro và giữ
giống dùng làm nguyên liệu thí nghiệm.
3.1.2. Vector chuyển gen
Sơ đồ 3.1.1. Cấu trúc vector pITB.HIV-1 p24
Plasmid pITB.HIV-1 p24, do TS. Nguyễn Thị Thanh (Viện Sinh học
Nhiệt đới) thiết kế và cung cấp, dùng để biến nạp gen vào lục lạp thuốc lá,
có kích thước 8344 bp, riêng trình tự gen cần chuyển chèn vào giữa hai vị
trí sườn bên khoảng 2,4 kb. Cấu trúc vector như sơ đồ 3.1.1, mang các gen
và các promoter đặc hiệu như sau:
- aadA: gen mã hóa men aminoglycoside adenylyltransferase, quy định
tính kháng hai loại kháng sinh spectinomycin và streptomycin dùng để
chọn lọc đối tượng chuyển gen.

- HIV-1 p24: gen mã hóa protein HIV-1 p24, là protein vỏ capsid virus
HIV.
- Prrn: promoter đặc hiệu biểu hiện mạnh ở lục lạp (Promoter rRNA).
- TpsbA, TrbcL: trình tự kết thúc (terminator) từ gen psbA và gen rbcL
(RUBISCO tiểu đơn vị lớn) ở lục lạp.
3
- Flank: đoạn trình tự gen lục lạp trnG, trnfM là đoạn đồng dạng với
mục đích thực hiện tái tổ hợp, hòa nhập cấu trúc chuyển gen vào bộ gen lục
lạp (lạp thể).
3.1.3. Môi trường nuôi cấy mô thực vật và vi khuẩn
- Môi trường nuôi cấy mô cơ bản là môi trường có thành phần khoáng
MS, vitamin B5, pH 5,8.
+ Môi trường rắn: môi trường cơ bản có bổ sung agar 9 g/l.
+ Các chất điều hòa sinh trưởng thực vật BAP, NAA.
- Môi trường LB dùng để nuôi cấy E.coli.
3.2. PHƯƠNG PHÁP
3.2.1. Xây dựng hệ thống tái sinh từ mô lá thuốc lá in vitro
Nuôi cấy các mảnh lá thuốc lá có kích thước khoảng 1 x 1 cm trên môi
trường tái sinh, có thành phần môi trường cơ bản, được bổ sung tổ hợp các
chất điều hòa sinh trưởng khác nhau gồm NAA (0,1; 0,2; 0,3) và BAP (0,5;
1; 1,5) để khảo sát sự phát sinh hình thái của mô lá và chọn môi trường tái
sinh hiệu quả nhất.
3.2.2. Khảo sát ảnh hưởng của kháng sinh chọn lọc streptomycin và
spectinomycin đối với tính chống chịu tự nhiên của mô lá, đoạn thân
Mô lá có kích thước khoảng 1 x 1 cm và đoạn thân mang chồi nách
được nuôi cấy trên môi trường có bổ sung các kháng sinh ở nồng độ khác
nhau để khảo sát mức độ ức chế của các kháng sinh lên sự tái sinh chồi ở
mô lá cũng như sự phát triển thành cây hoàn chỉnh từ đoạn thân, qua đó
thiết lập nồng độ chọn lọc phù hợp.
Nồng độ kháng sinh sử dụng trong thí nghiệm, với streptomycin là 15,

25, 40, 50, 60, 75, 100, 125, 150; và spectinomycin là 15, 25, 40, 60, 80,
110, 140 (mg/l).
3.2.3. Phương pháp bắn gen (biolistic)
Ly trích và tinh sạch vector plasmid pITB.HIV-1 từ sinh khối vi khuẩn
E.coli. Bọc DNA plasmid vào hạt vàng (coating) và trải lên các vật liệu
mang của thiết bị bắn gen. Bắn gen vào mô lá trong thiết bị Bio-Rad PDS -
4
1000/He, với áp lực để tạo gia tốc là 1100 PSI, khoảng cách đặt mẫu là 6
cm.
- Lá sau khi bắn được ủ trong tối 2 ngày trên cùng môi trường, rồi được
cắt thành những mảnh kích thước (0,5-1) x (0,5-1) cm và chuyển sang môi
trường tái sinh chọn lọc.
3.2.4. Chọn lọc thể chuyển gen
Các thể chuyển gen được chọn lọc trên hai loại kháng sinh là
spectinomycin và streptomycin, đến nồng độ tối đa là 500 mg/l.
3.2.5. Điện di DNA
Điện di DNA trên gel Agarose 0,8%, với các ladder 1 kb và λHindIII.
3.2.6. Phân tích PCR
- Ly trích DNA các dòng thuốc lá.
- Mồi và các đoạn khuếch đại mong muốn:
+ Gen aadA, mồi xuôi aadAp1: AACCTCCTATAGACTAGGC, mồi
ngược aadAp2: AGCGAAATGTAGTGCTTACG, KTĐKĐ: 250 bp.
+ Gen HIV-1 p24, mồi xuôi p24 for:ATGGCTAGCGGATCCCCTATT,
mồi ngược p24 rev TCTAGAGGAATTCTACTCAGCTTTATGTC,
KTĐKĐ: 700 bp.
+ Gen trnG - gen trnfM, mồi cpT1: GGATTTGGTATAGTTGGCC,
mồi cpT2: CTTGTTTATCTATTAGTTTTCAGT, KTĐKĐ: 255 bp
(nguyên bản). KTĐKĐ: ~ 2,65 kb (chuyển gen).
+ Gen trnG - gen HIV-1 p24, mồi cpT1:
GGATTTGGTATAGTTGGCC mồi p24 rev

TCTAGAGGAATTCTACTCAGCTTTATGTC KTĐKĐ: ~ 2,3 kb
(chuyển gen).
(KTĐKĐ: kích thước đoạn khuếch đại)
3.2.7. Phân tích Southern blot
Phương pháp Southern blot không phóng xạ được thực hiện dựa trên
quy trình của McCabe và cs (1997).
5
~ 5,9 kb

TpsbA
TrbcL
Mẫu dò (probe) đặc hiệu gen psaB kích thước 543 bp được đánh dấu
theo phương pháp DIG bằng PCR dùng để phát hiện trình tự DNA cần
kiểm tra thông qua lai phân tử.
Trình tự đoạn cắt ở lục lạp cây thuốc lá nguyên bản là 3,5 kb và ở cây
thuốc lá chuyển gen với đoạn hòa nhập mục tiêu như sơ đồ là ~ 5,9 kb.

Sơ đồ 3.2.1. Sơ đồ các gen chuyển vào lục lạp và vị trí giới hạn
3.2.8. Phân tích Western blot
Protein tổng số được ly trích từ lá và dùng SDS - PAGE phân tách thành
các băng theo trọng lượng phân tử. Các băng protein trên gel được chuyển
sang màng và được dò tìm thông qua sự kết hợp với kháng thể đặc hiệu và
sau đó được phát hiện bởi kết hợp với kháng thể đặc hiệu loài liên kết các
yếu tố tạo phát quang horseradish peroxidase.
3.2.9. Phân tích ELISA
Protein tổng số được ly trích từ lá và được phân tích bằng phương pháp
ELISA sandwich trực tiếp để định lượng hàm lượng protein tích lũy trong
cây. Hai kháng thể được sử dụng là kháng thể đặc hiệu kháng nguyên kết
hợp trên pha rắn và kháng thể đặc hiệu kháng nguyên liên kết với yếu tố
phát quang alkaline phosphatase.

CHƯƠNG 4: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN
4.1. Xây dựng hệ thống tái sinh từ mảnh lá thuốc lá V2
Mô lá thuốc lá được cho tái sinh trên môi trường có tổ hợp BAP và
NAA ở các nồng độ khác nhau cho thấy:
Ở kết quả khảo sát ở tuần thứ 5 (Bảng 4.1.1), nghiệm thức 4 có 100%
mảnh lá tái sinh và số lượng chồi tái sinh nhiều nhất trung bình là 113 chồi/
6
3,5 kb cây nguyên bản
trnS
ycf9
trnG
Bglll
Bglll
Prrn
rps14
trmfM
Prrn
psaC
HIV-1 p24
aadA
psaB
nghiệm thức, tập trung ở mép mô lá, mô sẹo rất ít, hầu như không có (Hình
4.1.1). NT4, có tổ hợp chất điều hòa sinh trưởng BAP 1 mg/l và NAA 0,1
mg/l được sử dụng làm môi trường tái sinh cho các thí nghiệm tiếp theo.
Bảng 4.1.1. Giống thuốc lá V2 tái sinh chồi trên môi trường có bổ
sung các tổ hợp chất điều hòa sinh trưởng NAA và BAP khác nhau.
Các giá trị trung bình theo sau không cùng mẫu tự trong cùng một cột có
sự khác biệt rất có ý nghĩa ở mức p = 0,01 dựa theo trắc nghiệm Duncan.
7
Nghiệm

thức
NAA (mg/l) BAP (mg/l) Số chồi trung bình tái sinh
trên một nghiệm thức
1 0,1 0,5 35,33 e
2 0,2 0,5 56,67 de
3 0,3 0,5 52,33 de
4 0,1 1 113,3 a
5 0,2 1 66,33 cd
6 0,3 1 88,33 b
7 0,1 1,5 51,33 de
8 0,2 1,5 50,67 de
9 0,3 1,5 86,00 bc
CV = 12,58 %
Hình 4.1.1. Sự tái sinh chồi của mô lá thuốc lá trên tổ hợp
chất điều hòa sinh trưởng BA 1 mg/l NAA 0,1mg/l.
4.2. Khảo sát ảnh hưởng của kháng sinh chọn lọc streptomycin và
spectinomycin lên sự tái sinh của mảnh lá và phát triển cây con từ
đoạn thân của giống thuốc lá V2
Mô lá được cho tái sinh trên môi trường có bổ sung các kháng sinh ở
nồng độ khác nhau và được quan sát từ ngày thứ 18 đến ngày thứ 30. Các
đoạn thân có chồi nách cũng được nuôi cấy trên môi trường MS có bổ sung
các kháng sinh tương tự và được quan sát từ ngày thứ 3 đến ngày thứ 30.
Khảo sát ảnh hưởng của streptomycin
Bảng 4.2.1. Ảnh hưởng của kháng sinh streptomycin lên
sự tái sinh chồi và hình thành rễ cây thuốc lá in vitro.
Nồng độ kháng sinh streptomycin (mg/l)
50 75 100 125 150
Tái sinh chồi ++++ +++ + - -
Hình thành rễ ++ ++ + - -
+: có tái sinh chồi hoặc hình thành rễ.

- : không có tái sinh chồi hoặc hình thành rễ.
Khảo sát ảnh hưởng của spectinomycin
Bảng 4.2.2. Ảnh hưởng của kháng sinh spectinomycin
lên sự tái sinh chồi và hình thành rễ cây thuốc lá in vitro.
+: có tái sinh chồi hoặc hình thành rễ.
8
Nồng độ kháng sinh spectinomycin (mg/l)
15 25 40 60 80 110
Tái sinh chồi ++++ ++ + - - -
Hình thành rễ ++ ++ - - - -
- : không có tái sinh chồi hoặc hình thành rễ.
Kết quả kháo sát cho thấy giống thuốc lá V2 in vitro nhạy cảm với
spectinomycin hơn streptomycin. Nồng độ gây ức chế tái sinh mô lá của
spectinomycin là từ 60 mg/l và streptomycin là từ 125 mg/l, trong khi nồng
độ gây ức chế sự phát triển cây con của spectinomyin là từ 40 mg/l và
streptomycin là từ 125 mg/l.
4.3. Bắn gen vào mô lá thuốc lá V2 và chọn lọc cây chuyển gen
- Plasmid pITB.HIV-1 p24 mang các cấu trúc gen cần chuyển vào lục
lạp thuốc lá, gồm Prrn/HIV-1 p24/TrbcL và Prrn/aadA/TpsbA, được ly
trích từ vi khuẩn E.coli, pha loãng đến nồng độ 1µg/ml và được bọc vào hạt
vàng để chuẩn bị bắn vào mô lá.
- Bắn plasmid vào mô lá được thực hiện trên 48 mẫu và cho tái sinh trên
môi trường có chất chọn lọc.
- Kháng sinh spectinomycin được dùng để chọn lọc trước ở nồng độ bắt
đầu là 100 mg/l, thu được 5 chồi phát triển tốt. Các chồi kháng tốt được
chuyển sang môi trường MS có bổ sung spectinomycin 100 mg/l cho sự
hình thành rễ và phát triển thành cây con hoàn chỉnh, nhận được 5 dòng cây
kháng tốt T1, T2, T3, T5, T6. Các cây này được cấy chuyền sang môi
trường MS có bổ sung spectinomycin tăng dần theo thang nồng độ 200,
300, 400, 500 (mg/l) qua mỗi lần cấy chuyền.

- Bốn dòng cây con có khả năng kháng kháng sinh và phát triển, được
ký hiệu là T1, T2, T5, T6. Một dòng không phát triển rễ, lá ngả vàng và
chết được ký hiệu là T3.
Bốn dòng T1, T2, T5, T6 sau đó sẽ được chọn lọc trên môi trường có bổ
sung hai loại kháng sinh chọn lọc là spectinomycin 500 mg/l và
streptomycin với nồng độ tăng dần theo thang nồng độ 125, 300, 500 (mg/l)
qua mỗi lần cấy chuyền. Trong quá trình chọn lọc này khi tăng kháng sinh
streptomycin từ 300-500 mg/l, một số mẫu chọn lọc có hiện tượng lá bị
loang lỗ trắng, mất màu diệp lục theo từng đốm trên mô và bề ngang bản lá
có thể bị thu hẹp. Tuy nhiên, sau các đợt chọn lọc thì hiện tượng này được
9
khắc phục, các cây con phát triển có hình thái bình thường. Cuối cùng,
những cây có khả năng kháng tốt được tiếp tục chọn lọc trên môi trường có
hai kháng sinh spectinomycin và streptomycin ở 500 mg/l.
Để quá trình đồng nhất hóa lục lạp (lạp thể) chuyển gen được triệt để,
các dòng đã qua chọn lọc trên được thực hiện 4 chu kỳ tái sinh chồi từ mô
lá trên môi trường có bổ sung hai loại kháng sinh spectinomycin và
streptomycin ở nồng độ 500 mg/l. Các cây sau chọn lọc phát triển tốt.
Mỗi đợt cấy chuyền tăng nồng độ kháng sinh cách nhau 3 tuần.
Tỉ lệ các dòng chuyển gen giả định nhận được, trên số mẫu lá của các
đợt bắn gen như sau (Bảng 4.3.1):
Bảng 4.3.1. Tỉ lệ các dòng thuốc lá sau chọn lọc, kháng spectinomycin
và streptomycin 500 mg/l, trên số lượng mẫu bắn gen.
Các đợt
bắn gen
Số mẫu lá
được bắn gen
Các dòng kháng
kháng sinh (từ các
event khác nhau)

Tỉ lệ các dòng kháng
kháng sinh/ số mẫu
chuyển gen
1 23 lá 2 dòng 8,7%
2 25 lá 2 dòng 8 %
Tỉ lệ trung bình các dòng chuyển gen thu được/số
mẫu chuyển gen
8,4%
Tỉ lệ trung bình các dòng chuyển gen giả định thu được trên tổng số
mẫu chuyển gen là 8,4% (Bảng 4.3.1).
Tần số chuyển gen ở giống thuốc lá V2 trong công trình nghiên cứu
thấp hơn so với ở giống thuốc lá Maryland Mammoth trong công trình của
McCabe và cs (2008) đạt mức 26,6%, tương đương với tỉ lệ chuyển gen
trên giống thuốc lá Petite Havana có tỉ lệ chuyển gen cao.
Tuy nhiên, các dòng V2 chuyển gen giả định sau khi chọn lọc triệt để
đều phát triển tốt trên môi trường được bổ sung 2 loại kháng sinh chọn lọc
spectinomycin và streptomycin ở nồng độ 500 mg/l và có kiểu hình bình
thường khi quan sát so với cây nguyên bản đối chứng. Kết quả này cũng
10
tương tự với với các dòng Maryland Mamooth (McCabe và cs, 2008) và
Petite Havana (Zhou và cs, 2008) chuyển gen với nhóm vector pZSJH1p24.
Dòng T3 kháng được spectinomycin ở nồng độ từ 100 - 200 mg/l và bị
chết khi chọn lọc ở nồng độ cao hơn có thể là dòng chuyển gen hoặc dòng
có đột biến tự phát.
4.4. Phân tích PCR các dòng thuốc lá V2 chuyển gen
Để kiểm tra bản chất di truyền của những cây thuốc lá V2 chuyển gen
giả định, các phân tích dựa trên PCR được thực hiện đối với các dòng T1,
T2, T3, T5, T6 nhằm xác định sự hiện diện của các cấu trúc gen chuyển
trong cây, sự ổn định của các liên kết sau quá trình tái tổ hợp đồng dạng, vị
trí hòa nhập gen trên lục lạp chuyển gen. DNA của cây được trích ly để

phân tích PCR.
Kiểm tra sự hiện diện của gen aadA và gen HIV-1 p24
Kết quả các sản phẩm PCR ở các dòng T1, T2, T3, T5, T6 cho thấy như
sau:
Hình 4.4.1. Phân tích PCR kiểm tra sự hiện diện của gen
aadA (với băng khuếch đại mong muốn 250 bp).
T1, T2, T3, T5, T6: các dòng thuốc lá chuyển gen giả định. PC:
Vector pITB.HIV-1 p24 đối chứng dương. V2: cây thuốc lá
nguyên bản đối chứng âm. Marker: 1 kb (Biolabs).
Như vậy, có thể kết luận các gen HIV-1 p24 và gen aadA đã được
chuyển vào các dòng thuốc lá T1, T2, T5, T6. Các dòng này sẽ được tiếp
tục phân tích các đặc điểm liên kết giữa các gen trong cấu trúc gen chuyển
11
250
bp
Marker V2 PC T1 T2 T3 T5 T6
và với các trình tự trên lục lạp.
Ngoài ra, khi phân tích dòng T3, không phát hiện trình tự khuếch đại
gen aadA, cho thấy dòng T3 không được chuyển nạp gen aadA. Do đó, có
thể giả định đây là dòng đột biến có khả năng kháng spectinomycin ở nồng
độ thấp.
Hình 4.4.2. Phân tích PCR kiểm tra sự hiện diện của gen
HIV-1 p24 (với băng khuếch đại mong muốn 700 bp).
T1, T2, T5, T6: các dòng thuốc lá chuyển gen giả định. PC:
Vector pITB.HIV-1 p24 đối chứng dương. V2: cây thuốc lá
nguyên bản đối chứng âm. Marker: 1 kb (Biolabs).
Kiểm tra trình tự từ gen HIV-1 p24 đến gen trnG
Hình 4.4.3. Phân tích PCR kiểm tra sự hiện diện của trình tự
liên kết từ gen trnG đến gen HIV-1 p24 (với các mồi cpt1 và
p24 rev, với băng khuếch đại mong muốn ~ 2,3 kb).

12
700 bp
3 kb
kb
0,5kb
Marker V2 PC T1 T2 T5 T6
~ 2,3 kb
Marker V2 PC T1 T2 T5 T6
T1, T2, T5, T6: các dòng thuốc lá chuyển gen. PC: vector
pITB.HIV-1p24 đối chứng dương. V2: cây nguyên bản đối chứng
âm. Marker: 1kb (Biolabs).
Đoạn trình tự liên kết giữa gen HIV-1 p24 và vị trí sườn bên trên gen
trnG được khuếch đại bằng PCR với hai mồi đặc hiệu, gồm một mồi xuôi
cpt1 bắt cặp ở vị trí gen trnG và một mồi ngược p24 rev bắt cặp ở vị trí gen
HIV-1 p24.
Kiểm tra trình tự từ trnfM và trnG

Hình 4.4.4. Phân tích PCR kiểm tra sự hiện diện của trình tự liên
kết từ gen trnfM đến gen trnG (với các mồi cpt1 và cpt2 với băng
khuếch đại mong muốn ~ 2,65 kb (cây chuyển gen) và 255 bp (cây
nguyên bản)).
T1, T2, T5, T6: các dòng thuốc lá chuyển gen. V2: cây nguyên bản đối
chứng âm. Marker: 1 kb (Biolabs). NC: nước cất.
Kết quả sản phẩm PCR cho thấy ở các dòng T1, T2, T5, T6 có các băng
khuếch đại đoạn trình tự đặc hiệu liên kết từ gen trnG đến HIV-1 p24 kích
thước ~ 2,3 kb (Hình 4.4.3) phù hợp với kích thước mong muốn. Ở cây V2
đối chứng không có băng khuếch đại tương ứng.
Hai thí nghiệm PCR khuếch đại trình tự gen HIV-1 p24 đến gen trnG
(1); và từ gen trnG đến gen trnfM, trình tự DNA chuyển vào lục lạp giữa
hai đầu đồng dạng (2) được thực hiện ở các dòng T1, T2, T5, T6 đều có kết

13
255 bp
Marker NC V2 T1 T2 T5 T6
~ 2,65 kb
quả dương tính. Ở thí nghiệm PCR (1) các băng sản phẩm PCR nhận được
từ 4 dòng T1, T2, T5, T6 có kích thước mong muốn là ~ 2,3 kb. Ở thí
nghiệm PCR (2) sản phẩm PCR của dòng V2 nguyên bản là băng khuếch
đại kích thước 255 bp và của các dòng chuyển gen T1, T2, T5, T6 là băng
khuếch đại kích thước ~ 2,65 kb. Các kết quả này cho thấy có sự hiện diện
của đoạn tái tổ hợp với liên kết các gen từ trnG, aadA, HIV-1 p24 và trnfM
nguyên vẹn như thiết kế trên vector trong các dòng chuyển gen. Ngoài ra, ở
các dòng chuyển gen T1, T2, T5, T6 hoàn toàn không có sự xuất hiện của
các băng khuếch đại lục lạp nguyên bản 255 bp đã gián tiếp chứng minh
rằng, trình tự gen chuyển thông qua tái tổ hợp đồng dạng đã được thực hiện
vào đúng vị trí hòa nhập mong muốn trên lục lạp và thay thế trình tự
nguyên bản; những dòng chuyển gen kiểm tra đã đạt được trạng thái đồng
nhất bộ gen lạp thể chuyển gen (Hình 4.4.4).
4.5. Phân tích Southern blot các dòng thuốc lá V2 chuyển gen
Ở thí nghiệm phân tích Southern blot, DNA bộ gen lục lạp từ các dòng
chuyển gen và đối chứng được cắt bằng enzyme cắt giới hạn BglII, tại 1 vị
trí cắt ở gen psaB và một vị trí cắt kề cận trnS như sơ đồ nằm ngoài hai vị
trí tái tổ hợp đồng dạng ở gen trnG và gen trnfM để kiểm tra các trình tự
gen chuyển.

Hình 4.5.1. Phân tích Southern blot các dòng thuốc lá
14
3,5 kb
Marker V2 T1 T2 T5 T6
~ 5,9 kb
2,3 kb

4,3 kb
T1, T2, T5, T6: các dòng chuyển gen có băng lai ở vị trí ~5,9 kb.
V2: cây nguyên bản có băng lai ở vi trí 3,5. Marker: λ/HindIII.
Kết quả ghi nhận được trên phim cho thấy (Hình 4.5.1) đoạn cắt đã
được chèn thêm trình tự gen chuyển. Điều này khẳng định trình tự DNA
cần chuyển thông qua tái tổ hợp đồng dạng đã hòa nhập vào đúng vị trí
đích mong muốn trên lục lạp. Đồng thời các kết quả cũng một lần nữa xác
định, ở thời điểm phân tích các dòng chuyển gen ở trạng thái đồng lạp thể
mang bộ gen đã được biến nạp. Đây là các dòng chuyển gen thế hệ T
o
.
4.6. Quy trình chuyển gen
- Cây thuốc lá V2 in vitro sau 1 tháng nuôi cấy đoạn thân.
- Lá trưởng thành, khoảng từ giữa cây trở lên có kích thước khoảng 4,5
cm (dài) x 2,5 cm (rộng) được dùng để bắn gen, được cắt và đặt trên môi
trường tái sinh qua đêm trước khi bắn.
- Vector plasmid được ly trích và bọc vào hạt vàng có đường kính 0,6
µm (coating) sau đó được bắn vào mô lá, ở khoảng cách 6 cm, với áp suất
1100 PSI trong thiết bị bắn gen của Bio-rad.
- Mẫu bắn được giữ nguyên trên môi trường và ủ trong tối 2 ngày, sau
đó được cắt thành các mảnh nhỏ khoảng 0,5 cm x 0,5 cm và cho tái sinh
chọn lọc mô trên môi trường tạo chồi, chọn lọc với spectinomycin ở nồng
độ 100 mg/l. Cấy chuyền cây kháng sau mỗi 3 tuần.
- Chọn lọc chồi tái sinh từ mô, cấy chuyền mô mỗi 3 tuần.
- Tách các chồi kháng tốt sang nuôi cấy trên môi trường tạo cây, chọn
lọc. Gia tăng nồng độ spectinomycin chọn lọc lên 200, 300, 400, 500 mg/l
và kết hợp kháng sinh chọn lọc thứ hai streptomycin từ 125 mg/l - 500
mg/l. Cấy chuyền cây kháng sau mỗi 3 tuần.
- Cây kháng và phát triển tốt được cho tái sinh lặp lại 4 chu kỳ trên hai
kháng sinh spectinomycin và streptomycin ở nồng độ 500 mg/l để nhận các

dòng thuần lục lạp chuyển gen.
- Cây chuyển gen giả định được phân tích di truyền để xác định sự biến
nạp gen và biểu hiện protein mong muốn.
15
4.7. Đặc điểm hình thái các dòng thuốc lá V2 chuyển gen
Đối với cây in vitro
Các dòng thuốc lá V2 nguyên bản và chuyển gen T1, T2, T5, T6 được
nuôi cấy in vitro từ đoạn thân trên môi trường MS, có bổ sung kháng sinh
spectinomycin 500 mg/l và streptomycin 500 mg/l ở các dòng chuyển gen.
Cây con phát triển tốt, sau 2 tháng có chiều cao thân từ 4-5 cm và khoảng
7-9 lá, hình thái không khác biệt giữa các dòng chuyển gen và dòng nguyên
bản.
Đối với cây ex vitro
Để khảo sát các đặc điểm hình thái trong điều kiện ex vitro giữa các
dòng chuyển gen và nguyên bản, các cây in vitro sau thời gian nuôi cấy 1
tháng, có chiều cao thân từ 3-4 cm và 4-7 lá được đưa ra ươm trồng trong
điều kiện nhà lưới có phủ nylon và lưới che nắng.
Các cây chuyển gen và nguyên bản phát triển bình thường, lá trưởng
thành có bản rộng, hình elip, đuôi lá hơi nhọn. Số lá từ 27 - 33 lá. Chiều
cao thân từ 128 - 143 cm. Kích thước lá tối đa có chiều dài khoảng 45 - 52
cm, chiều rộng khoảng 25 - 30 cm (Bảng 4.7.1).
Sau 60 - 70 ngày trồng, thuốc lá bắt đầu ra hoa, cánh hoa màu hồng
nhạt, tập trung thành các chùm. Tổng số hoa khoảng 25 - 50. Phần lớn hoa
đều đậu quả và phát triển tốt.
Quả hình thành sau khi ra hoa khoảng 1,5 tháng. Các quả sau 4 tháng kể
từ lúc ra hoa được thu nhận và bảo quản ở điều kiện hút ẩm, nhiệt độ 4
o
C.
So sánh các đặc điểm về hình thái, chiều cao cây, kích thước, màu sắc
và hình dạng của lá, hoa và quả giữa các cây chuyển gen T1, T2, T5, T6 và

cây V2 nguyên bản cho thấy không có sự khác biệt đáng ghi nhận.
Bảng 4.7.1 . Đặc điểm chiều cao thân và kích thước lá các dòng
V2 nguyên bản và chuyển gen trồng trong vườn ươm.
V2 nguyên bản T1 T2 T5 T6
Chiều cao tối đa thân (cm) 135 14 132 14 128
16
0 3
Chiều dài tối đa lá (cm) 48 47 50 52 45
Chiều ngang tối đa (cm) 29 25 30 28 27
Hạt thuốc lá của các dòng chuyển gen và V2 nguyên bản, sau thời gian
bảo quản 1 năm, được khử trùng và cho nảy mầm trên môi trường MS đối
với dòng V2 nguyên bản và có bổ sung spectinomycin 500 mg/l ở các dòng
chuyển gen T1, T2, T5, T6. Hạt của các dòng thuốc lá này chắc có khả
năng nảy mầm từ 90% và cây phát triển tốt.
So sánh với hai công trình chuyển gen HIV-1 p24 vào lục lạp thuốc lá
của hai tác giả McCabe (2008) và Zhou (2008), vector chuyển gen của
công trình này tương tự với vector pZSJH1p24 đã được hai tác giả nói trên
sử dụng. Mặc dù vị trí hòa nhập trên lục lạp được thiết kế khác nhau, ở
vector pITB.HIV-1 p24 là vị trí nằm giữa các gen trnG-trnfM trong khi ở
vector pZSJH1p24 là vị trí nằm giữa các gen accD-rbcL, nhưng cả hai vị trí
này đều nằm trên vùng bản lớn của lục lạp và chỉ có một phiên bản trên bộ
gen. Cây thuốc lá Maryland Mammoth của tác giả McCabe và Petite
Havana tác giả Zhou chuyển gen từ vector pZSJH1p24 của hai tác giả cũng
có kiểu hình xanh bình thường giống cây nguyên bản tương tự như các cây
thuốc lá V2 chuyển gen với vector pITB.HIV-1 p24.
4.8. Phân tích biểu hiện protein p24 bằng phương pháp Western blot ở
trong các dòng thuốc lá V2 chuyển gen
- Bốn dòng thuốc lá chuyển gen T1, T2, T5, T6 được kiểm tra sự biểu
hiện của protein p24 bằng phương pháp Western blot.
- Lá từ các dòng thuốc lá trồng ở vườn ươm khoảng 1 tháng được dùng

để ly trích protein. Nồng độ protein mẫu được tính dựa trên đường chuẩn
BSA.
Kết quả đường chuẩn:
Nồng độ mg/ml 0,0625 0,125 0,25 0,5 1
OD 0,039 0,071 0,127 0,211 0,393
17
- Phương trình đường chuẩn được thành lập y = 0,4066 x với R
2
=
0,9816 theo x là giá trị các nồng độ protein chuẩn và y là giá trị OD tương
ứng.
Nồng độ protein tổng của mẫu được tính theo phương trình trên từ giá
trị OD (Bảng 4.8.1):
Bảng 4.8.1. Nồng độ protein tổng tan ở các dòng thuốc lá phân tích.
Mẫu V2 T1 T2 T5 T6
OD
0,14
4
0,225 0,352 0,352 0,217
Nồng độ protein mg/ml 0,708 1,107 1,731 1,067 0,994
Nồng độ protein trong lá mg/g 2,361 3,689 3,558 3,558 3,312
- Protein của các cây V2 nguyên bản đối chứng âm, các dòng chuyển
gen T1, T2, T5, T6 và protein đối chứng dương từ vi khuẩn E. coli được
phân tách bằng điện di trên gel acrylamide trên nền SDS với marker GE
Rainbow RPN800E. Các băng protein phân tách được nhuộm thể hiện trên
bản gel (Hình 4.8.1).
Hình 4.8.1. Bản gel SDS PAGE phân tách protein ly trích.
T1, T2, T5, T6: các dòng thuốc lá chuyển gen. V2: dòng nguyên
bản. E. coli: vi khuẩn mang plasmid pITB.HIV-1 p24. Marker:
GE Rainbow RPN800E.

Các băng protein trên bản gel sẽ được chuyển qua màng lai và kết quả
18
26 kDa
Marker E.coli V2 T1 T2 T5 T6
thực nghiệm Western blot xác định được các băng protein p24 ở dòng đối
chứng dương và các dòng chuyển gen T1, T2, T5, T6. Ở cây V2 nguyên
bản đối chứng âm không có băng protein p24 (Hình 4.8.2).
Kết quả Western blot cho thấy phát hiện được các băng protein p24
trong phản ứng kết hợp kháng thể đặc hiệu gắn kết trên màng tại vị trí
mong muốn khoảng 26 kDa. Điều này chứng tỏ gen HIV-1 p24 đều có biểu
hiện protein p24 với kích thước phù hợp trong các dòng thuốc lá chuyển
gen T1, T2, T5, T6.
Hình 4.8.2. Phân tích Western blot phát hiện
các băng protein p24.
T1, T2, T5, T6: các dòng thuốc lá chuyển gen. V2: cây nguyên
bản đối chứng âm. E. coli: vi khuẩn mang plasmid pITB.HIV-1
p24. Marker: GE Rainbow RPN800E.
4.9. Phân tích hàm lượng protein p24 tích lũy trong các dòng thuốc lá
V2 chuyển gen bằng phương pháp ELISA
Các dòng chuyển gen có biểu hiện protein p24 đã được chứng minh
bằng Western blot sẽ được phân tích bằng ELISA để định lượng mức
protein p24 tích lũy trong cây.
Đối với cây in vitro, mẫu được lấy ở các lá không quá non, khoảng thứ
3, 4 tính từ ngọn xuống dưới, của các cây hơn một tháng tuổi. Sau khi được
ly trích từ lá, protein tan của mẫu được chuẩn độ bằng phương pháp
Bradford dựa trên thang chuẩn protein BSA.
Thang chuẩn tương quan giữa các nồng độ protein BSA và giá trị OD đo
19
24 kDa
Marker E.coli V2 T1 T2 T5 T6

p24 ~ 26 kDa
ở bước sóng 595 như sau:
Nồng độ mg/ml 0 0,0625 0,125 0,25 0,5 1
OD 0 0,053 0,105 0,209 0,368 0,613
Phương trình đường chuẩn được thành lập y = 0,6499x, với R
2
=
0,9024, x là nồng độ protein BSA chuẩn và y là giá trị OD tương ứng.
Nồng độ protein của mẫu được tính theo phương trình trên từ giá trị OD
như sau (Bảng 4.9.1):
Bảng 4.9.1. Hàm lượng protein tổng ở các dòng phân tích.
Mẫu V2 T1 T2 T5 T6
OD
0,255 0,331 0,233 0,372 0,321
Protein tan (mg)
0,39 0,51 0,36 0,57 0,49
Protein tan (mg)/g lá
3,13 4,07 2,87 4,58 3,95
Dịch protein của các mẫu trên sau đó được pha loãng 10 lần và được
phân tích bằng kỹ thuật ELISA để xác định hàm lượng protein p24 dựa trên
thang chuẩn là kháng nguyên protein p24 tinh khiết ở các nồng độ 0;
0,0625; 0,125; 0,25; 0,5; 1 µg/ml.
Thang chuẩn tương quan giữa nồng độ protein p24 và giá trị OD:
Nồng độ µg/ml 0 0,0625 0,125 0,25 0,5 1
OD 0 0,312 0,425
0,61
4
0,75 1,893
Phương trình đường chuẩn được thành lập y = 1.416 x, R
2

= 0,9021, với
x là nồng độ protein p24 và y là giá trị OD tương ứng.
Kết quả hàm lượng protein p24 ở các mẫu được tính theo phương trình
trên từ giá trị OD như sau (Bảng 4.9.2):
Bảng 4.9.2. Hàm lượng protein p24 ở các dòng phân tích.
Mẫu V2 T1 T2 T5 T6
OD 0
1,597 1,266 1,196 0,865
Protein p24 (µg)
1,13 0,90 0,85 0,61
Protein p24 (µg)/g lá
45,23 35,85 33,89 24,50
20
% protein p24/protein tổng
tan
1,11 1,25 0,74 0,62
Để phân tích biểu hiện protein p24 trong điều kiện ex vitro, các dòng
thuốc lá được trồng trong vườn ươm và lá được thu nhận ở ngày thứ 55 trên
các lá 12 và 20. Nồng độ protein tổng tan trong lá được chuẩn độ bằng
phương pháp Bradford dựa trên thang chuẩn protein BSA.
Hình 4.9.1. Tỉ lệ phần trăm protein p24/protein tổng tan.
Thang chuẩn tương quan giữa các nồng độ protein BSA và giá trị OD đo
ở bước sóng 595 như sau.
Nồng độ mg/ml 0,0625 0,125 0,25 0,5 1
OD 0,056 0,116 0,193
0,40
9
0,665
Phương trình đường chuẩn được thành lập y = 0,7025 x, với R
2

=0,0976,
x là nồng độ protein BSA chuẩn và y là giá trị OD tương ứng.
Nồng độ protein của mẫu được tính theo công thức trên từ giá trị OD
như sau (Bảng 4.9.3):
Bảng 4.9.3. Hàm lượng protein tổng tan ở các dòng phân tích.
Mẫu V2 T1 T2 T5
21
Các dòng thuốc lá
Phần trăm protein 24/protein tổng tan
OD lá 12
0,591 0,569 0,606 0,589
Protein tan (mg)
1,68 1,62 1,73 1,68
Protein tan (mg)/g lá
5,61 5,40 5,75 5,59
OD lá 20
0,650 0,659 0,672 0,659
Protein tan (mg)
1,85 1,88 1,91 1,87
Protein tan (mg)/g lá
6,17 6,25 6,38 6,25
Các mẫu trên sau đó được phân tích bằng kỹ thuật ELISA để xác định
hàm lượng protein p24 dựa trên thang chuẩn là kháng nguyên protein p24
tinh khiết ở các nồng độ 0, 10, 50, 100 µg/ml.
Nồng độ µg/ml 0 10 50 100
OD 0,013 0,12 0,175 0,35
∆OD 0 0,107 0,162 0,337
Phương trình đường chuẩn được thành lập y = 0,0035x, R
2
= 0,9091

theo x là nồng độ protein p24 và y là giá trị OD tương ứng.
Kết quả hàm lượng protein p24 ở các mẫu được tính theo công thức trên
từ giá trị OD như sau (Bảng 4.9.4):
Từ kết quả trên cho thấy protein p24 biểu hiện ở các cây in vitro của các
dòng T1, T2, T5, T6 so với protein tổng tan tương ứng lá 1,11; 1,25; 0,74;
0,62 (%). Khi được trồng trong điều kiện ex vitro mức độ biểu hiện protein
ở lá của các dòng chuyển gen cao hơn. Thu nhận ở ngày thứ 55, các dòng
T1, T2, T5 có mức protein p24 tích lũy trên protein tổng tan ở lá 12 là
1,743; 6,219; 5,662 và lá 20 là 6,340; 5,313; 3,142.
Bảng 4.9.4. Hàm lượng protein p24 ở các dòng phân tích ELISA.
Mẫu V2 T1 T2 T5
OD Lá 12
0,079 0,159 0,383 0,348
∆OD
0,08 0,304 0,269
Protein p24 µg/ml
23,53 89,41 79,12
Protein p24 µg/g lá
94,12 357,65 316,47
% protein p24/protein
1,74 6,22 5,66
22
tổng
OD Lá 20
0,085 0,422 0,373 0,252
∆OD
0,337 0,288 0,167
Protein p24 µg/ml
99,12 84,71 49,12
Protein p24 µg/g lá

396,4
7
338,82 196,47
% protein p24/protein
tổng
6,34 5,31 3,14
Như vậy, khi phân tích bằng ELISA 4 dòng chuyển gen ở điều kiện cây
in vitro, cho thấy biểu hiện protein p24 từ 0,62% - 1,25%. Ở các cây ex
vitro trong vườn ươm, mức biểu hiện protein p24 trong các cây từ 1,7%
-6,3% ở cả các lá 12 và 20 sau 55 ngày trồng.
CHƯƠNG 5. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ
5.1. Kết luận
- Xây dựng được môi trường tái sinh hiệu quả cho giống thuốc lá V2,
với tổ hợp chất điều hòa sinh trưởng BA 1 mg/l và NAA 0,1 mg/l.
- Khảo sát ảnh hưởng của kháng sinh chọn lọc streptomycin và
spectinomycin khi nuôi cấy mô in vitro giống V2 cho thấy: Nồng độ
streptomycin 125 mg/l và spectinomycin 100 mg/l ức chế hoàn toàn khả
năng tái sinh của mô lá; nồng độ streptomycin 125 mg/l và spectinomycin
40 mg/l ức chế hoàn toàn sự ra rễ, phát triển cây con từ đoạn thân.
- Chuyển gen thành công vào lục lạp thuốc lá bằng phương pháp bắn
gen với vector plasmid pITB.HIV-1 p24 mang các cấu trúc gen Prrn/HIV-1
p24/TrbcL và Prrn/aadA/TpsbA. Các dòng cây chuyển gen thu được T1,
T2, T5, T6 thông qua phương thức chọn lọc và tái sinh lặp lại 4 chu kỳ với
cả hai kháng sinh spectinomycin và streptomycin ở nồng độ 500 mg/l.
Kiểm tra bằng PCR và Southern blot cho thấy cấu trúc gen chuyển thông
qua tái tổ hợp đồng dạng vào đúng vị trí mục tiêu giữa hai gen trnG và
trnfM trên lục lạp các dòng chuyển gen; cây chuyển gen ở trạng thái đồng
lạp thể chuyển gen.
23