Tách dòng gen cry4A, cry4B mã hóa protein diệt côn trùng bộ hai cánh từ các chủng Baccillus thuringiensis phân lập từ một số mẫu đất thuộc thành phố Nha Trang

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC

NGUYỄN VĂN NAM






TÁCH DÒNG GEN cry4A, cry4B MÃ HOÁ PROTEIN
DIỆT CÔN TRÙNG BỘ HAI CÁNH TỪ CÁC CHỦNG
Baccillus thuringiensis PHÂN LẬP TỪ MỘT SỐ MẪU ĐẤT
THUỘC THÀNH PHỐ NHA TRANG






LUẬN VĂN THẠC SỸ CÔNG NGHỆ SINH HỌC

THÁI NGUYÊN - 2012






Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC

NGUYỄN VĂN NAM





TÁCH DÒNG GEN cry4A, cry4B MÃ HOÁ PROTEIN
DIỆT CÔN TRÙNG BỘ HAI CÁNH TỪ CÁC CHỦNG
Baccillus thuringiensis PHÂN LẬP TỪ MỘT SỐ MẪU ĐẤT
THUỘC THÀNH PHỐ NHA TRANG


Chuyên ngành: Công nghệ sinh học
Mã số: 60 42 02 01




LUẬN VĂN THẠC SỸ CÔNG NGHỆ SINH HỌC




Ngƣời hƣớng dẫn khoa học: PGS TS. NGÔ ĐÌNH BÍNH

THÁI NGUYÊN - 2012






Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên


LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu khoa học của tôi.
Các số liệu và kết quả nêu trong luận văn là trung thực và chưa từng
được ai công bố trong công trình nghiên cứu khác.

Thái Nguyên, ngày 18 tháng 10 năm 2012
Tác giả



Nguyễn Văn Nam

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

LỜI CẢM ƠN

Trong quá trình học tập và thực hiện luận văn, tôi đã nhận được nhiều
sự giúp đỡ, hỗ trợ của thầy cô, bạn bè, đồng nghiệp và gia đình. Tôi xin trân
trọng cảm ơn tất cả những tình cảm quý báu đó.
Trước tiên, tôi xin chân thành cảm ơn PGS. TS Ngô Đình Bính, người
thầy đã tận tình hướng dẫn, giúp đỡ và tạo mọi điều kiện để tôi hoàn thành
luận văn này.
Tôi cũng xin chân thành cảm ơn CN. Đặng Văn Tiến cùng toàn thể cán
bộ phòng Di truyền Vi sinh, Viện công nghệ Sinh học, Viện Khoa học và
Công nghệ Việt Nam, đã nhiệt tình giúp đỡ tôi trong suốt thời thời gian dài
thực tập.
Tôi cũng xin chân thành cảm ơn Tiến sĩ Nguyễn Vũ Thanh Thanh, các
giảng viên cùng các thầy cô giáo trường Đại học Khoa học đã nhiệt tình giúp đỡ
tôi trong suốt thời gian học tập tại trường và hoàn thành tốt luận văn của mình.
Cuối cùng tôi xin cảm ơn bạn bè và gia đình, những người đã luôn ủng
hộ tôi trong suốt thời gian qua!
Thái Nguyên, ngày 18 tháng 10 năm 2012
Học viên



Nguyễn Văn Nam

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

i
MỤC LỤC
Trang
MỞ ĐẦU 1
Chƣơng 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3
1.1. Đại cương về Bacillus thuringiensis 3
1.1.1. Lịch sử nghiên cứu Bacillus thuringiensis 3
1.1.2. Vị trí, đặc điểm hình thái và sinh thái học Bacillus thuringiensis 4
1.1.3. Phân biệt Bt với các loài khác trong nhóm Bacillus cereus 6
1.1.4. Đặc điểm sinh lý, sinh hóa 7
1.1.5. Protein tinh thể của vi khuẩn Bacillus thuringiensis 7
1.1.6. Đặc điểm phân loại của Bacillus thuringiensis 8
1.1.7. Đặc điểm phân loại loài phụ Bti 8
1.1.8. Hệ gen của vi khuẩn Bacillus thuringiensis 8
1.2. Lịch sử nghiên cứu và ứng dụng của Bti 15
1.2.1. Tinh thể độc của Bacillus thuringiensis var. israelensis 16
1.2.2. Cấu trúc phân tử nhân độc tố của Bti 17
1.2.3. Hoạt tính diệt côn trùng của Bti 18
1.2.4. Tác động của Bti đến các sinh vật khác 19
1.3. Tình hình nghiên cứu ứng dụng trong nước và trên thế giới 19
1.3.1. Tình hình nghiên cứu, ứng dụng trên thế giới 19
1.3.2. Tình hình nghiên cứu trong nước 20
1.4. Tổng quan về côn trùng thử nghiệm 21
1.4.1. Phân loại khoa học của muỗi 21
1.4.2. Vòng đời của muỗi 23
1.4.3. Khả năng gây bệnh của muỗi 24
1.4.4. Sơ lược về côn trùng thử nghiệm: 24

Chƣơng 2: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP 29
2.1. Vật liệu 29
2.1.1. Sinh phẩm 29

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

ii
2.1.2. Hoá chất và môi trường 29
2.1.3. Dụng cụ và thiết bị thí nghiệm 31
2.2. Phương pháp nghiên cứu 32
2.2.1. Phương pháp phân lập vi khuẩn Bacillus thuringiensis 32
2.2.2. Phương pháp xác định nồng độ bào tử 33
2.2.3. Phương pháp thử hoạt tính sinh học 34
2.2.4. Kỹ thuật định typ huyết thanh 35
2.2.5. Khuyếch đại gen mã hóa độc tố bằng phản ứng PCR 35
2.2.6. Phương pháp tách chiết DNA plasmid từ vi khuẩn 37
2.2.7. Phương pháp điện di trên gel agarose 38
2.2.8. Phương pháp thôi gel 39
2.2.9. Phương pháp tách dòng gen cry4A, cry4B 40
Chƣơng 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 43
3.1. Phân lập vi khuẩn Bacillus thuringiensis từ các mẫu lá 43
3.2. Sự đa dạng tinh thể của các chủng phân lập 44
3.3. Phân loại dưới loài của các chủng Bacillus thuringiensis 45
3.4. Thử nghiệm hoạt tính diệt ấu trùng muỗi Culex quinquefasciatus của các
chủng Bacillus thuringiensis 46
3.4.1. Xác định nồng độ bào tử 46
3.4.2. Thử nghiệm hoạt tính 46
3.5. Phát hiện gen mã hóa protein diệt ấu trùng muỗi của chủng Bacillus
thuringiensis phân lập 49
3.6. Tách dòng, đọc trình tự gen cry4A và cry4B 52

3.6.1. Tách dòng gen cry4A và gen cry4B 52
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 63
TÀI LIỆU THAM KHẢO 65

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

iii
DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT

STT
Chƣ̃ viết tắt
Chƣ̃ viết đầy đủ
1
Bp
Base pair – Cặp Base
2
Bt
Bacillus thuringiensis
3
dH
2
O
Deion water – Nước khử ion
4
DNA
Deoxyribonucleotide acid – Axit Nucleic
5
ĐC
Đối chứng
6

E. coli
Escherichia coli
7
h
Giờ
8
kDa
Kilo Dalton
9
OD
Optical density – mật độ quang học
10
PCR
Polymerase Chain Reaction – phản ứng chuỗi trùng
hợp
11
SDS
Sodium dodecyl sulphate
12
Sol
Solution – Dung dịch tách triết DNA plasmid
13
TE
Tris EDTA
14
X-gal
5-Bromo-4 Cloro-3 indolyl β-D galactoside


Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

iv
DANH MỤC BẢNG
Trang
Bảng 1.1. Một số đặc điểm phân biệt các loài trong nhóm 1 chi Bacillus 6
Bảng 1.2: Phân loại gen cry mã hóa các protein độc tố Cry diệt côn trùng 11
Bảng 1.2. Đặc điểm của một số protein độc tố Cry 13
Bảng 3.1. Thống kê số lượng chủng Bt phân lập được và hình dạng tinh thể
của chủng phân lập. 44
Bảng 3.2. Kết quả thử hoạt tính diệt ấu trùng muỗi Culex quinquefasciatus của
các chủng phân lập sau các khoảng thời gian khác nhau, ở các
nồng độ khác nhau. 46
Bảng 3.3. Kết quả khuếch đại gen độc tố thuộc nhóm cry4 của các chủng
phân lập 50
Bảng 3.5. So sánh trình tự ĐNT5.4-4B1 với các trình tự đã công bố trên
ngân hàng gen quốc tế bằng phần mềm Blast 60



Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

v
DANH MỤC HÌNH
Trang

Hình 1.1. Hình thái tế bào vi khuẩn Bacillus thuringiensis 5
Hình 1.2. Hình thái tế bào vi khuẩn Bacillus thuringiensis var. israelensis 7
Hình 1.3. Mô hình cấu trúc chung của một protein độc tố Cry 9
Hình 1.4. Cơ chế tác động của protein tinh thể độc lên côn trùng 12
Hình 1.5. Các giai đoạn phát triển của muỗi 23

Hình 1.6. Muỗi Anopheles trưởng thành(A) và vòng đời của muỗi Anopheles(B) 25
Hình 1.7. Ấu trùng(A) và muỗi Aedes trưởng thành (B) 26
Hình 1.8. Muỗi Culex trưởng thành 27
Hình 3.1. Hình thái khuẩn lạc của chủng Bacillus thuringiensis phát triển
trên môi trường MPA sau 72 giờ nuôi cấy. 43
Hình 3.2. Hình thái bào tử và tinh thể của chủng ĐNT8.1 chụp dưới kính
hiển vi điện tử quét với độ phóng đại 5000 lần. 44
Hình 3.3. Phản ứng ngưng kết của Bacillus thuringiensis var. israelensis
với kháng huyết thanh. 45
Hình 3.4. Hình ảnh thử hoạt tính diệt ấu trùng muỗi Culex quinquefasciatus
của các chủng phân lập 49
Hình 3.5. Hình ảnh điện di sản phẩm PCR với các cặp mồi đặc hiệu cho
gen Cry4A trên gel agarose1%. 51
Hình 3.6. Hình ảnh điện di sản phẩm PCR với các cặp mồi đặc hiệu cho
gen cry4B trên gel agarose1%. 51
Hình 3.7. Hình ảnh khuẩn lạc xanh – trắng trên môi trường LBA 53
Hình 3.8. Hình ảnh kết quả điện di sản phẩm cắt DNA plasmid các dòng
khuẩn lạc biến nạp gen cry4A trên gel agarose 0,8 % 54
Hình 3.9. Hình ảnh điện di sản phẩm cắt DNA plasmid trên gel agarose 0,8 % 55
Hình 3.10. Hình ảnh kết quả điện di sản phẩm PCR khuếch đại gen cry4A
v cry4B từ các dòng plasmid tái tổ hợp: 56
Hình 3.11. Kết quả so sánh trình tự gen cry4A 59
Hình 3.12. Kết quả so sánh trình tự gen cry4B 62


1
MỞ ĐẦU
Muỗ i là loài côn trùng truyền nhiều bệnh rất nguy hiểm . Các bệnh sốt
rét, số t xuấ t huyế t , viêm nã o Nhậ t Bả n , sùi chân voi , giun chỉ do muỗ i
truyề n thự c sự đã và đang đe dọ a sinh mạ ng của hàng triệu người. Hằng năm

có khoảng 270 triệ u ngườ i mắ c bệ nh số t ré t , làm chết hàng triệu người. Hàng
triệ u mắ c bệ nh sốt xuấ t huyế t và cá c bệ nh khác.  Việt Nam, theo số liệu của
Tổ ng cụ c Thố ng kê, 9 tháng đầu năm 2012 cả nước có 51,3 nghìn trường hợp
mắ c bệ nh số t xuấ t huyế t , trong đó 42 ca tử vong , 16 nghìn trường hợ p mắ c
bệ nh số t ré t , 554 trườ ng hợ p mắ c bệ nh viêm nã o Nhậ t Bả n , trong đó 15
trườ ng hợ p tử vong (64).
Có rất nhiều biện pháp hoá học và sinh học được áp dụng để khắc phục
tình trạng trên. Tuy nhiên các biện pháp hoá học lại thường gây ra tính kháng
thuốc trên côn trùng, cứ sau một khoảng gian rất ngắn thì thuốc hoá học lại
không còn tác dụng đồng thời thuốc hoá học còn gây ảnh hưởng đến sức khỏe
cộng đồng và góp phần làm mất cân bằng sinh thái. Vì vậy, các biện pháp
sinh học được khuyến khích sử dụng. Một trong các vi sinh vật được quan
tâm và sử dụng nhiều nhất là vi khuẩn Bacillus thuringiensis. Sở dĩ như vậy là
do đặc tính sinh protein tinh thể độc có khả năng diệt côn trùng gây hại như:
Côn trùng bộ cánh vảy, bộ hai cánh, bộ cánh cứng Vi khuẩn Bacillus
thuringiensis được ứng dụng để diệt côn trùng gây hại theo phương pháp:
thuốc diệt trừ sinh học Bt.
Việc nghiên cứu các hoạt tính diệt côn trùng của các chủng Bt phân lập
ở Việt Nam đặc biệt là hoạt tính diệt muỗi, ruồi là hết sức cần thiết nhằm tìm
ra những chủng mang gen tự nhiên có hoạt tính mạnh phục vụ cho việc diệt
ruồi, muỗi. Protein tinh thể độc Cry4A, Cry4B là hai trong nhiều protein có
hoạt tính chống lại côn trùng bộ hai cánh. Xuất phát từ mục đích này chúng
tôi đã tiến hành nghiên cứu đề tài: “Tách dòng gen cry4A, cry4B mã hoá


2
protein diệt côn trùng bộ hai cánh từ các chủng Bacillus thuringiensis phân
lập từ một số mẫu đất thuộc thnh phố Nha Trang”.
Mục tiêu của đề tài
- Sàng lọc các chủng Bacillus thuringiensis có hoạt tính diệt côn trùng

bộ hai cánh.
- Tách dòng gen cry4A, cry4B của các chủng Bacillus thuringiensis
phân lập có hoạt tính diệt côn trùng bộ hai cánh.
- Đọc trình tự gen, so sánh với trình tự gen trên ngân hàng gen quốc tế.
Nhiệm vụ của đề tài:
- Phân lập các chủng Bccillus thuringiensis từ các mẫu đất thuộc thành
phố Nha Trang.
- Sàng lọc các chủng Bt có khả năng diệt côn trùng bộ hai cánh.
- Phát hiện gen cry4A, cry4B bằng phương pháp PCR.
- Tách dòng gen cry4A, cry4B mã hoá protein tinh thể diệt côn trùng bộ
hai cánh.
- Đọc trình tự gen cry4A, cry4B và so sánh với trình tự trên ngân hàng
gen quốc tế.


3
Chƣơng 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1. Đại cƣơng về Bacillus thuringiensis
1.1.1. Lịch sử nghiên cứu Bacillus thuringiensis
Trong hơn một trăm năm qua, vi khuẩn Bacillus thuringiensis (Bt)
được coi là vi khuẩn được nghiên cứu nhiều nhất trong số các tác nhân vi
sinh vật gây bệnh cho côn trùng.
Lịch sử nghiên cứu ứng dụng của Bacillus thuringiensis được bắt
nguồn ngay từ những năm đầu tiên của thế kỉ 20. Nó được đánh dấu
bằng những phát hiện đầu tiên của một nhà khoa học người Nhật Bản
có tên là Ishiwata khi ông này phát hiện ra một loài vi khuẩn có khả
năng gây chết ở những con tằm vào năm 1901. Phát hiện thấy những
con tằm chết trước khi loài vi khuẩn này phát triển, ông nhận định ban
đầu những con tằm chết là do độc tố chứ không phải là nhiễm khuẩn và

đặt tên cho loài vi khuẩn này là Bacillus sotto, tên căn bệnh tằm dâu mà
ông đang nghiên cứu.
Mười năm sau (1911), loài vi khuẩn này được nhà khoa học người
Đức là E. Berliner phân lập được từ xác ấu trùng bướm Địa Trung Hải,
Anagasta kuhniella và ông đã có những mô tả đầu tiên về loài vi khuẩn
đất, tế bào hình que, có khả năng sinh bào tử này. Đến tận năm 1915, vi
khuẩn này mới mang tên Bacillus thuringiensis do nó được phân lập tại
một nhà máy bột vùng Thuringen của Đức. Về sau chủng này bị thất lạc
và được Mattes và cộng sự phân lập lại từ A. kuhniella vào năm 1927.
Chế phẩm Bt được sử dụng lần đầu tiên là vào năm 1930 để kiểm
soát loài côn trùng hại có tên là Angasta kuehnella, một loài sâu đục thân
ở Châu Âu. Chế phẩm thương mại đầu tiên được tung ra thị trường vào
năm 1938 để diệt loài côn trùng hại mùa màng ở Pháp[7] .


4
Năm 1953, Hannay và Fitzjame đã phát hiện ra thể vùi và công bố
tinh thể có bản chất protein. 1956, Angus đã chứng minh được hoạt tính
diệt sâu là do tinh thể độc tách ra từ tế bào và bào tử [16].
Năm 1962, de Barjac và Bonnefoi đã đưa ra một phương pháp phân
loại mới cho các chủng Bt và Bacillus sphaericus (Bs) bằng phương pháp
huyết thanh [11].
Năm 1977, phát hiện ra dưới loài Bacillus thuringiensis var.
israelensis tại Israel và người đầu tiên phân lập và nghiên cứu là
Goldberg và Margarit. Loài này được kiểm nghiệm là có khả năng diệt ấu
trùng muỗi và ruồi thuộc bộ hai cánh [4].
Từ đó đến nay, việc phân lập, phân loại và nghiên cứu Bacillus
thuringiensis trên cả hai lĩnh vực (ứng dụng và cơ bản) không ngừng phát
triển và được tiến hành ở nhiều phòng thí nghiệm trên thế giới.
 Việt Nam, Bt đã được nghiên cứu và ứng dụng là thuốc trừ sâu

đầu tiên tại Viện Bảo vệ Thực vật năm 1971. Năm 1973, Nguyễn Công
Bình và cộng sự đã tiến hành nghiên cứu sản xuất chế phẩm Bt tại Viện
Sinh Vật với môi trường đặc, giá thể là agar tự chế tạo từ rong câu sử
dụng các nguyên liệu rẻ tiền sẵn có như bã khô lạc, bột đậu tương…
Trong mười năm trở lại đây thì việc nghiên cứu Bt đã được tiến hành ở
nhiều nơi như Viện Công nghệ Sinh học, Viện Công nghiệp Thực phẩm,
Viện Bảo vệ thực vật, Viện Công nghệ Sau thu hoạch… chủ yếu là phân
lập, phân loại để tìm ra các chủng mới có phổ hoạt tính rộng cũng như
nghiên cứu sinh học phân tử của chủng cũng đã được tiến hành [16].
1.1.2. Vị trí, đặc điểm hình thái và sinh thái học Bacillus thuringiensis


5

Hình 1.1. Hình thái tế bào vi khuẩn
Bacillus thuringiensis
Bacillus thuringiensis thuộc chi
Bacillus. Nhóm này gồm hơn 20
loài khác nhau, ngoài Bt còn có vi
khuẩn B. subtilis, B. cereus (vi
khuẩn gây bệnh tiêu chảy), vi
khuẩn B. anthracis (vi khuẩn gây
bệnh than). Các vi khuẩn thuộc chi
Bacillus thường được coi là vi
khuẩn đất. Chúng sống trong môi
trường đất, bề mặt thực vật, côn
trùng [31]. Bacillus thuringiensis hình que (Hình 1.1), Gram dương, hô
hấp hiếu khí hoặc kị khí không bắt buộc, sinh bào tử, kích thước tế bào
khoảng 0,8-1,4m x 2,5-10m. Đặc điểm chung là bào tử hình oval, kích
thước 0,5 - 1,2 x 1,5 - 2,6 m, quá trình hình thành bào tử không làm thay

đổi hình dạng tế bào. Một đặc điểm quan trọng là trong quá trình hình
thành bào tử hầu hết các chủng Bacillus thuringiensis đều tổng hợp
protein tinh thể. Protein tinh thể ở mỗi chủng khác nhau sẽ có hình dạng,
kích thước và số lượng khác nhau, tuy nhiên chúng mang đặc điểm chung
là có khả năng gây độc đối với nhiều loài côn trùng. Khi ở trong tế bào
sinh dưỡng, tinh thể thường nằm kề với bào tử, khi tế bào tan tinh thể và
bào tử đều thoát ra ngoài. Trong môi trường lỏng Bacillus thuringiensis
có khả năng chuyển động, khả năng này có được là nhờ các lông roi
(flagellar) trên bề mặt tế bào có kích thước lớn hơn 0,9 µm [57].
B. thuringiensis được xem như là loài vi khuẩn bản địa tồn tại trong
rất nhiều môi trường khác nhau. Meadows phân chia ra 3 ổ sinh thái phổ
biến của B. thuringiensis trong môi trường tự nhiên là côn trùng, thực vật
và đất [14].


6
1.1.3. Phân biệt Bt với các loài khác trong nhóm Bacillus cereus
Các loài thuộc nhóm B. cereus gồm B. cereus, B. thuringiensis, B.
anthracis, B. mycoides, B. Megaterium. Gần đây có phát hiện thêm 2 loài
B. weihenstephanensis và B. pseudomycoides [59]. Việc sinh ra protein
tinh thể là một đặc tính để phân biệt Bacillus thuringiensis, tuy nhiên đó
chỉ là một chỉ tiêu dùng trong mục đích phân loại.
Bảng 1.1. Một số đặc điểm phân biệt các loài trong nhóm 1 chi Bacillus
Đặc điểm
Bc
Bt
Bmy
Ba
Bme
Nhuộm Gram

+
(a)

+
+
+
+
Phản ứng catalase
+
+
+
+
+
Khả năng chuyển động
+/-
(b)

+/-
-
(c)

-
+/-
Phản ứng khử nitrate
+
+/
+
+
-
(d)

Phân hủy tyrosine
+
+
+/-
-
(d)

+/-
Kháng lysozyme
+
+
+
+
-
Phản ứng với lòng đỏ
trứng
+
+
+
+
-
Lên men glucose kị khí
+
+
+
+
-
Phản ứng V-P
+

+
+
+
-
Sinh Axít từ mannitol
-
-
-
-
+
Làm tan huyết
+
+
+
-
(d)

-
Sinh protein tinh thể
-
+
-
-
-
Chú thích:
a
+: 90-100% số chủng phản ứng dương tính

b
+/-: 50-50% số chủng phản ứng dương tính

c
-: 90-100% số chủng phản ứng âm tính
d
-: hầu hết các chủng phản ứng âm tính
Bc: Bacillus cereus
Bt: Bacillus thuringiensis
Bmy: Bacillus mycoides
Ba: Bacillus anthracis
Bme: Bacillus megaterium



7


Hình 1.2. Hình thái tế bào vi khuẩn
Bacillus thuringiensis var.
israelensis

1.1.4. Đặc điểm sinh lý, sinh hóa
B. thuringiensis không lên men sinh axit trong môi trường có chứa
đường arabinoza, xyloza, manitol, nhưng tạo axit ở môi trường có chứa
đường glucoza. Có khả năng thuỷ phân tinh bột, khử nitrat thành nitrit, phát
triển được ở môi trường có chứa 0,001% lysozyme, 7% NaCl với pH=5,7, có
phản ứng với lòng đỏ trứng gà. Không có khả năng khử amin của
phenilalamin, không sử dụng axit xitric, không khử muối sunphat [57].
B. thuringiensis có khả năng sinh trưởng, phát triển ở nhiệt độ dao động
từ 15-45
0
C, nhiệt độ tối ưu là 28-30

0
C. Không mẫn cảm đặc biệt với pH, pH
tối ưu cho sự phát triển của Bt là pH=7. Bt có khả năng oxy hoá hydrocacbon
đến axit hữu cơ và dioxit cacbon theo chu trình Embden- Meyerhoff- Panas.
1.1.5. Protein tinh thể của vi khuẩn Bacillus thuringiensis
Sự tồn tại của các thể vùi ở Bt được phát hiện đầu tiên vào năm 1915
nhưng đến tận những năm 1950 việc nghiên cứu chúng mới được thực hiện.
Những nghiên cứu đã chỉ ra các thể vùi này chính là các protein có cấu trúc
tinh thể [60]. Các tinh thể protein được hình thành trong quá trình tạo bào tử.
Chúng được tạo thành từ một hoặc một vài gen cry (crystal) và gen cyt
(cytolytic) mã hóa tinh thể độc nằm trên các plasmid. Các protein độc tố của
Bt rất đa dạng. Đã có khoảng 30 loại protein Cry và 8 loại Cyt đã được biết
đến, hơn 100 gen đã được tách
dòng và xác định trình tự [31].
Tùy theo thành phần protein cấu
tạo khác nhau mà các tinh thể có
nhiều hình dạng đặc biệt như
hình lưỡng tháp, hình khối hộp,
hình thoi dẹt… [60].



8
1.1.6. Đặc điểm phân loại của Bacillus thuringiensis
Năm 1962 Barjac và Bonnefoi đã đưa ra một phương pháp phân loại
mới cho Bt bằng phản ứng huyết thanh và đã mô tả 27 typ huyết thanh.
Phương pháp này đã được cải tiến năm 1980, 1981 và được công nhận là
phương pháp đáng tin cậy, được Trung Tâm quốc tế Bacillus thuringiensis đặt
tại Viện Pasteur, Paris khuyến cáo sử dụng trên thế giới từ năm 1982. Phương
pháp được xác định chủ yếu dựa trên nguyên lý của phản ứng kháng nguyên -

kháng thể [3]. Cho đến năm 1999, người ta đã phát hiện được 69 typ huyết
thanh bao gồm 82 thứ huyết thanh khác nhau của Bacillus thuringiensis [23].
1.1.7. Đặc điểm phân loại loài phụ Bti
Bacillus thuringiensis var. israelensis (Bti) là một loài phụ của loài
vi khuẩn Bacillus thuringiensis, tạo tinh thể hình cầu và hình vuông có
khả năng diệt muỗi và ruồi (hình1.2) [20].
Theo hệ thống phân loại dựa trên cơ sở của 69 typ huyết thanh thì
Bti thuộc typ huyết thanh H14 [42].
Nếu dựa vào cấu trúc di truyền thì đặc điểm quan trọng để phân biệt
loài phụ Bti với các loài phụ khác là thành phần protein tinh thể của
chúng phải chứa các protein 135kDa, 128kDa, 78kDa, 72kDa và 27kDa
(thành phần được xác định bằng phương pháp diện di trên gen
polyacrylamid). Vì các protein này là do các gen cry4 A, B, C, D và cyt
mã hóa, vì vậy sự tồn tại các protein này trong tinh thể đồng nghĩa với
việc tồn tại các lớp gen cry4 (A, B, C, D) và gen cyt trong cấu trúc di
truyền của chúng [23].
1.1.8. Hệ gen của vi khuẩn Bacillus thuringiensis
Kích thước hệ gen của vi khuẩn Bacillus thuringiensis vào khoảng
2,4-5,7 triệu bp. Trên thế giới người ta đã mô tả được bản đồ cấu trúc gen


9


Hình 1.3. Mô hình cấu trúc chung
của một protein độc tố Cry

tự nhiên cho một số chủng Bacillus thuringiensis [21]. Hầu hết các chủng
Bacillus thuringiensis phân lập mang các nhân tố di truyền ngoài nhiễm
sắc thể (NST), các nhân tố di truyền này có thể đóng vòng hoặc không

đóng vòng [45]. Trong một thời gian dài người ta cho rằng các protein
tinh thể được mã hóa chung trên các plasmid lớn. Khi sử dụng kỹ thuật lai
ADN với các mẫu dò cho gen cry đã nhận thấy chúng xuất hiện cả trên
NST [15, 38].
1.1.8.1. Đặc điểm gen mã hóa protein độc tố diệt côn trùng
Từ những năm đầu thập kỷ 80, nhiều nghiên cứu tập trung vào sự
tồn tại của các gen mã hóa protein tinh thể diệt sâu (ICP -Insecticidal
Crystal Protein) ở các loài phụ Bt khác nhau. Các phương pháp xử lý
plasmid, tiếp hợp và các thí nghiệm tách dòng gen đã chứng minh rằng
các gen mã hoá protein diệt côn trùng thường nằm trên các plasmid lớn có
hệ số copy thấp. Theo điều tra của Carlton and Gonzalez thì plasmid có
mặt trong hầu hết các chủng Bacillus thuringiensis số lượng plasmid dao
động từ 2 đến 12 trong các chủng nghiên cứu. Các thí nghiệm lai gen đã
cung cấp bằng chứng về sự tồn tại các gen tổng hợp nhiều độc tố trong
một tế bào Bacillus thuringiensis.
Chẳng hạn như trong Bacillus
thuringiensis israelensis có 4 gen cry
và 2 gen cyt mã hoá các protein
Cry4Aa (125 kDa), Cry4Ab (135 kDa),
Cry10Aa (58 kDa), Cry11Aa (68 kDa)
và Cyt1Aa, Cyt2Ba (27 kDa), các gen
này nằm trong một plasmid có khối
lượng 72 MDa [21, 22, 53].


10
1.1.8.2. Phân loại độc tố từ Bacillus thuringiensis
Trước đây, khóa phân loại protein độc tố được Hoft và Whiteley đề
nghị năm 1989 dựa trên tính tương đồng giữa các trình tự axít amin. Dựa trên
khóa phân loại này năm 1998 Crickmore và cộng sự đã đề xuất một khóa

phân loại mới hoàn thiện hơn. Trong khóa phân loại này đã đổi tên một số
protein và thay đổi cách viết tên độc tố và tên gen mã hóa các độc tố đó [27].
Trong quá trình sinh trưởng và phát triển Bacillus thuringiensis có khả
năng sinh ra 3 loại độc tố diệt côn trùng chính là Cry (crystal -endotoxin),
Cyt (Cytolysin) và Vip (Vegetative Insecticidal Protein). Dựa vào tính tương
đồng của trình tự axit amin của các họ độc tố này lại được chia thành các lớp
khác nhau, cách viết tên độc tố với các bậc cấu trúc đầy đủ được quy ước như
sau; họ độc tố (Cry, Cyt, Vip), số đếm (1,2,3 ), ký tự viết hoa (A, B ), ký tự
viết thường (a, b ), số đếm (1,2,3 ), ví dụ như độc tố Cry25Aa1. Tỷ lệ axit
amin tương đồng để phân chia các lớp độc tố như sau; lớp 1 (Cry1, Cry2 ) có độ
tương đồng dưới 45%, lớp 2 từ 45%-78%, lớp 3 từ 78%-95%, lớp 4 dưới 99%
[20,39]=17,28,47. Ngoài 3 họ độc tố trên Bacillus thuringiensis còn sinh ra một
số độc tố khác như hemolysin, enterotoxin, chitinase, phospholipase [29].
1.1.8.3. Độc tố Cry
Gen cry mã hóa cho các độc tố Cry khác nhau. Đây là gen độc tố quan
trọng nhất của vi khuẩn Bt, tính đặc hiệu diệt côn trùng là do các protein độc
mà nó tạo ra. Năm 2005, người ta đã phát hiện được gen cry khác nhau thuộc
về 47 nhóm ( từ cry1-cry47). Nhưng tính đến năm 2012, thì người ta đã phát
hiện được hơn 607 gen cry khác nhau thuộc về 70 nhóm ( từ cry1 - cry70).
Mỗi nhóm gen lại có những đặc điểm và đặc tính khác nhau [10].


11

Bảng 1.2: Phân loại gen cry mã hóa các protein độc tố Cry diệt côn trùng

Gen
Hình dạng
tinh thể
Trọng lượng phân

tử protein (kDa)
Hoạt tính diệt
côn trùng
cry1A – 1M
Lưỡng tháp
130 - 138
Cánh vảy Lepidoptera
cry2A -cry2C
Cầu
69 - 71
Cánh vảy Lepidoptera/
Hai cánh Diptera
cry3A -cry3C
Lập phương
73 - 74
Cánh cứng Coleoptera
cry4A-cry4D
Cầu
73 - 134
Hai cánh Diptera
cry5A-cry5E
Lưỡng tháp
81
Nematode
cry8
Lập phương
130
Cánh cứng
Các gen cry
còn lại

Đa dạng
35 - 129
Đa dạng
a. Cấu trúc chung
Cấu trúc của protein tinh thể đã được làm sáng tỏ nhờ kỹ thuật nghiên
cứu tinh thể bằng tia X với nghiên cứu đầu tiên về cấu trúc Cry3A và Cry1Aa,
sau đó được mở rộng cho các độc tố khác. Các protein tinh thể có cấu trúc
chung gồm 3 vùng (Domain) (Hình 1.3). Thứ tự các vùng được tính từ đầu N
đến đầu C của chuỗi polipeptid [19, 36].
Vùng 1 có chứa một bó gồm 7 chuỗi xoắn  đối song song (
antiparallel) trong đó chuỗi số 5 được bao bọc bởi các chuỗi còn lại, vùng này
mang đầu N [46].
Vùng 2 có chứa ba tấm  đối song song tạo thành một dạng hình học
topo điển hình gọi là “Greek key”, sắp xếp này cũng được gọi là cuộn lăng
kính  (-prism fold) [54]. Vùng 2 được xem là quyết định tính đặc hiệu liên
quan đến việc gắn độc tố vào màng, cơ chế gắn cho vùng 2 là phức tạp. Các
số liệu đã chỉ ra một sự giống nhau giữa các móc gắn thụ thể của vùng 2 với
các epitop đã biết như là vị trí liên kết kháng nguyên - kháng thể.


12
Vùng 3 có chứa hai cuộn xoắn, các tấm  đối song song tạo thành một
kẹp  (-sandwich) hình học topo gọi là “jelly roll”. Vùng 3 cũng tham gia
vào việc gắn thụ thể [46].
b. Cơ chế tác động
Cơ chế hoạt động của protein Cry của Bacillus thuringiensis liên quan
đến sự hòa tan của tinh thể trong ruột giữa côn trùng, quá trình phân giải
protein của tiền độc tố nhờ protease ruột giữa, sự gắn kết của độc tố Cry với
các thụ thể ruột giữa, sự gắn độc tố vào màng để tạo ra các lỗ hoặc kênh ion
(Hình 4). Tinh thể bao gồm các tiền độc tố, để tiền độc tố trở nên hoạt động

thì côn trùng mẫn cảm phải ăn chúng. Với hầu hết côn trùng cánh vảy, tiền
độc tố được hòa tan trong môi trường kiềm của ruột giữa côn trùng [24, 32].
Sự khác nhau trong phạm vi hòa tan đôi khi giải thích sự khác nhau về cấp độ
gây độc trong số các protein Cry. Sự giảm tính tan có lẽ tích lũy một cơ chế tiềm
tàng cho sự kháng của côn trùng. Sau khi hòa tan nhiều tiền độc tố phải được xử lí
bởi protease ruột giữa côn trùng để trở thành độc tố hoạt động. Protease chính
của ruột giữa côn trùng cánh vảy giống trypsin hoặc chymotrypsin.

Hình 1.4. Cơ chế tác động của protein tinh thể độc lên côn trùng
(a) Tinh thể độc bị hòa tan bởi dịch ruột, (b) Protease ruột cắt từ đầu C của protein
độc tố, (c) Tạo ra độc tố được hoạt hóa với hoạt động của vùng 2 và 3, (d) vùng I
sắp xếp hai chuỗi xoắn cho phép gắn vào màng, (e) hình thành lỗ rò [51].


13
Hoạt động của độc tố Cry đã được biết đến với hai chức năng: gắn vào
thể đặc hiệu trên màng của lông nhung ruột giữa côn trùng mẫn cảm. Sự gắn
này là một quá trình hai giai đoạn, thuận nghịch và không thuận nghịch. Các
bước sau này có thể dẫn đến sự gắn chặt giữa độc tố vào thụ thể, sự gắn độc
tố vào màng ruột hoặc cả hai.
Bảng 1.2. Đặc điểm của một số protein độc tố Cry
Tên độc
tố
Hình
dạng tinh
thể
Trọng
lƣợng
(kDa)
Nguồn gốc

(Dƣới loài Bacillus thuringiensis sinh
độc tố)
Cry1Aa




Lưỡng
tháp
133
kurstaki, sotto, aizawai, entomocidus,
thuringiensis, alesti
Cry1Ab
131
kurstaki, aizawai, entomocidus,
thuringiensis, alesti, darmstadiensis,
tolworthi
Cry 1Ac
133
kurstaki, kenyae
Cry 1B
138
kurstaki, aizawai, entomocidus
Cry 1C
135
aizawai, entomocidus
Cry 1D
133
aizawai, entomocidus, darmstadiensis,
galleriae

Cry 1E
133
kenyae, darmstadiensis, tolworthi
Cry 1F
134
aizawai
Cry1 G
130
galleriae
Cry 2A
Hình khối
71
kurstaki
Cry 2B
Cry 3A
Hình hộp
73
tenebrionis (san diego), morrisoni
Cry 3Ba
Không xác
định
74
tolworthi
Cry3Bb
kyushuensis
Cry 4A
Lưỡng
tháp
134

israelensis, morrisoni
Cry 4B
128
Cry 4C
Cầu
78
Cry 4D
72


14
- Nhóm Cry1: Gồm 139 protein thuộc các nhóm độc tố Cry1A-Cry1L,
có khối lượng khoảng 130kDa, tích lũy thể vùi dạng hình tháp và thường chỉ
có hoạt tính chống lại các loài thuộc bộ cánh vảy. Gen đầu tiên mã hóa cho
protein nhóm này được Schnepf và cộng sự phát hiện trong Bt. kurstaki từ chế
phẩm Dipel [56].
- Nhóm Cry2: Gồm 21 protein độc tố thuộc nhóm Cry2A. Các protein
nhóm này có khối lượng khoảng 70kDa, có hoạt tính với cả hai loài thuộc bộ
cánh vảy và bộ hai cánh [56].
- Nhóm Cry3: Nhóm này gồm 17 protein thuộc các nhóm Cry3A-
Cry3C, có khối lượng khoảng 73kDa, có hoạt tính chống lại các loài thuộc bộ
cánh cứng [56].
- Nhóm Cry4: Gồm 8 protein thuộc nhóm Cry4A-Cry4B tích lũy cả hai
loại tinh thể có khối lượng khoảng 70kDa và 130kDa. Nhóm này có hoạt tính
với các loài thuộc bộ hai cánh. Những protein này cùng với protein 27kDa do
nhóm cyt1A tổng hợp ra một phức hợp tinh thể tròn [56].
1.1.8.4. Độc tố cyt
Cũng có bản chất là protein và hình thành thể vùi như độc tố Cry,
nhưng tính tương đồng của trình tự axit amin giữa độc tố Cyt và độc tố Cry
hầu như không đáng kể. Độc tố Cyt đầu tiên được Waalwijk phát hiện là

cyt1Aa1 vào năm 1985. Hiện nay, người ta đã phát hiện được 22 độc tố Cyt
thuộc hai nhóm, các độc tố này có trọng lượng 25-30 kDa. Các độc tố Cyt
được phát hiện chủ yếu thuộc các dưới loài Bacillus thuringiensis israelensis,
morrisoni, medellin, neolonensis, kyushuensis, damstradiensis, fuokukaensis,
tenebrionis.
1.1.8.5. Độc tố Vip
Có một số protein diệt sâu không liên quan đến protein Cry được tạo ra
ở một số chủng Bt trong pha sinh trưởng sinh dưỡng của tế bào, các protein


15
này gọi chung là Vip (Vegetative Insecticidal Protein). Các Vip này không
phải là protein tinh thể mà là protein tiết từ tế bào. Độc tố Vip được phát hiện
đầu tiên là Vip3A1 và Vip3A2 vào năm 1996 nhờ Estruch và cộng sự.
Gen vip3A mã hóa protein 88 kDa được tổng hợp trong suốt pha sinh
dưỡng nhưng nó không được tiết ra ngoài. Gen mã hóa protein Vip3A xuất
hiện trong cả các chủng Bacillus thuringiensis và Bacillus cereus. Protein này
có hoạt tính đối với rất nhiều côn trùng gây hại thuộc bộ cánh vảy như:
Agrotis ipsilon, Spodoptera frugiperda, Spodoptera exigua, Helicoverpa zea.
Khi côn trùng mẫn cảm ăn phải độc tố, Vip3A là nguyên nhân gây phân giải
các tế bào biểu mô ruột giữa; các đặc tính vật lý của Vip3A biểu lộ tính độc
như protein Cry [43, 44].
1.2. Lịch sử nghiên cứu và ứng dụng của Bti
Bt. israelensis (Bti) được phân lập lần đầu tiên bởi Goldberg và
Margalit (1977) tại Israel, được phân lập từ xác chết của ấu trùng muỗi culex
pipiens chủng này lúc đó được đặt tên là ONR60. Về sau chủng này được
phân loại bằng huyết thanh H14 phương pháp của de Barjac (1978) và đặt tên
là Bacillus thuringiensis var. israelensis. Bti được công nhận là có khả năng
gây độc cao đối với côn trùng thuộc bộ Diptera và nó đóng vai trò quan trọng
trong việc kiểm soát vectơ truyền bệnh cho người là ruồi và muỗi.

Thời kì đầu khi mới phát hiện ra dưới loài Bti, việc nghiên cứu và ứng
dụng Bti chỉ giới hạn trong lãnh thổ nước Đức, người Đức đã dùng chế phẩm
Bti để kiểm soát ấu trùng muỗi Culex pipiens và Aedes vexans. Chế phẩm này
có tên là Culex
đ
-Bti và nó được sử dụng kết hợp với chủng Bacillus sphaericu
(Becker, 1997)[14].
Sang thập kỉ 80, Bti được nghiên cứu và ứng dụng rộng rãi ở nhiều
nước trên thế giới, đặc biệt là ở các nước nhiệt đới. Vào thời gian này, người
ta đã sử dụng chế phẩm Bti cho việc kiểm soát loài ruồi và muỗi ở 11 quốc


16
gia Tây Phi và đã thu về những kết quả ngoài mong đợi (Hougard et al.,
1997).  Brazil, chế phẩm Bti cũng được sử dụng để thay thế cho thuốc trừ
sâu hóa học (Mardini et al., 1999).  Trung Quốc, Bti đã chứng tỏ vai trò của
mình trong việc giảm dịch bệnh sốt rét (Becker, 1997) [14].
Chế phẩm Bti có tác dụng tốt trong môi trường nước sạch, nước không
tù đọng hoặc nước có nồng độ muỗi thấp. Các chế phẩm này được tổ chức y
tế thế giới (W.H.O) khuyến cáo sử dụng để diệt trừ các vectơ truyền bệnh: sốt
rét, sốt xuất huyết, viên não Nhật Bản là những bệnh thường xuất hiện thành
dịch lớn do muỗi lây truyền ở các nước nhiệt đới.
1.2.1. Tinh thể độc của Bacillus thuringiensis var. israelensis (Bti)
Tinh thể độc của Bti có dạng hình cầu (trứng) có kích thước khoảng
0,71,2 m có hoạt lực đặc hiệu với côn trùng bộ 2 cánh (Diptera). Người ta
đã xác định thành phần protein của Bti bằng phương pháp điện di trên gel
polyacrylamid (PAGE) theo đó tinh thể độc của Bti bao gồm các protein có
trọng lượng phân tử là 135 kDa, 128 kDa, 78 kDa, 72 kDa và 27 kDa do các
gen cryIV A, B, C, D và cyt mã hoá [22]. Các độc tố này có cấu trúc và phổ
diệt côn trùng khác nhau [28, 49].

Các protein này thực chất là các tiền độc tố nó chỉ có tác dụng gây độc
khi được hoà tan và phân giải thành mảnh nhân độc, tác dụng phân giải xảy ra
trong môi trường kiềm và dưới tác dụng của proteaza. Khi ở trong môi trường
kiềm và dưới tác dụng của proteaza thì:
Protein 27 kDa bị phân hủy thành protein 25 kDa (cả 2 protein này đều
có hoạt lực diệt côn trùng thấp).
Protein 72 kDa bị phân hủy thành các tiểu phần 31 và 35 kDa, 2 tiểu
phần này cũng có tác dụng diệt muỗi thấp.
Protein 78 kDa bị phân hủy thành nhân độc 58 kDa.
Protein 128 và 135 kDa bị phân hủy thành nhân độc 58 và 73 kDa [28].