Tài liệu kiểm định nguồn gốc thực phẩm ( thủy sản , thịt , sữa )

8/22/2014
1
KIỂM ĐỊNH NGUỒN GỐC THỰC PHẨM
BF5320
KỸ THUẬT DNA – PCR: Kiểm định nguồn gốc
TH.S HOÀNG QUỐC TUẤN
TS. NGUYỄN THỊ THẢO
KỸ THUẬT DNA – PCR: Kiểm định nguồn gốc
Nguyên tắc của PCR
The components of nucleotides (Picture: Andy
Vierstraete, 1999)
8/22/2014
2
Nguyên tắc của PCR
Formation of a DNA chain from individual
nucleotides (Picture: Andy
Vierstraete, 1999
Structure of DNA in a cell (Picture: Andy
Vierstraete, 1999)
Nucleus: Nhân
Chromosomes: Nhiễm sắc thể
Nguyên tắc của PCR
Nguyên tắc của PCR
Bước 1: Biến tính
1 phút, 94
o
C
Bước 2: Gắn mồi
45 giây, 54
o
C

Bước 3: Kéo dài phân tử
2 phút, 72
o
C
/>8/22/2014
3
Nguyên tắc của PCR
Các chu kỳ của kỹ thuật PCR
QUI TRÌNH PHÂN TÍCH PCR
Giới thiệu môn học 8
Các vi sinh vật,
động vật
Thu nhận mẫu
Kỹ thuật PCR lần đầu tiên được
Mullis và cộng sự mô tả vào
năm 1986 và cũng do chính
phát minh này Mullis đã được
trao giải nobel vào năm 1993
Bioinformatics 9
CÁC THÀNH PHẦN CỦA PCR
• DNA khuôn
• Polymerase
• Nucleotide tự do
• Dung dịch đệm
• Mồi
8/22/2014
4
Bioinformatics 10
DNA khuôn
• Là các trình tự DNA dùng để tổng hợp trình tự mục tiêu

• DNA khuôn có thể là toàn bộ genome hoặc được giới
hạn bởi các enzyme cắt giới hạn
• Cả hai mạch đều được sử dụng trong phản ứng PCR
Các loại polymerase dùng trong PCR
• Tag Polymerase
• Pfu Polymerase
• Polymerase thế hệ mới
Tag polymerase
• Thermus aquaticus
• Nhiệt độ tối ưu: 75 – 80
o
C
• Có thể tồn tại 2 giờ ở 92.5
o
C, 40’ ở 95
o
C, 7’ ở 97.5
o
C
• Tốc độ: 1,000bp/10s
• Sai sót: 1/9,000
8/22/2014
5
Pfu polymerase
• Pyrococcus furiosus
• Chịu nhiệt tốt hơn Tag polymerase
• Có thể tồn tại 6-7h ở 97.5
o
C
• Tốc độ: 1,000bp/1-2’

• Sai sót: 1/1,300,000
• Có hoạt tính sửa sai
Polymerase thế hệ mới
• Chịu nhiệt tốt
• Tốc độ cao
• Sai sót ít
• Có thể tái sử dụng nhiều lần
Nucleotide tự do
• Nucleotide tự do là nguồn nguyên liệu để tổng hợp mạch mới
• Trong một số trường hợp, người ta bổ sung một số nucleotide
“lạ”
8/22/2014
6
Dung dịch đệm
• Ảnh hưởng đến hiệu suất, tính chính xác của phản
ứng PCR
• Ứng với từng loại polymerase, nhà sản xuất khuyến
cáo sử dụng dung dịch đệm tương ứng
• Nồng độ Mg
2+
là yếu tố quan trọng:
– Thiếu: hoạt động của polymerase kém dẫn đến
hiệu suất PCR kém
– Thừa: thu nhận một số sản phẩm không đặc hiệu,
tính chính xác thấp
Mồi-primer
• Mồi trong phản ứng sao chép DNA là những trình tự RNA
ngắn được tổng hợp bởi enzyme Primase
• Mồi trong sinh học phân tử là những đoạn oligonucleotide
ngắn được tổng hợp hóa học

• Ứng dụng: phản ứng PCR, lai phân tử,…
Thiết kế trình tự mồi
Bioinformatics
Bioinformatics 18
Đặc điểm của mồi
• Tính duy nhất: đảm bảo vị trí bắt cặp là DUY NHẤT trên toàn
trình tự
• Chiều dài mồi: tối thiểu 15 base, thông thường khoảng 17-28
base
• Thành phần base: thường là tổng (G+C) khoảng 50-60%, tránh
trình tự mồi với (A+T) dài
• Kẹp G/C: tính ổn định ở đầu 3’ ảnh hưởng lớn tới hiệu quả
phản ứng, thường 3’ của mồi là G hay C
8/22/2014
7
Đặc điểm của mồi (tiếp theo)
• Độ ổn định đầu 3’: năng lượng cần để phá hủy sự bắt cặp của
5nu cuối cùng ở đầu 3’, tuy nhiên để tránh bắt cặp nhầm trên
các vùng giàu GC, 5nu cuối cùng không nên chứa quá 3G/C
• Nhiệt độ nóng chảy (Tm): trong giới hạn 52
o
C – 65
o
C, không
nên cách biệt quá lớn giữa 2 mồi
Các tiêu chuẩn thiết kế mồi
• Tính duy nhất
• Chiều dài: 17-28 base
• Thành phần base: G+C (50-60%), tránh A+T dài
• Tối ưu hóa sự bắt cặp và kéo dài: đầu 3’ của mồi có độ bền cao và

bắt cặp cao
• Nhiệt độ nóng chảy trong giới hạn 48-65˚C
• Sự khác biệt nhiệt độ nóng chảy mồi xuôi và mồi ngược < 5˚C
• Giảm thiểu sự tự tạo thành cấu trúc bậc hai của mồi
Ảnh hưởng của cấu trúc bậc 2
• Cấu trúc bậc 2 giữa hai mồi là sự bắt cặp bổ sung
toàn bộ hay một phần giữa hai mồi
• Cấu trúc bậc 2 làm mồi mất khả năng gắn vào DNA
mục tiêu
• Giảm số lượng mồi tự do trong môi trường
• Giảm hiệu quả của phản ứng PCR
8/22/2014
8
Hairpin
Hairpins. Là cấu trúc thứ cấp hình thành
trong nội bộ mồi. Giá trị ΔG của các hairpin
đầu 3’ không nên <-2 kcal/mol và của các
hairpin ở giữa không nên <-3 kcal/mol.
Self-Dimer
Tự mồi (Self Dimer). Là cấu trúc hình
thành giưã các phân tử của cùng loại mồi.
Giá trị ΔG của các hairpin đầu 3’ không nên
<-5 kcal/mol và của các hairpin ở giữa
không nên <-6 kcal/mol.
Dimer
Là cấu trúc hình thành giữa các phân tử
của 2 mồi khác nhau (cặp mồi trong phản
ứng PCR). Giá trị ΔG của các hairpin đầu
3’ không nên <-5 kcal/mol và của các
hairpin ở giữa không nên <-6 kcal/mol

8/22/2014
9
5’ 3’
5’
5’
5’
3’
3’
3’
Mồi hợp lệ?
Slide 26
Tóm tắt về mồi
Tính đc hiu
Đặc hiệu cho trình tự
đích (tránh các liên kết
không đặc hiệu)
Tính bn
Hình thành thể lai bền
với đoạn mẫu trong p/ứ
PCR
Tính tng thích
Các đoạn mồi phải chịu
cùng một điều kiện trong
p/ứ PCR
Tính duy nhất
Chiều dài
Nhiệt độ hồi tính
Sự bắt cặp giữa 2 mồi
Cấu trúc mồi
Thành phần base

Tính bền
Đặc tính:
Các yếu tố cần quan tâm:
Nhiệt độ nóng chảy
KỸ THUẬT DNA-PCR
KIỂM ĐỊNH NGUỒN GỐC THỰC PHẨM
8/22/2014
10
Ứng dụng PCR trong kiểm định một số loại thực phẩm
Cases in Indonesia
8/22/2014
11
Tổ Chức Liên Hiệp Hồi Giáo
(Organization of Islamic Countries -OIC)
HALAL LOGO’s
8/22/2014
12
Halal Standard and Guidelines Worlwide
8/22/2014
13
Ứng dụng PCR trong kiểm định một số loại thực phẩm
PCR amplification of mitochondrial D-loop gene with different
meat species. Lane M: 100 bp ladder; Lane 1: cattle; Lane 2:
buffalo; Lane 3: sheep; Lane 4: goat; Lane 5: pig; Lane 6:
chicken; Lane 7: negative control
8/22/2014
14
PCR amplification of chicken mitochondrial D-loop gene with raw,
cooked and autoclaved meat and meat emulsion. Lane M: 100 bp
ladder; Lane 1: raw meat; Lane 2: cooked meat; Lane 3: autoclaved

meat; Lane 4: raw meat emulsion; Lane 5: cooked meat emulsion;
Lane 6: autoclaved meat emulsion; Lane 7: negative control
The result of PCR specificity and sensitivity test
for the specific horse primers. M: marker, 1:
100 ng horse, 2: 10 ng horse, 3: 1 ng horse, 4:
0.1 ng horse, 5: 0.01 ng horse, 6: donkey, 7:
porcine, 8: beef, 9: lamb, 10: negative control and
11: positive control.
The result of PCR specificity and sensitivity test
for the specific donkey primers. M: marker, 1:
100 ng donkey, 2: 10 ng donkey, 3: 1 ng
donkey, 4: 0.1 ng donkey, 5: 0.01 ng donkey, 6:
horse, 7: porcine, 8: beef, 9: lamb, 10: negative
control and 11: positive control.
8/22/2014
15
Electrophoretic gel of the sausage samples
prepared from donkey–beef binary mixtures.
M: marker, 1: donkey 5% + beef 95%, 2:
donkey 1% + beef 99%, 3: donkey 0.5% + beef
99.5%, 4: donkey 0.1% + beef 99.9%, 5: beef
100%, 6: positive control and 7: negative
control.
Electrophoretic gel of the sausage samples
prepared from pork–beef binary mixtures. M:
marker, 1: porcine 5% + beef 95%, 2: porcine
1% + beef 99%, 3: porcine 0.5% + beef 99.5%,
4: porcine 0.1% + beef 99.9%, 5: beef 100%, 6:
positive control and 7: negative control.
The specificity of beef-specific primer

pair with DNA by PCR assay for different
meat species. Legends: Lane M: 100 bp
Ladder; Lane 1: Cattle DNA; Lane 2:
Buffalo DNA; Lane 3: Sheep DNA; Lane 4:
Goat DNA; Lane 5: Pig DNA; Lane 6:
Chicken DNA; Lane 7: Negative Control.
The efficiency of beef specific PCR assay
under different processing conditions.
Legends: Lane M: 100 bp Ladder; Lane 1:
Fresh meat; Lane 2: Cooked meat; Lane 3:
Autoclaved meat; Lane 4: Raw meat
emulsion; Lane 5: Cooked meat emulsion;
Lane 6: Autoclaved meat emulsion; Lane 7:
Negative Contro
8/22/2014
16
The sensitivity assay of beef
specific PCR under different
manufacturing conditions at 1%
level of adulteration in meat and
meat emulsion. Legends: Lane M:
100 bp Ladder; Lane 1: Fresh
meat; Lane 2: Cooked meat; Lane
3: Autoclaved meat; Lane 4: Raw
meat emulsion; Lane 5: Cooked
meat emulsion; Lane 6:
Autoclaved meat emulsion; Lane
7: Negative Control.
The sensitivity assay of beef specific
PCR employed in admixed meat

products at 5% and 1% level of
adulteration. Legends: Lane M:
100 bp Ladder; Lane 1 & 4: Meat
kabab; Lane 2 & 5: Meat patty; Lane 3
& 6: Meat block; Lane 7: Negative
Control (Note: Lane-1, 2 and 3
contains 1% and 4, 5 and 6 contains
5% level of beef in meat products)
Electrophoretic analysis of the 12S
rRNA PCR products obtained from
cows’ (lane 1), sheep's (lane 2), and
goats’ (lane 3) milk DNA using
primers 12S-FW and 12S-REV. NC =
negative control; M = molecular
weight marker, 1 kb plus DNA ladder
(GibcoBRL)
Electrophoretic analysis of the cow-
specific 12S rRNA amplification from
milk samples using primers 12SM-FW
and 12SBT-REV. Samples are: cow (lane
1), sheep (lane 2), and goat (lane 3). NC
= negative control; M = molecular
weight marker, 1 kb plus DNA ladder
(GibcoBRL).
8/22/2014
17
Electrophoretic analysis of the 12S rRNA
PCR products obtained from raw milk
binary mixtures of cow in sheep using
primers 12SM-FW and 12SBT-REV.

Samples are cow 100% (lane 1), cow 10%
(lane 2), cow 5% (lane 3), cow 1% (lane 4),
cow 0.5% (lane 5), cow 0.1% (lane 6), and
sheep 100% (lane 7). NC = negative
control; M = molecular weight marker,
1 kb plus DNA ladder (GibcoBRL).
Electrophoretic analysis of the 12S rRNA PCR
products obtained from heat-treated milk
binary mixtures of cow in sheep using primers
12SM-FW and 12SBT-REV. A) Pasteurized
samples (65°C; 30 min); B) sterilized samples
(120°C; 20 min). Lines are cow 100% (lane 1),
cow 10% (lane 2), cow 5% (lane 3), cow 1%
(lane 4), cow 0.5% (lane 5), cow 0.1% (lane 6),
and sheep 100% (lane 7). NC = negative
control; M = molecular weight marker, 1 kb
plus DNA ladder (GibcoBRL).
Electrophoretic analysis of the 12S rRNA PCR products obtained
from heat-treated milk binary mixtures of cow in goat using primers
12SM-FW and 12SBT-REV. A) Pasteurized samples (65°C; 30 min); B)
sterilized samples (120°C; 20 min). Lines are cow 100% (lane 1),
cow 10% (lane 2), cow 5% (lane 3), cow 1% (lane 4), cow 0.5% (lane
5), cow 0.1% (lane 6), and goat 100% (lane 7). NC = negative
control; M = molecular weight marker, 1 kb plus DNA ladder
(GibcoBRL).
8/22/2014
18
8/22/2014
1
KIỂM ĐỊNH NGUỒN GỐC THỰC PHẨM

BF5320
KỸ THUẬT ENZYME
Th.S HOÀNG QUỐC TUẤN
TS. NGUYỄN THỊ THẢO
KỸ THUẬT MIỄN DỊCH ENZYME (ENZYME
IMMUNOASSAY)
ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent Assay)
Direct ELISA (ELISA trực tiếp)
ELISA gián tiếp (Indirect ELISA)
Sandwich ELISA
ELISA cạnh tranh (competitive ELISA)
/>peptides, protein, antibodies, hormone,…
EIA (Enzyme ImmunoAssay)
• Kĩ thuật ELISA gồm ba thành phần tham gia phản ứng
là: kháng nguyên, kháng thể và chất tạo màu; thực
hiện qua hai bước:
• Phản ứng miễn dịch học: Là sự kết hợp giữa kháng
nguyên và kháng thể
• Phản ứng hóa học: Thông qua hoạt tính xúc tác của
enzyme làm giải phóng oxy nguyên tử [O] từ H
2
O
2
để
oxy hóa cơ chất chỉ thị màu, do đó làm thay đổi màu
của hỗn hợp trong dung dịch thí nghiệm.
8/22/2014
2
nitrophenol phosphate
Ưu điểm: Có thể phát hiện sự khác

biệt nhỏ giữa các kháng nguyên
nếu sử dụng kháng thể bắt và
kháng thể phát hiện khác nhau.
Chuyên biệt hơn Direct sanwich ELISA do
antispecies kháng thể được gắn enzyme
không phản ứng với kháng thể bắt kháng
nguyên.
8/22/2014
3
Ưu điểm: Đơn giản nhất
Nhược điểm:
• Độ đặc hiệu bị giới hạn vì thường thì kháng nguyên
có ít nhất là 2 epitope (trình diện kháng nguyên) mà
phương pháp này chỉ sử dụng 1 kháng thể gắn vào
một epitope.
• Phải đánh dấu cho từng kháng thể chuyên biệt với
từng đối tượng
8/22/2014
4
• Ưu điểm:
Kháng thể gắn enzyme có thể sử dụng để đánh
dấu cho nhiều loại kháng nguyên nên tiện lợi và
kinh tế hơn, dễ dàng thương mại hóa.
• Nhược điểm:
Độ đặc hiệu của từng kháng huyết thanh là khác
nhau. Điều này dẫn đến kết quả khác nhau giữa
các thí nghiệm và do đó cần phải thử nghiệm với
nhiều kháng huyết thanh khác nhau để kết quả có
thể tin tưởng được
Direct ELISA (ELISA trực tiếp)

ELISA gián tiếp (Indirect ELISA)
8/22/2014
5
Sandwich ELISA
ELISA cạnh tranh (competitive ELISA)
Các yếu tố ảnh hưởng đến độ nhạy của phản ứng
ELISA
• Số lượng kháng thể thứ nhất được gắn vào đáy
giếng
• Ái lực của kháng thể thứ nhất đối với kháng
nguyên
• Ái lực của kháng thể thứ hai đối với kháng nguyên
8/22/2014
6
Ứng dụng phương pháp enzyme immunoassay
8/22/2014
7
Ứng dụng phương pháp enzyme immunoassay
Kháng nguyên Giới hạn phát hiện
Huyết thanh, albumin (Lợn) 1-10%
Dịch chiết cơ xương (Lợn, Gà) 250 ppm (Thịt lợn)
126 ppm (Gia cầm)
Desmin (Gà) 10%
Huyết thanh (Bò) <10%
Protein cơ đã gia nhiệt (Lợn) 0.5%
Huyết thanh albumin (Bò, Ngựa, Lợn) 3%
Albumin (Bò, Ngựa, Lợn, Gà) 0.6%
Dịch chiết Sarcoplasmatic (Lợn) 1%
Protein cơ hòa tan (Gà) 1%
Glycoprotein (Lợn) 0.06%

Protein cơ (Lợn) 1%
IgG (Lợn, Gà, Bò) <1%
Huyết thanh Protein (Trâu, Dê, Lừa) 0.1-1%
Tht và sn phm t tht
Sa và sn phm t sa
Kháng nguyên Giới hạn phát hiện
β-Lactoglobulin 0.5% sữa bò
κ-Casein 0.25% sữa bò
IgG Bò 0.0008% sữa bò tươi
Whey Protein Bò 1% sữa bò
Whey Protein Dê 0.5% sữa bò
α-S2-casein 0.5% sữa dê
β-lactoglobulin Bò 0.0001% sữa bò
γ3-Casein 0.2% sữa bò
IgG Dê 1% sữa bò