bước đầu nghiên cứu cấu trúc của polysaccharide trong lá mãng cầu xiêm (annona muricata) trồng tại huyện tân đông phú, tỉnh tiền giang
Bạn đang xem bản rút gọn của tài liệu. Xem và tải ngay bản đầy đủ của tài liệu tại đây (1.52 MB, 66 trang )
ĐẠI HỌC HUẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC
KHOA HÓA HỌC
Khóa luận Tốt nghiệp Cử nhân Khoa học
BÆÅÏC ÂÁÖU NGHIÃN CÆÏU CÁÚU TRUÏC CUÍA
POLYSACCHARIDE TRONG LAÏ MAÎNG CÁÖU
XIÃM (ANNONA MURICATA)
TRÄÖNG TAÛI HUYÃÛN TÁN ÂÄNG PHUÏ, TÈNH
TIÃÖN GIANG
Nguyễn Công Đức
Khóa 2010- 2014
Huế, 6/2014
ĐẠI HỌC HUẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC
KHOA HÓA HỌC
Khóa luận Tốt nghiệp Cử nhân Khoa học
BÆÅÏC ÂÁÖU NGHIÃN CÆÏU CÁÚU TRUÏC CUÍA
POLYSACCHARIDE TRONG LAÏ MAÎNG CÁÖU
XIÃM (ANNONA MURICATA)
TRÄÖNG TAÛI HUYÃÛN TÁN ÂÄNG PHUÏ, TÈNH
TIÃÖN GIANG
Chuyên ngành: Hóa Hữu cơ
Sinh viên thực hiện: Nguyễn Công Đức
Giáo viên hướng dẫn: PGS.TS. Trần Thị Văn Thi
Huế, 6/2014
Lời Cảm Ơn
Những lời đầu tiên trong bài khóa luận này, tôi xin
được bày tỏ lòng biết ơn chân thành đến giáo viên
hướng dẫn khoa học của tôi, cô PGS.TS. Trần Thị Văn
Thi đã tận tình hướng dẫn, chỉ bảo và những giúp đỡ
của cô về cả vật chất lẫn tinh thần để tôi có thể hoàn
thành tốt khóa luận tốt nghiệp.
Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến thầy Th.S.
Lê Trung Hiếu đã tận tình chỉ bảo, giúp tôi nâng cao
tay nghề cũng như rèn luyện những kĩ năng cần thiết
trong cuộc sống, giúp tôi ngày một hoàn thiện và
trưởng thành hơn, đỡ bỡ ngỡ trước khi bước chặng
đường khó khăn phía trước.
Tôi cũng xin gởi lời cảm ơn đến anh Nguyễn Ngọc
Hưng (CH K20), bạn Lý A Phồn (Hóa K34) và các em
Hóa K35 đã đồng hành cùng tôi trong suốt khoảng thời
gian làm thực nghiệm vừa qua.
Xin chân thành cảm ơn các thầy cô trong khoa Hóa,
bộ môn Hóa Hữu cơ, phòng thí nghiệm Hóa học Ứng
dụng đã tận tình giúp đỡ, tạo điều kiện thuận lợi để tôi
hoàn thành khóa luận.
Tôi cũng xin chân thành cảm ơn đến tập thể Lớp Hóa
K34 đã giúp đỡ tôi trong suốt thời gian làm khóa luận.
Cuối cùng xin được cảm ơn gia đình, thầy cô và bạn
bè đã đồng hành cùng tôi trong suốt quãng đời sinh
viên.
Huế, ngày 05 tháng 06 năm
2014
i
Nguyễn Công Đức
ii
TÓM TẮT
Trong khoá luận này, chúng tôi đã tiến hành tách chiết, định tính và định lượng
một số thành phần có trong cao nước chiết từ lá mãng cầu xiêm (Annona muricata).
Khảo sát số lần tinh chế polysaccharide. Tiến hành phân đoạn polysaccharide thành
homo-PS và hetero-PS và hàm lượng PS và protein trong các cao. Khả năng kháng
oxy hoá của các phân đoạn cao PS lá mãng cầu xiêm là cao hơn so với nấm linh chi
Phú Lương. Bước đầu nghiên cứu cấu trúc PS của phân đoạn homo-PS.
Từ khoá: Annona muricata, kháng oxy hoá, polysaccharide, homo-PS, hetero-
PS, cấu trúc PS.
iii
DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ TỪ NGỮ VIẾT TẮT
PS : Polysaccharide
MS : Monosaccharide
MCX : Mãng cầu xiêm
EtOH : C
2
H
5
OH
MeOH : CH
3
OH
GC-MS : Gas chromatography–Mass spectrometry (Sắc ký khí ghép
khối phổ)
TFA : Trifluoroacetic acid
iv
MỤC LỤC
Trang
LỜI CẢM ƠN I
TÓM TẮT III
DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ TỪ NGỮ VIẾT TẮT IV
MỤC LỤC V
DANH MỤC CÁC BẢNG VIII
DANH MỤC CÁC HÌNH X
MỞ ĐẦU 1
CHƯƠNG 1 2
TỔNG QUAN 2
1.1. Tổng quan về lá mãng cầu xiêm 2
!"#$%&'(
)*+,-
./(0123
1.2. Tổng quan về polysaccharide và cấu trúc của polysaccharide trong lá MCX 4
!45 #(62 ',7)
*8'9 #(62 ',7.
1.3. Phương pháp phân đoạn polysaccharide thô bằng amonium sulfate 6
1.4. Các phương pháp xác định cấu trúc polysaccharide lá MCX 6
):;1"#<=>
):?$###4@(0A
1.5. Tổng quan về gốc tự do và chất kháng oxy hóa 8
.BC,(.D
.*8E(6F .D
CHƯƠNG 2 12
ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 12
2.1. Đối tượng nghiên cứu 12
v
G6
/F 8HI%J",--
2.2. Nội dung nghiên cứu 12
2.3. Phương pháp nghiên cứu 12
:?$##HJ, "KLM
:?$##EB?NJOP ME+
:?$##J1FN#8'(M)
):?$##I'QRS"#?$##ISRS>
.:?$##J?NA
>:?$###;(0:=R#'(7":=R((TD
D:?$##0(,M8 ((2 ',7"#;1%U*R<=JV"#
((2 ',7T
W:4@(0XY
T:?$##E&(2(01E(6F 4OZ!( [\(, * # 6]A
:?$##KL2B
CHƯƠNG 3 24
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 24
3.1. Độ ẩm của mẫu lá 24
3.2. Định tính các nhóm hợp chất hữu cơ trong cao nước 24
3.3. Hàm lượng các hợp chất sơ cấp trong lá mãng cầu xiêm 28
/"?N:=D
/"?N#'(7'(<*^W
3.4. Khảo sát số lần tinh chế polysaccharide 31
)/"?N:='( (5 \I
)/"?N#'(75 \I
3.5. Hàm lượng polysaccharide trong các cao hetero-PS và homo-PS 33
./"?N((R:="77'(R:=)
./"?N:='( (((R:="77'(R:=)
3.6. Đánh giá khả năng kháng oxi hóa của các cao PS 36
>^;6,C?_P>
>!4CE(F (:=A
>`?N8E(F '( (:=D
3.7. Nghiên cứu cấu trúc polysaccharide tách chiết từ lá mãng cầu xiêm 39
A:4@(0XY :=R.W
A!"#((2 ',7 #(62 ',7F'( (((R:=)T
A^JJ'aEI6(2,7)
KẾT LUẬN 42
KIẾN NGHỊ 44
TÀI LIỆU THAM KHẢO 45
vi
PHỤ LỤC 1
vii
DANH MỤC CÁC BẢNG
Trang
BẢNG 2.1. CHƯƠNG TRÌNH NHIỆT ĐỘ PHÂN TÍCH MẪU TRÊN THIẾT
BỊ SẮC KÝ GCMS-DB 20
BẢNG 3.1. ĐỘ ẨM CỦA MẪU LÁ MÃNG CẦU XIÊM (P= 0,95; N= 3).24
BẢNG 3.2. KẾT QUẢ ĐỊNH TÍNH CÁC NHÓM HỢP CHẤT HỮU CƠ
TRONG CAO NƯỚC 27
BẢNG 3.3. MẬT ĐỘ QUANG CỦA DUNG DỊCH D-GLUCOSE CHUẨN 28
BẢNG 3.4. TỈ LỆ CÁC LOẠI CARBOHYDRATE TRONG MẪU LÁ MÃNG
CẦU XIÊM (P= 0,95 ; N= 5) 28
BẢNG 3.5. MẬT ĐỘ QUANG CỦA DUNG DỊCH ALBUMIN CHUẨN Ở
CÁC NỒNG ĐỘ KHÁC NHAU SAU KHI XỬ LÝ BẰNG PHƯƠNG PHÁP
LOWRY 30
BẢNG 3.6. HÀM LƯỢNG PROTEIN QUY TƯƠNG ĐƯƠNG ALBUMIN
TRONG CAO PS THÔ VÀ TRONG LÁ MCX (P= 0,95; N=4) 30
BẢNG 3.7. HÀM LƯỢNG POLYSACCHARIDE TRONG CÁC CAO PS (P
=0,95) 31
BẢNG 3.8. HÀM LƯỢNG PROTEIN QUY TƯƠNG ĐƯƠNG ALBUMIN
TRONG QUA CÁC LẦN TINH CHẾ (P=0,95) 32
BẢNG 3.9. HÀM LƯỢNG CAO HOMO-PS VÀ CAO HETERO-PS 34
BẢNG 3.10. HÀM LƯỢNG PS CỦA CAO HOMO-PS VÀ CAO HETERO-
PS CÓ TRONG CAO PS-5 (P=0,95; N=4) 34
BẢNG 3.11. HÀM LƯỢNG PS VÀ PROTEIN CÓ TRONG CÁC CAO PS
( P= 0,95; N=4) 35
BẢNG 3.12. MẬT ĐỘ QUANG CỦA DUNG DỊCH ACID ASCORBIC
CHUẨN 37
viii
BẢNG 3.13. LƯỢNG CÁC CHẤT KHÁNG OXY HÓA QUY TƯƠNG
ĐƯƠNG CHẤT CHUẨN CÓ TRONG CAO PS THÔ, PS-5, HOMO-PS VÀ
HETERO-PS (P=0,95; N=4) 39
. BẢNG 3.15. CÁC DẪN XUẤT MONOSACCHARIDE THU ĐƯỢC TỪ
HOMO-PS 40
BẢNG 3.16. TỶ LỆ THÀNH PHẦN CÁC DẪN XUẤT
MONOSACCHARIDE CỦA HOMO-PS 40
BẢNG 3.17. CÁC DẪN XUẤT METHYL ALDITOL ACETATE
MONOSACCHARIDE THU ĐƯỢC THEO KẾT QUẢ GC-MS VÀ LIÊN KẾT
GLYCOSIDE TƯƠNG ỨNG 41
BẢNG 3.18. TỶ LỆ CÁC LOẠI LIÊN KẾT GLYCOSIDE CỦA CAO HOMO-
PS 41
ix
DANH MỤC CÁC HÌNH
Trang
HÌNH 1.1. BỘ KHUNG GALACTOMANNAN TRONG HẠT MCX 5
HÌNH 1.2. SƠ ĐỒ PHÂN ĐOẠN CÁC PS TỪ PS THÔ [30] 6
HÌNH 1.3. QUY TRÌNH PHÂN TÍCH THÀNH PHẦN MS THEO PHƯƠNG
PHÁP HPAEC-PAD 6
HÌNH 1.4. QUY TRÌNH PHÂN TÍCH THÀNH PHẦN MS THEO PHƯƠNG
PHÁP GC-MS 7
HÌNH 1.5. CƠ CHẾ HOẠT ĐỘNG CỦA CHẤT CHỐNG OXY HÓA 9
HÌNH 1.6. CÔNG THỨC CẤU TẠO CỦA ACID GALLIC 9
HÌNH 1.7. CÔNG THỨC CẤU TẠO CỦA BHT 10
HÌNH 1.8. CẤU TRÚC CỦA ACID L-ASCORBIC 11
HÌNH 2.1. LÁ CÂY MÃNG CẦU XIÊM 13
HÌNH 2.2. SƠ ĐỒ CHIẾT PS TRONG MẪU LÁ MÃNG CẦU XIÊM 16
HÌNH 2.3. SƠ ĐỒ TINH CHẾ POLYSACCHARIDE TRONG LÁ MÃNG
CẦU XIÊM 17
HÌNH 2.4. SƠ ĐỒ PHÂN ĐOẠN CÁC LOẠI POLYSACCHARIDE TRONG
CAO POLYSACCHARIDE 18
HÌNH 2.5. QUY TRÌNH XỬ LÝ MẪU ĐỂ PHÂN TÍCH GC – MS 19
HÌNH 2.6. QUY TRÌNH XỬ LÝ MẪU PHÂN TÍCH GC-MS ĐỂ XÁC ĐỊNH
LIÊN KẾT GLYCOSIDE 21
HÌNH 3.1. HÌNH ẢNH ĐỊNH TÍNH CÁC NHÓM HỢP CHẤT HỮU CƠ
TRONG CAO NƯỚC 27
HÌNH 3.2. ĐƯỜNG HỒI QUY TUYẾN TÍNH BIỂU DIỄN SỰ PHỤ THUỘC
CỦA MẬT ĐỘ QUANG VÀO NỒNG ĐỘ D-GLUCOSE CHUẨN 28
x
HÌNH 3.3. HÀM LƯỢNG CÁC LOẠI CARBOHYDRATE TRONG MẪU LÁ
29
HÌNH 3.4. ĐƯỜNG HỒI QUY TUYẾN TÍNH BIỂU DIỄN SỰ PHỤ THUỘC
CỦA MẬT ĐỘ QUANG VÀO NỒNG ĐỘ ALBUMIN CHUẨN 30
HÌNH 3.5. HÀM LƯỢNG POLYSACCHARIDE TRONG CÁC CAO SAU KHI
TINH CHẾ 31
HÌNH 3.6. HÀM LƯỢNG PROTEIN QUY TƯƠNG ĐƯƠNG ALBUMIN
QUA CÁC LẦN TINH CHẾ 33
HÌNH 3.7. TỦA HETERO-PS VÀ DUNG DICH HOMO-PS SAU KHI XỬ LÝ
BẰNG AMMONIUM SULFATE 34
HÌNH 3.8. HÀM LƯỢNG PS TINH KHIẾT TRONG CÁC CÁC CAO HOMO-
PS VÀ HETERO-PS 35
HÌNH 3.9. HÀM LƯỢNG PS VÀ PROTEIN CÓ TRONG CÁC CAO HOMO-
PS VÀ HETERO-PS 36
HÌNH 3.10. ĐƯỜNG HỒI QUY TUYẾN TÍNH BIỂU DIỄN SỰ PHỤ
THUỘC CỦA MẬT ĐỘ QUANG VÀO NỒNG ĐỘ ACID ASCORBIC
CHUẨN 37
HÌNH 3.11. TỔNG LỰC KHÁNG OXY HÓA CỦA CÁC PHÂN ĐOẠN PS
TÁCH CHIẾT TỪ LÁ MÃNG CẦU XIÊM, PS NẤM LINH CHI PHÚ LƯƠNG
VÀ CHẤT CHUẨN 38
HÌNH 3.12. PHỔ IR CỦA PS-5 39
xi
MỞ ĐẦU
Trong những năm gần đây, dược thảo thiên nhiên ngày càng đóng vai trò quan
trọng trong phòng bệnh, chữa bệnh và nâng cao sức khỏe. Một trong những loài cây
đang được nhiều nhà khoa học trên thế giới quan tâm và nghiên cứu trong những năm
gần đây là cây mãng cầu xiêm Annona muricata.
Mãng cầu xiêm được biết đến từ lâu đời với vai trò làm thực phẩm và một số
bài thuốc dân gian có khả năng chữa một số bệnh như: trị cảm, xổ mũi, tiêu chảy, tim,
…
Hóa dược hiện đại cho thấy lá mãng cầu xiêm có khả năng chữa các bệnh như
kháng nấm, kháng khuẩn, ức chế tế bào ung thư, kháng oxi hóa,… hoạt chất tạo nên
hoạt tính sinh học kỳ diệu của cây mãng cầu xiêm là polyphenol, flavonoid, alkaloid,
polysaccharide, acetogennins,…[16], [17], [24], [15], [7].
Tuy nhiên, mối quan hệ giữa cấu trúc và hoạt tính sinh học của các hoạt chất
trong cây mãng cầu xiêm vẫn chưa đươc nghiên cứu nhiều. Trong các thành phần đó,
polysaccharide là các polymer thiên nhiên, có cấu trúc đa dạng, phức tạp và đã được
chứng minh là có nhiều hoạt tính sinh học quý giá.
Ở Việt Nam, số công trình nghiên cứu về polysaccharide trong lá mãng cầu
xiêm còn rất ít. Qua các tài liệu mà chúng tôi tham khảo được: chỉ tìm thấy tài liệu của
Nguyễn Minh Nhung đã nghiên cứu về thành phần hóa học và hoạt tính kháng oxy hóa
của lá mãng cầu xiêm [3], trong đó có polysaccharide. Tuy nhiên, chưa tìm thấy công
trình nào nghiên cứu về cấu trúc của polysacharide trong lá mãng cầu xiêm. Vì vậy,
việc nghiên cứu cấu trúc của PS trong lá mãng cầu xiêm là một vấn đề không chỉ có ý
nghĩa quan trọng về mặt khoa học mà còn đáp ứng nhu cầu cấp thiết về việc ứng dụng
lá mãng cầu xiêm hiện nay của xã hội.
Xuất phát từ những yếu tố đó, chúng tôi chọn đề tài: “Bước đầu nghiên cứu
cấu trúc của polysaccharide trong lá mãng cầu xiêm (Annona muricata) trồng tại
huyện Tân Đông Phú, tỉnh Tiền Giang”.
1
Chương 1
TỔNG QUAN
1.1. Tổng quan về lá mãng cầu xiêm
1.1.1. Giới thiệu về lá mãng cầu xiêm [31]
Mãng cầu xiêm (danh pháp khoa học: Annona muricata) thuộc Loài A.
muricata, Chi Annona, Họ Annonaceae, Bộ Magnoliales, Giới Plantae.
Các tên thông thường: Soursop (Anh-Mỹ), Guanabana, Graviola, Paw Paw
(Brazilian), Corossolier (Pháp), Guanavana, Durian benggala Nangka londa.
Mãng cầu xiêm là một loài cây nhiệt đới rất thường gặp trong vùng Nam Mỹ và Đông
Ấn. Đây cũng là một trong những cây đầu tiên được đưa từ châu Mỹ về lục địa ‘Cựu Thế
Giới’- châu Âu chúng được di thực và được trồng rộng rãi suốt từ khu vực Đông Nam Trung
Hoa sang đến Úc và những vùng bình nguyên tại Đông và Tây Phi châu.
Ở Việt Nam, cây mãng cầu xiêm chủ yếu được trồng ở Nam Bộ và rãi rác ở
Nam Trung Bộ. Đặc biệt được trồng nhiều tại tỉnh Tiền Giang.
1.1.2. Đặc điểm của mãng cầu xiêm [31]
Mãng cầu xiêm thuộc loại tiểu mộc, cao 6- 8 m, là loại cây rất dễ trồng, có thể phát
triển được ở cả vùng nước ngọt lẫn nước lợ và cho quả sau 3 năm. Mãng cầu xiêm cho trái
rộ nhất vào mùa mưa kéo dài đến tết âm lịch (từ tháng 9 đến tháng 2 năm sau).
Về hình dạng cây có các đặc điểm sau:
- Vỏ thân có nhiều lỗ nhỏ màu nâu.
- Lá hình trái xoan, thuôn thành ngọn giáo, mọc so le. Phiến lá có 7- 9 cặp gân phụ.
- Hoa mọc đơn độc ở thân hay nhánh già, hoa có ba lá đài nhỏ màu xanh, ba
cánh ngoài màu xanh- vàng và ba cánh trong màu vàng. Nhị và nhụy hoa tạo thành 1
khối tròn.
- Trái thuộc loại trái mọng kép, lớn, hình trứng phình dài 20- 25 cm, màu xanh
lục hay vàng xanh, khi chín quá mức sẽ đổi sang vàng. Trái có thể kết tại nhiều vị trí khác
nhau trên thân, cành hay nhánh con, và có thể cân nặng đến 5 kg. Vỏ rất mỏng, bên ngoài
có những nốt phù thành những múi nhỏ nhọn hay cong, chứa nhiều hạt màu đen.
2
1.1.3. Thành phần cơ bản trong lá mãng cầu xiêm
Trong lá mãng cầu xiêm có nhiều thành phần quan trong:
- Nhóm hợp chất kháng oxy hóa:
+ Polyphenol [3]
+ Flavonol [3]
- Nhóm hợp chất thiên nhiên có hoạt tính sinh học quan trọng:
+ Alkaloid [16], [17] [3]
+ Acetogenin [24], [7]
+ Tinh dầu [15]
+ Steroid [3]
+ Polysaccharide [3]
1.1.4. Công dụng [31]
- Mãng cầu xiêm được dùng làm thực phẩm tại nhiều nơi trên thế giới.
- Mãng cầu xiêm (lá, rễ và hạt) được dùng làm thuốc tại rất nhiều nơi trên thế
giới, nhất là tại những quốc gia Nam Mỹ:
+ Tại Peru: lá mãng cầu xiêm được dùng làm thuốc trị cảm, xổ mũi, hạt nghiền
nát làm thuốc trừ sâu bọ, trong vùng Amazon, vỏ cây và lá dùng trị tiểu đường, giảm
đau, chống co giật.
+ Tại Guyana: lá và vỏ cây, điều chế thành trà giúp trị đau và bổ tim.
+ Tại Ba Tây: lá nấu thành trà trị bệnh gan, dầu ép từ lá và trái còn non, trộn
với dầu olive làm thuốc thoa bên ngoài trị thấp khớp, đau sưng gân cốt.
+ Tại Jamaica, Haiti và West Indies: trái hay nước ép từ trái dùng trị nóng sốt, giúp
sinh sữa và trị tiêu chảy, vỏ thân cây và lá dùng trị đau nhức, chống co giật, ho, suyển.
+ Tại Ấn Độ, cây được gọi theo tiếng Tamilnadu là mullu- chitta: quả dùng
chống thiếu vitamin C (scorbut), hạt chống nôn mửa và làm se da.
+ Tại Việt Nam: hạt nghiền nát trong nước, lấy nước gội đầu để trị chí rận. Một
phương thuốc Nam khá phổ biến để trị huyết áp cao là dùng vỏ trái hay lá mãng cầu
xiêm, sắc chung với rễ nhàu và rau cần thành nước uống (bỏ bã) mỗi ngày.
1.1.5. Hoạt tính sinh học
- Tác dụng kháng viêm, kháng khuẩn, kháng nấm.
- Hạ huyết áp, làm giãn nở mạch máu.
3
- Gây độc tế bào và chống tế bào ung thư: Cassady (1990), Chang và cộng sự
(1993) [23].
- Thuốc chống co giật: N'Gouemo và cộng sự (1997), González-Trujano và
cộng sự (1998, 2001, 2006a) [23].
- Thuốc chống côn trùng: Sookvanichsilp và cộng sự (1994).
- Thuốc chống ký sinh trùng: Bories và cộng sự (1991), Waechteret và cộng sự
(1997) [23].
- Chống viêm: Orlando Vieira de Sousa và cộng sự (2010) [8].
1.2. Tổng quan về polysaccharide và cấu trúc của polysaccharide trong lá MCX
1.2.1. Tổng quan về polysaccharide [2]
1.2.1.1. Khái niệm
- Là polymer thiên nhiên thuộc nhóm carbohydrate được cấu tạo từ nhiều
monosaccharide kết hợp lại với nhau, dạng bột.
- Có khối lượng phân tử lớn.
- Cho màu xanh lục khi tác dụng với anthrone- acid sulfuric, và cho màu vàng
da cam khi tác dụng với phenol- acid sulfuric [5], [10].
PS được chia làm 2 loại:
1.2.1.2. PS thuần (homopolysaccharide)
PS thuần (homopolysaccharide) bao gồm 2 loại:
- Polyhomosaccharide (glycan): đây là loại PS chỉ gồm 1 loại đường đơn trong
phân tử.
- Polyheterosaccharide (heteroglycan): đây là loại PS được cấu tạo từ nhiều loại
đường đơn khác nhau.
1.2.1.3. PS tạp (heteropolysaccharide)
PS tạp (heteropolysaccharide) bao gồm 2 loại:
- N- heteropolysaccharide: đây là loại PS hỗn tạp giữa hợp chất của đường và
các hợp chất của nitơ.
- S- heteropolysaccharide: đây là loại PS hỗn tạp giữa hợp chất của đường và
các hợp chất của lưu huỳnh
1.2.2. Hoạt tính sinh học của polysaccharide
1.2.2.1. Hoạt tính của PS-homo
Những hợp chất có hoạt tính kháng ung thư như heteroglycan, thường là các
hợp chất tan trong nước [25].
4
Trong các hợp chất thiên nhiên thì polysaccharide chiết xuất từ sinh vật là các
polymer thiên nhiên, có cấu trúc rất đa dạng, phức tạp và đã được nghiên cứu rất nhiều
trên thế giới cũng như trong nước bởi các hoạt tính sinh học quý giá của chúng như:
khả năng chống ung thư, tăng tính miễn dịch, hạ đường huyết, tăng tổng hợp protein,
tăng chuyển hoá acid nucleic chống oxy hóa, bảo vệ gan, chống đông cục máu, kháng
khuẩn, kháng virut (kể cả virut HIV), chống nghẽn tĩnh mạch [1], [2],…
Mặc dù, polysaccharide có hoạt tính có lợi cho sức khỏe con người nhưng nếu
sử dụng với nồng độ cao có thể dẫn đến ức chế hệ thống miễn dịch của cơ thể [25].
1.2.2.2. Hoạt tính của hetero-PS
Các nhà khoa học đã chứng minh được rằng, nếu trong phân tử polysaccharide có
thêm một hoặc nhiều nhánh của protein hay sulfat thì hoạt tính sinh học của nó có thể bị
thay đổi, có nhiều hoạt tính mà PS-homo không có, nhưng hetero-PS thì lại xuất hiện.
PS-protein được biết đến với khả năng chống lại sự hình thành các khối u, gây
độc cho các tế bào ung thu vú của con người ở nồng độ 200 và 100 g/mL [21], khả
năng kháng oxi hóa [6], kháng ung thư [25].
PS-sulfat có thể chữa bệnh do vius herpes gây ra-anti-HSV, [13], tăng hoạt
động miễn dịch [11], tác dụng ức chế tế bào ung thư [26], kháng khuẩn, kháng vius, kể
cả virus HIV [4], [20], chống đông máu, chống oxi hóa [28]…
1.2.3. Cấu trúc của polysaccharide mãng cầu xiêm
Cấu trúc PS của các loại thực vật nói chung và cây mãng cầu xiêm nói riêng
thuộc vào rất nhiều yếu tố: giống, điều kiện sinh trưởng và phát triển, thời gian thu
hoạch, điều kiện tách chiết.
Theo nghiên cứu trước đây về hạt của cây mãng cầu xiêm, cấu trúc PS hạt
MCX có bộ khung galactomannan. Các phân tử có chuỗi mạch chính là (1-4)-α-D-
mannopyranose, các nhánh bên là các chuỗi (1-6)-α-D-galactopyranose với các tỷ lệ
khác nhau. Khối lượng phân tử được tìm thấy thay đổi từ 6000-17000. [14]
Hình 1.1. Bộ khung galactomannan trong hạt MCX
5
Các nghiên cứu gần đây cho thấy, trong lá của cây MCX cũng có chứa thành
phần polysaccharide, và nó hoạt tính sinh học [3]. Hoạt tính sinh học của PS phần lớn
phụ thuộc vào cấu trúc của nó. Tuy nhiên, vẫn chưa tìm thấy các tài liệu nghiên cứu về
cấu trúc PS trong lá MCX.
1.3. Phương pháp phân đoạn polysaccharide thô bằng amonium sulfate
Hình 1.2. Sơ đồ phân đoạn các PS từ PS thô [30]
1.4. Các phương pháp xác định cấu trúc polysaccharide lá MCX
1.4.1. Phân tích thành phần MS
Quá trình phân tích thành phần MS được thực hiện như sau: PS trong
Ganoderma được thuỷ phân thành các MS, các MS được xác định trực tiếp bằng
HPAEC-PAD hay gián tiếp thông qua việc xác định các dẫn xuất của nó (GC-MS).
(a) Phương pháp HPAEC-PAD [19]
Hình 1.3. Quy trình phân tích thành phần MS theo phương pháp HPAEC-PAD
Giải thích quy trình:
6
PS 5 mg/mL,
100 mL
PS-sol-1,
120 mL
PS-gel-3,
120 mL, PS3
PS-sol-3,
150 mL, PS1
p
PS-gel-1,
60 mL
1. 100 mL (NH
4
)
2
SO
4
50%,
khuấy đều
2. Để qua đêm ở 25
0
C
1. 80 mL (NH
4
)
2
SO
4
50%,
khuấy đều
2. Để qua đêm ở 25
0
C
PS-gel-2,
30 mL, PS4
PS-sol-2,
60 mL, PS2
1. 30 mL nước cất, khuấy
đều
2. Để qua đêm ở 25
0
C
5 mg PS
2 mL TFA 2 N, 100
0
C, 8 giờ
MS + TFA dư
MS
H
2
O, bay hơi nước ở áp suất thấp
Phân tích HPAEC-PAD
- TFA được dùng để thuỷ phân PS thành các MS. H
2
O được cho vào để loại
TFA dư.
- MS được xác định trực tiếp bằng hệ thống HPAEC-PAD.
(b) Phương pháp GC-MS [9]
Hình 1.4. Quy trình phân tích thành phần MS theo phương pháp GC-MS
Giải thích quy trình:
- TFA được dùng để thuỷ phân PS thành các MS. MeOH được cho vào để loại
TFA dư.
- Dùng NaBH
4
để khử MS thành alditol. Cho HCl vào để trung hoà NaBH
4
, sau
đó cho MeOH vào để loại hỗn hợp sản phẩm phụ.
- Dùng (CH
3
CO)
2
O để chuyển các alditol thành dẫn xuất bay hơi. Các dẫn xuất
này được chiết ra bằng CHCl
3
và phân tích bằng GC-MS.
1.4.2. Phương pháp phổ hồng ngoại
Phép phân tích phổ hồng ngoại FTIR là phương pháp đơn giản cho phép xác
định nhanh sự có mặt của các nhóm chức hóa học cấu tạo nên phân tử hợp chất. Bằng
các peak đặc trưng trên phổ hồng ngoại cho phép xác định các liên kết hóa học của các
nguyên tố trong polysaccharide.
7
50 mg PS
TFA 4 N, 121
0
C, 4 giờ
Mono + TFA
dư
Mono
MeOH 50%, sấy khô ở áp suất thấp
1. 80 mg NaBH
4
trong MeOH, để yên 30 phút
2. Rửa bằng HCl và MeOH, sấy áp suất thấp
Alditol
Dịch CHCl
3
1. (CH
3
CO)
2
O:pyridine = 1:2, 80
0
C, 2 giờ
2. Giữ ở 25
0
C, 16 giờ
Alditol peracetate
1. Chiết bằng CHCl
3
:HCl = 2:1
2. NaHCO
3
bão hoà
Phân tích GC-MS
Dịch NaHCO
3
Cô đuổi dung môi
1.5. Tổng quan về gốc tự do và chất kháng oxy hóa
1.5.1. Gốc tự do [35]
Gốc tự do được khái niệm là những nguyên tử, nhóm nguyên tử hoặc phân tử
ở lớp ngoài cùng có những electron không ghép đôi. Gốc tự do có thể tồn tại độc
lập, tuy nhiên thời gian tồn tại của các gốc tự do thường rất ngắn (khoảng một phần
triệu đến một phần nghìn giây). Các electron này có năng lượng cao, rất kém bền
nên dễ dàng tham gia vào nhiều phản ứng hóa học như phản ứng oxy hóa – khử,
phản ứng polymer hóa…
Về bản chất, gốc tự do là một electron độc thân. Các gốc tự do rất không ổn
định và nhạy cảm. Chúng tìm kiếm những electron khác để hình thành một cặp
electron mới. Các gốc tự do gây hại khi chúng kéo những electron từ các tế bào
bình thường.
1.5.2. Các chất kháng oxy hóa [35]
1.5.2.1. Khái niệm
Chất kháng oxy hóa là những chất có khả năng ngăn ngừa, chống lại và loại bỏ
tác dụng độc hại của các gốc tự do một cách trực tiếp hoặc gián tiếp. Chất kháng oxy
hóa có thể trực tiếp phản ứng với các gốc tự do hoạt động để tạo ra những gốc tự do
mới kém hoạt động hơn, từ đó có thể ngăn cản chuỗi phản ứng dây chuyền được khơi
mào bởi các gốc tự do.
Chất kháng oxy hóa cũng có thể gián tiếp tạo phức với các ion kim loại chuyển
tiếp trong phản ứng Fenton hoặc ức chế các enzyme xúc tác cho các quá trình sinh ra
gốc tự do nhằm ngăn cản sự hình thành gốc tự do trong cơ thể.
1.5.2.2. Cơ chế hoạt động của chất kháng oxy hóa
8
Chất kháng oxy hóa Gốc tự do
Electron lẻ
Trao đổi
điện tử
Hình 1.5. Cơ chế hoạt động của chất chống oxy hóa
Chất kháng oxy hóa có thể chuyển một nguyên tử hydro hoặc một electron đến
gốc tự do. Khi phân tử gốc tự do nhận H hoặc e từ chất kháng oxy hóa thì trở nên ổn
định và không còn khả năng gây ra hại nữa. Ngoài ra chất kháng oxy hóa còn giúp hạn
chế sự phân hủy các hydroperoxide.
1.5.2.3. Phân loại
Có nhiều cách phân loại chất kháng oxy hóa dựa trên nguồn gốc, cấu trúc của
chất kháng oxy hóa.
+ Theo nguồn gốc: chất kháng oxy hóa tự nhiên và chất kháng oxy hóa tổng hợp.
+ Theo bản chất: chất kháng oxy hóa có bản chất enzyme và chất kháng oxy
hóa không có bản chất không enzyme.
1.5.2.4. Một số chất kháng oxy hóa hay sử dụng
(a) Acid gallic [32], [35]
Acid gallic là một acid hữu cơ, danh pháp là acid 3,4,5-trihydroxylbenzoic, có
trong lá chè và nhiều loại thực vật khác. Acid gallic có thể tồn tại ở dạng tự do hay là
một phần của tannin.
Hình 1.6. Công thức cấu tạo của acid gallic
Acid gallic là tên thông dụng trong ngành công nghiệp dược. Nó được sử dụng
làm chất chuẩn để xác định hàm lượng phenol trong một số phép phân tích sử dụng
thuốc thử Folin-Ciocalteu
Acid gallic có tính kháng nấm và kháng khuẩn. Acid gallic hoạt động như một
chất chống oxy hóa và giúp bảo vệ các tế bào khỏi nguy cơ bị oxy hóa. Nó cũng có khả
năng kháng các tế bào ung thư mà không gây hại đến các tế bào khỏe mạnh.
(b) BHT (Butylated hydroxyl toluene) [32], [34]
BHT có danh pháp hóa học là 2,6-bis (1,1-dimethylethyl)-4-methylphenol; 2,6-
di-tert-butyl-p-cresol; 2,6-di-tert-butyl-4-methylphenol. BHT được tạo thành phản ứng
9
của para–cresol (4-methylphenol) với isobutylen (2-methylpropene) xúc tác bởi acid
sulfuric, có công thức phân tử là C
15
H
24
O.
Hình 1.7. Công thức cấu tạo của BHT
BHT hoạt động tương tự như là một vitamin E tổng hợp, chủ yếu hoạt động như
một chất ngăn chặn quá trình oxy hoá, một quá trình không bão hòa. Trong đó, thường
là các hợp chất hữu cơ bị tấn công bởi oxy trong khí quyển. BHT chống oxy hoá xúc
tác phản ứng bằng cách chuyển đổi các gốc tự do peroxy trong liên kết
hydroperoxides. Điều này tác động đến chức năng chống oxi hoá bằng cách nó sẽ
quyên góp một nguyên tử hydro:
RO
2
+ ArOH → ROOH + ArO
RO
2
+ ArO
→ sản phẩm không gốc tự do
R là alkyl hoặc aryl, và nơi ArOH là phenolic của BHT hoặc có liên quan đến
chất chống oxy hóa. Người ta thấy rằng BHT liên kết với hai gốc tự do peroxy. Ngoài
ra, nó còn là chất thuộc nhóm chất chống oxi hóa có hiệu quả và được sử dụng rộng rãi
trong các sản phẩm có nhiều chất béo. Do đó có tác dụng bảo quản thực phẩm, ngăn
ngừa sự hư hỏng của hương liệu.
(c) Acid L-ascorbic (Vitamin C) [33]
Acid L-ascorbic được tìm thấy nhiều trong thực phẩm tươi, rau quả và trái cây.
Nó đóng một vai trò hết sức quan trọng trong nhiều hoạt động của cơ thể.
10
