báo cáo dna vaccine và công nghệ sản xuất plasmid dna

DNA VACCINE VÀ CÔNG
NGHỆ SẢN XUẤT
PLASMID DNA
CBGD: PGS TS. Nguyễn Thúy Hương
Lớp: HC07SH
Nhóm:
1.Trần Tú Bửu 60700186
2.Lưu Ngọc Thanh Hương 60701035
3.Trần Hoàng Lâm 60701248
4.Bùi Vũ Ngọc Quỳnh 60702000
5.Nguyễn Xuân Quỳnh 60702005
NỘI DUNG
A. Tổng quan
B. Ứng dụng công nghệ gene trong
DNA vaccine
C. Công nghệ lên men sản xuất
plasmid DNA
A. TỔNG QUAN
I. Sơ lược về vaccine
II. DNA vaccine (cơ chế
miễn dịch)
I. Sơ lược về vaccine
1. Lịch sử hình thành
- Năm 1776, bác sĩ Edward Jenner đã làm thực
nghiệm để kiểm tra một quan niệm dân gian
cho rằng người nào bị nhiễm bệnh gia súc thể
nhẹ gọi là bệnh đậu bò sẽ không bị nhiễm bệnh
đậu người.
- Khi Jenner công bố kết quả thí nghiệm của
mình, người ta chỉ hình dung là có các "mầm
bệnh" gây nên sự truyền nhiễm. Tám mươi năm

sau, Louis Pasteur nghiên cứu bệnh tả, Qua đó,
Pasteur đã xác nhận các giả thuyết của Jenner
và mở đường cho khoa miễn dịch học hiện đại.
2. Phân loại
 Vaccine tiểu đơn vị
 Vaccine giảm độc lực
 DNA vaccine
 Vaccine giảm độc lực
- Vaccine chứa vi sinh vật đã bị làm yếu hay đã bị chết
hoàn toàn.
- Mặc dù có những thành công đáng kể trong việc tạo
các vaccine hiệu quả chống lại các bệnh như ; viêm
gan siêu vi A (virus bất hoạt), tả, uốn ván, đậu
mùa… nhưng vẫn còn những hạn chế trong việc sản
xuất vaccine hiện nay :
 Không phải tất cả tác nhân lây nhiễm đều có thể nuôi
cấy được.
 Sản xuất vaccine có giá thành cao do sản lượng thấp
và tốc độ sản xuất chậm.
 Yếu tố an toàn trong sản xuất và tiêm phòng khó
kiểm soát.
 Thời gian sử dụng hạn chế, đòi hỏi bảo quản nghiêm
ngặt.
 Vaccine tiểu đơn vị
- Khái niệm: vaccine dùng một phần kháng nguyên
gây bệnh chứ không phải toàn bộ sinh vật gây
bệnh.
- Ưu điểm:
 Chế phẩm bền và an toàn.
 Không có các protein hay acid nucleic ngoại lai có

thể gây phản ứng phụ.
- Nhược điểm:
 Giá thành cao trong việc tinh sạch protein.
 Protein được phân lập có thể không cùng cấu trúc
với loại in situ (ở vỏ ngoài hoặc capsid của virus)
làm biến đổi tính kháng nguyên của protein đó.
 DNA vaccine
- Là thế hệ vaccine thứ ba.
- Sự tiêm chủng DNA vaccine là một kỹ thuật
giúp bảo vệ sinh vật chống lại những tác nhân
gây bệnh bằng cách tiêm DNA mã hóa kháng
nguyên gây bệnh nhằm tạo ra đáp ứng miễn
dịch cho cơ thể.
- DNA vaccine vừa mang tính chất của vaccine
là tính chủng ngừa, vừa mang tính chất điều trị
bệnh như một liệu pháp gen.
 DNA vaccine
Ưu
điểm
Nhượ
c điểm

Không xảy ra sự hồi độc.

Kháng nguyên được trình diện bời cả MHC lớp I, II

Khả năng biệt hóa lympho T hỗ trợ theo 2 hướ
ng
Th1 và Th2, kích hoạt T độc tế bào.


Hiệu lực vaccine trong thời gian dài

Protein được dịch mã trong cơ thể sinh vật giống
với
cấu trúc thông thường của Eukaryote.

Không cần tổng hợp peptide, biểu hiện và tinh sạ
ch
protein tái tổ hợp, cũng như sử dụng các tá dược độ
c

Dễ phát triển và sản xuất, ổn định trong bảo quản
và
vận chuyển

Hiệu quả kinh tế cao

Giới hạn trong nhữ
ng
bệnh gây ra bởi khá
ng
nguyên protein.

Nguy cơ tác động đế
n
bộ gen cơ thể sinh
vật
được tiêm chủng.

Có khả năng gây

ra
kháng thể kháng
DNA
(tự miễn dịch).

Có thể gây ra sự chị
u
thuốc (tolerance).
II. DNA vaccine (cơ chế miễn dịch)
Cơ chế hấp thu DNA
Các nhà khoa học đưa ra 2 giả thuyết về cơ chế hấp
thu DNA :
 Cơ chế hấp thu không định hướng giống như cơ chế
thực bào và ẩm bào (phagocytosis và pinocytosis)
 Hoặc thông qua những thụ thể đặc biệt gắn trên
màng (specific receptors).
II. DNA vaccine (cơ chế miễn dịch)
Trình diện kháng nguyên bởi APCs thông
qua phân tử MHC
Việc trình diện kháng nguyên được thực hiện
bởi DCs (dendritic cells), đại thực bào
(macrophages), và những tế bào B chuyên biệt.
Các tế bào này được gọi là pro-APCs.
Có 2 hướng trình diện kháng nguyên theo
MHC I hay II
Ngoài ra còn có hiện tượng “cross-priming”
(hay “cross-presentation”)
II. DNA vaccine (cơ chế miễn dịch)

Đáp ứng T hỗ trợ
 T hỗ trợ sau khi nhận diện kháng nguyên sẽ truyền đạt
thông tin tới các tế bào khác thông qua việc tiết cytokine,
kích hoạt các tế bào khác tiêu diệt tế bào nhiễm.
 Một ưu điểm của DNA vaccine là có thể điều khiển sự
biệt hóa theo hướng Th1 hay Th2.
Đáp ứng T độc tế bào (CTL)
 Một trong những ưu điểm quan trọng nhất của DNA
vaccine là khả năng gây ra đáp ứng CTL mà không gây
ra những nguy hiểm như loại vaccine truyến thống sử
dụng toàn bộ tác nhân lây nhiễm còn sống.
 Nhiều nghiên cứu nhằm tăng đáp ứng này.
II. DNA vaccine (cơ chế miễn dịch)
 Đáp ứng miễn dịch thể dịch
Tuy động học của việc đáp ứng kháng thể khá
chậm, nhưng DNA vaccine gây đáp ứng sản
xuất ra lượng kháng thể có chất lượng cao, tức
là có ái lực với epitope mạnh nhất so với các
loại vaccine khác.
Ngoài ra sự đáp ứng kháng thể còn chủ yếu
xảy ra theo cơ chế phụ thuộc T lympho cụ thể
là T hỗ trợ.
Những bước tiến triển thử nghiệm lâm
sàng trong vài năm trở lại đây
 1/2009, vaccine AS04 ngừa HPV 16/18 thực hiện phase III, so sánh kết quả giữa 2
nhóm phụ nữ từ 26-55 tuổi và 15-25 tuổi. Kết quả là chịu thuốc tốt và sai 1 tháng
tiêm nhắc 3 lần thì đạt kết quả dương tính 100%.
 1/2009, vaccine ngừa HIV có kết hợp và không kết hợp GM-CSF thực hiện ở
Phase I với 80 tình nguyện viên.

 11/2009 vaccine thế hệ mới kích hoạt đáp ứng Th ngừa HIV thử nghiệm phase I.
 2009, DNA vaccine BHT-3021 ngừa bệnh tiểu đường type-1 thực hiện phase I/II.
 3/2010, vaccine ngừa cúm A gây ra bởi virus H5 hemaghluyinin thực hiện ở phase
I.
 9/2010, vaccine ngừa sốt rét PfCS102 chống Plasmodium falciparum thực hiện ở
Phase I/IIa.
 2010, vaccine ngừa sởi tiến hành thử nghiệm trên trẻ sơ sinh ở vùng Sahara, Châu
Phi.
B. Ứng dụng công nghệ gene
trong DNA vaccine
I. Thiết kế plasmid DNA
II. Chuyển giao plasmid
(Delivery methods)
III.Tá dược (Genetic Adjuvants)
I. Thiết kế plasmid DNA
1. Yêu cầu
2. Xây dựng plasmid DNA
3. Thiết kế vector đa cistron
4. Tối ưu thiết kế plasmid vector
5. Tối ưu thiết kế gen đích
1. Yêu cầu
 Yêu cầu về tính an toàn :
 Không nhập vào DNA nhiễm sắc thể con người.
Để hạn chế tối đa khả năng kết hợp thì vector cần
được được thiết kế sao cho có ít nhất hoặc không
có những đoạn tương đồng. Sử dụng phần mềm
BLAST để hỗ trợ.
 Không được sao chép trong tế bào người được
tiêm chủng.
 Không được chứa những đoạn gen kháng sinh

như penicillin hay β-lactam… Những loại kháng
sinh này có thể gây dị ứng ở cơ thể người.
1. Yêu cầu
 Yêu cầu trong sản xuất:
 Cho sản lượng cao thông qua một quy trình sản
xuất đơn giản. Thường sử dụng Escherichia coli
là vật chủ trong sản xuất plasmid, nên đòi hỏi
vector phải có vùng sao chép hoạt động mạnh ở
prokaryote.
 Chứa đoạn gen đánh dấu để dễ dàng chọn lọc
dòng tái tổ hợp.
 Kích thước vector nhỏ gọn, hạn chế gánh nặng
trao đổi chất cho vi sinh vật chủ.
 Có tính ổn định cao, hạn chế các trình tự nhạy
cảm với vi sinh vật chủ.
1. Yêu cầu
 Yêu cầu về tính hiệu quả biểu hiện :
 Một vector dùng trong DNA vaccine nên phân ra
thành 2 phần: một chỉ biểu hiện ở E.coli lả đoạn gen
đánh dấu để sàng lọc dòng tổ hợp, một chỉ biểu hiện
ở tế bào của đối tượng tiêm chủng là đoạn kháng
nguyên đích.
 Có promoter mạnh. Có thể kết hợp sử dụng những
đoạn enhancer tăng cường hoạt động của promoter.
 Có yếu tố kết thúc phiên mã rõ ràng, tránh hiện
tượng read-through trong quá trình phiên mã làm
giảm hiệu quả biểu hiện.
 Có yếu tố hỗ trợ khởi sự dịch mã, thường sử dụng
đoạn Kozak.
2. Xây dựng plasmid DNA

 Chuẩn bị gen đích
 Chuẩn bị plasmid
 Chèn gen đích vào plasmid
 Biến nạp và thu nhận pDNA
 Kiểm tra kết quả chèn
 Kiểm tra biểu hiện
Chọn plasmid pVAX1 là vector mang đoạn gen
kháng nguyên
 Chuẩn bị gen đích
Thiết kế mồi PCR : Chọn 2 vị trí giới hạn với
điều kiện: 2 đoạn này có mặt trong vector pVAX1
và không có mặt trong đoạn gen đích. Chọn NheI
và XhoI và gắn lần lượt vào 2 đoạn mồi.
 Mồi xuôi có đầu5’ được gắn thêm đoạn Kozak và
codon ATG.
 Mồi ngược có đầu 3’ được gắn thêm codon kết
thúc.
 Ngoài ra, mỗi đầu còn được gắn thêm một số
nucleotide nhằm tạo nên độ bám và trượt tốt cho
enzyme cắt giới hạn tăng độ chính xác khi cắt.