nghiên cứu biến động một số chỉ tiêu hóa sinhcủa cây nha đam dưới tác động của mannitol trong điều kiện nuôi cấy in vitro

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
ĐẠI HỌC HUẾ
TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC





HUỲNH THỊ HỒNG TRANG













NGHIÊN CỨU BIẾN ĐỘNG MỘT SỐ CHỈ TIÊU HÓA SINH
CỦA CÂY NHA ĐAM DƯỚI TÁC ĐỘNG CỦA MANNITOL
TRONG ĐIỀU KIỆN NUÔI CẤY IN VITRO

CHUYÊN NGÀNH: SINH HỌC THỰC NGHIỆM
MÃ SỐ : 60. 42. 30



LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC SINH HỌC



NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC
TS. HOÀNG THỊ KIM HỒNG


Huế, 2012








LỜI CAM ĐOAN



Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của
tôi.Các số liệu, kết quả trình bày trong đề tài là trung thực, khách
quan và nghiêm túc. Những tài liệu tham khảo có nguồn gốc rõ

ràng. Nếu có gì sai sót tôi xin chịu hoàn toàn trách nhiệm.


Tác giả luận văn




HUỲNH THỊ HỒNG TRANG

Trong suốt thời gian học cũng như làm luận văn em nhận được rất nhiều sự
quan tâm giúp đỡ của các thầy cô giáo trong khoa Sinh học, trường Đại học Khoa
học, Đại học Huế. Em xin chân thành cảm ơn sự giúp đỡ quý giá đó.
Đặc biệt, em xin gởi lời cảm ơn sâu sắc nhất đến TS.Hoàng Thị Kim Hồng,
PGS.TS Nguyễn Hoàng Lộc đã tận tình hướng dẫn, chỉ bảo em trong suốt quá trình
thực hiện luận văn.
Em xin gởi lời cảm ơn đến các anh chị tại phòng thí nghiệm Công nghệ gen
và phòng Miễn dịch, Viện Tài nguyên, Môi trường và Công nghệ sinh học, Đại học
Huế đã nhiệt tình giúp đỡ, tạo mọi điều kiện thuận lợi nhất trong suốt quá trình
thực hiện luận văn.
Cuối cùng, em xin bày tỏ lòng biết ơn đến những người thân trong gia đình,
bạn bè đã động viên, giúp đỡ trong suốt thời gian học tập cho đến khi hoàn thành
luận văn.
Một lần nữa em xin chân thành cảm ơn!

Huế, tháng 9 năm 2012
Tác giả luận văn

Huỳnh Thị Hồng Trang






MỤC LỤC
Trang

Trang phụ bìa
Lời cam đoan
Lời cảm ơn
Mục lục
Danh mục viết tắt
Danh mục bảng
Danh mục hình
Danh mục đồ thị
MỞ ĐẦU 1
Chƣơng I. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3
1.1. Giới thiệu chung về thực vật CAM 3
1.1.1. Thực vật CAM 3
1.1.2. Cơ chế chuyển hóa acid malic trong quá trình quang hợp của thực vật CAM 5
1.2. Giới thiệu chung về cây nha đam 7
1.2.1. Lịch sử phát hiện cây nha đam 7
1.2.2. Đặc điểm sinh học của cây nha đam 8
1.2.3. Thành phần hóa học cây nha đam 9
1.3. Nhân giống in vitro 9
1.3.1. Thuật ngữ nhân giống in vitro 9
1.3.2. Lược sử phát triển của nhân giống in vitro 10
1.3.3. Nhân nhanh cây con in vitro 14
1.4. Đặc tính chịu hạn của thực vật 15
1.4.1. Cơ sở sinh lý, hóa sinh và sinh học phân tử của tính chịu hạn của thực vật 15
1.4.2. Ảnh hưởng của mannitol lên nuôi cấy mô tế bào thực vật 17
1.5. Tổng quan về một số thành phần hóa sinh 18
1.5.1. Tổng quan về tinh bột 18
1.5.2. Tổng quan về acid oxaloacetic (OAA) 19

1.5.3. Tổng quan về acid pyruvic 20
1.5.4. Tổng quan về mannitol 20
1.6. Tổng quan về protein và kỹ thuật điện di SDS-PAGE 21
1.6.1. Khái quát về protein 21
1.6.2. Giới thiệu về kỹ thuật điện di 22
Chƣơng 2 . ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 24
2.1. Đối tượng nghiên cứu 24
2.2. Phương pháp nghiên cứu 24
2.2.1. Kỹ thuật nuôi cấy in vitro 24
2.2.1.1. Kiểm tra môi trường tối ưu 24
2.2.1.2. Kỹ thuật nhân nhanh từ cây tái sinh 25
2.2.1.3. Xử lý stress nước cho cây con in vitro và thu mẫu 25
2.2.2. Xác định tốc độ sinh trưởng tương đối 26
2.2.3. Xác định hàm lượng nước bằng phương pháp sấy khô mẫu 26
2.2.4. Xác định cường độ quang hợp bằng máy đo cường độ quang hợp Ciras-2
Portable hệ thống quang hợp của hãng Licor - Mỹ 26
2.2.5. Xác định hàm lượng tinh bột theo phương pháp của Coombs và cs (1987) 26
2.2.6. Xác định hàm lượng đường khử theo phương pháp dinitro salixylic acid 26
2.2.7. Xác định hàm lượng OAA và pyruvate bằng phương pháp đo mật độ quang
học ở bước sóng 340 nm 26
2.2.8. Xác định hoạt tính enzyme 27
2.2.9. Xác định hàm lượng protein và chạy điện di SDS - PAGE 27
2.2.10. Xử lý kết quả thí nghiệm 28
Chƣơng 3. KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN 29
3.1. Tạo nguồn nguyên liệu ban đầu 29
3.1.1. Khả năng nhân chồi của đoạn thân tách từ cây nha đam in vitro 29
3.1.2. Khả năng nhân chồi của đỉnh sinh trưởng tách từ cây nha đam in vitro 29
3.1.3. Nhân nhanh cây nha đam in vitro lên môi trường tối ưu và cấy chuyển lên môi
trường bổ sung mannitol ở các nồng độ khác nhau 31

3.2. Ảnh hưởng của mannitol ở các nồng độ khác nhau lên khả năng sinh trưởng
và các chỉ tiêu sinh lý, hóa sinh của cây nha đam in vitro 32
3.2.1. Ảnh hưởng của mannitol lên khả năng sinh trưởng của cây nha đam in vitro 32
3.2.2. Ảnh hưởng của nồng độ mannitol đến tốc độ sinh trưởng tương đối cây nha
đam trong điều kiện in vitro 34
3.2.3. Ảnh hưởng của mannitol đến các chỉ tiêu sinh lý của cây nha đam in vitro 35
3.2.3.1. Biến động pH của dịch lá nha đam in vitro nuôi cấy trên môi trường
có bổ sung các nồng độ mannitol khác nhau 35
3.2.3.2. Cường độ quang hợp ở lá của cây nha đam in vitro sau 4 tuần nuôi
cấy trên môi trường có bổ sung mannitol ở các nồng độ khác nhau 37
3.3. Ảnh hưởng của mannitol đến các chỉ tiêu hóa sinh của lá cây nha đam in
vitro nuôi cấy trên môi trường có bổ sung mannitol ở các nồng độ khác nhau . 38
3.3.1. Hàm lượng nước trong lá cây nha đam in vitro cấy chuyển lên môi trường có
bổ sung mannitol ở các nồng độ khác nhau 38
3.3.2. Hàm lượng protein 39
3.3.3. Hàm lượng đường khử và hàm lượng tinh bột 40
3.3.4. Hàm lượng pyruvate và OAA 42
3.3.5. Hoạt độ enzyme 44
3.6. Kết quả chạy điện di SDS-PAGE 46
Chƣơng 4 . KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 48
4.1. Kết luận 48
4.2. Kiến nghị 48
TÀI LIỆU THAM KHẢO 50
PHỤ LỤC

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT

cs : Cộng sự
CAM : Crassulacean acid metabolism
DTT : dithiothreiton
MDH : malate dehydrogenase
ME : malate enzyme
MS : Murashige & Skoog
OAA : acid oxaloacetic
PBS : phosphate buffer in salt
PCK : phosphoenolpyruvate carboxylkinase
PEP : phosphoenolpyrvate
PEPC : phosphoenolpyruvate carboxylase
PVP : polyvinylpyrrolidone
SDS : sodium dodecyl sulfate
SDS - PAGE : sodium dodecyl sulfate – polyacrylamide gel
electrophoresis






DANH MỤC BẢNG

Số hiệu bảng
Tên bảng

Trang
Bảng 2.1
Thành phần môi trường MS
25
Bảng 3.1
Ảnh hưởng của nồng độ mannitol đến tốc độ sinh trưởng
tương đối của cây nha đam trong điều kiện in vitro
34
Bảng 3.2
Biến động pH của dịch lá cây nha đam in vitro sau 4 tuần
nuôi cấy trên môi trường có bổ sung mannitol ở các nồng
độ khác nhau
36
Bảng 3.3
Cường độ quang hợp của lá cây nha đam in vitro nuôi cấy
trên môi trường có bổ sung mannitol ở các nồng độ khác
nhau
37
Bảng 3.4
Hàm lượng chất khô và protein trong lá nha đam được
nuôi cấy trên môi trường bổ sung các nồng độ mannitol
khác nhau
39
Bảng 3.5
Hàm lượng đường khử và hàm lượng tinh bột trong lá cây
nha đam in vitro khi nuôi cấy trên môi trường có bổ sung
mannitol ở các nồng độ khác nhau
41
Bảng 3.6
Hàm lượng pyruvate và OAA trong lá nha đam in vitro

khi nuôi cấy trên môi trường có bổ sung mannitol ở các
nồng độ khác nhau
42
Bảng 3.7
Hoạt độ enzyme MDH, PEPC và ME trong dịch chiết lá
nha đam in vitro trên môi trường có bổ sung mannitol ở
các nồng độ khác nhau
44






DANH MỤC HÌNH VẼ

Số hiệu hình
Tên hình
Trang
Hình 1.1
Các giai đoạn của chu trình quang hợp
5
Hình 1.2
Sơ đồ phân loại thực vật CAM
6
Hình1.3
Sơ đồ chuyển hóa acid malic
7
Hình 1.4
Cấu trúc amylose và amylopectin

19
Hình 1.5
Cấu tạo phân tử mannitol
21
Hình 2.1
Cây nha đam (Aloe vera L.) in vitro
24
Hình 3.1
Cụm chồi thu được từ đoạn thân tách từ cây nha đam in vitro
29
Hình 3.2
Cụm chồi thu được từ đỉnh sinh trưởng tách từ cây nha
đam in vitro 3 tuần
30
Hình 3.3
Chồi đơn tách từ cụm chồi nha đam in vitro mới cấy chuyển
31
Hình 3.4
Chồi đơn tách từ cụm chồi nha đam in vitro sau cấy
chuyển 4 tuần
32
Hình 3.5
Mẫu nha đam in vitro xử límannitol :a,b,c,d,e,f,g tương
ứng với nồng độ mannitol: 1, 3, 6, 9, 12,15, 18% cấy
chuyển sau 4 tuần.
33
Hình 3.6
Quá trình tích lũy và chuyển hóa acid malic trong nhóm
PCK – CAM
35

Hình 3.7
Phổ điện di protein hòa tan tổng số của lá cây nha đam in
vitro trên môi trường bổ sung mannitol ở các nồng độ
khác nhau.
46






DANH MỤC ĐỒ THỊ

Số hiệu đồ thị
Tên đồ thị
Trang
Đồ thị 3.1
Hàm lượng protein trong lá cây nha đam in vitro nuôi cấy trên
môi trường có bổ sung mannitol ở các nồng độ khác nhau
40
Đồ thị 3.2
Hàm lượng pyruvate của cây nha đam in vitro khi nuôi cấy
trên các môi trường có bổ sung hàm lượng mannitol khác nhau
43
Đồ thị 3.3
Hàm lượng OAA của cây nha đam in vitro khi nuôi cấy trên
các môi trường có bổ sung hàm lượng mannitol khác nhau
44

1



MỞ ĐẦU

Thực vật có mạch lá được chia thành 3 nhóm chính: C3, C4, CAM
(Crassualacean acid metabolism). Trong số đó, thực vật CAM chiếm khoảng 6 –
7%, được phân thành 5 lớp, 33 họ, 328 giống, 16.000 loài khác nhau. Thực vật
CAM có nhiều giá trị kinh tế khác nhau, một số thuộc nhóm hoa cây cảnh như
phong lan, hoa quỳnh đỏ, quỳnh trắng, xương rồng…, một số thuộc nhóm cây dược
liệu như cây thuốc bỏng, nha đam, dứa dại…, một số thuộc nhóm cây ăn trái như
dứa, thanh long… [26].
Khác với các loài thực vật C3 và C4, các loài thực vật CAM thường có khả
năng đóng khí khổng vào ban ngày, do vậy hạn chế được sự mất nước qua lá, đồng
thời vào ban đêm, khí khổng của chúng thường mở ra để hấp thụ CO
2
và tích lũy
lượng CO
2
này trong acid malic. Quá trình chuyển hóa acid malic vào ban ngày sẽ
tạo ra sản phẩm hữu cơ là pyruvate hoặc acid oxaloacetic (OAA) đồng thời thải ra
CO
2
. Lượng CO
2
này sẽ được bào quan lục lạp ở trong cây sử dụng, phối hợp với
nước và ánh sáng để tiến hành quá trình quang hợp [31]. Căn cứ vào sản phẩm tạo

thành trong quá trình chuyển hóa acid malic mà người ta chia thực vật CAM ra
thành 2 nhóm chính: nhóm malate enzyme (ME – CAM) xúc tác chuyển hóa acid
malic thành pyruvate và nhóm phosphoenolpyruvate carboxykinase (PCK – CAM)
xúc tác chuyển hóa acid malic thành OAA.
Trong số các loài thực vật CAM, cây nha đam (Aloe vera Linne)( A. vera)
được xếp vào nhóm PCK – CAM và được xem như một loại thần dược với những
công dụng, dược tính hữu ích. Nhiều nghiên cứu của các nhà khoa học đã cho thấy
cây nha đam có rất nhiều tác dụng như trị vết thương, ngăn ngừa và chữa bệnh, làm
thức uống, dưỡng da, dầu gội…Chất gel chiết rút từ cây nha đam được dùng nhiều
trong các ngành công nghệ dược phẩm, hóa mỹ phẩm, tạo ra các sản phẩm kem
dưỡng da từ nha đam. Nha đam là loại cây không chỉ có tác dụng làm đẹp mà còn
được sử dụng vào mục đích trị bệnh và được ghi nhận có tác dụng tốt trong những

2



bệnh lý như: đái tháo đường, vảy nến, tăng cholesterol máu, bỏng, tổn thương da do
tia xạ sau điều trị ung thư, giúp nhanh lành vết thương…[14].
Một số nghiên cứu gần đây đã xây dựng hoàn chỉnh quy trình nhân nhanh
giống cây nha đam bằng kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào. Quy trình nuôi cấy này cho
phép tạo ra một lượng lớn cây nha đam in vitro làm nguồn vật liệu khởi đầu trong
việc nghiên cứu khả năng chịu hạn của cây trong điều kiện nhân tạo.
Trong kỹ thuật nuôi cấy mô, người ta thường dùng mannitol để gây hạn sinh lý
trong cây in vitro. Mannitol thường gây mất nước trong cây, khối nguyên sinh chất của
tế bào sẽ bị tách dần ra khỏi màng tế bào và co cụm lại, dẫn đến hiện tượng co nguyên
sinh. Mức độ co nguyên sinh trong cây nhiều hay ít phụ thuộc vào nồng độ xử lý
mannitol. Dưới tác động của mannitol, cây sẽ mất đi lượng nước tự do nhưng chúng
vẫn có thể sử dụng được lượng nước liên kết không chặt và nước nội bào để duy trì sự
sống. Tuy nhiên, khi tất cả các dạng nước này trong cây đều bị mất đi thì cây bị thiếu

nước trầm trọng, dẫn đến sự ngừng trệ các hoạt động trao đổi chất trong cây và gây ảnh
hưởng lớn đến sự sống của cây. Một số trường hợp nghiên cứu gần đây cho thấy, trong
trường hợp mất nước nghiêm trọng, một số loại cây có khả năng chuyển hướng trao đổi
chất để tăng cường tính thích nghi nhằm duy trì sự sống.
Để hiểu rõ hơn đặc tính này trong nhóm thực vật CAM, chúng tôi chọn đề tài
“Nghiên cứu biến động một số chỉ tiêu hóa sinh của cây nha đam dƣới tác động
của mannitol trong điều kiện nuôi cấy in vitro”.










3



Chƣơng 1
TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1. Giới thiệu chung về thực vật CAM
1.1.1. Thực vật CAM
Thực vật CAM được phát hiện đầu tiên vào cuối năm 1940, bởi 2 nhà thực
vật học Rason và Thormas. Thuật ngữ “CAM” được đặt theo tên của họ thực vật mà
cơ chế này lần đầu tiên được phát hiện ra. Từ sau phát hiện đó, thực vật CAM dần
được các nhà sinh học quan tâm nghiên cứu nhiều hơn và đã có một số kết quả về

CAM công bố trên các tạp chí chuyên ngành [26].
Công trình nghiên cứu phân loại về thực vật CAM đã được Dittrich và cộng
sự (cs) công bố trên tạp chí quốc tế lần đầu tiên vào năm 1973 [23]. Trong đó, ông
cho rằng acid malic và cơ chế tích lũy hoặc chuyển hóa của chúng theo thời gian
ngày, đêm là một trong những yếu tố chính đóng vai trò hết sức quan trọng trong
quang hợp và hô hấp của thực vật CAM.
Xu hướng thế giới hiện nay, sau khi đã tập trung khai thác và sử dụng triệt để
tiềm năng kinh tế của các nhóm thực vật C3 và C4, nhiều nhà nghiên cứu chuyên
sâu chuyển hướng tập trung nghiên cứu về thực vật CAM, họ đã khai thác và đưa
vào sử dụng tiềm năng kinh tế của nhóm thực vật này nhằm phục vụ nhu cầu của
con người. Hiện nay, nhiều nghiên cứu về thực vật CAM tập trung vào hai hướng
chính: sử dụng chúng để trồng trên các vùng đất hoang, có thời tiết khắc nghiệt để
cải tạo đất, tăng diện tích đất trồng trọt, một hướng khác là thay đổi điều kiện sống
để cải tạo một số loại thực vật CAM làm thức ăn cho người và gia súc [26].
Riêng nước ta, khi đề cập đến thực vật CAM, các nhà nghiên cứu chủ yếu
chú trọng đến giá trị hoa cây cảnh của nhóm phong lan và xương rồng, các tiềm
năng có giá trị kinh tế khác của thực vật CAM vẫn chưa được khai thác, có thể thấy
rằng nghiên cứu chuyên sâu về thực vật CAM thực sự vẫn là một khoảng trống rất
lớn, chưa được chú trọng đến ở nước ta. Thực tế cho thấy, chưa có một số liệu điều
tra, thống kê nào được công bố về số lượng các loài và chủng loại của thực vật

4



CAM trên lãnh thổ nước ta. Hơn nữa, các nghiên cứu chuyên sâu về cơ chế chuyển
hóa, trao đổi chất đặc trưng của thực vật CAM vẫn chưa được thực hiện. Vì thế,
chúng ta thiếu hẳn cơ sở khoa học cho việc tìm kiếm, cải tạo một số loài thực vật
CAM theo hướng vừa có giá trị kinh tế vừa có khả năng thích nghi tốt để trồng trên
các vùng đất hoang phế, có điều kiện sống khắc nghiệt, nhằm giữ đất và cải tạo đất

để khai thác và sử dụng chúng phục vụ nhu cầu đời sống của con người là một việc
làm cần thiế ý nghĩa lớn trong tương lai [26].
Hiện nay, khí hậu toàn cầu đang ngày càng nóng lên và theo dự đoán, nhiệt
độ trái đất sẽ ấm lên trung bình từ 2 – 4
0
C trong thế kỷ tới (IPCC, 2007), dẫn đến
tình trạng khan hiếm nước. Việt Nam là nước nằm trong khu vực nhiệt đới gió mùa.
Vì vậy, hạn là yếu tố thường xuyên tác động gây ảnh hưởng đến sinh trưởng, phát
triển của cây trồng, ảnh hưởng xấu đến năng suất và phẩm chất của chúng [12].
Trong điều kiện cực kì khô hạn, thực vật CAM có thể đóng khí khổng một thời gian
dài để ngăn chặn sự mất nước và lặp lại chu trình CO
2
bên trong tế bào. Do đó,
chúng sẽ không có bất cứ một sự sinh trưởng nào nhưng có thể duy trì sự sống cho
tế bào. Thực vật CAM được tìm thấy trước đây chủ yếu là ở sa mạc hay những vùng
khí hậu khô hạn với các dạng sống như: biểu sinh, leo hay thẳng đứng. Nhưng
những nghiên cứu gần đây cho rằng một số thực vật CAM cũng sống trong nước.
Có nhiều tài liệu khác nhau về thực vật CAM sống thủy sinh như Isoëtes và một số
thực vật 1 lá mầm và 2 lá mầm. Keeley khẳng định: "Thực vật CAM thủy sinh sống
ở những nơi mà quang hợp có khả năng bị hạn chế bởi carbon" [30]. Thực vật CAM
sống thủy sinh không có liên quan với sự mất nước, đúng hơn là có liên quan tới
hàm lượng khí CO
2
. Các dạng sống có thể thay đổi trong chu trình sống. Ví dụ như
cây dạng sống bán biểu sinh sẽ sống như dạng thẳng và trở thành dạng đứng tự do
khi chúng giết chết tế bào chủ. Các họ thực vật CAM sống dạng đứng tự do như:
Cactaceae, Euphorbiaceae, Didieraceae, Agavaceae. Có một số thực vật thực hiện
cả quang hợp C3 và CAM hay C4 và CAM .
Ở nước ta có rất ít nghiên cứu được tiến hành trên thực vật CAM. Một số nghiên
cứu hiện nay về thực vật CAM hầu như chỉ tập trung chủ yếu vào hướng hoa cây cảnh

5



(phong lan, xương rồng), nghiên cứu cải biến để tăng năng suất (dứa, nha đam) nhưng lại
không khai thác được đặc trưng cơ bản của CAM trong các đối tượng này [26].
1.1.2. Cơ chế chuyển hóa acid malic trong quá trình quang hợp của thực vật CAM
Ở một số loài thực vật CAM, quá trình chuyển hóa acid malic để tạo thành
OAA hay pyruvate và giải phóng ra CO
2
là quá trình trao đổi chất rất quan trọng
trong giai đoạn III (hình 1.1) của chu trình quang hợp.

Hình 1.1.Các giai đoạn (phase) của chu trình quang hợp [17].
Căn cứ vào sản phẩm tạo thành trong quá trình chuyển hóa acid malic mà
người ta chia thực vật CAM ra thành 2 nhóm chính: malic enzyme (ME) – CAM và
phosphoenolpyruvate (PCK) – CAM [23]. Các loại thực vật thuộc nhóm ME –
CAM thường chứa một lượng lớn ME tham gia xúc tác cho quá trình chuyển hóa
acid malic tạo ra pyruvate và CO
2
. Ngược lại, các loại thực vật thuộc nhóm PCK –
CAM thường chứa một lượng lớn enzyme phosphoenolpyruvate carboxykinase
(PCK) tham gia xúc tác cho quá trình chuyển hóa acid malic để tạo thành OAA và
CO
2
, sau đó OAA lại tiếp tục chuyển đổi sang phosphoenolpyruvate (PEP)
[22]…Tuy nhiên, dưới tác động thay đổi của yếu tố môi trường (đặc biệt trong điều
kiện khô hạn) mà trong quang hợp, một số loài thực vật CAM có khả năng thay đổi

6



cơ chế chuyển hóa acid malic tạo thành OAA hoặc pyruvate để tăng khả năng sống
sót và thích nghi với sự biến đổi của môi trường.
Mỗi nhóm ME – CAM hay PCK – CAM được chia thành 2 nhóm nhỏ: nhóm
tạo thành tinh bột và nhóm tạo thành đường glucose bên ngoài lục lạp dựa trên
nguồn carbonhydrate chính đã sử dụng trong chu trình hàng ngày của chúng. Bên
cạnh đó có 1 số loài thực vật CAM trung gian có đặc tính của cả 2 nhóm ME –
CAM và PCK – CAM, phụ thuộc vào điều kiện môi trường.
Mỗi loài thực vật CAM sở hữu một cơ chế chuyển hóa riêng biệt.

Hình 1.2. Sơ đồ chuyển hóa acid malic ở hai nhóm thực vật CAM
- Chuyển hóa acid malic tế bào chất và chức năng sinh lý của chúng ở các
loài thực vật CAM
Ở các loài thực vật CAM, acid malic tạo thành vào ban đêm và tích lũy trong
không bào của các tế bào quang hợp, phụ thuộc vào mỗi loài thực vật CAM khác
nhau. Acid malic được chuyển hóa tạo thành pyruvate và CO
2
hoặc OAA và CO
2

vào ban ngày. ME và malate dehydrogenase (MDH) đóng vai trò quan trọng trong
chuyển hóa acid malic ở tế bào chất của các loài thực vật CAM [26].

7

Hình1.3. Sơ đồ chuyển hóa acid malic [48]
Mặc dù ME, MDH cùng được định vị trong tế bào chất của A.vera nhưng
hoạt tính ME trong tế bào chất thấp hơn nhiều so với hoạt tính MDH. Ở A. vera,
acid malic được oxy hóa bởi MDH tạo OAA và sau đó OAA chuyển đổi thành PEP
và CO
2
, CO
2
tiếp tục đi vào chu trình Calvin. Những chuyển hóa của acid malic
trong tế bào chất giúp cho các loài thực vật CAM thích nghi và sống sót được dưới
điều kiện khô hạn [26].
1.2. Giới thiệu chung về cây nha đam
1.2.1. Lịch sử phát hiện cây nha đam
Cây nha đam là loại cây thảo mộc đã có từ thời thượng cổ [6]. Khoảng 5.000
năm trước công nguyên, nhiều dân tộc Ả Rập ở vùng Trung Đông đã biết sử dụng
cây nha đam để phục vụ cho cuộc sống của mình. Rồi từ vùng Trung Đông cây nha

8



đam di thực sang nhiều quốc gia khác như: Ấn Độ, Trung Quốc, Malaysia, Mexico,
CuBa. Lịch sử tồn tại và phát triển cây nha đam trên khắp thế giới gắn liền với sự
hiểu biết ngày càng phong phú về các lĩnh vực: sinh học, dược lý.
Đến nay, sau nhiều năm nghiên cứu, các nhà khoa học đã chứng minh được
rằng: cây nha đam có nguồn gốc từ Bắc Phi và Trung Đông, từ rất lâu nó được loài
người sử dụng để làm thuốc. Vào thế kỷ XIII, nhà khoa học người Ý là Macro Polo
(1254 – 1323) đã thực hiện chuyến đi nghiên cứu thực vật cận nhiệt đới Châu Á.
Đến Trung Quốc, Macro Polo đã giới thiệu cho người dân bản xứ 1 loại cây thảo

dược (sau này gọi là nha đam hoặc lô hội), từ Trung Quốc cây nha đam được di thực
sang Việt Nam.
Cây nha đam là loại cây bụi như xương rồng, còn được gọi bằng một số tên
khác như: tượng đảm, long tu, du thông, lưỡi hổ, hổ thiết… thuộc chi Aloe, họ huệ
tây (Liliaceae) [4]. Trong khoảng 180 loài thuộc chi Aloe thì chỉ có 4 loài được sử
dụng để làm thuốc bổ dưỡng và chữa bệnh, một số loài có độc tố. Hai loài được chú
ý nhiều nhất là A. Ferox và A. vera Linne.
Theo sách “Cây cỏ Việt Nam” của Phạm Hoàng Hộ thì chi Aloe ở nước ta
chỉ có 1 loài là A.vera L. Sinensis. Berger tức là cây nha đam lá nhỏ [6], [7].
1.2.2. Đặc điểm sinh học của cây nha đam
Theo Võ Văn Chi (1991), Đỗ Thanh Hội (1997) thì cây nha đam là loại cây
dạng thân cỏ, mập, màu xanh lục nhạt, thân ngắn [3], [8].
Cây nha đam trưởng thành có lá mập, dài 30 – 50 cm, rộng 5 – 10 cm, dày 1 – 2 cm.
Lá nha đam gồm 2 phần: phần vỏ ngoài là lớp vỏ xanh, khi cắt ngang chảy ra
nhựa màu vàng có mùi hắc, để khô chuyển thành màu đen, phần trong là phần thịt
mọng nước dạng gel.
Cụm hoa của cây cao khoảng 1m, mọc thành chùm, hoa to đều có màu vàng
lục nhạt. Quả nang hình trứng màu xanh, chứa nhiều hạt. Nếu rạch một đường giữa
là nha đam tươi rồi dùng thìa nạo ở giữa lá nha đam quan sát sẽ thấy có một chất gel
trong suốt.


9



1.2.3. Thành phần hóa học cây nha đam
Phân tích các thành phần lấy từ lá nha đam, các nhà nghiên cứu tìm thấy các
chất sau [14]:
1. Hợp chất anthraquinon: đây là thành phần có tác dụng chữa bệnh của

nha đam bao gồm:
o Aloe emodin (chất này không có trong dịch tươi nha đam). Trong nhựa
khô, Aloe emodin chiếm 0,05 – 0,5% chất này tan trong ete, cloroform, benzen.
o Barbaloin: chiếm 15 – 30% thành phần nhựa của nha đam. Chất này sẽ tan
dần khi để ngoài không khí và ánh sáng, tan trong nước, cồn, aceton, rất ít trong
benzen và cloroform.
o Aloinosit A, Aloinosit B, Anthranol
o Glycozit, Aloezin, Aloenin
2. Chất nhựa: este của acid cinnamic.
3. Chất hữu cơ: monosaccharit, polysacarit, xenluloza, mannoza, L-
rhamnoza…
4. Các vitamin: gồm B1, B2, B6 và acid folic.
5. Cácenzyme: oxydase, lipase, amilase, catalase, allnilase…
6. Các nguyên tố khoáng vi lượng: zinc, potasodium, mangesium,
manganese,calcium…
1.3. Nhân giống in vitro
1.3.1. Thuật ngữ nhân giống in vitro
Nhân giống in vitro hay còn gọi là vi nhân giống được sử dụng đặc biệt cho việc
ứng dụng các kỹ thuật nuôi cấy mô để nhân giống thực vật, tạo dòng cây sạch bệnh,
làm nguồn nguyên liệu cho chọn lọc… bắt đầu bằng nhiều bộ phận khác nhau có kích
thước nhỏ, sinh trưởng ở điều kiện vô trùng trong các bình nuôi cấy. Trong thực tế, các
nhà vi nhân giống dùng thuật ngữ nhân giống in vitro và nuôi cấy mô thay đổi cho
nhau để chỉ mọi phương thức nhân giống thực vật trong điều kiện vô trùng. Thuật ngữ
đồng nghĩa là nuôi cấy in vitro. Nhân giống in vitro và nuôi cấy mô bắt đầu bằng các
mảnh nhỏ của thực vật, sạch vi sinh vật, và được nuôi cấy vô trùng [2].

10

1.3.2. Lược sử phát triển của nhân giống in vitro:
Bắt đầu từ năm 1938, hai nhà sinh học người Đức là Matthias Jacob
Schleiden (nhà thực vật học) và Theodor Schwann (nhà động vật học) mới chính
thức đề xướng học thuyết cơ bản của sinh học gọi là Học thuyết tế bào. Học thuyết
tế bào khẳng định: mỗi cơ thể động, thực vật đều bao gồm những thể tồn tại hoàn
toàn độc lập, riêng lẻ và tách biệt, đó chính là tế bào [1].
Năm 1883, Wilhelm Roux lần đầu tiên lý giải về phân bào giảm nhiễm ở cơ
quan sinh dục. Từ một tế bào thực vật nuôi cấy in vitro có thể tái sinh thành một cơ
thể sống hoàn chỉnh. Khả năng này của tế bào thực vật được gọi là tính toàn năng.
Năm 1902, Haberlandt là người đầu tiên đề xuất phương pháp nuôi cấy mô và tế
bào thực vật để chứng minh tính toàn năng của tế bào. Ông làm thí nghiệm với tế
bào khí khổng và đã không thành công, do ông đã chọn cây một lá mầm là đối
tượng rất khó nuôi cấy, hơn nữa ông đã dùng các tế bào đã mất hết khả năng tái
sinh. Một nguyên nhân khác của sự thất bại là do vào thời kỳ đó, những hiểu biết
khoa học về nhu cầu dinh dưỡng của mô thực vật còn rất hạn chế nên Haberlandt đã
không tìm ra được môi trường dinh dưỡng tối thích cho sự phân chia tế bào.
Đến năm 1922, Robins và học trò của Haberlandt là Kotte đã tiến hành nuôi
cấy đỉnh sinh trưởng của rễ một cây hòa thảo trong môi trường lỏng, có sự hiện diện
của muối khoáng và glucose, đầu rễ sinh trưởng khá mạnh và tạo nên một hệ rễ nhỏ
có cả rễ phụ. Sau đó, hệ rễ này sinh trưởng chậm dần và ngừng lại, mặc dù đã
chuyển sang môi trường mới [1].
Năm 1934, Kogl lần đầu tiên xác định được vai trò của IAA, một hormone
thực vật đầu tiên thuộc nhóm auxin có khả năng kích thích sự tăng trưởng và phân
chia tế bào. Năm 1939, ba nhà khoa học Gautheret, Nobecourt và White đã đồng
thời nuôi cấy mô sẹo thành công trong thời gian dài từ mô tượng tầng (cambium) ở
cà rốt và thuốc lá, mô sẹo có khả năng sinh trưởng liên tục.
Năm 1934. White đã nuôi cấy thành công đầu rễ cà chua (Lycopersicum
esculentum) trong môi trường lỏng có bổ sung muối khoáng, glucose và dịch chiết

11

nấm men trong một thời gian dài. Ba năm sau, ông thay thế dịch chiết nấm men
bằng hỗn hợp các vitamine nhóm B là thiamine (B1), pyridoxine (B6) và acid
nicotinic (B3), và ông thấy rằng việc thay thế này hoàn toàn phù hợp. Từ đó việc
nuôi cấy đầu rễ trong thời gian vô hạn đã được tiến hành ở nhiều cây khác nhau.
Sau khi Went và Thimann phát hiện chất kích thích sinh trưởng thực vật đầu
tiên, axit β-indolacetic (IAA) và kết tinh được chất này, Gautherets xác nhận tác
dụng kích thích sinh trưởng mô sẹo của IAA và 3 nhóm vitamin do White đề nghị.
Năm 1939, cùng với Nobescourt, Gautherets đã thành công trong việc duy trì sự
tăng trưởng của mô sẹo cà rốt (Daucus carota) trên môi trường có agar trong thời
gian vô hạn bằng cách cấy chuyền đều đặn 6 tuần một lần.
Năm 1941, Overbeck ở Mỹ đã chứng minh được khả năng kích thích sự sinh
trưởng phôi ở cây Datura thuộc họ Cà (Solanaceae) của nước dừa trong quá trình
nuôi cấy. Steward (1948) xác nhận tác dụng kích thích sinh trưởng của nước dừa lên
callus cà rốt. Trong thời gian này, nhiều chất điều hòa sinh trưởng nhân tạo thuộc
nhóm auxin đã được nghiên cứu và tổng hợp hóa học thành công. Nhiều tác giả
nhận thấy cùng với nước dừa, 2,4-dichlorophenoxy aceticacid (2,4-D) và α-
napthaleneacetic acid (NAA) đã giúp tạo mô sẹo, gây phân chia tế bào thành công ở
nhiều đối tượng thực vật trước đó rất khó nuôi cấy.
Năm 1949, Limmasets và Cornuet đã phát hiện rằng virus phân bố không
đồng nhất trên cây và thường không thấy có virus ở vùng đỉnh sinh trưởng. Năm
1952, Morel và Martin đã tạo ra cây sạch bệnh virus của 6 giống khoai tây từ nuôi
cấy đỉnh sinh trưởng. Ngày nay, kỹ thuật này với một số cải tiến đã trở thành
phương pháp loại trừ bệnh virus được dùng rộng rãi đối với nhiều loài cây trồng
khác nhau. Năm 1952, Morel và Martin lần đầu tiên thực hiện vi ghép in vitro thành
công. Kỹ thuật vi ghép sau đó đã được ứng dụng rộng rãi trong tạo nguồn giống
sạch bệnh virus và tương tự virus ở nhiều cây trồng nhân giống bằng phương pháp
vô tính khác nhau, đặc biệt là tạo giống cây ăn quả sạch bệnh.

Năm 1954, Miller và Skoog trong khi nuôi cấy mô lõi cây thuốc lá đã đã phát
minh cấu trúc và sinh tổng hợp của kinetin - một cytokinin đóng vai trò quan trọng

12



trong phân bào và phân hoá chồi ở mô nuôi cấy. Sau này, người ta đã chứng minh
rằng sự phân bào ở thực vật trong tự nhiên cũng do các chất hóa học tương tự như
kinetin điều khiển và xếp chung các chất đó vào nhóm có tên gọi là cytokinin. Chất
cytokinin đầu tiên được tách từ thực vật bậc cao là zeatin lấy từ mầm ngô.
Việc phát hiện ra vai trò của IAA, NAA, 2,4-D và kinetin cùng với việc phát
hiện vai trò của vitamin và nước dừa có ý nghĩa rất quan trọng trong lịch sử nuôi
cấy mô và tế bào thực vật. Chính việc phát hiện này làm cơ sở cho sự phát triển tiếp
theo của lĩnh vực khoa học này.
Đến năm 1957, Skoog và Miller đã khám phá vai trò của tỷ lệ nồng độ các
chất auxin: cytokinin trong môi trường đối với sự phát sinh cơ quan (rễ hoặc chồi).
Khi tỷ lệ auxin/ cytokinin (ví dụ: nồng độ IAA/kinetin) nhỏ hơn 1 và càng nhỏ, mô
có xu hướng tạo chồi. Ngược lại khi nồng độ IAA/ nồng độ kinetin lớn hơn 1 và
càng lớn, mô có xu hướng tạo rễ. Tỷ lệ nồng độ auxin và cytokinin thích hợp sẽ
kích thích phân hoá cả chồi và rễ, tạo cây hoàn chỉnh. Hiện tượng này được xác
nhận trên nhiều cây khác nhau và đóng góp rất lớn vào điều khiển sinh trưởng, phát
triển và phát sinh cơ quan của mô, tế bào trong nuôi cấy mô, tế bào thực vật.
Từ năm 1954 - 1959, kỹ thuật tách và nuôi tế bào đơn được phát triển.
Muller, Haberlandt và Riker đã tách các tế bào của mô sẹo thành một huyền phù các
tế bào đơn bằng cách nuôi trên máy lắc. Nickell (1956) nuôi liên tục được một
huyền phù tế bào đơn cây đậu (Phaseolus vulgaris). Reinert và Steward (1958) tạo
được phôi và cây cà rốt hoàn chỉnh từ tế bào đơn nuôi cấy trong dung dịch.
Melchers và Beckman (1959) đã nuôi liên tục các tế bào đơn trong bình có dung
tích khá lớn bằng cách sục khí liên tục và thỉnh thoảng thu hoạch tế bào, thêm dung

dịch dinh dưỡng mới. Kỹ thuật nuôi cấy tế bào đơn đã phát triển cao độ với các thiết
bị tinh vi phức tạp do Street và cs. đề nghị.
Năm 1960, Morel đã thực hiện bước ngoặt cách mạng trong sử dụng kỹ thuật
nuôi cấy đỉnh sinh trưởng trong nhân nhanh các loại địa lan Cymbidium, mở đầu
công nghiệp vi nhân giống thực vật.

13



Cũng vào năm 1960, Cooking ở Đại học Notthingham (Anh) lần đầu tiên sử
dụng enzyme cellulase để phân huỷ vách cellulose của tế bào thực vật và thu được
các tế bào chỉ có màng nguyên sinh chất bao quanh, được gọi là tế bào trần
(protoplast). Cũng trong thời gian này, Bergman công bố có thể dùng phương pháp
lọc đơn giản để thu được một huyền phù không có các tế bào kết cụm mà gồm hầu
hết là các tế bào đơn. Cùng với kỹ thuật nuôi tế bào của Bergman, nhiều tác giả đã
thành công trong việc tạo được cây hoàn chỉnh từ một tế bào, chứng minh tính toàn
thể của tế bào thực vật.
Năm 1964 - 1966, Guha và Maheshwari đã thu được cây đơn bội bằng cách
nuôi cấy bao phấn của cây cà độc dược (Datura inoxia) và chứng minh được rằng
cây đơn bội này xuất hiện từ hạt phấn đơn bội. Sau đó một năm, Bourgin và Nitsch
đã nuôi thành công cây thuốc lá (Nicotiana tabacum) đơn bội từ bao phấn tới lúc ra
hoa. Cho đến nay, người ta đã thành công trong nuôi cấy bao phấn của nhiều loài
khác nhau (lúa, ngô, cải, tiêu, ) và đã góp phần to lớn vào việc tăng thêm vào kiến
thức về di truyền học thực vật và thực tiễn chọn giống.
Năm 1970, Takebe, Labib và Melchers đã sử dụng kỹ thuật tế bào của
Bergman để nuôi cấy protoplast của cây thuốc lá và tái sinh được cây hoàn chỉnh.
Đến nay, người ta đã thành công ở nhiều loài khác như các cây ăn quả, lấy sợi, các
loài cây lấy gỗ và thậm chí các loài ngũ cốc (pennisetum, lúa và lúa mì). Trong quá
trình nghiên cứu, người ta nhận thấy các protoplast có khả năng dung hợp với nhau

trong các điều kiện nhất định và hấp thu các phân tử lớn hoặc thậm chí các bào quan
từ bên ngoài. Do đó, các nhà nghiên cứu nuôi cấy mô thực vật hy vọng rất lớn là có
thể sử dụng protoplast trong công tác chọn giống thực vật.
Từ năm 1980 đến nay là giai đoạn thành công của lĩnh vực công nghệ gen thực
vật. Chỉ trong một thời gian ngắn, hàng loạt các phương pháp đưa gen ngoại lai vào tế
bào thực vật đã được công bố như phương pháp chuyển gen thông qua vi khuẩn
Agrobacterium, kỹ thuật dung hợp bằng điện (electroporation), kỹ thuật vi tiêm
(microinjection), sử dụng sóng siêu âm (ultrasonic gene transfer), sử dụng súng bắn
gen (gene gun) đang được các phòng thí nghiệm trên thế giới sử dụng và đạt được

14



nhiều kết quả mong muốn. Sau khi đưa gen ngoại lai vào tế bào, người ta sử dụng kỹ
thuật nuôi cấy mô và tế bào thực vật để nuôi cấy tế bào được chuyển nạp, sau đó tái
sinh lại thành cây hoàn chỉnh mang những đặc tính sinh học mới. Các cây chuyển gen
đó ra hoa, kết hạt bình thường và được coi như một giống cây trồng mới.
Từ năm 1996 - 2000, một hướng ứng dụng khác của nuôi cấy mô và tế bào thực
vật là sản xuất protein ngoại lai bằng cách sử dụng huyền phù tế bào thực vật như một
phương tiện cho sản xuất kháng thể tái tổ hợp (recombinant antibodies) và các đoạn
kháng thể (antibody fragments) (Lacount và cs., 1997; Liu và cs., 1999), các enzyme như
β-glucuronidase (Kurata và cs., 1998), invertase (Molles và cs., 1999),
phosphomonoesterase (Ilieva và cs., 1996) và các protein có giá trị chữa bệnh như
interleukin 2 (IL-2) và interleukin 4 (IL-4) của người (Magnuson và cs., 1997), Ricin
(Sehnke và cs., 1999), α
1
-antitrypsin người, GM-CSF người (James và cs., 2000).
Năm 2004, Kunet và cs. đã nghiên cứu ứng dụng công nghệ chíp DNA vào
trong ngành nuôi cấy mô và tế bào thực vật để phân tích sự sai khác DNA trong quá

trình nuôi cấy, đặc biệt là trong nuôi cấy callus, nuôi cấy phát sinh phôi.
Năm 2005, Wayne R. Curtis đã ứng dụng nguyên lý trao đổi khí, cải thiện
điều kiện môi trường để thiết kế bioreactor trong vi nhân giống cây trồng.
1.3.3. Nhân nhanh cây con in vitro
Giai đoạn này kích thích tạo cơ quan phụ hoặc các cấu trúc khác mà từ đó
cây hoàn chỉnh có thể phát sinh. Những khả năng tạo cây đó là:
- Phát triển chồi nách
- Tạo phôi vô tính
- Tạo đỉnh sinh trưởng
- Tạo rễ
Trong giai đoạn này cần nghiên cứu các tác nhân kích thích sự phân hóa cơ
quan, đặc biệt là chồi như:
+ Bổ sung tổ hợp các chất kích thích sinh trưởng mới. Tăng tỷ lệ auxin/cytokinin
sẽ kích thích mô nuôi cấy tạo rễ và ngược lại sẽ kích thích phát sinh chồi.

15



+ Tăng thời gian chiếu sáng 16 giờ/ngày, tối thiểu 1.000 lux. Trong thực tế
nghiên cứu, người ta nhận thấy khó tách biệt ảnh hưởng của chu kỳ chiếu sáng khỏi
ảnh hưởng của cường độ chiếu sáng. Ánh sáng tím là thành phần quan trọng kích
thích phân hóa mạnh. Ánh sáng đỏ có ảnh hưởng giống cytokinin, nó tạo nên sự tích
lũy cytokinin trong mô một số loài, chính lượng cytokinin này góp phần kích thích
quá trình phát sinh cơ quan và tạo chồi từ những mô nuôi cấy in vitro.
+ Bảo đảm chế độ nhiệt trong khoảng 20 – 30
0
C. Trong trường hợp những
loài có nguồn gốc nhiệt đới, nhiệt độ nuôi cấy thích hợp vào khoảng 32 – 35
0

C.
Ngược lại, đối với những loài hoa ở vùng ôn đới nhiệt độ thích hợp cho quá trình
tạo cụm chồi phải < 30
0
C.
Mục tiêu của giai đoạn này là nhân nhanh với số lượng lớn tạo điều kiện cho
việc tiến hành thí nghiệm sau này khi xử lý mannitol gây stress nước.
1.4. Đặc tính chịu hạn của thực vật
1.4.1. Cơ sở sinh lý, hóa sinh và sinh học phân tử của tính chịu hạn của thực vật
Khả năng của thực vật ngăn ngừa tổn thương khi bị ảnh hưởng của các yếu
tố bất lợi đó là tính chống chịu [15].
Trong tự nhiên, hạn hán là hiện tượng thường xuyên xảy ra và liên quan trực
tiếp đến vấn đề nước trong cây. Kramer (1983) cho rằng, những tác động của môi
trường xung quanh đủ để gây nên mất nước ở thực vật đó là hạn [33]. Khi hạn là yếu
tố bất lợi với thực vật sẽ gây ra các mức độ thiệt hại khác nhau. Để chống lại sự mất
nước do nguyên nhân từ các tác động bên ngoài, ở thực vật có 3 cơ chế sinh lý chủ
yếu được thảo luận, đó là cơ chế trốn hạn, cơ chế tránh hạn và cơ chế chịu hạn [15].
Thực vật có thể hoàn thành chu kỳ sống sớm hơn trước khi sự thiếu nước
nghiêm trọng trong đất và trong cây xảy ra. Kiểu chịu mất nước này gọi là trốn hạn.
Muốn trốn được hạn, cây phải có sức sinh trưởng và phát triển mạnh, có thể ra hoa
và tạo quả sớm để thời điểm thiếu nước không ảnh hưởng đến chu kỳ sống của cây.
Nhóm cây trốn hạn thường là cây sống ở vùng sa mạc, cây có thời gian sinh trưởng
ngắn. Chu trình sống của chúng thường hoàn thành trước mùa khô hạn tới.