tình hình ung thư vòm mũi họng trên thế giới và việt nam

1
ĐẶT VẤN ĐỀ
Tỷ lệ ung thư vòm mũi họng (UTVMH) thay đổi rất khác nhau ở các
quần thể dân cư và các vùng địa lý khác nhau trên thế giới. Nơi có tỷ lệ ung
thư vòm cao nhất là miền Nam Trung Quốc và Grơnlen, trong khi ở châu Âu
lại có tỷ lệ rất thấp. Các nước đông nam Á, trong đó có Việt nam có tỷ lệ
UTVMH trung bình. Virut Epstein-Barr (EBV), các yếu tố môi trường khác
và sự nhạy cảm di truyền đều cho là liên quan đến nguyên nhân ung thư vòm
mũi họng và EBV là yếu tố được nghiên cứu nhiều nhất.
EBV có mặt trong 100% các khối u vòm mũi họng thể ung thư biểu mô
không biệt hóa và duy trì các thể nhiễm tiềm ẩn I và II, trong đó EBV biểu lộ
các gen quan trọng là EBNA1, LMP1 và LMP2. EBNA1 giúp duy trì bộ gen
EBV trong tế bào chủ, trong khi LMP1 lại là một gen có chức năng quan
trọng liên quan đến dẫn truyền tín hiệu, chống lại sự chết theo chương trình
của tế bào và có khả năng sinh ung thư cho các tế bào bị nhiễm. Các gen này
nằm cách xa nhau trong bộ gen EBV và được biểu lộ bởi sự hoạt hóa các
promoter khác nhau. EBNA1 được biểu lộ ở các thể nhiễm tiềm ẩn nhờ sự
hoạt hóa các promoter: Cp, Wp và Qp. Tuy nhiên, trong ung thư vòm mũi
họng hai promoter Cp và Wp không hoạt động mà chỉ có Qp điều hòa biểu lộ
gen EBNA1.
Methyl hóa ADN vùng promoter là một trong các yếu tố ngoại di truyền
có vai trò rất quan trọng trong điều hòa biểu lộ gen. Mức độ methyl hóa diễn
ra ở các vị trí của đảo CpG tại vùng promoter và exon1 có vai trò trong điều
hòa biểu lộ gen, có thể làm giảm biểu lộ hoặc không biểu lộ hoàn toàn một
gen mà bình thường vẫn được biểu lộ. Việc xác định mức độ methyl hóa vùng
promoter của một gen có ý nghĩa quan trọng trong tìm hiểu cơ chế bệnh sinh
của bệnh liên quan đến chức năng gen đó trong nhiều quá trình bệnh lý ác
2
tính, đồng thời dấu ấn này cũng có thể góp phần trong chẩn đoán sớm các
bệnh ung thư. Ngoài ra, khi dùng các chất hóa học để làm mất methyl hóa thì
có tác dụng làm gen hoạt động trở lại và thực hiện chức năng của chúng, giúp

cho việc điều trị những rối loạn hay các bệnh lý khác nhau.
Hiện nay, nhờ những tiến bộ của sinh học phân tử người ta có thể xác
định được mức độ methyl hóa của một gen đặc hiệu hay toàn bộ bộ gen. Các
kỹ thuật này dựa vào những nguyên lý khác nhau, có những kỹ thuật rất phức
tạp, nhưng có những kỹ thuật đơn giản và thông dụng. Chúng tôi sử dụng kỹ
thuật PCR đặc hiệu methyl hóa sau khi xử lýADN bằng phương pháp
bisulfite để xác định mức độ methyl hóa các promoter Wp, Cp và Qp liên
quan đến biểu lộ gen EBNA1, đồng thời phát triển PCR đa mồi đối với các
promoter đó. Việc phát triển PCR đa mồi đặc hiệu methyl hóa không chỉ giúp
ích cho nghiên cứu ngoại di truyền ở mức độ ADN của EBV mà còn rất nhiều
gen khác liên quan đến ung thư, đặc biệt là các gen ức chế ung thư.
Đề tài này nhằm mục đích sau:
1. Phát triển phản ứng PCR đa mồi đặc hiệu methyl hóa xác định mức độ
methyl hóa ở các promoter Wp, Cp và Qp của EBV ở các tế bào dòng
B95-8, Namalwa và Raji.
2. Ứng dụng PCR đa mồi đặc hiệu này xác định mức độ methyl hóa 3
promoter điều hòa biểu lộ gen EBNA1 của EBV trong các mẫu sinh
thiết bệnh nhân ung thư vòm mũi họng.
3
CHƯƠNG 1
TỔNG QUAN
1.1.Tình hình ung thư vòm mũi họng trên thế giới và Việt Nam.
Ung thư vòm mũi họng (UTVMH), một khối u phát triển từ các tế bào
biểu mô nằm ở vị trí cửa mũi sau và vòm họng, là loại bệnh đứng hàng đầu
trong số các ung thư vùng đầu mặt cổ với tính chất dịch tễ học khá đặc biệt là
liên quan tới địa lý[3]. Tỷ lệ mắc chuẩn theo tuổi trên thế giới có thể xếp
thành 3 vùng rất khác nhau: Khu vực có tỷ lệ mắc cao nhất là miền Nam
Trung Quốc và Grơnlen với tỷ lệ mới mắc từ 30 - 40/100.000 dân/năm .
Ngược lại, vùng có tỷ lệ mắc thấp, gồm châu Âu, Mỹ chỉ từ 0,7 -
1/100.000 dân/ năm [4]. Còn lại là vùng có tỷ lệ mắc trung bình nhưng ngày

càng có xu hướng tăng lên, đó là vùng Bắc Phi, vùng biển Caribee và đông
nam Á với tỷ lệ từ 8 - 12/100.000 dân. Ở Việt nam UTVMH đứng hàng thứ 5
trong các ung thư nói chung và đứng hàng đầu trong các ung thư ở vùng đầu
mặt cổ [1]
1.2. Những yếu tố nguy cơ liên quan đến UTVMH
1.2.1. Vai trò của virut Epstein-Barr .
Virut Epstein-Barr (EBV), là một trong các yếu tố môi trường và được
nghiên cứu nhiều nhất cho thấy có liên quan chặt chẽ của nó với UTVMH.
Người ta phát hiện thấy EBV có mặt trong 100% các khối u vòm mũi họng
thể ung thư biểu mô không biệt hóa (UCNT). Ngoài ra, các sản phẩm gen của
EBV là EBER, EBNA1 và LMP-1,-2 đã được xác định ở hầu hết các mẫu
sinh thiết UTVMH hoặc ở tổn thương quá sản tại biểu mô vòm họng gồm
những dòng tế bào tiền ác tính nhiễm EBV. Điều này phù hợp với giả thuyết
4
cho rằng EBV là một trong những yếu tố khởi phát trong cả quá trình nhiều
bước dẫn đến sự phát triển của UTVMH [5]
Ngoài việc phát hiện EBV và sản phẩm của nó trong khối u vòm họng,
người ta cũng xác định được các kháng thể chống EBV trong huyết thanh
bệnh nhân. Lượng kháng thể IgG và IgA trong huyết thanh bệnh nhân lần so
với những bệnh nhân ung thư đầu mặt cổ khác hoặc người khỏe về lâm sàng.
Đặc biệt IgA/VCA (kháng nguyên vỏ của EBV), một xét nghiệm sử dụng
rộng rãi, thường qui ở nhiều nước trên thế giới, trong đó có Việt Nam có giá
trị để theo dõi và phát hiện nguy cơ mắc UTVMH, đồng thời cũng có giá trị là
một dấu ấn quan trọng theo dõi tái phát sau điều trị bệnh [6,7]. Người ta cho
rằng sự tái hoạt hóa, sao chép và nhân lên của EBV là hiện tượng xảy ra trong
suốt quá trình phát triển của UTVMH và nó tương quan với nồng độ IgA/VCA.
UTVMH cao hơn 8 - 10 lần so với những bệnh nhân ung thư đầu mặt cổ khác
hoặc người khỏe về lâm sàng. Đặc biệt IgA/VCA (kháng nguyên vỏ của
EBV), một xét nghiệm sử dụng rộng rãi, thường qui ở nhiều nước trên thế
giới, trong đó có Việt Nam có giá trị để theo dõi và phát hiện nguy cơ mắc

UTVMH, đồng thời cũng có giá trị là một dấu ấn quan trọng theo dõi tái phát
sau điều trị bệnh khi nó tăng cao [6,7]. Người ta cho rằng sự tái hoạt hóa, sao
chép và nhân lên của EBV là hiện tượng xảy ra trong suốt quá trình phát triển
của UTVMH và nó tương quan với nồng độ IgA/VCA.
1.2.2. Môi trường sống và thói quen sinh hoạt
Nhiều tác giả đã đề cập đến môi trường sống như khí hậu, bụi, khói ô
nhiễm liên quan đến UTVMH, nhưng được nói đến nhiều nhất là tập quán ăn
uống. Nhiều nghiên cứu bệnh - chứng được tiến hành đã thu được những kết
quả phù hợp với ý kiến cho rằng, tập quán ăn cá mối của người Trung Quốc
(vùng Quảng Đông) là nguyên nhân quan trọng gây UTVMH, mối liên quan
này lớn hơn nếu ăn cá muối ngay từ nhỏ. Dùng cá muối hàng ngày có thể làm
5
tăng tỷ lệ UTVMH lên 1.8 đến 7.5 lần [8]. Sử dụng thuốc là cây cỏ cũng liên
quan đến UTVMH thông qua hoạt hóa EBV hoặc trực tiếp thông qua ảnh
hưởng đến tăng trưởng đến các tế bào chuyển dạng do EBV [9]. Các bằng
chứng khác như hút thuốc lá hoặc dùng formadehyde có giá trị thấp trong
bệnh sinh ung thư vòm họng.
1.2.3. Yếu tố di truyền
Người ta thấy rằng người Trung Quốc sinh ra ở Bắc Mỹ có một tỷ lệ
mắc thấp hơn so với những người sinh ra ở đất nước Trung Quốc, nhưng tỷ lệ
mắc chuẩn vẫn cao hơn dân số nói chung . Điều đó cho thấy rằng yếu tố di
truyền có vai trò trong bệnh sinh của UTVMH. Nghiên cứu ở Trung quốc chỉ
ra rằng UTVMH có mối liên quan đến HLA-A2, B14 và B46 [10]. Ở Việt
Nam, các kháng nguyên A11, A2, B17 và liên kết mất cân bằng A2-B17,
A11- B17 có liên quan đến UTVMH [2]. Việc xác định các gen khác liên
quan với tính cảm thụ bệnh lý cũng đã được nghiên cứu: CYP 2E1 (chuyển
hóa nitrosamine), glutathion transferase M1. Cơ chế tác động của chúng cho
đến nay vẫn chưa được rõ ràng, song điều hiện nay đã và đang được khẳng
định là sự phát triển UTVMH là do sự phối hợp tác động của 3 yếu tố là môi
trường sống, EBV và HLA

1.3. Virut Epstein-Barr
1.3.1. Sinh học của EBV
Trên thực tế, hơn 90 % người trưởng thành trên thế giới nhiễm EBV và
nó tồn tại lâu dài trong cơ thể nhiễm. Việc lây nhiễm EBV chủ yếu thông qua
nước bọt và ở lứa tuổi rất sớm của đời sống con người mà thường không có
triệu chứng. Ngoài ra, EBV có thể được lây nhiễm qua máu, tổ chức và cũng
có thể qua sữa của mẹ truyền sang con, thậm chí là thông qua quan hệ tình
dục. EBV nhân lên trong tế bào biểu mô tuyến nước bọt, sau đó qua biểu mô
vòm họng rồi xâp nhập vào tế bào lympho B qua thụ thể CD21 trên bề mặt tế
6
bào. Sau khi đi vào nhân tế bào, EBV tồn tại ở dạng vòng là chủ yếu và tự
nhân lên nhờ nguyên liệu của tế bào. Tuy nhiên, EBV cũng tích hợp vào ADN
của nhiễm sắc thể tế bào chủ, ví dụ ở tế bào dòng Namalwa, nó tích hợp vào
nhiễm sắc thể ở vị trí 1p35. Ở thể nhiễm tiềm ẩn trong lympho B, EBV biểu
lộ rất ít kháng nguyên, hơn nữa với số lượng tế bào nhiễm quá thấp (1 tế bào
lympho B/1ml máu) do đó EBV khó bị tiêu diệt bởi hệ miễn dịch. Khi ở thể
dung giải, EBV nhân lên nhiều và giải phóng ra ngoài rồi lại nhiễm vào các tế
bào lympho khác, chúng đến tuyến nước bọt và hình thành chu kỳ nhân lên
EBV trong cơ thể.
Với những tế bào biểu mô không biểu lộ rexeptơ CD21, người ta cho
rằng virut có thể vào bằng những cách sau: Khả năng thứ nhất: có thể xảy ra
là sự tiếp cận giữa tế bào biểu mô vòm họng và tế bào nhiễm EBV. Tế bào B
đi vào chu trình dung giải, bung ra các bản sao của virus, cung cấp một số
lượng lớn các hạt virus mới cho các tế bào khác trên một diện rộng . Và khả
năng thứ hai: virus vào tế bào biểu mô bởi hiện tượng thực bào qua trung
gian rexeptơ với IgA Sixbey and Yao. Ngoài ra, phân tử MHC lớp II cũng có
thể là con đường chính virus xâm nhập vào tế bào biểu mô. Ngoài các tế bào
lympho B và tế bào biểu mô, đôi khi EBV còn bị tấn công bởi các tế bào
máu khác như đai thực bào, lympho T hoặc tế bào diệt tự nhiên (Natural
Killer cell).

1.3.2. Cấu trúc của EBV
EBV thuộc loại virut herpes, gamma-1, chiều dài bộ gen của nó
khoảng 172-kb và ADN là chuỗi đôi, GC chiếm 60% tổng số nucleotid. EBV
hình thành phân tử DNA dạng vòng ở tế bào bị nhiễm (hình 1A). Khi xử lý
EBV của dòng tế bào B95-8 bằng emzym cắt giới hạn BamHI, các đoạn gen
tạo ra được ký hiệu theo bảng chữ cái và theo thứ tự kích thước giảm dần
(hình 1B). Thuật ngữ sử dụng cho từng đoạn như sau: Mỗi chữ cái là ký hiệu
7
cho từng đoạn (A, B …), khung đọc mở trái hoặc phải và tiếp theo là thứ tự
(0,1,2,3…) ví dụ như BARF0 và BARF1. Toàn bộ bộ gen EBV của dòng tế
bào B95-8 được giải trình tự gen đầu tiên, và có mã số tại ngân hàng gen là
V01555.
Các EBV sản xuất khoảng 100 kháng nguyên khác nhau (các phân tử
protein lớn) trong thể dung giải của nó, ngược lại, chỉ có khoảng 10 kháng
nguyên được sản xuất trong các thể nhiễm tiềm ẩn [12].
Hình 1. Sơ đồ cấu trúc của EBV: A) Cấu trúc EBV dạng vòng biểu thị các vùng promoter
và các gen thể nhiễm tiềm ẩn: EBER1 và 2: EBV Early RNA, EBNA1-6: EBV Nuclear
Antigen, LMP1 và 2: Latent Membrane Protein. B) EBV ở dạng thẳng gồm các đoạn gen
được tạo ra sau khi xử lý với enzym giới hạn BamH1 và vị trí các gen của thể tiềm ẩn.
1.3.3. Thể tiềm ẩn của EBV
Giống như tất cả các virut herpes, EBV có thể tồn tại dạng không hoạt
động trong tế bào bị nhiễm. Ở thể này, EBV biểu lộ 12 gen, nhưng chỉ có 10
gen trong số này được dịch mã để tổng hợp protein, bao gồm 6 loại protein là
kháng nguyên nhân (EBV Nuclear Antigen ): EBNA1, 2,3A,3B,3C, -LP; 3 loại
protenin màng tiềm ẩn (Latent Membrane Protein): LMP1, LMP2A và 2B; 2 loại
BamHI
B
A
A
8

RNA không mã hóa protein (EBV Early RNA): EBER1 và2. Có bốn thể tiềm ẩn
được phân loại dựa trên sự biểu lộ gen của virut,được liệt kê ở bảng dưới đây.
Bảng 1: Các thể tiềm ẩn của EBV
Thể tiềm ẩn Biểu lộ gen EBV Người thường và các bệnh liên quan
0 EBER1 & 2
LMP2A +/-
Người thường
I EBER1 & 2
EBNA1
U lympho Burkitt, UTVMH
II EBER1 & 2
EBNA1
LMP1
LMP2A&2B
UTVMH, U lympho Hodgkin,
U lympho tế bào T, ung thư
tuyến nước bọt.
III EBER1&2
EBNA1- 6
LMP1
LMP2A & B
U lympho sau ghép tạng. U lympho ở bệnh
nhân AIDS, bạch cầu đơn nhân nhiễn khuẩn,
LCL.
1.3.4. Các gen EBV của thể tiềm ẩn
1.3.4.1. EBNA1
Protein EBNA1 của EBV thuộc dòng tế bào B95-8 có trọng lượng
khoảng 66-95 kDa và chiều dài là 641 axit amin. Kích thước này được thay
đổi ở các chủng khác nhau do sự khác nhau ở đoạn lặp lại glycin- alanin (Gly-
Ala) [13]. Các cấu trúc cơ bản của EBNA1 được chia thành bốn vùng rõ ràng:

một vùng cơ bản nằm ở đầu N gồm 89 acid amin, vùng lặp lại Gly-Ala gồm
239 acid amin, vùng cơ bản ngắn và một vùng gắn DNA ở đầu C có chiều dài
từ axit amin 459-641 Ambinder, Mullen, Chang, Hayward and Hayward
(Hình 2).
9
Hình 2. Cấu trúc của EBNA1
EBNA1 là protein biểu lộ hầu như tất cả các tế bào nhiễm EBV [15] và
nó đóng một vai trò quan trọng trong việc duy trì episom của EBV (dạng
vòng) trong nhân tế bào chủ, cũng như chức năng phiên mã của virut[16].
Vùng gắn ADN của protein EBNA1 tương tác với hai khu vực nằm ở vùng
oriP của promoter Cp, bao gồm gia đình lặp đi lặp lại FR (Family of Repeat)
có chứa 20 đoạn nucleotid có trình tự lặp, đoạn DS (Dyad Symmetry) có 4 vị
trí gắn, và một vùng có hai vị trí gắn sau promoter của Qp.
Liên kết EBNA1 với vùng FR có ái tính cao nhất so với DS và Qp và
khi gắn với FR thì nó điều hòa phiên mã các gen EBNA. Các gen này được
biểu lộ dưới sự kiểm soát của promoter Cp hay Wp. EBNA1 cũng có thể liên
kết với các intron đầu tiên xuôi chiều của promoter Qp làm tự điều hòa biểu
lộ protein EBNA1. Ở các thể nhiễm tiềm ẩn I và II, các promoter Cp và Wp
không hoạt động và biểu lộ của EBNA1 được thực hiện bởi Qp. Cp và Wp
không hoạt động do các yếu tố phiên mã và methyl hóa ADN [17] .
1.3.4.2. EBNA2
Protein EBNA2 có trọng lượng phân tử từ 75-105 kDa. Do có trình tự
gen khác nhau ở các chủng EBV mà người ta xếp thành EBNA2A và
EBNA2B, cũng là dấu ấn quan trọng để xếp loại EBV typ I và typ II [18]. Các
protein EBNA2A và EBNA2B chứa 484 và 443 axit amin một cách tương
ứng và giống nhau về trình tự khoảng 57%. EBNA2 là một trong những
protein virut đầu tiên được biểu lộ ở các tế bào lympho B bị nhiễm EBV, nó
xuất hiện khoảng 24-48 giờ sau khi nhiễm EBV trong nuôi cấy tế bào in
10
vitro[19]. Protein này là một chất kích hoạt phiên mã một số gen của virut và

tế bào bao gồm cả những gen như CD21, CD23, Bcl-2 và c-myc, và là cần
thiết cho sự bất tử của tế bào B trong in vitro. EBNA2 không gắn trực tiếp
với ADN, nhưng tác động thông qua các protein in khác như RBP-JK), PU1
các protein khác của tế bào.
1.3.4.3. Gia đình EBNA3 ( EBNA3A, 3B và 3C)
Các gen trong gia đình EBNA3 bao gồm EBNA3A, 3B và 3C nằm ở
giữa bộ gen EBV, có cấu trúc exon-intron tương tự và có trọng lượng phân tử
từ 140-180 kDa. Các chuỗi acid amin EBNA3A, 3B và 3C giữa EBV typ I và
II có giống nhau ở 84%, 80% và 72% một cách tương ứng . Các protein này
hoạt động có chức năng phiên mã và cũng có thể tương tác với các protein
RBP-JK[20].
1.3.4.4. EBNA-LP
Các protein EBNA dẫn đầu EBNA-LP có kích thước khác nhau từ 20-
130 kDa, là kết quả của hoạt động promoter Wp. Cùng với EBNA2, EBNA-
LP là một trong những protein đầu tiên biểu lộ sau nhiễm EBV vào tế bào
lympho B in vitro
1.3.4.5. LMP1
Protein LMP1 được phiên mã từ vùng BNLF1 nằm ở gần cuối đầu 3'
của bộ gen EBV và có trọng lượng khoảng 60-66kD, tùy thuộc vào chủng
virus . Ở chủng EBV của tế bào dòng B95-8, protein này có 386 axit amin và
chia thành ba vùng,(i) một vùng đầu N gồm 24 axit amin, (ii) sáu vùng
xuyên màng kỵ nước được kết nối bởi ba vòng bên ngoài và hai vòng nội bào,
(iii) một vùng đầu C có 200 axít amin bao gồm hai lĩnh vực chức năng quan
trọng [21]được gọi là vùng hoạt hóa CTAR1 (C-Terminal Activation Region
1: aa194-232) và CTAR2 ( aa 351-386).
11
LMP1 tham gia ba chức năng chính là chuyển dạng, di căn và chống lại
chết theo chương trình LMP1 được coi là sản phẩm của một gen sinh ung thư
vì nó có thể làm chuyển dạng các nguyên bào sợi động vật gặm nhấm. Biểu
hiện của LMP1 cũng tác động ảnh hưởng đáng kể đến sự tăng trưởng của tế

bào biểu mô, ức chế sự biệt hóa của chúng, gây biến đổi hình thái của một số
dòng tế bào biểu mô , và làm tăng biểu hiện của các yếu tố tăng trưởng biểu
bì EGFR[22].
1.3.4. 6. LMP2A/2B
LMP2 được mã hóa bởi chỗ ghép nối hình thành dạng vòng của EBV .
LMP2 có hai loại là LMP2A và LMP2B, và chỉ khác nhau là LMP2A có thêm
đoạn 119 acid amin ở đầu N tận còn LMP2 thì không có. Mặc dù chưa biết
được chức năng cụ thể của LMP2B, nhưng việc biểu lộ nhiều của nó cho
thấy rằng nó đóng vai trò quan trọng trong sinh học của EBV. Trong khi chức
năng của LMP2A đã được xác định trong các tế bào B. Tuy nhiên, protein
này biểu lộ ở một tỷ lệ thấp trong các khối u vòm họng.
1.4. Yếu tố ngoại di truyền
Ngoại di truyền là nghiên cứu các cơ chế làm không biểu lộ gen mà
không liên quan đến sự thay đổi trình tự nucleotid của gen. Những biến đổi
ngoại di truyền có thể di truyền được từ thế hệ tế bào này sang tế bào khác.
Khi nói đến ngoại di truyền người ta thường nhấn mạnh 3 yếu tố là: methyl
hóa ADN, sửa chữa histon và nucleosom. Các thay đổi này là độc lập với
nhau và methyl hóa xảy ra ở mức độ ADN trong khi 2 yếu tố còn lại diễn ra ở
mức độ protein.
1.4.1. Methyl hóa ADN và điều hòa biểu lộ gen.
Methyl hóa ADN là sự kiện diễn ra do một gốc CH3 liên kết đồng hóa
trị với vị trí cacbon số 5 của Cytosin nằm ở vị trí hai nucleotid Cytosin-
12
Guanin viết tắt là CpG (p là liên kết phosphodieste). Khi CpG tập hợp nhiều
trong khoảng 200bp tại một ví trí nào đó trong gen có GC chiếm hơn 50% thì
người ta gọi là đảo CpG. Khoảng 10-15% CpG ở động vật có vú nằm ở vùng
đảo CpG và nó thường xuất hiện ở vị trí vùng promoter và exon1của khoảng
40% các gen của động vật có vú. Cơ chế gắn gốc CH3 vào ADN trong quá
trình phân bào nhờ các enzym methyltransferase (DNMT). Có 4 loại DNMT
được xác định ở động vật có vú và cả 4 enzym đều chuyển nhóm CH3 từ S-

adenosyl methionin sang ADN. Trong các mô bình thường các đảo CpG
thường không bị methyl hóa. Khi chúng bị methyl hóa ở vùng promoter dẫn
đến hai cơ chế điều hòa biểu lộ gen: Một là, ức chế các yếu tố điều hòa biểu
lộ gen gắn vào vùng khởi động do gốc CH3 gắn vào Cytosin, cơ chế này được
minh họa trong Hình 3. Hai là, có các protein gắn đặc hiệu với CpG methyl
hóa dẫn đến cơ chế làm mất axetyl của histon và làm cấu trúc sợi chromatin
co lại, cuối cùng dẫn đến các yếu tố phiên mã không gắn được vào vùng đó
của DNA.
Hình 3: Một cơ chế không biểu lộ gen bởi methyl hóa ADN.Hai nucleotid CpG ở vùng
promoter không methyl hóa, cho phép thực hiện phiên mã trong các tế bào bình thường.
B) Phiên mã bị chặn bởi tăng methyl hóa trong vùng promoter.
13
1.4.2. Methyl hóa ADN các promotor của EBNA1
EBNA1 được biểu lộ trong tế bào nhiễm nhờ sự hoạt hóa của các
promoter khác nhau ở những thể tiềm ẩn khác nhau (Wp, Cp và Qp) và chu
kỳ dung giải (Fp). Ở chu kỳ dung giải, EBNA1 biểu lộ do promoter Fp hoạt
hóa, trong khi các promoter khác không hoạt động. Ngược lại, trong thể
nhiễm tiềm ẩn Wp, Cp và Qp được hoạt hóa, tuy nhiên phụ thuộc vào từng
thể nhiễm tiềm ẩn I, II hay III. Ở thể nhiễm tiềm ẩn I và II chỉ có Qp hoạt
động, còn thể nhiễm tiềm ẩn III, cả hai promoter Wp và Cp hoạt động. Hai
promoter này hoạt động luân phiên và Wp được hoạt động trước ở một thời
gian ngắn, sau đó mới chuyển sang Cp hoạt động lâu dài hơn.
Hình 4. Các promotor của EBV điểu khiển phiên mã EBNA1.
Việc các promoter đóng hoặc mở được thực hiện bởi các yếu tố khác
nhau, trong đó có methyl hóa các CpG vùng promoter. Ở thể nhiễm tiềm ẩn I
và II, các promoter Wp và Cp bị đóng lại, do đó EBV chỉ biểu lộ EBNA1 do
14
Qp như trong trường hợp UTVMH. Nghiên cứu về methyl hóa giúp tìm hiều
cơ chế biểu lộ gen, đồng thời nó cũng là những dấu ấn giúp cho chẩn đoán
cũng như điều trị liên quan đến ngoại di truyền vì rối loạn này có thể được

sửa chữa nhờ những chất hóa học được bổ sung vào tế bào [23]. Chúng tôi
phát triển kỹ thuật PCR đa mồi đặc hiệu methyl hóa trên mô hình của EBV
trong ung thư vòm mũi họng, đồng thời nó cũng có thể ứng dụng cho nhiều
các gen khác của các bệnh lý khác nhau.
15
Chương 2
ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1.Thời gian và địa điểm nghiên cứu.
-Thời gian nghiên cứu: Từ tháng 1/2011 đến tháng 10/2011.
- Mẫu được thu thập tại Bệnh viện K Hà Nội.
- Các kỹ thuật phân tử được tiến hành tại Phòng thí nghiệm của Bộ môn
Miễn dịch - Sinh lý bệnh và Labo Gen-Protein , Trường Đại học Y Hà nội
2.2. Đối tượng nghiên cứu.
2.2.1. Tế bào dòng.
Các nguyên liệu tế bào dòng B95-8, Namalwa, và Raji được tài trợ bởi
Labo nghiên cứu ung thư vòm mũi họng, MTC, Viện Karolinska, Stockholm,
Thụy điển
2.2.2. Tiêu chuẩn chọn bệnh nhân.
- Bệnh nhân mới, được chẩn đoán xác định từ mô sinh thiết lấy từ khối u
vòm họng là UTVMH thể không biệt hóa (UCNT).
- Những mô sinh thiết tươi và mô sinh thiết đúc farafin của bệnh nhân đã
được chẩn đoán là UTVMH thể không biệt hóa.
2.2.3. Tiêu chuẩn loại trừ.
- Các thể mô bệnh học khác ngoài UCNT
- Bệnh nhân tái phát hoặc đến khám định kỳ
2.3. Phương pháp và chỉ tiêu nghiên cứu:
2.3.1. Phương pháp nghiên cứu:
16
- Thiết kế nghiên cứu mô tả cắt ngang
- Trình tự kỹ thuật cần thực hiện:

+ Thiết kế mồi: Để xác định mức độ methy hóa, mỗi gen cần thiết
kế 2 cặp mồi. Một cặp mồi dùng cho xác định methyl hóa (M) và một
cặp mồi dùng để xác định không methyl hóa (K), sử dụng phần mềm
chuyên dụng
+ Chiết tách và kiểm tra chất lượng: ADN, ARN, Protein.
+ Xử lý ADN bằng Bisulfite.
+ Chạy kỹ thuật PCR đơn mồi đặc hiệu methyl hóa.
+ Chạy kỹ thuật PCR đa mồi đặc hiệu methyl hóa.
+ Điện di sản phẩm PCR, nhuộm và chụp ảnh
2.3.2. Biến số và chỉ số nghiên cứu:
- Các chỉ số nghiên cứu về PCR đa mồi đặc hiệu methyl hóa được
nghiên cứu bao gồm các thông số về lượng DNA khuôn mẫu, nồng độ mồi,
nhiệt độ gắn mồi, nồng độ Mg
++
, và chu kỳ nhiệt đối với cả hai loại mồi
methyl hóa và không methyl hóa.
- Các biến số nghiên cứu của mẫu sinh thiết bệnh nhân là mức độ
methyl hóa hay không methyl hóa các promoter của EBNA1
2.3.3. Phương pháp thu thập thông tin
- Quan sát và ghi kết quả nghiên cứu thực nghiệm
- Hồi cứu thông tin từ hồ sơ bệnh án và điền phiếu theo mẫu (phụ lục
kèm theo)
17
2.4. Phương pháp xử lý số liệu
Xử lý số liệu bằng phần mềm chương trình SPSS 15.0 với các test thống
kê thích hợp trong y học
2.5. Sơ đồ nghiên cứu

Mẫu
ADN
PCR
đơn
mồi
Bisulfite
PCR
đa mồi
cDNA
RT-PCR
ProteinARN
Điện di, nhuộm sản phẩm PCR và chụp ảnh
WB
Thu thập thông tin và xử lý số liệu
18
CHƯƠNG 3
DỰ KIẾN KẾT QUẢ
Các cặp mồi của gen nội chuẩn được sử dụng để xác định lượng
ADN đưa vào và để so sánh tỷ lệ khếch đại các gen nghiên cứu. Sản
phẩm khuếch đại gen được đánh giá định tính hoặc định lượng bởi
phần mềm chuyên dụng. Trước khi chạy PCR đa mồi, các cặp mồi
đơn sẽ được chạy và xác định đúng sản phẩm. Các kết quả về thay
đổi các thông số của nồng độ mồi, ADN khuôn mẫu, nồng độ Mg+
+, nhiệt độ gắn mồi và chu kỳ nhiệt của các cặp mồi methyl hóa và
không methyl hóa. Kèm theo các ảnh minh họa
Bảng 3.1. Xác định độ nhạy và độ đặc hiệu của phản ứng
PCR đa mồi sử dụng các số lượng tế bào dòng Namalwa khác
nhau (mỗi tế bào dòng Namalwa có 2 EBV)
. Số lượng
tế bào

Promoter
10000 1000 100 10 1
K M K M K M K M K M
Wp
Cp
Qp
K: Không methyl hóa; M: Methyl hóa
19
Nhận xét:
Bảng 3.2. Nồng độ mồi của các cặp mồi không methyl hóa và
methyl hóa.
Mồi
Promoter
NĐ1 NĐ2 NĐ3 NĐ4 NĐ5
K M K M K M K M K M
Wp
Cp
Qp
Nhận xét:
Bảng 3.3. Nhiệt độ gắn mồi của các cặp mồi không methyl hóa và
methyl hóa.
Nhiệt độ
Promoter
56
0
C 58
0
C 60
0
C 62

0
C 64
0
C
K M K M K M K M K M
Wp
Cp
Qp
Nhận xét:
20
Bảng 3.4. Nồng độ Mg++ của các phản ứng PCR đa mồi với các
cặp mồi không methyl hóa và methyl hóa.
Mg++
Promoter
2.0mM 2.5mM 3.0mM 3.5mM 4.0mM
K M K M K M K M K M
Wp
Cp
Qp
Nhận xét:
Bảng 3.5. Số lượng chu kỳ nhiệt của phản ứng PCR đa mồi
không methyl hóa và methyl hóa.
Chu kỳ
nhiệt
Promoter
34 36 38 40 42
K M K M K M K M K M
Wp
Cp
Qp

Nhận xét:
21
Bảng 3.6. Mức độ không methyl hóa và methyl hóa các promoter
của EBNA1 ở các tế bào dòng khác nhau.
Dòng tế bào
Promoter
Namalwa Raji B95-8
K M K M K M
Wp
Cp
Qp
Nhận xét:
Bảng 3.7. Mức độ không methyl hóa và methyl hóa các promoter
của EBNA1 ở 20 mẫu sinh thiết ung thư vòm họng khác nhau.
Mẫu sinh
thiết
Promoter
01 02 03 04 05…
K M K M K M K M K M
Wp
Cp
Qp
Nhận xét:
CHƯƠNG 4
22
DỰ KIẾN BÀN LUẬN
1. Bàn luận về kết quả sự thay đổi các thông số là thành phần
chủ yếu của kỹ thuật PCR đa mồi đặc hiệu methyl hóa ở các tế bào
dòng chuẩn.
2. Bàn luận về mức độ methyl hóa của các promoter Wp, Cp và

Qp của EBV ở các khối u vòm họng.
3. Bàn luận về cơ chế điều hòa biểu lộ gen EBNA1 trong ung
thư vòm mũi họng.
23
DỰ KIẾN KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
24
KẾ HOẠCH NGHIÊN CỨU
1. Tiến độ về thời gian
Các hoạt động triển
khai
1,2,3 4,5,6,7 8 9 10 11,12
Nghiên cứu tài liệu và
viết, bảo vệ đề cương
Thu thập số liệu
Nhập số liệu
Xử lý số liệu
Viết báo cáo và bảo vệ
2.Dự trù kinh phí
Công việc Thành tiền
1.Chuẩn bị đề cương
- Công thu thập tài liệu tham khảo
- Photo tài liệu tham khảo
- Hoàn thiện đề cương
500.000đ
200.000đ
100.000đ
200.000đ
2. Thu thập số liệu
- Chiết tách mẫu
- Hóa chất và sinh phẩm:

+ Kit xử lý ADN (Bisufite)
+ Trizol
+ dNTPs
+ Enzym Taq DNA polymerase
+ Mồi
+Và các hóa chất khác:
31.500.000đ

8.000.000đ
4.000.000đ
2.500.000đ
8.000.000đ
5.000.000đ
4.000.000đ
4. In ấn tài liệu 1.000.000đ
5. Chi phí phát sinh 500.000đ
Tổng số tiền 33.500.000đ
MỤC LỤC
ĐẶT VẤN ĐỀ 1
TỔNG QUAN 3
1.1.Tình hình ung thư vòm mũi họng trên thế giới và Việt Nam 3
1.2. Những yếu tố nguy cơ liên quan đến UTVMH 3
1.2.1. Vai trò của virut Epstein-Barr 3
1.2.2. Môi trường sống và thói quen sinh hoạt 4
1.2.3. Yếu tố di truyền 5
1.3. Virut Epstein-Barr 5
1.3.1. Sinh học của EBV 5
1.3.2. Cấu trúc của EBV 6
1.3.3. Thể tiềm ẩn của EBV 7
1.3.4. Các gen EBV của thể tiềm ẩn 8

1.4. Yếu tố ngoại di truyền 11
1.4.1. Methyl hóa ADN và điều hòa biểu lộ gen 11
1.4.2. Methyl hóa ADN các promotor của EBNA1 13
ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 15
2.1.Thời gian và địa điểm nghiên cứu 15
2.2. Đối tượng nghiên cứu 15
2.2.1. Tế bào dòng 15
Các nguyên liệu tế bào dòng B95-8, Namalwa, và Raji được tài trợ bởi
Labo nghiên cứu ung thư vòm mũi họng, MTC, Viện Karolinska,
Stockholm, Thụy điển 15
2.2.2. Tiêu chuẩn chọn bệnh nhân 15
2.2.3. Tiêu chuẩn loại trừ 15
2.3. Phương pháp và chỉ tiêu nghiên cứu: 15
2.3.1. Phương pháp nghiên cứu: 15
2.3.2. Biến số và chỉ số nghiên cứu: 16
- Các chỉ số nghiên cứu về PCR đa mồi đặc hiệu methyl hóa được
nghiên cứu bao gồm các thông số về lượng DNA khuôn mẫu, nồng độ
mồi, nhiệt độ gắn mồi, nồng độ Mg++, và chu kỳ nhiệt đối với cả hai
loại mồi methyl hóa và không methyl hóa 16
- Các biến số nghiên cứu của mẫu sinh thiết bệnh nhân là mức độ methyl
hóa hay không methyl hóa các promoter của EBNA1 16
2.3.3. Phương pháp thu thập thông tin 16
2.4. Phương pháp xử lý số liệu 17
2.5. Sơ đồ nghiên cứu 17
DỰ KIẾN KẾT QUẢ 18
DỰ KIẾN BÀN LUẬN 22